JPH0641912B2 - 光学的免疫検定装置 - Google Patents
光学的免疫検定装置Info
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- JPH0641912B2 JPH0641912B2 JP60276145A JP27614585A JPH0641912B2 JP H0641912 B2 JPH0641912 B2 JP H0641912B2 JP 60276145 A JP60276145 A JP 60276145A JP 27614585 A JP27614585 A JP 27614585A JP H0641912 B2 JPH0641912 B2 JP H0641912B2
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
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- G01N21/03—Cuvette constructions
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- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、溶液中の分析対象物を測定するための、特に
免疫検定式の反応により生物活性の分析対象物を測定す
るための装置に用いることができる分析用キュベット及
び光導波路手段を含む複合装置又は集合体に関する。
免疫検定式の反応により生物活性の分析対象物を測定す
るための装置に用いることができる分析用キュベット及
び光導波路手段を含む複合装置又は集合体に関する。
（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点） 光ファイバーの芯にある化学的分析対象の吸着を光学的
に測定することができる光ファイバー製探針を含む分析
装置は知られている。この技術は、試験溶液中の照明さ
れた光学的導波路の浸漬に基礎を置くものであり、その
光学的導波路は、例えばファイバーの芯の屈折率よりも
小さい屈析率であるクラッド層が取り除かれた光ファイ
バーであって、それにより導波路に沿って伝播する光信
号のエバネッセント波成分と溶液中の決定されるべき分
析対象物との間に相互作用が起こる。この方法は、ファ
イバーの直ぐ近くの、すなわちエバネッセント波成分の
及ぶ範囲内（数十又は数百nm）の反応区域において起こ
ることを測定することについて特に興味深い。これは、
探針表面に吸着又は付着した結合反応の第一成分と、試
料溶液中に溶解した第二成分との反応に基づく反応の場
合にそうである。
に測定することができる光ファイバー製探針を含む分析
装置は知られている。この技術は、試験溶液中の照明さ
れた光学的導波路の浸漬に基礎を置くものであり、その
光学的導波路は、例えばファイバーの芯の屈折率よりも
小さい屈析率であるクラッド層が取り除かれた光ファイ
バーであって、それにより導波路に沿って伝播する光信
号のエバネッセント波成分と溶液中の決定されるべき分
析対象物との間に相互作用が起こる。この方法は、ファ
イバーの直ぐ近くの、すなわちエバネッセント波成分の
及ぶ範囲内（数十又は数百nm）の反応区域において起こ
ることを測定することについて特に興味深い。これは、
探針表面に吸着又は付着した結合反応の第一成分と、試
料溶液中に溶解した第二成分との反応に基づく反応の場
合にそうである。
このような方式の測定に適当する装置は、最近では次の
参照文献に開示されている、すなわち、WO-84/00817、U
SP-4,447,546（ヒルシュフェルド(Hirschfeld)等）、GB
-2,103,786（ICI社）、アンドレード、（J.D.Andrade）
等のもの（アプライド・オプティクス（Applied optic
s）第２３巻、第１１号、１８１２〜１８１５ページ（1
984））、WO-A-8100912（バックルス(Buckles)）、US-A
-4,050,895（ハーディ(Hardy)等）、US-A-3,939,350
（クロニック(Kronick)等）である。
参照文献に開示されている、すなわち、WO-84/00817、U
SP-4,447,546（ヒルシュフェルド(Hirschfeld)等）、GB
-2,103,786（ICI社）、アンドレード、（J.D.Andrade）
等のもの（アプライド・オプティクス（Applied optic
s）第２３巻、第１１号、１８１２〜１８１５ページ（1
984））、WO-A-8100912（バックルス(Buckles)）、US-A
-4,050,895（ハーディ(Hardy)等）、US-A-3,939,350
（クロニック(Kronick)等）である。
最近では、分析対象物とそれに特有の反応物との反応に
おけるパラメーターを測定するための、前記反応が導波
路（例えば１片の光ファイバーの芯）の表面で起り、そ
してそれの光学的性質の検出できる変化を引き起す装置
が開示されており（EP-A-75353参照）、そしてそれは、
光源と、その光源からの信号を前記導波路の入力端に入
射するための手段と、それを通って伝播する時に変化を
受けてそれから発生し、そしてそれを電気信号に変換す
る光信号を検出するための検出手段と、前記信号を前記
反応に関係する有用なデータへと処理するための手段と
を含む。この装置は、下記のものを含む。
おけるパラメーターを測定するための、前記反応が導波
路（例えば１片の光ファイバーの芯）の表面で起り、そ
してそれの光学的性質の検出できる変化を引き起す装置
が開示されており（EP-A-75353参照）、そしてそれは、
光源と、その光源からの信号を前記導波路の入力端に入
射するための手段と、それを通って伝播する時に変化を
受けてそれから発生し、そしてそれを電気信号に変換す
る光信号を検出するための検出手段と、前記信号を前記
反応に関係する有用なデータへと処理するための手段と
を含む。この装置は、下記のものを含む。
a) 導波路。これの主要部分は、測定される液体分析対
象物を保持するための容器すなわちキュベットを貫通し
ており、その液に浸された導波路の露出表面は、操作の
前に、その液に溶解されており、そして測定されるべき
分析対象物の特定な結合剤の薄膜で被覆される。導波路
とキュベットの集合体は、装置の試験探針を構成する。
象物を保持するための容器すなわちキュベットを貫通し
ており、その液に浸された導波路の露出表面は、操作の
前に、その液に溶解されており、そして測定されるべき
分析対象物の特定な結合剤の薄膜で被覆される。導波路
とキュベットの集合体は、装置の試験探針を構成する。
b) 光源、コリメーティング、レンズ、環状開口部、及
び光源から発し、そして探針ファイバー中の多重反射に
よる光ビームの伝播を保証するために、選ばれた角度で
導びかれるビームを導波路に入射するための焦点レン
ズ。
び光源から発し、そして探針ファイバー中の多重反射に
よる光ビームの伝播を保証するために、選ばれた角度で
導びかれるビームを導波路に入射するための焦点レン
ズ。
c) 開示された装置は更に、芯の出力端からの出口光信
号を電気信号に変換するための主検出器、その検出器か
らの信号を処理するための増幅及び演算回路、そして最
後に所望の読出し出力を提供する表示装置を含む。
号を電気信号に変換するための主検出器、その検出器か
らの信号を処理するための増幅及び演算回路、そして最
後に所望の読出し出力を提供する表示装置を含む。
測定されるべき化学反応を行なうための、以前に開示さ
れた導波路とキュベットとの集合体は、従来満足に働い
ているとはいえ、より速く組立てられ、操作がより簡単
で、分析溶液の二つ以上のパラメーターについての情報
をほぼ同時に供給することができる他の方式を提供する
のが望ましいことが分った。
れた導波路とキュベットとの集合体は、従来満足に働い
ているとはいえ、より速く組立てられ、操作がより簡単
で、分析溶液の二つ以上のパラメーターについての情報
をほぼ同時に供給することができる他の方式を提供する
のが望ましいことが分った。
（問題点を解決するための手段及び作用効果） 本発明が提供するのは、 単一試料のうちの二つ以上の成分を分析するための免疫
検定装置であり、 (a) 液体試料を入れるための保持手段、 (b) 光信号の伝播を可能にするための少なくとも二つ
の独立した光導波路手段、 (c) これらの導波路手段のそれぞれに入力の光信号を
供給するための光源手段、 (d) 前記導波路手段からの出力の光信号を集め、そし
てそれらに対応する電気信号を発生するための検出手
段、及び (e) この検出手段からの前記電気信号を受取りそして
処理するための分析手段、 を含んでなる装置であって、前記導波路手段のそれぞれ
が前記保持手段の一部を形成していて、当該導波路手段
の表面が当該試料に露出されるようになっており、そし
て前記露出される導波路表面のうちの少なくとも一つに
試料から分析しようとする成分に特有の反応物が被覆さ
れる免疫検定装置である。この装置の一つの態様を、そ
れらの変形も同様に組み入れられている装置と共に、添
付図面を参照して記述することにする。
検定装置であり、 (a) 液体試料を入れるための保持手段、 (b) 光信号の伝播を可能にするための少なくとも二つ
の独立した光導波路手段、 (c) これらの導波路手段のそれぞれに入力の光信号を
供給するための光源手段、 (d) 前記導波路手段からの出力の光信号を集め、そし
てそれらに対応する電気信号を発生するための検出手
段、及び (e) この検出手段からの前記電気信号を受取りそして
処理するための分析手段、 を含んでなる装置であって、前記導波路手段のそれぞれ
が前記保持手段の一部を形成していて、当該導波路手段
の表面が当該試料に露出されるようになっており、そし
て前記露出される導波路表面のうちの少なくとも一つに
試料から分析しようとする成分に特有の反応物が被覆さ
れる免疫検定装置である。この装置の一つの態様を、そ
れらの変形も同様に組み入れられている装置と共に、添
付図面を参照して記述することにする。
本質の光学的部材が第１図に図式化される装置は、双導
波路部材のセル５０を含み、これらの主要壁５１及び５
２が二つの光導波路部材を構成し、光源６から発する励
起信号を伝播する。このキュベットの内壁は、セル５０
に入れられた分析対象溶液と接触している。キュベット
の特別に成形されたこの壁は、通常の方法によって、例
えば透明プラスチック（例えばルーサイト（商品名））
の成形によって供給することができ、或はこれらはガラ
ス、好ましくは光学等級のガラスから作ることができ
る。キュベットの幅、すなわち壁５１と５２との間の間
隔は、分析するのに十分な量の分析対象物の保持量に応
じていろいろであるが、この幅は数mm又は１mmより小さ
い（例えば１０〜1000μｍ）であることができ、その場
合にはキュベットは、互いに非常に接近して配置された
壁による毛管効果のために、試料採取器としても働くこ
とができる。
波路部材のセル５０を含み、これらの主要壁５１及び５
２が二つの光導波路部材を構成し、光源６から発する励
起信号を伝播する。このキュベットの内壁は、セル５０
に入れられた分析対象溶液と接触している。キュベット
の特別に成形されたこの壁は、通常の方法によって、例
えば透明プラスチック（例えばルーサイト（商品名））
の成形によって供給することができ、或はこれらはガラ
ス、好ましくは光学等級のガラスから作ることができ
る。キュベットの幅、すなわち壁５１と５２との間の間
隔は、分析するのに十分な量の分析対象物の保持量に応
じていろいろであるが、この幅は数mm又は１mmより小さ
い（例えば１０〜1000μｍ）であることができ、その場
合にはキュベットは、互いに非常に接近して配置された
壁による毛管効果のために、試料採取器としても働くこ
とができる。
光源６から発した光ビームは、回転するチョッパー鏡５
７ａ及び５７ｂによりビーム５５及び５６に択一的に分
けられる。第１図では、この鏡５７は二つの位置に表わ
されている、すなわち一つの位置は符号５７ａに対応
し、もう一つの位置（最初のそれに対しほぼ直角のとこ
ろ）は符号５７ｂに対応する。鏡５７の位置によって、
光源からのビームは、ビーム５５に反射されるか或はビ
ーム５６に伝播されるかのいずれかであることが容易に
分る。このように、光源６からの光は、それぞれ一連の
鏡（５８ａ，５８ｂ，５８ｃ）及び（５９ａ，５９ｂ，
５９ｃ）のいずれか一方によって、双導波路部材のセル
５０のいずれかの部分５１又は５２に択一的に入射され
る。導波路のいずれかの部分からの、チョッパーブレー
ドでの反射による出力光６０及び直接の出力光６１は、
それぞれその後検出器６２に集められる。
７ａ及び５７ｂによりビーム５５及び５６に択一的に分
けられる。第１図では、この鏡５７は二つの位置に表わ
されている、すなわち一つの位置は符号５７ａに対応
し、もう一つの位置（最初のそれに対しほぼ直角のとこ
ろ）は符号５７ｂに対応する。鏡５７の位置によって、
光源からのビームは、ビーム５５に反射されるか或はビ
ーム５６に伝播されるかのいずれかであることが容易に
分る。このように、光源６からの光は、それぞれ一連の
鏡（５８ａ，５８ｂ，５８ｃ）及び（５９ａ，５９ｂ，
５９ｃ）のいずれか一方によって、双導波路部材のセル
５０のいずれかの部分５１又は５２に択一的に入射され
る。導波路のいずれかの部分からの、チョッパーブレー
ドでの反射による出力光６０及び直接の出力光６１は、
それぞれその後検出器６２に集められる。
この態様の残りの構成部材は、モノクロメーター９と、
光検出器６２、前置増幅器１１、強度調節機構１２付の
光源、マイクロプロセッサ１３、印字装置１４、そして
記憶装置（フロッピディスク）１５を包含するデータ取
得及び処理用マイクロコンピュータ付の電子構成部材と
を含む。
光検出器６２、前置増幅器１１、強度調節機構１２付の
光源、マイクロプロセッサ１３、印字装置１４、そして
記憶装置（フロッピディスク）１５を包含するデータ取
得及び処理用マイクロコンピュータ付の電子構成部材と
を含む。
好ましく使用される光源６は、キセノン閃光ランプ（マ
サチューセッツ州サレム(Salem)のE.G.＆G.社製）であ
り、モノクロメーターは、凹面形のホログラィー格子
（フランス、パリのジョビン・イボン(Jobin-Yvon)社
製）によって好ましく取付けられて５nmの解像限界を可
能にした。光源６の閃光ランプは、マイクロコンピュー
タ１２により調節された。セル５０に試料を注入するた
めに、プログラマブル自動ピペット（スイス、Bonabuz
のHamilton Bonaduz AG社製Microlab-P）が好ましく使
用された。検出器６２は、光強度の変化を直接測定する
ために導波路出力端に設置された光電子増倍管（東京、
浜松社製R928）を含んだ。光電子増倍管からの信号は、
増幅され（１１で）、閃光時間の間に積分され（１２
で）、そして標準的な１２ビットのアナログ／ディジタ
ル変換器（示されていない）によりディジタル形式に変
換された。開発されたインハウス・マイクロコンピュー
タ１２は、高速で信号の平均化処理を行ない、そして全
てのデータは、モノクロメーターに設置されたフォトダ
イオード１９への参照によって閃光ランプの強度の変動
を調節した。信号は、表示及び記憶のためにアップルII
型（商品名）マイクロコンピュータ１３へ送られた。
サチューセッツ州サレム(Salem)のE.G.＆G.社製）であ
り、モノクロメーターは、凹面形のホログラィー格子
（フランス、パリのジョビン・イボン(Jobin-Yvon)社
製）によって好ましく取付けられて５nmの解像限界を可
能にした。光源６の閃光ランプは、マイクロコンピュー
タ１２により調節された。セル５０に試料を注入するた
めに、プログラマブル自動ピペット（スイス、Bonabuz
のHamilton Bonaduz AG社製Microlab-P）が好ましく使
用された。検出器６２は、光強度の変化を直接測定する
ために導波路出力端に設置された光電子増倍管（東京、
浜松社製R928）を含んだ。光電子増倍管からの信号は、
増幅され（１１で）、閃光時間の間に積分され（１２
で）、そして標準的な１２ビットのアナログ／ディジタ
ル変換器（示されていない）によりディジタル形式に変
換された。開発されたインハウス・マイクロコンピュー
タ１２は、高速で信号の平均化処理を行ない、そして全
てのデータは、モノクロメーターに設置されたフォトダ
イオード１９への参照によって閃光ランプの強度の変動
を調節した。信号は、表示及び記憶のためにアップルII
型（商品名）マイクロコンピュータ１３へ送られた。
別の態様においては（第２図参照）、装置は、先の態様
のセルと同一の、すなわち二つの独立した導波路の構成
部材として働き且つ以下に見られるように同様に作用す
る壁７１及び７２を有する、双導波路部材のセル７０を
含む。
のセルと同一の、すなわち二つの独立した導波路の構成
部材として働き且つ以下に見られるように同様に作用す
る壁７１及び７２を有する、双導波路部材のセル７０を
含む。
その装置は光源７３を含み、それの出力は、波路部材７
１及び７２の入力側のレンズ及び鏡によってそのどちら
かの側に焦点を合わされる。鏡は、番号７４と７５とで
ある。ウィンドーホール（７７）を有するチョッパー盤
７６は、入射光を構成部材７１及び７２に択一的に分配
する働きをする。導波路からの出力信号は、その後鏡７
９及び８０によって検出器７８に向けられる。
１及び７２の入力側のレンズ及び鏡によってそのどちら
かの側に焦点を合わされる。鏡は、番号７４と７５とで
ある。ウィンドーホール（７７）を有するチョッパー盤
７６は、入射光を構成部材７１及び７２に択一的に分配
する働きをする。導波路からの出力信号は、その後鏡７
９及び８０によって検出器７８に向けられる。
第１図と第２図とに示される両方の態様において、導波
路部材の一方（５１，７１）は、特定の結合する分析対
象物、例えば分析溶液中の測定されるべき成分の特有の
抗体で、結合反応により被覆され（ここに開示されるよ
うに）、一方で別の部材（５１，７２）は未被覆のまま
にしておかれる。ここで、「未被覆」は抗体のない表面
を指すものとする。しかしながら、この表面のタンパク
質吸着部位は、その表面に代りの非反応性又は非結合性
タンパク質（例えばウシ血清アルブミン(BSA)を吸着す
ることによって通常はふさがれる。従って分析の間、未
被覆の区域の出力側の信号は、分析溶液のバルクと励起
ビームとの相互作用を反映する。しかしながら、（交互
に、同時に又はほぼ同時に）導波路の被覆側から現われ
る信号は、セルのこの側の内面に被覆された特定の反応
物と結合している成分に関する必要情報を提供する。こ
れは、この明細書の例を参照してより詳細に説明され
る。今は、この種の導波路方式（双部材式）は、その導
波路の別々の部材からの二種類の情報を集めることを可
能にすると言えば十分である。明らかに、この態様にお
ける検出器の出力信号は、前の態様に関して開示された
ように、その後処理されそして読取りデータに変換され
る。変形して、導波路部材５１と５２又は７１と７２
は、分析溶液中のある特定の分析対象物におのおの特有
の異なる抗体で被覆することができ、この変形において
分析結果は、そのとき導波路のおのおの別々の部材上の
前記抗体によって結合されている二つの前記分析対象物
に関係づけられる。
路部材の一方（５１，７１）は、特定の結合する分析対
象物、例えば分析溶液中の測定されるべき成分の特有の
抗体で、結合反応により被覆され（ここに開示されるよ
うに）、一方で別の部材（５１，７２）は未被覆のまま
にしておかれる。ここで、「未被覆」は抗体のない表面
を指すものとする。しかしながら、この表面のタンパク
質吸着部位は、その表面に代りの非反応性又は非結合性
タンパク質（例えばウシ血清アルブミン(BSA)を吸着す
ることによって通常はふさがれる。従って分析の間、未
被覆の区域の出力側の信号は、分析溶液のバルクと励起
ビームとの相互作用を反映する。しかしながら、（交互
に、同時に又はほぼ同時に）導波路の被覆側から現われ
る信号は、セルのこの側の内面に被覆された特定の反応
物と結合している成分に関する必要情報を提供する。こ
れは、この明細書の例を参照してより詳細に説明され
る。今は、この種の導波路方式（双部材式）は、その導
波路の別々の部材からの二種類の情報を集めることを可
能にすると言えば十分である。明らかに、この態様にお
ける検出器の出力信号は、前の態様に関して開示された
ように、その後処理されそして読取りデータに変換され
る。変形して、導波路部材５１と５２又は７１と７２
は、分析溶液中のある特定の分析対象物におのおの特有
の異なる抗体で被覆することができ、この変形において
分析結果は、そのとき導波路のおのおの別々の部材上の
前記抗体によって結合されている二つの前記分析対象物
に関係づけられる。
もう一つ別の態様を第３図に示す。この変形において、
前述のセル５０及び７０と同じ全体的形状の双導波路部
材のセル９０が使用されるが、それらとの違いは、その
終端９１ａ及び９２ａが、例えば鏡の場合におけるよう
に金属被覆（鏡又はアルミニウム）によって、実際的に
反射性にされることである。従って、光を伝える部材で
ある導波路のもう一方の先端９１ｂ及び９２ｂは、それ
ぞれ同時に入力端及び出力端として働く。これは、二つ
の光源９３及び９４により供給される励起ビームの進路
によって説明され、それらはビームスプリッター９５及
び４９をそれぞれ横切った後に、それぞれ先端９１ｂ及
び９２ｂに向けられる。このように、先端９１ｂ及び９
２ｂを通過する光は、最初は前方に、そして次には終端
９１ａ及び９２ａから反射された後で逆方向に、導波路
を通って伝播する。この形状は、分析対象物による励起
光線の相互作用容量が前に開示された態様と比べて実際
に２倍であることを可能にする。この変形は、９１ｂ及
び９２ｂから出、そしてビームスプリッター９５及び９
６と三角形の鏡９８とによってそれへ向けられる逆方向
の信号を集めるための検出器９７を更に含む。光源９３
及び９４、例えば発光ダイオード(LED)は、導波路の先
端９１ｂ及び９２ｂから出るパルス信号が検出器９７に
同時には来なくするために、当該技術分野において知ら
れている方法によって交互に同期される。当然ながら、
三つ以上の導波路部材を有する他の型式のキュベット−
導波路ユニットも可能であって、例えば対面する導波路
として働く壁に加えて光ファイバーの導波路を含むキュ
ベットである。従って、ユニット内で一緒に操作する独
立な導波路部材の合計数で、２よりも大きい、溶液のパ
ラメーターに対応する数を、同時に（又はほとんど同時
に）調べることができる。
前述のセル５０及び７０と同じ全体的形状の双導波路部
材のセル９０が使用されるが、それらとの違いは、その
終端９１ａ及び９２ａが、例えば鏡の場合におけるよう
に金属被覆（鏡又はアルミニウム）によって、実際的に
反射性にされることである。従って、光を伝える部材で
ある導波路のもう一方の先端９１ｂ及び９２ｂは、それ
ぞれ同時に入力端及び出力端として働く。これは、二つ
の光源９３及び９４により供給される励起ビームの進路
によって説明され、それらはビームスプリッター９５及
び４９をそれぞれ横切った後に、それぞれ先端９１ｂ及
び９２ｂに向けられる。このように、先端９１ｂ及び９
２ｂを通過する光は、最初は前方に、そして次には終端
９１ａ及び９２ａから反射された後で逆方向に、導波路
を通って伝播する。この形状は、分析対象物による励起
光線の相互作用容量が前に開示された態様と比べて実際
に２倍であることを可能にする。この変形は、９１ｂ及
び９２ｂから出、そしてビームスプリッター９５及び９
６と三角形の鏡９８とによってそれへ向けられる逆方向
の信号を集めるための検出器９７を更に含む。光源９３
及び９４、例えば発光ダイオード(LED)は、導波路の先
端９１ｂ及び９２ｂから出るパルス信号が検出器９７に
同時には来なくするために、当該技術分野において知ら
れている方法によって交互に同期される。当然ながら、
三つ以上の導波路部材を有する他の型式のキュベット−
導波路ユニットも可能であって、例えば対面する導波路
として働く壁に加えて光ファイバーの導波路を含むキュ
ベットである。従って、ユニット内で一緒に操作する独
立な導波路部材の合計数で、２よりも大きい、溶液のパ
ラメーターに対応する数を、同時に（又はほとんど同時
に）調べることができる。
前の部分で開示された装置の使用法は、後の部分に用意
されたように血液試料の分析により説明することができ
る。
されたように血液試料の分析により説明することができ
る。
実際に、血液試料におけるヘモグロビン、及びグリコシ
ル化されたヘモグロビンのような種々の他のヘモグロビ
ン因子の、試料中の全ヘモグロビンを基準とする直接測
定は、所望されるなら、非常に重要な医療試験を構成す
る。グリコシル化されたヘモグロビン（HbA1a，Ａ1b，
及びＡ1c）は、糖尿病患者の診断と検査にとって重要な
因子である。全ヘモグロビン（HbA0、すなわちグリコシ
ル化されていないヘモグロビン及びグリコシル化された
ヘモグロビン）に関するHbA1c（これはグリコシル化さ
れたヘモグロビン（HbA1）全体の約８０％に達する）の
含有量の決定は、その疾患に関して特に重要である。
ル化されたヘモグロビンのような種々の他のヘモグロビ
ン因子の、試料中の全ヘモグロビンを基準とする直接測
定は、所望されるなら、非常に重要な医療試験を構成す
る。グリコシル化されたヘモグロビン（HbA1a，Ａ1b，
及びＡ1c）は、糖尿病患者の診断と検査にとって重要な
因子である。全ヘモグロビン（HbA0、すなわちグリコシ
ル化されていないヘモグロビン及びグリコシル化された
ヘモグロビン）に関するHbA1c（これはグリコシル化さ
れたヘモグロビン（HbA1）全体の約８０％に達する）の
含有量の決定は、その疾患に関して特に重要である。
ヘモグロビンＡ1cは、HbA0のものと同じアミノ酸構造を
有するグリコヘモグロビンであり、重要な差異は、HbA
1cのβ鎖のＮ末端バリンに2,3−ジホスホグリセリン酸
ポケットで付いた１−アミノ−１−デオキシフルクトー
スの存在である。HbA0のHbA1cへの変化は、連続性の非
酵素型翻訳後プロセスであり、その速度は血液中のグル
コース濃度の関数である。グリコシル化は、二段階プロ
セスとして起こる。まず第一に、開環したアルデヒド形
のグルコースがHbのβ環の末端アミノ基と反応してシッ
フ塩基を生ずる。第二に、そのシッフ塩基が次にアマド
リ転位してHbA1cを生ずる。中間体のシッフ塩基は、安
定なHbA1cのケトアミンよりも６０倍大きな解離する性
質（遊離の糖質とタンパク質とに）のために不安定であ
る。わずかに少量（およそ１０-6％）の血糖が開環した
アルデヒド形であり、またケトアミン生成速度が遅い
（効果的に不可逆的ではあるけれども）ので、HaA1cの
生成は長期の血糖濃縮を必要とする。ヒト赤血球の１２
０日の寿命の間に、グリコシル化されたHb分子数は、平
均血糖濃度に比例して増加する。血漿中の平均グルコー
ス濃度とHbA1cの濃度との関係は、単一のHbA1の消失の
測定が、それに先立つ６〜８週間にわたる血糖調節の遡
及的評価を提供する点において独特である。HbA1c測定
が、炭水化物代謝の患者、特に真性糖尿病患者の検査に
非常に有用な方法であることは一般的に容認される。糖
尿病患者は、長期の高い血糖レベルを示し、そしてこれ
はその患者のHbA1cレベルに反映される。正常な成人
は、全ヘモグロビンの約３〜６％のHbA1cを有するが、
これに反して糖尿病に罹患した年少者及び成人における
そのHbA1cの範囲は６〜１５％である。HbA1c濃度の同様
な増加は、遺伝学的に及び化学的に誘発された糖尿病の
マウスにおいて、そして膵切除された犬において認めら
れている。
有するグリコヘモグロビンであり、重要な差異は、HbA
1cのβ鎖のＮ末端バリンに2,3−ジホスホグリセリン酸
ポケットで付いた１−アミノ−１−デオキシフルクトー
スの存在である。HbA0のHbA1cへの変化は、連続性の非
酵素型翻訳後プロセスであり、その速度は血液中のグル
コース濃度の関数である。グリコシル化は、二段階プロ
セスとして起こる。まず第一に、開環したアルデヒド形
のグルコースがHbのβ環の末端アミノ基と反応してシッ
フ塩基を生ずる。第二に、そのシッフ塩基が次にアマド
リ転位してHbA1cを生ずる。中間体のシッフ塩基は、安
定なHbA1cのケトアミンよりも６０倍大きな解離する性
質（遊離の糖質とタンパク質とに）のために不安定であ
る。わずかに少量（およそ１０-6％）の血糖が開環した
アルデヒド形であり、またケトアミン生成速度が遅い
（効果的に不可逆的ではあるけれども）ので、HaA1cの
生成は長期の血糖濃縮を必要とする。ヒト赤血球の１２
０日の寿命の間に、グリコシル化されたHb分子数は、平
均血糖濃度に比例して増加する。血漿中の平均グルコー
ス濃度とHbA1cの濃度との関係は、単一のHbA1の消失の
測定が、それに先立つ６〜８週間にわたる血糖調節の遡
及的評価を提供する点において独特である。HbA1c測定
が、炭水化物代謝の患者、特に真性糖尿病患者の検査に
非常に有用な方法であることは一般的に容認される。糖
尿病患者は、長期の高い血糖レベルを示し、そしてこれ
はその患者のHbA1cレベルに反映される。正常な成人
は、全ヘモグロビンの約３〜６％のHbA1cを有するが、
これに反して糖尿病に罹患した年少者及び成人における
そのHbA1cの範囲は６〜１５％である。HbA1c濃度の同様
な増加は、遺伝学的に及び化学的に誘発された糖尿病の
マウスにおいて、そして膵切除された犬において認めら
れている。
血液中のグリコシル化されたHbを測定する数種類の方法
の中で、HbA1及び特にHbA1cの測定は、今や糖尿病患の
治療を検査するために選択される方法になった（ジョヴ
ァノヴィック（L.Jovanovic）等、アメリカ医学誌（Ame
rican J.of Medicgne）（１９８１）第７０巻，３３１
頁；ゴールドスタイン（D.E.Goldstein）等、糖尿病（D
iabetes）（１９８２）第３１巻，７０頁；ガボイ（K.
H.Gabboy）等、臨床内分泌学及び代謝誌（J.of Clinica
l Endocrinology and metabolism）（１９７７）第４４
巻，８５９頁；ゴーネン（B.Gonen）等、糖尿病学（Dia
betologia）（１９７８）第１５巻，１頁；ピーターソ
ン（C.M.Peterson）、糖尿病（１９８２）第３１巻，１
頁）。そして更に、次の特許文献を有用なものとして挙
げることができる。すなわち、US-A-4,247,553、GB-A-
1,580,318、US-A-4,222,836、US-4,372,747、US-4,200,
435、US-4,341,635である。これらの方法は、グリコシ
ル化されていないHbからグリコシル化されたHbを分離す
るのに使用される機構により容易に分類できる。例え
ば、イオン交換クロマトグラフィーは初期に使用され、
そして今でも最も一般的方法である（カンケル（H.G.Ku
nkel）等、サイエンス（１９５５）第１２２巻，２８８
頁）。このようなイオン交換技術は、特にHbA1cを測定
する現在唯一の有効な方法であるが、それは多数の制限
を有し、それの温度とpH感度とは最も重要である。その
上、不安定なグリコシル化されたHb（プレーHbA1c）が
分析より前に取り除かれねばならず、そしてその結果と
して胎児ヘモグロビン（HbF）と鎌状赤血球ヘモグロビ
ン（HbS）が妨害するので、イオン交換は妨害を受けや
すい。
の中で、HbA1及び特にHbA1cの測定は、今や糖尿病患の
治療を検査するために選択される方法になった（ジョヴ
ァノヴィック（L.Jovanovic）等、アメリカ医学誌（Ame
rican J.of Medicgne）（１９８１）第７０巻，３３１
頁；ゴールドスタイン（D.E.Goldstein）等、糖尿病（D
iabetes）（１９８２）第３１巻，７０頁；ガボイ（K.
H.Gabboy）等、臨床内分泌学及び代謝誌（J.of Clinica
l Endocrinology and metabolism）（１９７７）第４４
巻，８５９頁；ゴーネン（B.Gonen）等、糖尿病学（Dia
betologia）（１９７８）第１５巻，１頁；ピーターソ
ン（C.M.Peterson）、糖尿病（１９８２）第３１巻，１
頁）。そして更に、次の特許文献を有用なものとして挙
げることができる。すなわち、US-A-4,247,553、GB-A-
1,580,318、US-A-4,222,836、US-4,372,747、US-4,200,
435、US-4,341,635である。これらの方法は、グリコシ
ル化されていないHbからグリコシル化されたHbを分離す
るのに使用される機構により容易に分類できる。例え
ば、イオン交換クロマトグラフィーは初期に使用され、
そして今でも最も一般的方法である（カンケル（H.G.Ku
nkel）等、サイエンス（１９５５）第１２２巻，２８８
頁）。このようなイオン交換技術は、特にHbA1cを測定
する現在唯一の有効な方法であるが、それは多数の制限
を有し、それの温度とpH感度とは最も重要である。その
上、不安定なグリコシル化されたHb（プレーHbA1c）が
分析より前に取り除かれねばならず、そしてその結果と
して胎児ヘモグロビン（HbF）と鎌状赤血球ヘモグロビ
ン（HbS）が妨害するので、イオン交換は妨害を受けや
すい。
他の先行技術は、寒天ゲル電気泳動（メナード（L.Mena
rd）等、臨床化学（Clinical Chemistry）（１９８０）
第２６巻、１５９８頁）、等電点電気泳動（スパイサー
（K.M.Spicer）等、糖尿病（１９７８）第２７巻、３８
４頁）、例えばチオバルビツール酸を用いる比色分析
（フルキガー（R.Fluckiger）等、FEBSレター（１９７
６）第７１巻、３５６頁）及びアフィニティークロマト
グラフィー（ポーリオティス（V.Bouriotis）等、糖尿
病学（１９８１）第２１巻、５７９頁）を含む。放射線
免疫検定法は、一つだけ報告されており（ジャヴィッド
（J.Javid）等、英国血液液学誌（British J.of Haemat
ology（１９７８）第３８巻、３２９頁）、それは放射
性同位体により標識されたHbA1cの調製が必要なので、
遅く（使用するのに３日より更にかかる）そして技術的
に複雑であった。先行技術の方法は長所を有してはいる
けれども、迅速な結果（およそ１５分よりも短い）を提
供し、熟練技手を必要としない、そして日常的に費用が
かからずに行なわれる方法の必要がない存在する。現行
技術の方法は、遅く（典型的には１時間以上後に結果が
得られる）、技術的に複雑で（ピペットを使用する５回
以上の操作段階を必要とする）、そして実験室環境外で
の試験に適さない。更に、現在の方法は、全ヘモグロビ
ンがグリコシル化された因子とは独立に測定されること
を必要とし、そこで両方の分析データが実質的に一緒に
測定されそして遅れなしに補正され得ることが望まれ
た。
rd）等、臨床化学（Clinical Chemistry）（１９８０）
第２６巻、１５９８頁）、等電点電気泳動（スパイサー
（K.M.Spicer）等、糖尿病（１９７８）第２７巻、３８
４頁）、例えばチオバルビツール酸を用いる比色分析
（フルキガー（R.Fluckiger）等、FEBSレター（１９７
６）第７１巻、３５６頁）及びアフィニティークロマト
グラフィー（ポーリオティス（V.Bouriotis）等、糖尿
病学（１９８１）第２１巻、５７９頁）を含む。放射線
免疫検定法は、一つだけ報告されており（ジャヴィッド
（J.Javid）等、英国血液液学誌（British J.of Haemat
ology（１９７８）第３８巻、３２９頁）、それは放射
性同位体により標識されたHbA1cの調製が必要なので、
遅く（使用するのに３日より更にかかる）そして技術的
に複雑であった。先行技術の方法は長所を有してはいる
けれども、迅速な結果（およそ１５分よりも短い）を提
供し、熟練技手を必要としない、そして日常的に費用が
かからずに行なわれる方法の必要がない存在する。現行
技術の方法は、遅く（典型的には１時間以上後に結果が
得られる）、技術的に複雑で（ピペットを使用する５回
以上の操作段階を必要とする）、そして実験室環境外で
の試験に適さない。更に、現在の方法は、全ヘモグロビ
ンがグリコシル化された因子とは独立に測定されること
を必要とし、そこで両方の分析データが実質的に一緒に
測定されそして遅れなしに補正され得ることが望まれ
た。
本発明に開示された装置によって行なうことのできる方
法は、先行技術の方法の不便を改善し、そして血液中の
二つ以上のパラメーターをほとんど同時に測定すること
を可能にし、それは更に所望ならば、一つのパラメータ
ー（例えばグリコシル化された因子又は他のヘモグロビ
ン因子）のもう一つのパラメーター（例えば全ヘモグロ
ビン）に関する百分率を直接与えることの有利を提供す
る。
法は、先行技術の方法の不便を改善し、そして血液中の
二つ以上のパラメーターをほとんど同時に測定すること
を可能にし、それは更に所望ならば、一つのパラメータ
ー（例えばグリコシル化された因子又は他のヘモグロビ
ン因子）のもう一つのパラメーター（例えば全ヘモグロ
ビン）に関する百分率を直接与えることの有利を提供す
る。
この実例となる方法は、HbA1c，Ａ1a又はＡ1bに特有の
抗体を精製された形で入手できるならば、このような分
析対象物の別々な測定を提供する。言い換えれば、より
少ない特定な抗体の使用により、本方法は、ひとまとめ
にして取り扱われる二つ以上の血液因子の、すなわち例
として全Hbに関係する全てのグリコシル化されたHbの並
行する測定を提供する。もちろん、もし複合体生成反応
における前記因子に対応する特定の結合剤が入手可能で
あるならば、この方法はまた上記の血液因子以外の血液
因子の測定方法を提供する（例えば、HbF、HbS又はその
他のヒトヘモグロビン因子）。
抗体を精製された形で入手できるならば、このような分
析対象物の別々な測定を提供する。言い換えれば、より
少ない特定な抗体の使用により、本方法は、ひとまとめ
にして取り扱われる二つ以上の血液因子の、すなわち例
として全Hbに関係する全てのグリコシル化されたHbの並
行する測定を提供する。もちろん、もし複合体生成反応
における前記因子に対応する特定の結合剤が入手可能で
あるならば、この方法はまた上記の血液因子以外の血液
因子の測定方法を提供する（例えば、HbF、HbS又はその
他のヒトヘモグロビン因子）。
この方法は、そのような特に反応性の結合体の片方（単
クローン性又は多クローン性抗体）の入手又は調製には
関係しないが、本発明のユニットによって分析される血
液試料と接触する活性導波路の準備において、被覆物質
としてそれらを使用することに関係する。
クローン性又は多クローン性抗体）の入手又は調製には
関係しないが、本発明のユニットによって分析される血
液試料と接触する活性導波路の準備において、被覆物質
としてそれらを使用することに関係する。
ここで使用される光学技術は、これまで述べたように、
主として光の吸収に関係する、すなわち導波路の一つの
操作部材中を伝播されるエバネッセント波成分と、第一
に周囲の液中の分子との、そして第二に、導波路の操作
上別個のもう一方の部材の表面に前もって被覆された特
定の複合体の片方（抗体）と測定されるべき血液因子と
の反応のために導波路上に層状に形成し始めるHb−抗体
複合体との、相互作用が存在する。対応する部材におけ
るエバネッセント光成分の相互作用が及ぶ距離は、その
複合体の層の厚さに実質的に限定されるので、その層状
形成物に対する光学的応答は、血液自体によるバルクの
吸着と無関係である。上記二つの相互作用は、一方の又
は他方の相互作用から発する信号を読取るための比較的
簡単な技術によって容易に識別できる。
主として光の吸収に関係する、すなわち導波路の一つの
操作部材中を伝播されるエバネッセント波成分と、第一
に周囲の液中の分子との、そして第二に、導波路の操作
上別個のもう一方の部材の表面に前もって被覆された特
定の複合体の片方（抗体）と測定されるべき血液因子と
の反応のために導波路上に層状に形成し始めるHb−抗体
複合体との、相互作用が存在する。対応する部材におけ
るエバネッセント光成分の相互作用が及ぶ距離は、その
複合体の層の厚さに実質的に限定されるので、その層状
形成物に対する光学的応答は、血液自体によるバルクの
吸着と無関係である。上記二つの相互作用は、一方の又
は他方の相互作用から発する信号を読取るための比較的
簡単な技術によって容易に識別できる。
Hb誘導体は、それらの化学的状態に依存する特有の吸着
スペクトルを有する。それゆえ、通常の吸着技術はどれ
でも、本発明を実施するのに等しく応用できる（テント
リ（L.Tentori）等、ヘモグロビン、酵素学の方法（Met
hods in Enzymology）（１９８１）、第７６巻、７０２
−７３２頁、アカデミック・プレス（Academic Pres
s）、ニューヨーク）。好ましくは４００〜６００nm、
特に４００〜４２０nm及び５５０〜６００nmの範囲で
の、シアノメトヘモグロビン法及び単一又は多波長吸光
光度分析が含まれる。そして更に、Hb分子による吸収が
酵素飽和度に関係しないイソベスティック点法のような
方法が含まれる。
スペクトルを有する。それゆえ、通常の吸着技術はどれ
でも、本発明を実施するのに等しく応用できる（テント
リ（L.Tentori）等、ヘモグロビン、酵素学の方法（Met
hods in Enzymology）（１９８１）、第７６巻、７０２
−７３２頁、アカデミック・プレス（Academic Pres
s）、ニューヨーク）。好ましくは４００〜６００nm、
特に４００〜４２０nm及び５５０〜６００nmの範囲で
の、シアノメトヘモグロビン法及び単一又は多波長吸光
光度分析が含まれる。そして更に、Hb分子による吸収が
酵素飽和度に関係しないイソベスティック点法のような
方法が含まれる。
本発明による試験の操作は、下記に従って進行する。す
なわち、光ビーム１が、屈折率が大きい方の（ｎ１＞ｎ
２）伝播媒体ｎ１からやって来て二つの伝播媒体ｎ１及
びｎ２の間の界面に角度θで突き当たる時に（第４
図）、反射角θが式で与えられ臨界角と呼ばれるある
値θｃより大きい場合には、内面全反射が起こる（ハリ
ック（N.J.Harrick）、『内面反射分光学』、ウィーリ
ー・インターサイエンス（Wiley Interscience）社、ニ
ューヨーク（１９６７））。
なわち、光ビーム１が、屈折率が大きい方の（ｎ１＞ｎ
２）伝播媒体ｎ１からやって来て二つの伝播媒体ｎ１及
びｎ２の間の界面に角度θで突き当たる時に（第４
図）、反射角θが式で与えられ臨界角と呼ばれるある
値θｃより大きい場合には、内面全反射が起こる（ハリ
ック（N.J.Harrick）、『内面反射分光学』、ウィーリ
ー・インターサイエンス（Wiley Interscience）社、ニ
ューヨーク（１９６７））。
θc＝sin-1（ｎ２／ｎ１） 反射ビームは、番号２で示される。この場合には、エバ
ネッセント波は、反射する表面を越えて屈折率ｎ２の疎
なる媒体中に波長のフラクションのオーダーの距離（ｄ
p）へ透過する。マックスウェルの式に例えば、反射面
に垂直な定常正弦波が、密なる媒体中に生ずる（第５
図）。吸収しない、疎なる媒体への正味のエネルギーの
流れはないけれども、減衰する非伝播領域３がその媒体
中に存在し、それの電界の強さ（Ｅ）は、界面において
最大（Ｅ０）であり、そして式に従って界面からの距
離（ｚ）により指数関数的に減少する。
ネッセント波は、反射する表面を越えて屈折率ｎ２の疎
なる媒体中に波長のフラクションのオーダーの距離（ｄ
p）へ透過する。マックスウェルの式に例えば、反射面
に垂直な定常正弦波が、密なる媒体中に生ずる（第５
図）。吸収しない、疎なる媒体への正味のエネルギーの
流れはないけれども、減衰する非伝播領域３がその媒体
中に存在し、それの電界の強さ（Ｅ）は、界面において
最大（Ｅ０）であり、そして式に従って界面からの距
離（ｚ）により指数関数的に減少する。
Ｅ＝Ｅ０・exp（−ｚ／ｄp） 透過距離（ｄp）は、電界の強さが界面におけるそれの
値のexp(-1)倍となるのに必要な距離として定義され、
式で与えられる。
値のexp(-1)倍となるのに必要な距離として定義され、
式で与えられる。
９０゜から始めて、θがθcに近づくにつれて、ｄpは無
限に大きくなり、そして角度が固定された場合には、屈
折率の組合せが接近するにつれて（すなわち、ｎ２／ｎ
１→１のような）増加する。そして更に、ｄpは波長に
比例するので、それはより長い波長においてより大きく
なる。
限に大きくなり、そして角度が固定された場合には、屈
折率の組合せが接近するにつれて（すなわち、ｎ２／ｎ
１→１のような）増加する。そして更に、ｄpは波長に
比例するので、それはより長い波長においてより大きく
なる。
このように、透明な導波路の屈折率ｎ１、入射角、そし
て波長の適切な選択により、ｄpを選択し、主として界
面に接近しているすなわち界面から所定の距離にある物
質４と、そして前記距離を越えるところの物質５による
光学的相互作用を調節することができる。本態様におい
ては、密なる媒体は、プラスチック又はガラス（ｎ１は
1.40〜1.60の範囲である）製の本発明の光学セルすなわ
ちキュベットの壁によって構成することができ、そして
疎なる媒体は水性血液試料（ｎ２＝1.34）であって、θ
は調節できるように変えられるので、λが可視波長から
選択された場合、ｄpは約２０〜３００nmで変わること
ができる。本発明のユニットでは、導波路部材用に使用
される異なる物質（例えばキュベットの壁）は、性質が
異なる、すなわち異なる屈折率（ｎ１）であることがで
き、従って一つの部材を伝播するエバネッセント波成分
の透過する距離は、他の部材中のそれとは違うものであ
ることができ、その結果入射信号と測定される分析対象
物との間の相互作用が、分析される溶液内の異なる距離
における領域を含むことができる。
て波長の適切な選択により、ｄpを選択し、主として界
面に接近しているすなわち界面から所定の距離にある物
質４と、そして前記距離を越えるところの物質５による
光学的相互作用を調節することができる。本態様におい
ては、密なる媒体は、プラスチック又はガラス（ｎ１は
1.40〜1.60の範囲である）製の本発明の光学セルすなわ
ちキュベットの壁によって構成することができ、そして
疎なる媒体は水性血液試料（ｎ２＝1.34）であって、θ
は調節できるように変えられるので、λが可視波長から
選択された場合、ｄpは約２０〜３００nmで変わること
ができる。本発明のユニットでは、導波路部材用に使用
される異なる物質（例えばキュベットの壁）は、性質が
異なる、すなわち異なる屈折率（ｎ１）であることがで
き、従って一つの部材を伝播するエバネッセント波成分
の透過する距離は、他の部材中のそれとは違うものであ
ることができ、その結果入射信号と測定される分析対象
物との間の相互作用が、分析される溶液内の異なる距離
における領域を含むことができる。
導波路における反射数（Ｎ）は、導波路の長さ（Ｌ）と
厚さ（Ｔ）、及び入射角（θ）の関数である。
厚さ（Ｔ）、及び入射角（θ）の関数である。
Ｎ＝Ｌ／Ｔ・cotθ ここで使用された導波路では、別々の高さのビームにつ
いての全反射数は、約３０〜５０に変化した。
いての全反射数は、約３０〜５０に変化した。
第６図は、先に開示したような双導波路部材型のセルに
おける分析の間に起こる現象の、分子レベルでの概略説
明図である。第６図中、５１及び５２の印をつけられた
領域は、例えば第１図に示された導波路部材５１及び５
２に相当する。領域５１と５２との間の中間領域は、そ
の中に溶解した分析対象物及び部材５１と５２の内壁に
付着した分析対象物を有する分析媒体を図式的に表わ
す。部材５１は、１０１で示される構成要素HbA1cに特
有の抗体１００をその上に付着して描かれる。これらの
HbA1c分子のいくつかは、特定の抗体１００との結合後
の形で示され、その他は結合しないままである。他の内
面（すなわち部材５２の内面）は、阻止剤１０２（例え
ばウシ血清アルブミン）により被覆されて示され、前記
阻止剤は、溶液中の全てのHbの分析対象物（例えばHbA0
１０３）及び全ての様式のタンパク質１０４に対する露
出壁の可能な親和性を最小にするのを意図している。
おける分析の間に起こる現象の、分子レベルでの概略説
明図である。第６図中、５１及び５２の印をつけられた
領域は、例えば第１図に示された導波路部材５１及び５
２に相当する。領域５１と５２との間の中間領域は、そ
の中に溶解した分析対象物及び部材５１と５２の内壁に
付着した分析対象物を有する分析媒体を図式的に表わ
す。部材５１は、１０１で示される構成要素HbA1cに特
有の抗体１００をその上に付着して描かれる。これらの
HbA1c分子のいくつかは、特定の抗体１００との結合後
の形で示され、その他は結合しないままである。他の内
面（すなわち部材５２の内面）は、阻止剤１０２（例え
ばウシ血清アルブミン）により被覆されて示され、前記
阻止剤は、溶液中の全てのHbの分析対象物（例えばHbA0
１０３）及び全ての様式のタンパク質１０４に対する露
出壁の可能な親和性を最小にするのを意図している。
このように、分析の間、面５２へのHbに特有でない結合
は防止され（又は少くとも大いに最小化され）、このこ
とは、適当な値の角度θを用いることによって、その面
に付着した阻止被膜の厚さを越える距離における、５２
中を伝播する信号のエバネッセント波成分と分析溶液と
の相互作用によりバルクヘモグロビンを測定することを
可能にする。
は防止され（又は少くとも大いに最小化され）、このこ
とは、適当な値の角度θを用いることによって、その面
に付着した阻止被膜の厚さを越える距離における、５２
中を伝播する信号のエバネッセント波成分と分析溶液と
の相互作用によりバルクヘモグロビンを測定することを
可能にする。
対照的に、面５１上では、それに被覆された抗体分子１
００と分析溶液中のHbA1c(AG)分子との間で結合反応が
起こる。この反応は、迅速ではあるけれども即座には起
こらず、従って導波路の部材中を伝播する光成分との連
続的な対応する相互作用により、複合体の層が面５１上
に漸進的に生じ、この結果、第７図に示されるＡ型又は
Ｂ型の応答曲線が得られる（下記の例を参照）。
００と分析溶液中のHbA1c(AG)分子との間で結合反応が
起こる。この反応は、迅速ではあるけれども即座には起
こらず、従って導波路の部材中を伝播する光成分との連
続的な対応する相互作用により、複合体の層が面５１上
に漸進的に生じ、この結果、第７図に示されるＡ型又は
Ｂ型の応答曲線が得られる（下記の例を参照）。
（実施例） 試験を実際的に実行するために、標準的な着色スライド
ガラス器類を用いて、濃硫酸と蒸留水、エタノール及び
アセトンに連続的に浸漬することにより、ガラス製キュ
ベットを洗浄した。他の非ガラス製導波路は、エタノー
ル中で超音波洗浄した。導波路は、いろいろな抗体溶液
で被覆した。抗体は、導波路の表面に物理的に吸着され
るか、或は共有結合的に結びつくかした。吸着は、洗浄
した導波路を抗体の溶液（0.05mol/のトリスHcc緩衝
液１ml当り５μｇのタンパク質、pH＝7.0）と共に恒温
器に４時間入れることにより行なわれる。未吸着タンパ
ク質は、食塩水で洗い流し、そして残りのタンパク質結
合部位は、その抗体被覆された導波路をウシ血清アルブ
ミン（1.0重量％のトリス緩衝液）と共に恒温槽に入れ
ることにより阻止した。共有結合による方法は、本質的
にウィートール（Weetall）のそれであり、酸水溶液の
シラン処理環境における３−アミノプロピルトリエトキ
シシラン（APTS）を含む（「固定化生化学とアフィニテ
ィークロマトグラフィー（Immobilized Biochemicals a
nd Affinity Chromatograph）」、ダンロップ（R.G.Dun
lop）、プリーナム・プレス（Plenum Press）、ニュー
ヨーク、１９１〜２１２頁）。（「固定化酵素、抗原、
抗体及びペプチド（Immobilized Enzymes,Antigens,Ant
ibodies and Peptides）」、準備及びクロマトグラフィ
ー、１：酵素学、ウィートール（H.A.Weetall）、マー
セル・デッカー社（Marcel Dekker Inc.）、ニューヨー
ク（１９７５）、１〜４８頁）。
ガラス器類を用いて、濃硫酸と蒸留水、エタノール及び
アセトンに連続的に浸漬することにより、ガラス製キュ
ベットを洗浄した。他の非ガラス製導波路は、エタノー
ル中で超音波洗浄した。導波路は、いろいろな抗体溶液
で被覆した。抗体は、導波路の表面に物理的に吸着され
るか、或は共有結合的に結びつくかした。吸着は、洗浄
した導波路を抗体の溶液（0.05mol/のトリスHcc緩衝
液１ml当り５μｇのタンパク質、pH＝7.0）と共に恒温
器に４時間入れることにより行なわれる。未吸着タンパ
ク質は、食塩水で洗い流し、そして残りのタンパク質結
合部位は、その抗体被覆された導波路をウシ血清アルブ
ミン（1.0重量％のトリス緩衝液）と共に恒温槽に入れ
ることにより阻止した。共有結合による方法は、本質的
にウィートール（Weetall）のそれであり、酸水溶液の
シラン処理環境における３−アミノプロピルトリエトキ
シシラン（APTS）を含む（「固定化生化学とアフィニテ
ィークロマトグラフィー（Immobilized Biochemicals a
nd Affinity Chromatograph）」、ダンロップ（R.G.Dun
lop）、プリーナム・プレス（Plenum Press）、ニュー
ヨーク、１９１〜２１２頁）。（「固定化酵素、抗原、
抗体及びペプチド（Immobilized Enzymes,Antigens,Ant
ibodies and Peptides）」、準備及びクロマトグラフィ
ー、１：酵素学、ウィートール（H.A.Weetall）、マー
セル・デッカー社（Marcel Dekker Inc.）、ニューヨー
ク（１９７５）、１〜４８頁）。
一般的に、導波路はAPTS（0.4mol／）と８０℃で３時
間反応させた。それから導波路を、その物質を含んだま
ま２時間、８０〜１２０℃に加熱し、その後周囲温度で
９０分間、リン酸塩緩衝液（0.1mol／、pH＝6.8）中
のグルタルアルデヒド（0.5mol／）にそれらを漬け
た。「活性化」導波路は、その後４℃で２４時間、抗血
清Ab（リン酸緩衝液１ml当り５mgのタンパク質）と反応
させた。抗体を結合した導波路をリン酸緩衝液中で洗浄
後、それらを４℃で等張食塩水（0.14mol／、アジ化
ナトリウム８mmol／を含む）中に保管した。結合の前
後におけるタンパク質の測定（分析生化学（Anal・Bioch
em）第５１巻、６５４〜６５５頁（１９７３））は、石
英上に約１μｇ／cm2のタンパク質の付着を示した。
間反応させた。それから導波路を、その物質を含んだま
ま２時間、８０〜１２０℃に加熱し、その後周囲温度で
９０分間、リン酸塩緩衝液（0.1mol／、pH＝6.8）中
のグルタルアルデヒド（0.5mol／）にそれらを漬け
た。「活性化」導波路は、その後４℃で２４時間、抗血
清Ab（リン酸緩衝液１ml当り５mgのタンパク質）と反応
させた。抗体を結合した導波路をリン酸緩衝液中で洗浄
後、それらを４℃で等張食塩水（0.14mol／、アジ化
ナトリウム８mmol／を含む）中に保管した。結合の前
後におけるタンパク質の測定（分析生化学（Anal・Bioch
em）第５１巻、６５４〜６５５頁（１９７３））は、石
英上に約１μｇ／cm2のタンパク質の付着を示した。
例１ （異種ヘモグロビンの存在下でのヘモグロビンの測定） トリヘモグロビン（ピゲオン）を基に、測定するヒトヘ
モグロビンをいろいろな割合で含んで、試料溶液を調製
した。一連の試料(A)において、両ヘモグロビンの総量
は常に５mg/mlであり、ヒトヘモグロビンの割合は、下
記の表に示される。もう一方の一連の試料(B)において
は、全ヘモグロビン濃度はほぼ倍であった。第１図及び
第２図に示される型式の双導波路を使用し、面の一つ
（例えば５１）をヒトIgGに対する抗体で被覆した。他
の面５２は、通例のようにウシ血清アルブミンで阻止し
た。
モグロビンをいろいろな割合で含んで、試料溶液を調製
した。一連の試料(A)において、両ヘモグロビンの総量
は常に５mg/mlであり、ヒトヘモグロビンの割合は、下
記の表に示される。もう一方の一連の試料(B)において
は、全ヘモグロビン濃度はほぼ倍であった。第１図及び
第２図に示される型式の双導波路を使用し、面の一つ
（例えば５１）をヒトIgGに対する抗体で被覆した。他
の面５２は、通例のようにウシ血清アルブミンで阻止し
た。
全例において、伝播損失に対応する鋭い低下(I)が、測
定中に観察され、その後１０分間にわたって更に伝播率
の低下(M)が記録された（第７図参照）。トリヘモグロ
ビンのみを含む試料の場合、その１０分の間にそのよう
に更に変化することは観察されなかった。結果を下表に
要約する。第７図で使用した添字ＡとＢとは、異なる全
ヘモグロビン濃度の試料に対応する。
定中に観察され、その後１０分間にわたって更に伝播率
の低下(M)が記録された（第７図参照）。トリヘモグロ
ビンのみを含む試料の場合、その１０分の間にそのよう
に更に変化することは観察されなかった。結果を下表に
要約する。第７図で使用した添字ＡとＢとは、異なる全
ヘモグロビン濃度の試料に対応する。
このように、最初の初期低下Ｉについて記録される値
は、存在する全ヘモグロビンに関係づけることができ、
一方１０分間の反応期間後に観察され、そして面５１上
に被覆された抗体へのヒトヘモグロビン因子の結合に対
応する値(M)は、試料のヒトヘモグロビン含有量と全ヘ
モグロビンに対するそれの比率とに関係づけることがで
きる。この例で使用した装置につないだ自動記録計で記
録することによって、標準曲線を上記データから作成し
た。その後は、トリヘモグロビン中のヒトヘモグロビン
の未知の混合物を測定するのに、このような曲線を比較
データとして使用した。第７図において、Ｗの値（ＷA
及びＷB）は、未結合の全物質を取り除く分析緩衝液に
よりセルを完全に洗った後に（ｔ１において）測定され
た応答に対応する。そのＷの値は、所望するならば、溶
液の上記分析パラメーターに関係づけること、及び標準
として未知混合物の分析に用いることもできる。
は、存在する全ヘモグロビンに関係づけることができ、
一方１０分間の反応期間後に観察され、そして面５１上
に被覆された抗体へのヒトヘモグロビン因子の結合に対
応する値(M)は、試料のヒトヘモグロビン含有量と全ヘ
モグロビンに対するそれの比率とに関係づけることがで
きる。この例で使用した装置につないだ自動記録計で記
録することによって、標準曲線を上記データから作成し
た。その後は、トリヘモグロビン中のヒトヘモグロビン
の未知の混合物を測定するのに、このような曲線を比較
データとして使用した。第７図において、Ｗの値（ＷA
及びＷB）は、未結合の全物質を取り除く分析緩衝液に
よりセルを完全に洗った後に（ｔ１において）測定され
た応答に対応する。そのＷの値は、所望するならば、溶
液の上記分析パラメーターに関係づけること、及び標準
として未知混合物の分析に用いることもできる。
例２ （ヘモグロビン存在下でのグリコシル化されたヘモグロ
ビン（HbA1c）の測定） バイオレックス（Bio-REX）７０樹脂（米国カリフォル
ニア州リッチモンドのバイオラッド（Biorad）社製）を
使用しての陽イオン交換クロマトグラフィーにより、プ
ールされヘパリン処理した健康な血液から、グリコシル
化された標準Hb(HbA1c)を調製した（トリベリ（L.A.Tri
velli）等、ニューイングランド医学誌（New England
J.of Medicine）第２８４巻（１９７１）、３５３
頁）。精製したHbA1cはその後、グリコシル化されたヘ
モグロビンのない血液といろいろな既知の量で再結合す
ることにより、標準試料を調製するのに使用した。試料
中の全ヘモグロビンに関するHbA1cの濃度は、１〜２０
重量％に変化し、そして全Hb濃度は１５０g／程度で
あった。
ビン（HbA1c）の測定） バイオレックス（Bio-REX）７０樹脂（米国カリフォル
ニア州リッチモンドのバイオラッド（Biorad）社製）を
使用しての陽イオン交換クロマトグラフィーにより、プ
ールされヘパリン処理した健康な血液から、グリコシル
化された標準Hb(HbA1c)を調製した（トリベリ（L.A.Tri
velli）等、ニューイングランド医学誌（New England
J.of Medicine）第２８４巻（１９７１）、３５３
頁）。精製したHbA1cはその後、グリコシル化されたヘ
モグロビンのない血液といろいろな既知の量で再結合す
ることにより、標準試料を調製するのに使用した。試料
中の全ヘモグロビンに関するHbA1cの濃度は、１〜２０
重量％に変化し、そして全Hb濃度は１５０g／程度で
あった。
第２図に図示されるように双導波路を含むキュベットを
有する分析装置が測定用に使用され、そのキュベットの
一方の側の内面はHbA1cに特有の抗体で被覆し、これに
反して反対側の面は被覆しないままにした。おのおのの
セル５（おのおのの標準試料を連続的に試験するのに新
しいそれを使用した）の含有量は、約１mlであり、0.1m
lの測定される標準試料と約0.9mlのPBSとをピペットに
てその中に入れた。第８図は、１５分の恒温時間後に得
られた測定曲線の一つを示し（２０％HbA1c試料によ
る）、上の曲線（ほとんど横に寝た）は、導波路の未被
覆部で記録されたものであり、また下の曲線は、導波路
の抗体被覆された部分の応答を示す。
有する分析装置が測定用に使用され、そのキュベットの
一方の側の内面はHbA1cに特有の抗体で被覆し、これに
反して反対側の面は被覆しないままにした。おのおのの
セル５（おのおのの標準試料を連続的に試験するのに新
しいそれを使用した）の含有量は、約１mlであり、0.1m
lの測定される標準試料と約0.9mlのPBSとをピペットに
てその中に入れた。第８図は、１５分の恒温時間後に得
られた測定曲線の一つを示し（２０％HbA1c試料によ
る）、上の曲線（ほとんど横に寝た）は、導波路の未被
覆部で記録されたものであり、また下の曲線は、導波路
の抗体被覆された部分の応答を示す。
いろいろな標準溶液の分析結果も、下記の表に要約す
る。
る。
HbA1cがない試料についての0.3％の差は、デグリコシル
化された血液媒体に対するHbA1cの特定の抗体のアフィ
ニティーが、ある程度残っていることを示す。しかしな
がらこの因子は、実用的分析条件下では無視し得ると考
えられる。
化された血液媒体に対するHbA1cの特定の抗体のアフィ
ニティーが、ある程度残っていることを示す。しかしな
がらこの因子は、実用的分析条件下では無視し得ると考
えられる。
導波路の未被覆部における伝播率が、一方のセルから他
方へと一定でなく、この方法は全Hbを正確に測定するの
に適当でないことを示すように思われることも、注目さ
れるべきである。しかしながら、この場合全Hbを測定す
ることは必要ではなく、未被覆側と被覆側とからの信号
を関係づけることだけが必要なのである。次に、備品の
初期目盛り調整を必要としない無条件の測定の完全な再
現性を可能にするような一連のキュベットを手作業で組
み立てる場合に、不変性の程度を維持することは困難で
ある。疑いなく、キュベットが工業的に大規模に成形に
より製作される場合には、この不利は克服される。
方へと一定でなく、この方法は全Hbを正確に測定するの
に適当でないことを示すように思われることも、注目さ
れるべきである。しかしながら、この場合全Hbを測定す
ることは必要ではなく、未被覆側と被覆側とからの信号
を関係づけることだけが必要なのである。次に、備品の
初期目盛り調整を必要としない無条件の測定の完全な再
現性を可能にするような一連のキュベットを手作業で組
み立てる場合に、不変性の程度を維持することは困難で
ある。疑いなく、キュベットが工業的に大規模に成形に
より製作される場合には、この不利は克服される。
第１図は、双導波路セルを組合せた複合装置を含む分析
装置の態様の概略平面図である。 第２図は、第１図の態様の別形の概略図である。 第３図は、更にもう一つの態様の概略図である。 第４図は、導波路が接触している別の媒体（分析溶液）
の屈折率ｎ２より大きい屈折率ｎ１の媒体（導波路）に
おける全反射光の伝播の説明図である。 第５図は、第４図に付帯して、疎なる媒体（分析溶液）
におけるエバネッセント波成分の透過の概略説明図であ
る。 第６図は、本発明に従って導波路を用いる間に起こる現
象の概略説明図である。 第７図は、前述の説明に従って分析を行なう時の応答曲
線を示すグラフである。 第８図は、ヘモグロビンの存在下での血液成分HbA1cの
分析における典型的応答曲線を示すグラフである。 １，２……ビーム、４，５……試料物質、６，７３，９
３，９４……光源、９……モノクロメーター、１１……
前置増幅器、１２……マイクロコンピュータ、１３……
マイクロプロセッサ、１４……印字装置、１５……記憶
装置、１９……フォトダイオード、５０，７０，９０…
…双導波路セル、５１，５２，７１，７２……壁、５
５，５６……ビーム、５７……回転チョッパー鏡、５
８，５９，７４，７５，７９，８０，９８……鏡、６
２，７８，９７……検出器、７６……チョッパー盤、７
７……ウィンドーホール、９５，９６……ビームスプリ
ッター、１００……HbA1cに特有の抗体、１０１……HbA
1c、１０２……阻止剤、１０３……HbA0、１０４……タ
ンパク質。
装置の態様の概略平面図である。 第２図は、第１図の態様の別形の概略図である。 第３図は、更にもう一つの態様の概略図である。 第４図は、導波路が接触している別の媒体（分析溶液）
の屈折率ｎ２より大きい屈折率ｎ１の媒体（導波路）に
おける全反射光の伝播の説明図である。 第５図は、第４図に付帯して、疎なる媒体（分析溶液）
におけるエバネッセント波成分の透過の概略説明図であ
る。 第６図は、本発明に従って導波路を用いる間に起こる現
象の概略説明図である。 第７図は、前述の説明に従って分析を行なう時の応答曲
線を示すグラフである。 第８図は、ヘモグロビンの存在下での血液成分HbA1cの
分析における典型的応答曲線を示すグラフである。 １，２……ビーム、４，５……試料物質、６，７３，９
３，９４……光源、９……モノクロメーター、１１……
前置増幅器、１２……マイクロコンピュータ、１３……
マイクロプロセッサ、１４……印字装置、１５……記憶
装置、１９……フォトダイオード、５０，７０，９０…
…双導波路セル、５１，５２，７１，７２……壁、５
５，５６……ビーム、５７……回転チョッパー鏡、５
８，５９，７４，７５，７９，８０，９８……鏡、６
２，７８，９７……検出器、７６……チョッパー盤、７
７……ウィンドーホール、９５，９６……ビームスプリ
ッター、１００……HbA1cに特有の抗体、１０１……HbA
1c、１０２……阻止剤、１０３……HbA0、１０４……タ
ンパク質。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭52−102094（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−151542（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−81560（ＪＰ，Ａ) 米国特許3939350（ＵＳ，Ａ)
Claims (7)
- 【請求項１】単一試料のうちの二つ以上の成分を分析す
るための免疫検定装置であり、 (a) 液体試料を入れるための保持手段、 (b) 光信号の伝播を可能にするための少なくとも二つ
の独立した光導波路手段、 (c) これらの導波路手段のそれぞれに入力の光信号を
供給するための光源手段、 (d) 前記導波路手段からの出力の光信号を集め、そし
てそれらに対応する電気信号を発生するための検出手
段、及び (e) この検出手段からの前記電気信号を受取りそして
処理するための分析手段、 を含んでなる装置であって、前記導波路手段のそれぞれ
が前記保持手段の一部を形成していて、当該導波路手段
の表面が当該試料に露出されるようになっており、そし
て前記露出される導波路表面のうちの少なくとも一つに
試料から分析しようとする成分に特有の反応物が被覆さ
れる免疫検定装置。 - 【請求項２】前記保持段がキュベットであり、そして前
記導波路手段がこのキュベットの相対する壁を形成して
いて、これらの壁の間隔が10〜1000μｍである、特許請
求の範囲第１項記載の装置。 - 【請求項３】前記相対する壁が、当該試料中に存在して
いるであろう、分析しようとする成分に特有の別々の反
応物で処理される、特許請求の範囲第２項記載の装置。 - 【請求項４】前記相対する壁の一つが、当該試料中に存
在しているであろう、分析しようとする成分に特有の反
応物で処理され、そして他の壁が同じ成分に対する阻止
剤で処理される、特許請求の範囲第２項記載の装置。 - 【請求項５】前記光源手段が前記光導波路のそれぞれに
光信号を択一的に供給するためのチョッパー手段を含
む、特許請求の範囲第１項記載の装置。 - 【請求項６】前記チョッパー手段が回転式鏡あるいはチ
ョッパー盤である、特許請求の範囲第５項記載の装置。 - 【請求項７】前記光源手段が交互に閃光を発する独立し
た二つの光源を含み、その出力がビーム分割手段を経て
前記光導波路手段の各一方の光学端に焦点を合わされ、
且つ前記光導波路手段の他端が全反射するように作られ
ていて、前記光導波路手段によって伝播される光信号が
その中を前後両方向に伝播される、特許請求の範囲第１
項記載の装置。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP84810601A EP0185126B1 (en) | 1984-12-10 | 1984-12-10 | Optical test probe and apparatus for optically determining species in solution |
| EP84810601.9 | 1984-12-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61184442A JPS61184442A (ja) | 1986-08-18 |
| JPH0641912B2 true JPH0641912B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=8193058
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60276145A Expired - Lifetime JPH0641912B2 (ja) | 1984-12-10 | 1985-12-10 | 光学的免疫検定装置 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0185126B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0641912B2 (ja) |
| CA (1) | CA1272618A (ja) |
| DE (1) | DE3480490D1 (ja) |
| ES (1) | ES8900201A1 (ja) |
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| JP2011202997A (ja) * | 2010-03-24 | 2011-10-13 | Toshiba Corp | 光学式センサ |
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| DK163194C (da) * | 1988-12-22 | 1992-06-22 | Radiometer As | Fremgangsmaade ved fotometrisk in vitro bestemmelse af en blodgasparameter i en blodproeve |
| JPH0746108B2 (ja) * | 1988-02-29 | 1995-05-17 | ダイキン工業株式会社 | 免疫検査装置および免疫検査方法 |
| JPH0746109B2 (ja) * | 1988-02-29 | 1995-05-17 | ダイキン工業株式会社 | 免疫検査装置および免疫検査方法 |
| CA2069537A1 (en) * | 1991-06-07 | 1992-12-08 | Thomas A. Cook | Multiple output referencing system for evanescent wave sensor |
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| DE2606991A1 (de) * | 1976-02-20 | 1977-08-25 | Nils Dr Med Kaiser | Geraet zur bestimmung des gehaltes von stoffwechselprodukten im blut |
| JPS58501481A (ja) * | 1981-09-18 | 1983-09-01 | プルーテック リミティド | 光学的導波体による溶液中検査物の測定方法および装置 |
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| US4447546A (en) * | 1982-08-23 | 1984-05-08 | Myron J. Block | Fluorescent immunoassay employing optical fiber in capillary tube |
-
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- 1984-12-10 DE DE8484810601T patent/DE3480490D1/de not_active Expired
- 1984-12-10 EP EP84810601A patent/EP0185126B1/en not_active Expired
-
1985
- 1985-12-09 CA CA000497200A patent/CA1272618A/en not_active Expired
- 1985-12-10 ES ES549766A patent/ES8900201A1/es not_active Expired
- 1985-12-10 JP JP60276145A patent/JPH0641912B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011202997A (ja) * | 2010-03-24 | 2011-10-13 | Toshiba Corp | 光学式センサ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3480490D1 (en) | 1989-12-21 |
| EP0185126A1 (en) | 1986-06-25 |
| EP0185126B1 (en) | 1989-11-15 |
| ES8900201A1 (es) | 1989-03-16 |
| JPS61184442A (ja) | 1986-08-18 |
| CA1272618A (en) | 1990-08-14 |
| ES549766A0 (es) | 1989-03-16 |
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