JPS61184442A - 光学的免疫検定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、溶液中の分析対象物を測定するだめの、特に
免疫検定式の反応により生物活性の分析対象物を測定す
るための装置に用いることができる分析用キュベツト及
び光導波路手段を含む複合装置又は集合体に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）光フ
ァイバーの芯にある化学的分析対象の吸着を光学的に測
定することができる光フアイバー製探針を含む分析装置
は知られている。この技術は、試験溶液中の照明された
光学的導波路の浸漬に基礎を置くものであり、その光学
的導波路は、例えばファイバーの芯の屈折率よシも小さ
い屈折率であるクラッド層が取り除かれた光ファイバー
であって、それによシ導波路に沿って伝播する光信号の
エパネ、セント波成分と溶液中の決定されるべき分析対
象物との間に相互作用が起こる。この方法は、ファイバ
ーの直ぐ近くの、すなわちエバネッセント波成分の及ぶ
範囲内（数十又は数百ｎｍ）の反応区域において起こる
ことを測定することについて特に興味深い。これは、探
針表面に吸着又は付着した結合反応の第一成分と、試料
溶液中に溶解した第二成分との反応に基づく反応の場合
にそうである。

このような方式の測定に適当する装置は、最近では次の
参照文献に開示されている、すなわち、ＷＤ−８４１０
０８１７、ＵＳＰ−４，４４７，５４６（ヒルシュフェ
ルト（Ｈｌｒｓｃｈｆｅｌｄ）等）、ＣＢ−２，１０３
，７８６（ＩＣＩ社）、アンドレード（Ｊ、Ｄ、Ａｎｄ
ｒａｄｅ　）等のもの（アプライド・オノティクス（Ａ
ｐｐＨｅｄ　ｏｐｔｉｃｓ　）第２３巻、第１１号、１
８１２〜１８１５ページ（１９８４））、ＷＯ−Ａ−８
１００９１２（バックルス（Ｂｕｃｋｌｅｓ）　）、Ｕ
Ｓ　−Ａ−４，０５０，８９５（ハープ４　（Ｈａｒｄ
ｙ）等）、ＵＳ−Ａ−３，９３９，３５０（クロニック
（Ｋｒｏｎｌｃｋ）等）である。

最近では、分析対象物とそれに特有の反応物との反応に
おけるパラメーターを測定するための、前記反応が導波
路（例えば１片の光ファイバーの芯）の表面で起り、そ
してそれの光学的性質の検出できる変化を引き起す装置
が開示されており（ＥＰ−Ａ−７５３５３参照）、そし
てそれは、光源と、その光源からの信号を前記導波路の
入力端に入射するための手段と、それを通って伝播する
時に変化を受けてそれから発生し、そしてそれを電気信
号に変換する光信号を検出するための検出手段と、前記
信号を前記反応に関係する有用なデータへと処理するだ
めの手段とを含む。この装置は、下記のものを含む。

ａ）導波路。これの主要部分は、測定される液体分析対
象物を保持するための容器すなわちキュベツトを貫通し
ておシ、その液に浸された導波路の露出表面は、操作の
前に、その液に溶解されておシ、そして測定されるべき
分析対象物の特定な結合剤の薄膜で被覆される。導波路
とキュベツトの集合体は、装置の試験探針を構成する。

ｂ）光源、コリメルティング・レンズ、環状開口部、及
び光源から発し、そして探針ファイバー中の多重反射に
よる光ビームの伝播を保証するために、選ばれた角度で
導ひかれるビームを導波路に入射するための焦点レンズ
。

Ｃ）開示された装置は更に、芯の出力端からの出口光信
号を電気信号に変換するための主検出器、その検出器か
らの信号を処理するための増幅及び演算回路、そして最
後に所望の読出し出力を提供する表示装置を含む。

測定されるべき化学反応を行なうための、以前に開示さ
れた導波路とキュベツトとの集合体は、従来満足に働い
ているとはいえ、より速く組立てられ、操作がよシ簡単
で、分析溶液の二つ以上のツクラメ−ターについての情
報をほぼ同時に供給することができる他の方式を提供す
るのが望ましいことが分った。

以下余白 （問題点を解決するための手段及び作用効果）この集合
体（ユニット）は、分析される溶液を保持するためのキ
ュベツトとこの溶液に接触する光導波路手段とを含み、
前記光導波路手段を通って伝播する光信号と分析される
前記溶液中の分析対象物の間の相互作用が所望の分析デ
ータを与える、光学的に溶液の分析を行なう装置であっ
て、前記光導波路手段がおのおの独自の光学信号を用い
る少くとも二つの独立に操作される導波路部材を含むこ
とを特徴とするものであるように、前述の願望の完成で
ある。この集合体の一つの態様を、それらの変形も同様
に組み入れられている装置と共に、添付図面を参照して
記述することにする。

本質の光学的部材が第１図に図式化される装置は、双導
波路部材のセル５０を含み、これの主要壁５１及び５２
が二つの先導波路部材を構成し、光源６から発する励起
信号を伝播する。このキュベツトの内壁は、セル５０に
入れられた分析対象溶液と接触している。キュベツトの
特別に成形されたこの壁は、通常の方法によって、例え
ば透明グラスチック（例えばルーサイト（商品名））の
成形によって供給することができ、或はこれらはガラス
、好ましくは光学等級のガラスから作ることができる。

キュベツトの幅、すなわち壁５１と５２との間の間隔は
、分析するのに十分な量の分析対象物の保持量に応じて
いるいろであるが、この幅は数膿又は１聴より小さい（
例えば１０〜１０００μｍ）であることができ、その場
合にはキュベツトは、互いに非常に接近して配置された
壁による毛管効果のために、試料採取器としても働くこ
とができる。

光源６から発した光ビームは、回転するチョッ／”−鏡
５７＆及び５７ｂによシビーム５５及び５６に択一的に
分けられる。第１図では、この鏡５７は二つの位置に表
わされている、すなわち一つの位置は符号５７ａに対応
し、もう一つの位置（最初のそれに対しほぼ直角のとこ
ろ）は符号５７ｂに対応する。鏡５７の位置によって、
光源からのビームは、ビーム５５に反射されるが或はビ
ーム５６に伝播されるかのいずれかであることが容易に
分る。このように、光源６からの光は、それぞれ一連の
鏡（５８ｍ、５８ｂ、５８ｃ）及び（５９ａ、５９ｂ、
５９ｃ）のいずれか一方によって、双導波路部材のセル
５ｏのいずれかの部分５１又は５２に択一的に入射され
る。導波路のいずれかの部分からの、チョッパーグレー
ドでの反射による出力光６０及び直接の出力光６１は、
それぞれその後検出器６２に集められる。

この態様の残りの構成部材は、モノクロメータ−９と、
光検出器６２、前置増幅器１１、強度調節機構１２付の
光源、マイクログロセ、す１３、印字装置１４、そして
記憶装置（７０ツピデイスク）１５を包含するデータ取
得及び処理用マイクロコンピュータ付の電子構成部材と
を含む。

好ましく使用される光源６は、キセノン閃光ランプ（マ
サチューセッツ州すレム（Ｓａｌｅｍ）のＥ、Ｇ、＆Ｇ
、社製）であり、モノクロメータ−は、凹面形のホログ
ラフィ−格子（フランス、パリのジョビン・イデン（Ｊ
ｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ）社製）によって好ましく取付けら
れて５ｎｍの解像限界を可能にした。

光源６の閃光ランプは、マイクロコンピュータ１２によ
シ調節された。セル５０に試料を注入するために、プロ
グラマブル自動ピペット（スイス、ＢｏｎａｄｕｚのＨ
ａｍｉｌｔｏｎ　Ｂｏｎａｄｕｚ　ＡＧ社ｇ　Ｍｉｃｒ
ｏｌａｂ−Ｐ）が好ましく使用された。検出器６２は、
光強度の変化を直接測定するために導波路出力端に設置
された光電子増倍管（東京、浜松社製Ｒ９２８）を含ん
だ。光電子増倍管からの信号は、増幅され（１１で）、
閃光時間の間に積分され（１２で）、そして標準的な１
２ピツトのアナログ／ディジタル変換器（示されていな
い）によシディジタル形式に変換された。開発されたイ
ンハウス・マイクロコンピュータ１２は、高速で信号の
平均化処理を行ない、そして全てのデータは、モノクロ
メータ−に設置されたフォトダイオード１９への参照に
よって閃光ランプの強度の変動を調節し友。信号は、表
示及び記憶のためにアップル■型（商品名）マイクロコ
ンピュータ１３へ送られた。

別の態様においては（第２図参照）、装置は、先の態様
のセルと同一の、すなわち二つの独立した導波路の構成
部材として働き且つ以下に見られるように同様に作用す
る壁７１及び７２を有する、双導波路部材のセルフ０を
含む。

その装置は光源７３を含み、それの出力は、導波路部材
７１及び７２の入力側のレンズ及び鏡によってそのどち
らかの側に焦点を合わされる。鏡は、番号７４と７５と
である。ウィンドーホール（７７）を有するチョー・ぐ
−盤７６は、入射光を構成部材７１及び７２に択一的に
分配する働きをする。導波路からの出力信号は、その後
備７９及び８０によって検出器７８に向けられる。

第１図と第２図とに示される両方の態様において、導波
路部材の一方（５１，７１）は、特定の結合する分析対
象物、例えば分析溶液中の測定されるべき成分に特有の
抗体で、結合反応によシ被覆され（ここに開示されるよ
うに）、一方で別の部材（５２，７２）は未被覆のまま
にしておかれる。ここで、「未被覆」は抗体のない表面
を指すものとする。しかしながら、この表面のタンパク
質吸着部位は、その表面に代シの非反応性又は非結合性
タン／４’り質（例えばウシ血清アルブミ／（ＢＳＡ）
を吸着することによって通常はふさがれる。

従って分析の間、未被覆の区域の出力側の信号は、分析
溶液のバルクと励起ビームとの相互作用を反映する。し
かしながら、（交互に、同時Ｋ又はほぼ同時に）導波路
の被覆側から現われる信号は、セルのこの側の内面に被
覆された特定の反応物と結合している成分に関する必要
情報を提供する。

これは、この明細書の例を参照してよシ詳細に説明され
る。今は、この種の導波路方式（双部材式）は、その導
波路の別々の部材からの二種類の情報を集めることを可
能にすると言えば十分である。

明らかに、この態様における検出器の出力信号は、前の
態様に関して開示されたように、その後処理されそして
読取シデータに変換される。変形として、導波路部材５
１と５２又は７１と７２は、分析溶液中のある特定の分
析対象物におのおの特有の異なる抗体で被覆することが
でき、この変形において分析結果は、そのとき導波路の
おのおの別々の部材上の前記抗体によって結合されてい
る二つの前記分析対象物に関係づけられる。

もう一つ別の態様を第３図に示す。この変形において、
前述のセル５０及び７０と同じ全体的形状の双導波路部
材のセル９０が使用される。が、それらとの違いは、そ
の終端９１ａ及び９２ｍが、例えば鏡の場合におけるよ
うに金属被覆（銀又はアルミニウム）によって、実際的
に反射性にされることである。従って、光を伝える部材
である導波路のもう一方の先端９１ｂ及び９２ｂは、そ
れぞれ同時に入力端及び出力端として働く。これは、二
つの光源９３及び９４によシ供給される励起ビームの進
路によって説明され、それらはビームスプリッタ−９５
及び９６ｔｌ−それぞれ横切った後に、それぞれ先端９
１ｂ及び９２ｂに向けられる。このように、先端９１ｂ
及び９２ｂを通過する光は、最初は前方に、そして次に
は終端９１ａ及び９２ａから反射された後で逆方向に、
導波路を通って伝播する。この形状は、分析対象物によ
る励起光線の相互作用容量が前に開示された態様と比べ
て実際に２倍であることを可能にする。この変形は、９
１ｂ及び９２ｂから出、そしてビームスシリツタ−９５
及び９６と三角形の鏡９８とによりてそれへ向けられる
逆方向の信号を集めるための検出器９７を更に含む。光
源９３及び９４、例えば発光ダイオード（−）は、導波
管の先端９１ｂ及び９２ｂから出るパルス信号が検出器
９７に同時には来なくするために、当該技術分野におい
て知られている方法によって交互に同期される。当然な
がら、三つ以上の導波路部材を有する他の型式のキュベ
ツト−導波路ユニットも可能であって、例えば対面する
導波路として働く壁に加えて光ファイバーの導波路を含
むキュベツトである。従って、ユニット内で一緒に操作
する独立な導波路部材の合計数で、２よシも大きい、溶
液のノ々ラメ−ターに対応する数を、同時に（又はほと
んど同時に）調べることができる。

前の部分で開示された装置の使用法は、後の部分に用意
されたように血液試料の分析によシ説明することができ
る。

実際に、血液試料におけるヘモグロビン、及びグリコジ
ル化されたヘモグロビンのような種々の他のヘモグロビ
ン因子の、試料中の全ヘモグロビンを基準とする直接測
定は、所望されるなら、非常に重要な医療試験を横取す
る。グリコジル化されたヘモグロビン（ＨｂＡｌ、、Ａ
、ｂ＋及びＡ、ｅ）は、糖尿病患者の診断と横歪にとっ
て重要な因子である。全ヘモグロビン（ＨｂＡｏ、すな
わちグリコジル化されていないヘモグロビン及びグリコ
ジル化されたヘモグロビン）に関するＨ′ｂＡ１ｃ（こ
れはグリコジル化されたヘモグロビン（ＨｂＡ、）全体
の約８０チに達する）の含有量の決定は、その疾患に関
して特に重要である。

ヘモグロビンＡ、。は、ＨｂＡｏのものと同じアミノ酸
構造を有するグリコヘモグロビンであり、重要な差異は
、ＨｂＡ、ｃのβ鎖のＮ末端バリンに２，３−ジホスホ
グリセリン酸ポケットで付いた１−アミノ−１−デオキ
シフルクトースの存在である。

１１ｂ　ＡａのＨｂＡｌｃへの変化は、連続性の非酵素
型翻訳後プロセスであり、その速度は血液中のグルコー
ス濃度の関数である。グリコジル化は、二段階プロセス
として起こる。まず第一に、開環したアルデヒド形のグ
ルコースがＨｂのβ鎖の末端アミノ基と反応してシック
塩基を生ずる。第二に、そのシック塩基が次にアマトリ
転位してＨｂＡ、ｃｔ−生ずる。

中間体のシック塩基は、安定なＨ′ｂＡ、ｃのケトアミ
ンよりも６０倍大きな解離する性質（遊離の糖質とタン
ノ々り質とに）のために不安定である。わずかに少ｔ（
およそ１０−６チ）の血糖が開環したアルデヒド形であ
り、またケトアミン生成速度が遅い（効果的に不可逆的
ではめるけれども）ので、ＨａＡ、。の生成は長期の血
糖濃縮を必要とする。ヒト赤血球の１２０日の寿命の間
に、グリコジル化された励分子数は、平均血糖濃度に比
例して増加する。血漿中の平均グルコース濃度とＨｂＡ
、ｃの濃度との関係は、単一のＨｂＡｌｃの消失の測定
が、それに先立つ６〜８週間にわたる血糖調節の遡及的
評価を提供する点において独特である。Ｉ（ｂＡ１ｅ測
定が、炭水化物代謝の患者、特に真性糖尿病患者の検査
に非常に有用な方法であることは一般的に容認される。

糖尿病患者は、長期の高い血糖レベルを示し、そしてこ
れはその患者のＩ（ｂＡ、ｃレベルに反映される。正常
な成人は、全ヘモグロビンの約３〜６％のＨｂＡ、ｃを
有するが、これに反して糖尿病に罹患した年少者及び成
人におけるそのＨｂＡ、ｃの範囲は６〜１５チである。

ＨｂＡ、ｃ＃度の同様な増加は、遺伝学的に及び化学的
に誘発された糖尿病のマウスにおいて、そして膵切除さ
れた犬において認められている。

血液中のグリコジル化されたＷｂを測定する数株類の方
法の中で、ＨｂＡｌ及び特にＨｂＡ、。の測定は、今や
糖尿病の治療と横歪するために選択される方法になった
（ジョヴアノグイック（Ｌ、Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ）等、
アメリカ医学誌（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊ、　ｏｆ　Ｍｓ
ｄｌｃｉｎｅ）（１９８１）第７０巻、３３１頁；ゴー
ルドスタイン（Ｄ、Ｅ、Ｇｏｌｄａｔｅｉｎ　）等、糖
尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）（１９８２）第３１巻、７０
頁；ガデイ（Ｋ、Ｈ。

Ｇａｂｂｏｙ）等、臨床内分泌学及び代謝誌（Ｊ、　ｏ
ｆＣＩｉｎｉｃａｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ａ
ｎｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　）（１９７７）第４４巻
、８５９頁；ゴーネン（Ｂ、　Ｇｏｎｅｎ　）等、糖尿
病学（Ｄｉａｂｓｔｏｌｏｇｉａ　）（１９７８）第１
５巻、１頁；ピーターソン（ｃ。

Ｍ、　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　）、糖尿病（１９８２）第３
１巻。

１頁）。そして更に、次の特許文献を有用なものとして
挙げることができる。すなわち、　ＵＳ−Ａ−４、２４
７、５５３、ＱＢ−Ａ−１，５８０，３１８、ＵＳ−Ａ
−４，２２２，８３ａＵＳ−４，３７２，７４７、ＵＳ
−４，２００，４３５、ＵＳ−４，３４１，６３５であ
る。これらの方法は、グリコジル化されていないＨｂか
らグリコジル化された池を分離するのに使用される機構
により容易に分類できる。例えば、イオン交換クロマト
グラフィーは初期に使用され、そして今でも最も一般的
方法である（カンケル（Ｈ，Ｇ、　Ｋｕｎｋｓｌ　）等
、サイエンス（１９５５）第１２２巻、２８８頁）。こ
のようなイオン交換技術は、特にＨ′ｂＡ、ｃを測定す
る現在唯一の有効な方法であるが、それは多数の制限を
有し、それの温度と声感度とは最も重要である。その上
、不安定なグリコジル化されたＨｂ　（プレーＨｂＡ１
ｃ）が分析よシ前に取シ除かれねばならず、そしてその
結果として胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ　）と錐状赤血球
ヘモグロビン（ＨｂＳ　）が妨害するので、イオン交換
は妨害を受けやすい。

他の先行技術は、寒天グル電気泳動（メナード（Ｌ、Ｍ
ｅｎａｒｄ　）等、臨床化学（Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）（１９８０）第２６巻、１５９８頁）
、等電点電気泳動（ス・母イサー（Ｋ、Ｍ、５ｐｉｃｅ
ｒ）等、糖尿病（１９７８）第２７巻、３８４頁）、例
えばチオバルビッール酸を用いる比色分析（フルキが−
（Ｒ，Ｆｌｕｃｋｉｇｅｒ　）等、ＦＥＢＳレター（１
９７６）第７１４．３５６頁）及びアフィニティークロ
マトグラフィー（？−リオティス（Ｖ、Ｂｏｕｒｉｏｔ
ｉｓ　）等、糖尿病学（１９８１）第２１巻、５７９頁
）と含む。放射線免疫検定法は、一つだけ報告されてお
シ（ジャグイツト（Ｊ、Ｊａｖｉｄ　）等、英国血液字
詰（Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊ、　ｏｆ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏ
ｇｙ　（１９７８）第３８巻、３２９頁）、それは放射
性同位体により標識されたＨｂＡ、ｃの調製が必要なの
で、遅く（使用するのに３日よシ更にかかる）そして技
術的に複雑であった。先行技術の方法は長所を有しては
いるけれども、迅速な結果（およそ１５分よプも短い）
を提供し、熟練技手を必要としない、そして日常的に費
用がかからずに行なわれる方法の必要がなお存在する。

現行技術の方法は、遅く（典型的には１時間以上後に結
果が得られる）、−技術的に複雑で（ピペットを使用す
る５回以上の操作段階を必要とする）、そして実験室環
境外での試験に適さない。更に、現在の方法は、全ヘモ
グロビンがグリコジル化された因子とは独立に測定され
ることを必要とし、そこで両方の分析データが実質的に
一緒に測定されそして遅れなしに補正され得ることが望
まれた。

本発明に開示された装置によって行なうことのできる方
法は、先行技術の方法の不便を改善し、そして血液中の
二つ以上のＡ？ラメ−ターをほとんど同時に測定するこ
とと可能にし、それは更に所望ならば、一つのパラメー
ター（例えばグリコジル化された因子又は他のヘモグロ
ビン因子）のもう一つのパラメーター（例えば全ヘモグ
ロビン）に関する百分率を直接与えることの有利を提供
する。

この実例となる方法は、ＨｂＡｌｃ、Ａ、ａ又はＡｌｂ
に特有の抗体を精製された形で入手できるならば、この
ような分析対象物の別々な測定を提供する。

言い換えれば、よシ少ない特定な抗体の使用によシ、本
方法は、ひとまとめにして取シ扱われる二つ以上の血液
因子の、すなわち例として全油に関係する全てのグリコ
ジル化された油の並行する測定を提供する。もちろん、
もし複合体生成反応における前記因子に対応する特定の
結合剤が入手可能であるならば、この方法はまた上記の
血液因子以外の血液因子の測定方法と提供する（例えば
、ＨｂＦ　、　ＨｂＳ又はその他のヒトヘモグロビン因
子）。

この方法は、そのような特に反応性の結合体の片方（単
クローン性又は多クローン性抗体）の入手又は調製には
関係しないが、本発明のユニットによって分析される血
春試料と接触する活性導波路の準備において、被覆物質
としてそれらを使用することに関係する。

ここで使用される光学技術は、これまで述べたように、
主として光の吸収に関係する、すなわち導波路の一つの
操作部材中を伝播されるエバネッセント波成分と、第一
に周囲の液中の分子との、そして第二に、導波路の操作
上別個のもう一方の部材の表面に前もって被覆された特
定の複合体の片方（抗体）と測定されるべき血液因子と
の反応のために導波路上に層状に形成し始める批−抗体
複合体との、相互作用が存在する。対応する部材におけ
るエバネッセント光成分の相互作用が及ぶ距離は、その
複合体の層の厚さに実質的に限定されるので、その層状
形成物に対する光学的応答は、血液自体とバルクの吸着
と無関係である上記二つの相互作用は、一方の又は他方
の相互作用から発する信号を読取るための比較的簡単な
技術によって容易に識別できる。

油誘導体は、それらの化学的状態に依存する特有の吸着
スペクトルを有する。それゆえ、通常の吸着技術はどれ
でも、本発明を実施するのに等しく応用できる（テント
リ（Ｌ、Ｔｅｎｔｏｒｉ　）等、ヘモグロビン、酵素学
の方法（Ｍｅｔｈｏｄａ　１ｎＫｎｚｙｍｏｌｏｇ７　
）　（１９８１）、第７６巻、７０２−７３２頁、アカ
デミツク・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、ニ
ューヨーク）。好ましくは４００〜６００１ｍ％％に４
００〜４２０　ｎｍ及び５５０〜６００　ｎｍの範囲で
の、シアノメトヘモグロビン法及び単−又は多波長吸光
尤度分析が含まれる。

そして更に、Ｈｂ分子による吸収が酸素飽和度に関係し
ないインペスティック点法のような方法が含まれる。

本発明による試験の操作は、下記に従って進行する。す
なわち、光ビーム１が、屈折率が大きい方の（ｎｌ＞ｎ
２）伝播媒体ｎ１からやって来て二つの伝播媒体ｎ１及
びｎ２の間の界面に角度θで突き当たる時に（第４図）
、反射角θが式■で与えられ臨界角と呼ばれるある値θ
。よシ大きい場合には、内面全反射が起こる（ハリツク
（Ｎ、Ｊ。

Ｈａｒｒｉｅｋ　）、「内面反射分光学」、ウィーリー
・インターサイエンス（Ｗｉｌａｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉ
ｅｎｃｅ　）社、ニューヨーク（１９６７））。

θ。＝ｔｄｎ−１（ｎ２　／　Ｊ　）　　　　　　■反
射ビームは、番号２で示される。この場合には、エバネ
ッセント波は、反射する表面を越えて屈折率ｎ２の疎な
る媒体中に波長のフラクションのオーダーの距離（ｄ、
）へ透過する。マックスウェルの式に従えば、反射面に
垂直な定常正弦波が、密なる媒体中に生ずる（第５図）
。吸収しない、疎なる媒体への正味のエネルギーの流れ
はないけれども、減衰する非伝播領域３がその媒体中に
存在し、それの電界の強さくＥ）は、界面において最大
（Ｅｏ）であり、そして式■に従って界面からの距離（
ｚ）により指数関数的に減少する。

Ｅ　＝　Ｅ（１−ｅｘｐ　（−ｚ／ｄ　　）　　　　■
透過距離（ｄ、）は、電界の強さが界面におけるそれの
値のｅｘｐ（−１）倍となるのに必要な距離として定義
され、式■で与えられる。

９０’　から始めて、θがθ　に近づくにつれて、ｄ、
は無限に太きくな勺、そして角度が固定された場合には
、屈折率の組合せが接近するにつれて（すなわち、ｎ　
２　／　ｎ　ｌ→１のような）増加する。

そして更に、ｄ、は波長に比例するので、それはより長
い波長においてより大きくなる。

このように、透明な導波路の屈折率”１％入射角、そし
て波長の適切な選択により、ｄ、を選択し、主として界
面に接近しているすなわち界面から所定の距離にある物
質４と、そして前記距離を越えるところの物質５による
光学的相互作用を調節することができる。本態様におい
ては、密なる媒体は、プラスチック又はガラス（ｎｌは
１．４０〜１．６０の範囲である）製の本発明の光学セ
ルすなわちキュベツトの壁によって構成することができ
、そして疎なる媒体は水性血液試料（ｎｚ＝１．ａ４）
であって、θは調節できるように変えられるので、λが
可視波長から選択された場合、ｄ、は約２０〜３００　
ｎｍ　で変わることができる。本発明のユニットでは、
導波路部材用に使用される異なる物質（例えばキュベツ
トの壁）は、性質が異なる、すなわち異なる屈折率（ｎ
ｌ　）であることができ、従って一つの部材を伝播する
エパネッセント波成分の透過する距離は、他の部材中の
それとは違うものであることができ、その結果入射信号
と測定される分析対象物との間の相互作用が、分析され
る溶液内の異なる距離における領域を含むことができる
。

導波路における反射数（Ｎ）は、導波路の長さくＬ）と
厚さくＴ）、及び入射角（θ）の関数である。

Ｎ＝Ｌ／Ｔ−ｃｏｔθ　　　　　■ ここで使用された導波路では、別々の高さのビームにつ
いての全反射数は、約３０〜５０に変化した。

第６図は、先に開示したよりな双導波路部材型のセルに
おける分析の間に起こる現象の、分子レベルでの概略説
明図である。第６図中、５１及び５２の印をつけられた
領域は、例えば第１図に示された導波路部材５１及び５
２に相当する。領域５１と５２との間の中間領域は、そ
の中に溶解した分析対象物及び部材５１と５２の内壁に
付着した分析対象物を有する分析媒体を図式的に表わす
。

部材５１は、１０１で示される構成要素ＨｂＡ、ｃに特
有の抗体１００をその上に付着して描かれる。

これらの山Ａ、。分子のいくつかは、特定の抗体１００
との結合後の形で示され、その他は結合しないままであ
る。他の内面（すなわち部材５２の内面）は、阻止剤１
０２（例えばウシ血清アルブミン）によシ被覆されて示
され、前記阻と剤は、溶液中の全ての励の分析対象物（
例えばＨｂＡ。

１０３）及び全ての様式のタンパク質１０４に対する露
出壁の可能な親和性を最小にするのを意図している。

このように、分析の間、面５２へのＨｂに特有でない結
合は防市され（又は少くとも大いに最小化され）、この
ことは、適当な値の角度θを用いることによって、その
面に付着した阻止被膜の厚さを越える距離における、５
２中を伝播する信号のエパネッセント波成分と分析溶液
との相互作用によりバルクヘモグロビンを測定すること
を可能にする。

対照的に、面５１上では、それに被覆された抗体分子１
００と分析溶液中のＨｂＡｉｃ（ＡＧ）分子との間で結
合反応が起こる。この反応は、迅速ではあるけれども即
座には起こらず、従って導波路の部材中と伝播する光成
分との連続的な対応する相互作用によシ、複合体の層が
面５１上に漸進的に生じ、この結果、第７図に示される
Ａ型又はＢ型の応答曲線が得られる（下記の例を参照）
。

（実施例） 試験を実際的に実行するために、標準的な着色スライド
ガラス器類を用いて、濃硫酸と蒸留水、エタノール及び
アセトンに連続的に浸漬することによシ、ガラス製キュ
ベツトを洗浄した。他の非ガラス製導波路は、エタノー
ル中で超音波洗浄した。導波路は、いろいろな抗体溶液
で被覆した。

抗体は、導波路の表面に物理的に吸着されるか、或は共
有結合的に結びつくかした。吸着は、洗浄した導波路を
抗体の溶液（０，０５ｍｏ１７ｔのトリスＨｅｅ緩衝液
１ｍｌ当り５μｇのタンパク質、ｐｉ（＝７．０）と共
に恒温器に４時間入れることによシ行なわれる。未吸着
タンノ４り質は、食塩水で洗い流し、そして残シのタン
・臂り質結合部位は、その抗体被覆された導波路をウシ
血清アルブミン（１，０重量％のトリス緩衝液）と共に
恒温槽に入れることによシ阻とした。共有結合による方
法は、本質的にライ−トール（Ｗｅｅｔａｌｌ　）のそ
れであシ、酸水溶液のシラン処理環境における３−アミ
ノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ　）を含む（
「固定化生化学と７フイニテイークロマトグラフイー（
Ｉｒｒｒｎｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ　ａｎｄ　ＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈ　）　Ｊ、ダンｏ　ッ７’　（Ｒ，Ｇ、Ｄｕｎｌｏ
ｐ）、プリーナム会プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ
　）、ニューヨーク、１９１〜２１２頁）。（［固定化
酵素、抗原、抗体及びペプチド（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａ
ｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ。

Ａｎｔｌｇｅｎｓ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　
ＰｅＰｔ７ｄ６Ｇ）　Ｊ、準備及びクロマトグラフィー
、１：酵素学、ライ−トール（Ｈ，Ａ、Ｗｅｅｔａｌｌ
　）、マーセル・テラカー社（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋ
ｅｒ　Ｉｎｃ、　）、二＞−ヨーク（１９７５）、１〜
４８頁）。

一般的に、導波路はＡＰＴＳ　（０，４ｍｏｌ／Ｌ　）
と８０℃で３時間反応させた。それから導波路を、その
物質を含んだまま２時間、８０〜１２０℃に加熱し、そ
の後周囲温度で９０分間、リン酸塩緩衝液（Ｑ、　ｌ　
ｍｏな’ｔ、　ｐＨ＝　６．８　）中のグルタルアルデ
ヒド（０，５ｍｏ４／ｌ）にそれらを漬けた。「活性化
」導波路は、その後４℃で２４時間、抗血清Ａｂ（リン
酸緩衝液１−当り５Ｔｎ９のタンパク質）と反応させた
。抗体を結合した導波路をリン酸緩衝液中で洗浄後、そ
れらを４℃で等張索塩水（０，１４ｍｏｌｙ’Ｌ　％ア
ジ化ナトリウム８ｍｍＯ４／ｌを含む）中に保管した。

結合の前後におけるタンパク質の測定（分析生化学（Ａ
ｎａｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　）第５１巻、６５４〜６５５
頁（１９７３））は、石英上に約１μｇ／ｃＷ１２のタ
ン・臂り質の付着を示した。

二重 （異種ヘモグロビンの存在下でのヘモグロビンの測定） トリヘモグロビン（ピグオン）を基に、測定するヒトヘ
モグロビンをいろいろな割合で含んで、試料溶液を調製
した。一連の試料（４）において、両ヘモグロビンの総
量は常に５１ｖ／ＷＬｌであり、ヒトヘモグロビンの割
合は、下記の表に示される。もう一方の一連の試料中）
においては、全ヘモグロビン濃度はほぼ倍であった。第
１図及び第２図に示される型式の双導波路を使用し、面
の一つ（例えば５１）をヒ）ＩｇＧに対する抗体で被覆
した。他の面５２は、通例のようにウシ血清アルブミン
で阻正した。

金側において、伝播損失に対応する鋭い低下（Ｉ）が、
測定中に観察され、その後１０分間にわたって更に伝播
率の低下（財）が記録された（第７図参照）。

トリヘモグロビンのみを含む試料の場合、その１０分の
間にそのように更に変化することは観察されなかった。

結果を下表に要約する。第７図で使用した添字ＡとＢと
は、異なる全ヘモグロビン濃度の試料に対応する。

以下余白 このように、最初の初期低下工について記録される値は
、存在する全ヘモグロビンに関係づけることができ、一
方１０分間の反応期間後に観察され、そして面５１上に
被覆された抗体へのヒトヘモグロビン因子の結合に対応
する値（財）は、試料のヒトヘモグロビン含有量と全ヘ
モグロビンに対スるそれの比率とに関係づけることがで
きる。この例で使用した装置につないだ自動記録計で記
録することによって、標準曲線を上記データから作成し
た。その後は、トリヘモグロビン中のヒトヘモグロビン
の未知の混合物を測定するのに、このような曲線を比較
データとして使用した。第７図において、Ｗの値（ｗＡ
及びＷＢ）は、未結合の全物質を取り除く分析緩衝液に
よシセルを完全に洗った後に（１１において）測定され
た応答に対応する。そのＷの値は、所望するならば、溶
液の上記分析パラメーターに関係づけること、及び標準
として未知混合物の分析に用いることもできる。

氾 （ヘモグロビン存在下でのグリコジル化されたヘモグロ
ビン（ＨｂＡ、。）の測定） バイオレックス（Ｂｉｏ−ＲＩＸ　）　７０樹脂（米国
カリフォルニア州すッチモンドの）々イオラツド（Ｂｉ
ｏｒａｄ　）社＃）を使用しての陽イオン交換クロマト
グラフィーによシ、プールされヘノやリン処理した健康
な血液から、グリコジル化された標準Ｈｂ（ＨｂＡ、ｃ
）を調製した（トリベリ（Ｌ、Ａ、Ｔｒｉｖｅｌｌｌ）
等、ニューイングランド医学誌（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ
ｄＪ、　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｌｎｅ　）第２８４巻（１９
７１）、３５３頁）。精製したＨｂＡ、。はその後、グ
リコジル化されたヘモグロビンのない血液といろいろな
既知の量で再結合することによシ、標準試料を調製する
のに使用した。試料中の全ヘモグロビンに関するＨｂＡ
、ｃの濃度は、１〜２０重量％に変化し、そして全油濃
度は１５０　ｇ／を程度であった。

第２図に図示されるように双導波路を含むキュベツトを
有する分析装置が測定用に使用され、そのキュベツトの
一方の側の内面は）ｌ′ｂＡ、ｃに特有の抗体で被覆し
、これに反して反対側の面は被覆しないままにした。お
のおののセル（おのおのの標準試料を連続的に試験する
のに新しいそれｔ使用した）の含有量は、約１−であり
、０．１Ｍの測定される標準試料と約０．９４のＰＢＳ
とをピペットにてその中に入れた。第８図は、１５分の
恒温時間後に得られた測定曲線の一つを示しく２０％Ｈ
ｂＡ、ｃ試料による）、上の曲線（はとんど横に寝た）
は、導波路の未被覆部で記録されたものであり、また下
の曲線は、導波路の抗体被覆された部分の応答を示す。

いろいろな標準溶液の分析結果も、下記の表に要約する
。

ＨｂＡｌｃがない試料についての０．３％の差は、デグ
リコシル化された血液媒体に対する）ＩｂＡｌｃの特定
の抗体のアフィニティーが、ある程度残っていることを
示す。しかしながらこの因子は、実用的分析条件下では
無視し得ると考えられる。

導波路の未被覆部における伝播率が、一方のセルから他
方へと一定でなく、この方法は全油を正確に測定するの
に適当でないことと示すように思われることも、注目さ
れるべきである。しかしながら、この場合全油を測定す
ることは必要ではなく、未被覆側と被覆側とからの信号
を関係づけることだけが必要なのである。次に、備品の
初期目盛り調整を必要としない無条件の測定の完全な再
現性を可能にするような一連のキュベツトを手作業で組
み立てる場合に、不変性の程度を維持することは困難で
ある。疑いなく、キュベツトが工業的に大規模に成形に
よ＃）裏作される場合には、この不利は克服される。

【図面の簡単な説明】 第１図は、双導波路セルを組合せた複合装置を含む分析
装置の態様の概略平面図である。 第２図は、第１図の態様の別形の概略図である。 第３図は、更にもう一つの態様の概略図である。 第４図は、導波路が接触している別の媒体（分析溶液）
の屈折率ｎ２より大きい屈折率ｎｌの媒体（導波路）に
おける全反射光の伝播の説明図である。 第５図は、第４図に付帯して、疎なる媒体（分析溶液）
におけるエパネッセント波成分の透過の概略説明図であ
る。 第６図は、本発明に従って導波路を用いる間に起こる現
象の概略説明図である。 第７図は、前述の説明に従って分析を行なう時の応答曲
線を示すグラフである。 第８図は、ヘモグロビンの存在下での血液成分ＨｂＡ１
ｃの分析における典型的応答曲線を示すグラフである。 １．２・・・ビーム、４，５・・・試料物質、６，７３
゜９３．９４・・・光源、９・・・モノクロメータ−１
１１・・・前置増幅器、１２・・・マイクロコンピュー
タ、１３・・・マイクロプロセッサ、１４・・・印字装
置、１５・・・記憶装置、１９・・・フォトダイオード
、５ｏ。 ７０．９０・・・双導波路セル、５１．５２，７１゜７
２・・・壁、、５５．５６・・・ビーム、５７・・・回
転チョッパー鏡、５８’、５９．７４．７５．７９．８
０゜９８・・・鏡、６２．７８，９７・・・検出器、７
６・・・チョッノ４’−ｍ、７’ｔ・・・ウィンドーホ
ール、９５゜９６・・・ビームスプリッタ−１１００・
・・）ＩｂＡ１゜に特有の抗体、１０１・・・励Ａ、ｃ
１１０２・・・阻止剤、１０３・・・Ｔ（ｂＡｏ　、１
０４・・・タンノ４り５ｇ。 以下３白 〜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
＼リ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　罰
（％駐助Ｗ票 （％資田Ｗ軒 手続補正書（方式） 昭和６１年３月ｌコ　ロ 特、１１庁長官宇賀道部殿“ ■、　車外の表示 昭和６０年特許願第２７６１４５号 ２、−年明の名称 光学的；容シα分析ユニツ１〜 ３、　　ｌ′ｌＩｉ正をする者 事１′トとの関係　　　特許出願人 ？Ｊ１ホ　バテルメモリアルインスティチュー１〜４代
理人 （１所　〒１０５東京都港区虎）門−丁目８番１０号５
、　補正命令の日１・１ ６、補正の対象 明細書 ７、補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし） ８、添附書類の目録 浄書明細書　　　　　　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分析される溶液を保持するためのキュベットとこの
   溶液に接触する光導波路手段とを含み、前記光導波路手
   段を通って伝播する光信号と分析される前記溶液中の分
   析対象物の間の相互作用が所望の分析データを与える、
   光学的に溶液の分析を行なう装置であって、前記光導波
   路手段がおのおの独自の光学信号を用いる少くとも二つ
   の独立に操作される導波路部材を含むことを特徴とする
   光学的溶液分析ユニット。 ２、前記光学的に独立な導波路部材が前記キュベットの
   少くとも二つの壁から成り、前記壁が等しいか又は異な
   る屈折率の材料から作られることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載のユニット。 ３、前記壁が対面する関係にあること、及びこのキュベ
   ットの厚さ、すなわち前記導波路の独立部材として働く
   当該壁の間の距離が１０〜１０００μｍの桁であり、互
   いに非常に接近した前記壁を有することに起因して、分
   析溶液に対する吸い出し毛管効果のために、該キュベッ
   トを試料採取器としても使用することができることを特
   徴とする特許請求の範囲第２項記載のユニット。 ４、前記相互作用が当該導波路中を伝播する光信号のエ
   バネッセント波成分の、溶液のバルクとの、及び／又は
   導波路に付着したそれに特有の反応物による前記溶液中
   の前記分析対象物の結合に起因する複合物との相互作用
   であり、前記溶液中の少くとも二つのパラメーターの光
   学的手段による複合的測定用の、 ａ）少くとも一つの光ビームを発生し、且つそれを前記
   導波路の適当な入力端に入射するための少くとも一つの
   光源手段、 ｂ）前記導波路の少くとも一つの出口から出る光信号を
   集め、且つ前記相互作用に対応する電気信号を発生する
   ための少くとも一つの光検出手段、ｃ）前記電気信号を
   処理し、且つ所望の前記測定に関する適当な読出しを提
   供するための少くとも一つの計算処理手段、 を含む装置において使用される、前記特定の反応物がお
   のおの前記導波路操作部材の一つに伴われることを特徴
   とする特許請求の範囲第１、２又は３項記載のユニット
   。 ５、前記部材の少くとも一つが露出しているか又は前記
   分析対象物の結合が阻止薬剤によって阻止されているか
   のいずれかであり、その未被覆の又は阻止された部材が
   前記溶液のバルクに敏感であることを特徴とする特許請
   求の範囲第４項記載のユニット。 ６、前記光源手段が光信号を双導波路のおのおのの構成
   部材に択一的に入射するためのチョッパー手段を含む特
   許請求の範囲第４項記載のユニット。 ７、前記チョッパー手段が回転式鏡かチョッパー盤のい
   ずれかである特許請求の範囲第６項記載のユニット。 ８、前記光源手段が独立した交互に閃光を発する二つの
   光源を含み、その出力がビーム分割手段を経て前記部材
   のそれぞれの光学端に焦点を合わされ、且つ前記部材の
   他端が全反射するように作られていて、前記部材によっ
   て伝播される光信号がその中を前後両方向に伝播される
   特許請求の範囲第４項記載のユニット。