JP2016522448A - 組織の検出のための蛍光撮像システム - Google Patents

Abstract

撮像システム（１００）が、顕微鏡スライド（１８０）上に位置する組織の検出をすることができる。撮像システム（１００）は、光源（１５０）と、カメラを含む画像キャプチャ装置（１６０）と、撮像レンズ（１７０）とを含む。光源（１５０）は、光（１５４）がスライド（１８０）およびスライド（１８０）に担持されたカバーガラス（１８２）の表面間で内部全反射するように、スライド（１８０）の１つまたは複数の縁部に対して光（１５４）を向ける。光（１５４）は、スライド（１８０）に担持された１つまたは複数の標本を刺激するように設計された波長または波長帯を有する。撮像レンズ（１７０）は、組織および／またはフルオロフォアから放射された放射光をカメラに向けるように配置される。画像キャプチャ装置（１６０）は、全スライド（１８０）またはその一部の画像をキャプチャすることができる。

Description

本開示は、標本を撮像するためのシステムに関する。詳細には、本開示は、組織の検出のための蛍光撮像システムに関する。

全スライド撮像または希少細胞の検出のために使用される従来型の蛍光顕微鏡スキャナは、一般に、低倍率（例えば４×より低い倍率）で、スライドの正面側に配置された低倍率顕微鏡対物レンズと、スライドの裏側に配置された光源とを使用することによって、全顕微鏡スライドをスキャンする。光源からの光は、スライドのおもて面上に担持された標本を照射する（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅ）ようにスライドを通って伝わることができる。全スライドの画像を作成するために、スライドの小さい範囲が、順次撮像されて１セットの部分画像が作成される。部分画像は、組み合わされて、例えば病理学者による判読のために全スライドの合成画像を作成する。残念なことに、全体にわたる撮像時間は、スライド上の標本数、スライド上の標本の位置、倍率レベルおよび実行される分析および判読に応じて数分から数時間かかる。さらに、部分画像の取得には、カメラおよびスライドに関係する対物レンズを正確に動かすことができる複雑で高価な顕微鏡機器が必要となることが多い。光源からの励起光は、蛍光放射を生じさせるために、（例えば、落射照明またはワイド・エリア・イルミネーションを使用して）染色された組織標本を一度通過する。放射光は、カメラによってキャプチャされる。残念なことに、標本は、ほんのわずかの励起光を吸収して、励起光と比べて比較的弱い蛍光放射となり、信号対雑音比が低くなる。これにより、蛍光画像を判読または分析することが困難となる。

本発明は上述の課題を解決するものである。

本技術の少なくともいくつかの実施形態は、顕微鏡スライドに担持された標本を均等に照射し、標本全てを包含する単一画像をキャプチャするように協働する、１つまたは複数の光源、カメラおよび撮像構成部品（例えばレンズ）を含む撮像システムを含む。光源は、標本の蛍光発光（例えば、フルオロフォア、組織などの蛍光発光）を引き起こすための励起光を出力することができる。スライドは、標本に効率的に励起光を送達する光ガイドとして働くことができる。励起光は、カメラによって検出可能なスペクトルの任意の所望の部分（例えば、可視部分）の波長または波長帯で標本を励起することができる。励起光は、蛍光放射の波長または波長帯と異なる波長または波長帯とすることができる。いくつかの実施形態では、組織が、スペクトルの可視部分で蛍光発光して、比較的低コストのカメラおよびレンズを用いて全スライド撮像を提供する。

いくつかの実施形態では、単一の全スライド画像が、標本を位置特定し、標本を計数し、標本および／またはスライドについての他の情報を取得するために使用され得る。取得した情報に基づいて、その後の撮像が実行され得る。例えば、高解像度撮像（例えば、スキャン）は、スライドの標本を担持した範囲に制限され得る。したがって、対象の全ての範囲の高解像度画像は、比較的短時間でキャプチャされ得る。これにより、撮像システムのスループットが増大し、診断時間を短縮することなどができる。いくつかの実施形態では、全スライドの単一画像が、非常に迅速に取得され得る。例えば、全スライド画像が、３秒、２秒、１秒より短い時間で取得され得る。

励起光は、顕微鏡スライドおよび／またはカバーガラスによって制約され得る。励起光の認識可能な量がカメラに到達することを制限するまたは防ぐために、内部全反射が、達成され得る。励起光は、スライドとカバーガラスとの間を前後に複数回伝わり、高強度照明となることができる。励起光は、照明を概ね均質にし、スライド全体にわたって非常に均一な強度を実現するために、多重反射をするので、内部全反射は、光源と組織との間の距離に関連する強度の変化（例えば、減少）も最小限にし制限する。内部全反射は、カメラに向かって反射する迷光照明（ｓｔｒａｙ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）の励起光も制限し最小限にする。これにより、励起光を用いた組織試料からの比較的弱い蛍光放射を制圧することを防ぎ、複雑で高価なフィルタ（例えば励起光を遮断するためのフィルタ）を必要としなくなる。

いくつかの手順では、励起光が、限定しないが、組織試料の自己蛍光、（フルオロクロム、蛍光試薬、および／または蛍光染料を含む）フルオロフォアの蛍光、および／または、蛍光を生じさせる他の機構を含め、蛍光発光を引き起こすことができる。蛍光染色された組織試料を用いて、紫外線光が、組織中のフルオロフォアを励起することができる。色素生成染色された組織試料を用いて、紫外線光が、色素原蛍光および／または組織それ自体の自己蛍光を引き起こすことができる。例えば、色素原を用いて軽く染色された組織は、色素原蛍光、組織自己蛍光、または両方に基づいて位置特定され得る。いくつかの手順では、組織の自己蛍光が、単独で組織を位置特定するために使用される。非紫外線光源を含む他のタイプの光も使用され得る。光源は、比較的低コストの紫外線ＬＥＤまたは他のタイプのＬＥＤなどの、発光ダイオード（ＬＥＤ）とすることができる。

いくつかの実施形態では、撮像システムが、顕微鏡スライドの少なくとも１つの縁部に隣接して配置可能な光発生装置を含む。光発生装置は、光がスライドおよび／またはカバーガラスによって内部で反射されるように励起光をスライドの縁部に送達して、顕微鏡スライド上に担持された１つまたは複数の組織試料を照射することができる。内部反射光は、スライドから蛍光放射を引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、スライドからの蛍光放射が、組織それ自体の自己蛍光によって生じ得る。他の実施形態では、スライドからの蛍光放射が、組織に関連する（例えば、結合された）１つまたはフルオロフォアの蛍光発光によって生じ得る。

画像キャプチャ装置は、スライド画像を作成するために放射をキャプチャすることができる。一実施形態では、画像キャプチャ機器によってキャプチャされた放射光のほとんどが、蛍光放射の光である。スライドおよびカバーガラスは、画像キャプチャ装置に到達する光のほとんどが蛍光放射となるように、励起光を内部で反射させるように協働することができる。画像キャプチャ装置に到達する励起光（すなわちスライドおよび／またはカバーガラス中に送達される光）が、閾値またはそれを下回るレベルで維持され得る。いくつかの実施形態では、スライドの画像が、蛍光放射と励起光の両方に基づいて作成される。組織試料は、いくつかの励起光が画像キャプチャ装置に到達するように、励起光を散乱させることができる。蛍光放射と加算された励起光が、組織を位置特定に使用され得る。

いくつかの実施形態では、撮像システムが、スライドについての情報を得るために使用される単一の広範囲の画像をキャプチャするように構成される。この情報には、限定しないが、組織試料の存在、組織試料数、空間情報（例えば、組織試料の位置、組織試料間の間隔など）、組織試料の形状／サイズ、組織のタイプ、または他の所望の情報が含まれ得る。いくつかの実施形態では、付加的な撮像が、情報に基づいて実行され得る。付加的な撮像は、例えば組織がある範囲のみを撮像するための、スライドの対象の範囲のより高度な解像度の撮像とすることができる。

いくつかの実施形態では、撮像システムが、上側表面、下側表面および複数の縁部を有する顕微鏡スライド上に位置する組織を検出するように構成される。組織は、顕微鏡スライドの上側表面上に位置づけされ得る。撮像システムは、光源、カメラおよび撮像レンズを含む。光源は、光をスライドの縁部に向けるように、顕微鏡スライドの１つまたは複数の縁部の近位に配向され得る。光は、顕微鏡スライドの下側表面とスライド上に位置する全てのカバーガラスとの間で内部反射をすることができる。いくつかの実施形態では、光の内部全反射は、標本からの蛍光放射および／または光散乱を引き起こす。

いくつかの実施形態では、カメラが、単一の全スライド画像をキャプチャすることができる。例えば、カメラおよび撮像レンズは、カメラが、単一の蛍光強化した全スライド画像をキャプチャするように構成され得る。撮像レンズは、放射光（例えば、蛍光放射）をカメラに向けるように配置され得る。カメラは、サムネイルカメラ、または所望の画像を作成することができる他の装置とすることができる。

いくつかの実施形態では、光源が、紫外線（ＵＶ）光源を備える。紫外線光源は、スライドの少なくとも１つの縁部の近位とすることができる１つまたは複数の紫外線ＬＥＤを備えることができる。他の実施形態では、光源には、限定しないが、１つまたは複数のランプ、光バー（例えば、発光ダイオードのアレイ）などが含まれ得る。光源は、カメラの直接照明を防ぐために励起光を遮断するように配置された光バッフルをもつ光発生装置の一部とすることもできる。光バッフルは、光源とカメラおよび／または撮像レンズとの間に配置された不透明板とすることができる。

フルオロフォアは、組織に結合または重ねられ得る。いくつかの実施形態では、フルオロフォアが、有機フルオロフォア、量子ドットまたは蛍光放射を生じさせることができる他の物質を含む。いくつかの実施形態では、２つまたはそれより多くのフルオロフォアが、組織に結合される。光源は、フルオロフォアのそれぞれを刺激するための波長で光を放射することができる１つまたは複数の光源を含むことができる。例えば、試料が、２つのフルオロフォアを含む場合、光源は、それぞれがフルオロフォアの１つを励起することができる２つの発光素子を含むことができる。

少なくともいくつかの実施形態は、顕微鏡スライドを撮像するための方法である。方法は、顕微鏡スライドとスライドを覆うカバーガラスとの間の光の内部全反射を誘発するのに十分な角度で顕微鏡スライドの縁部中に光を向けるステップを含む。スライドおよび／またはカバーガラスから放射された光は、カメラに対して向けられ得る。光は、蛍光発光した組織、蛍光発光したフルオロフォアまたはその組合せから放射され得る。カメラは、放射された光をキャプチャし、スライドの１つまたは複数の画像を生成することができる。光は、カバーガラス（例えば、カバーガラスの上側表面または下側表面）および顕微鏡スライドの下側表面によって内部で反射され得る。こうして、光は組織を実質上均一に照明するために、組織を反復して通過することができる。組織からの蛍光放射は、スライドおよび／またはカバーガラスからカメラに対して向けられ得る。

顕微鏡は、本明細書で開示された撮像システムを含むことができる。顕微鏡は、限定しないが、１つまたは複数のフィルタ、撮像光学系、コントローラ、リーダなどを含む付加的な特徴を含むことができる。いくつかの実施形態では、撮像システムまたはその構成部品が、標準顕微鏡に組み込まれ得る。

限定しないまた包括的でない実施形態について、以下の図面を参照して説明する。同じ参照番号は、他に特定されない限り、種々の図面全体にわたって同様の部分または作用を指す。

一実施形態による撮像システムの正面図である。 光発生装置および標本を載せた顕微鏡スライドの平面図である。 標本を載せた全顕微鏡スライドの画像である。 一実施形態による撮像システムの一部および顕微鏡スライドの側面図である。 光源ならびに顕微鏡スライドおよびカバーガラスの端部の詳細図である。 一実施形態による顕微鏡スライドを撮像する方法の流れ図である。 一実施形態による自動撮像システムの正面図である。 一実施形態による顕微鏡スライドによって担持された標本を照射するように配置された光発生装置の平面図である。 一実施形態による顕微鏡スライドの対向する縁部に光を送達するように配置された光発生装置の平面図である。

顕微鏡スライドを撮像するための撮像システムおよび関連する方法について、本明細書で説明する。撮像システムは、光がスライドおよびスライド上に位置する標本を覆うカバーガラスの表面間で内部反射するように、顕微鏡スライドに対して励起光を向ける光源を含むことができる。顕微鏡スライドおよび／またはカバーガラスは、標本の蛍光発光を引き起こすように効率的に標本を照射する導波路として働くことができる。励起光が、内部全反射して、限定しないが、組織、フルオロフォアまたは他の物質を励起する光の空間的に実質上均一な分布をもたらして、組織の検出／分析の自動化のための迅速なスライド撮像を可能にする。本技術が付加的な実施形態を有してよく、また、本技術が図１〜図９を参照して実施形態のいくつかの以降の詳細な説明なしに実践され得ることが、当業者には理解されよう。

図１は、一実施形態による撮像システム１００の正面図である。撮像システム１００は、イメージャ１３０、コンピューティングデバイス１４０および光発生装置１５０を含むことができる。イメージャ１３０は、画像キャプチャ装置１６０、および撮像レンズ１７０の形式の撮像光学系を含むことができる。光発生装置１５０は、スライドホルダ１８１に位置づけられた顕微鏡スライド１８０（「スライド１８０」）によって担持された標本の蛍光発光を引き起こす励起光（矢印１５４で示す）を出力することができる。蛍光発光は、例えば、組織に結合されたフルオロフォアの蛍光発光、組織それ自体の蛍光発光などとすることができる。スライド１８０およびカバーガラス１８２は、放射（矢印１９２で示す）を生じるために標本（または複数の標本）全体を照射するように協働する導波路として働くことができる。撮像光学系１７０は、放射１９２を画像キャプチャ装置１６０に対して向けることができ、次にこの装置は、スライド１８０の画像を作成する。コンピューティングデバイス１４０は、画像を分析して、例えば、スライド１８０によって担持された組織試料数、組織試料の位置、組織試料の形状、および組織試料についての他の情報を決定することができる。

図２は、光発生装置１５０、スライド１８０およびカバーガラス１８２の平面図である。図１および図２を共に参照すると、光発生装置１５０は、スライド１８０および／またはカバーガラス１８２の縁部１９０（例えば側面、隅部、その組合せなど）の近位に配置され得る。光１５４は、縁部１９０に当たり、スライド１８０およびカバーガラス１８２を通って伝わり、スライド１８０および／またはカバーガラス１８２によって内部反射され得る。いくつかの実施形態では、光は、光を実質的に境界面（例えばスライド１８０とカバーガラス１８２との間）の全体、またはスライド１８０のカバーガラスで覆う範囲１８４（図１）に送達するように、内部全反射をすることができる。いくつかの実施形態では、光の内部全反射により、励起エネルギーがカバーガラスで覆う範囲１８４の少なくとも約９０％に伝えられる。一実施形態では、励起エネルギーが、カバーガラスで覆う範囲１８４の少なくとも約９５％に送達され、カバーガラスで覆う範囲１８４上の任意の組織を位置特定する。

光バッフル２００は、光１５４が画像キャプチャ装置１６０によってキャプチャされることを防ぐことができる。いくつかの実施形態では、光バッフル２００は、励起光に関連するノイズを最小限にし制限するために、光１５４がイメージャ１３０に直接入射することを防ぐ。図１に示すように、光バッフル２００は、光源２２２と撮像光学系１７０との間に直接配置され得る。光バッフル２００の位置、サイズおよび光学特性は、画像キャプチャ装置１６０に対して出力される励起光１５４の全てを実質的に遮断するように選択され得る。

カプラ２０８は、光バッフル２００を光発生装置１５０に結合することができる。別法では、光バッフル２００が、光発生装置１５０を好都合に交換できるように、イメージャ１３０上に取り付けられ得る。付加的にまたは別法で、１つまたは複数のフィルタは、光発生装置１５０によって出力される光をフィルタリングするために使用され得るが、放射１９２（図１）が画像キャプチャ装置１６０に到達することは可能である。フィルタは、撮像光学系１７０および／または画像キャプチャ装置１６０に結合される、または組み込まれ得る。光発生装置１５０が、光のビーム（例えばレーザビーム）を出力する場合、光バッフル２００およびフィルタは、取り除かれ得る。

図３は、標本のアレイを担持する全スライド１８０の画像である。標本は、スライド１８０上に位置する８つの組織試料２２０ａ〜ｈ（集合的に「試料２２０」）である。図３の試料２２０は、間隔をあけた前立腺試料であるが、他のタイプの組織試料も撮像され得る。組織試料２２０は、例えばフルオロフォアを用いて蛍光染色され得る。図３の画像は、スライド１８０の封入領域１７２およびラベル領域１７５を示す。封入領域１７２は、スライド１８０のほとんど、または、スライド１８０の約２５ｍｍ×５０ｍｍの範囲を含むことができる。図１および図３を参照すると、コンピューティングデバイス１４０（図１）は、単一の蛍光強化画像に基づいて、試料２２０（図３）の全てを検出することができる。１つまたは複数の試料２２０の付加的な撮像が実行され得る。

図４は、一実施形態による撮像システム１００の構成部品の正面図である。カバーガラス１８２は、スライド１８０の上側表面２４０上に位置する試料２２０の近位にある。画像キャプチャ装置１６０は、全スライド１８０の単一の蛍光強化画像をキャプチャすることができる。他の手順では、画像キャプチャ装置１６０および撮像レンズ１７０が、スライド１８０の封入領域１７２の画像をキャプチャするように協働することができる。ラベル領域１７５の分離画像は、白色光を使用してキャプチャされ得る。２つの画像は、合成の全スライド画像を作成するように、重ね合わせ、あるいは組み合わせられ得る。したがって、撮像システム１００は、単一の全スライド画像または合成の全スライド画像を作成することができる。

画像キャプチャ装置１６０は、Ｐｈａｓｅ １ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＮＹ州、Ｄｅｅｒ Ｐａｒｋ）によるＩＤＳ ＵＩ−１４９５ＬＥサムネイルカメラ、または他のサムネイルカメラなどのカメラを含むことができる。カメラは、限定しないが、電荷結合素子（ＣＣＤ）および／または相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）デバイスなどの、１つまたは複数のセンサを含むことができる。センサの構成および解像度は、画像の所望の特性に基づいて選択され得る。いくつかの実施形態では、撮像光学系１７０が、画像キャプチャ装置１６０に組み込まれる。さらに、画像キャプチャ装置１６０は、比較的短時間で画像をキャプチャすることができる。いくつかの実施形態では、スライド１８０上の組織試料の全てを含む単一画像が、約３秒、２秒または１秒より短い時間でキャプチャされ得る。コンピューティングデバイス１４０（図１）が、ＵＳＢ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｅｒｉａｌ Ｂｕｓ）ポートを含む場合に、画像キャプチャ装置１６０は、ＵＳＢケーブルを介してコンピューティングデバイス１４０に接続可能なＵＳＢカメラとすることができる。他の有線および無線接続が、撮像キャプチャ装置１６０とコンピューティングデバイス１４０との間の通信を実現してもよい。

撮像光学系１７０には、限定しないが、１つまたは複数の顕微鏡対物レンズ、レンズ（例えば、焦点レンズ）、センサ焦点レンズ群、または、もしあるならば、所望の倍率を達成する他の光学的構成部品が含まれ得る。図１を参照すると、コンピューティングデバイス１４０が、倍率を上げるまたは下げる、焦点を調整する、あるいはキャプチャした画像の特性を選択するように撮像光学系１７０に命令することができる。

図１および図４を参照すると、スライド１８０とイメージャ１３０との間の相対位置は、画像キャプチャ装置１６０が放射１９２を受け取ることを確実にするように調整され得る。いくつかのルーチンでは、図４の距離Ｄが、約１７０ｍｍから約１９０ｍｍの範囲である。例えば、距離Ｄが、実質的に顕微鏡スライド１８０全体の単一画像をキャプチャするように約１８０ｍｍとすることができる。他の距離Ｄも使用され得る。

図５は、光発生装置１５０の一部、スライド１８０およびカバーガラス１８２の詳細図である。光源２２２には、限定しないが、１つまたは複数のＬＥＤ（例えば、面発光ＬＥＤ、端発光ＬＥＤ、スーパールミネセンスＬＥＤなど）、レーザダイオード、エレクトロルミネセンス光源、白熱光源、冷陰極蛍光光源、有機ポリマー光源、ランプ、無機光源、または他の適した発光素子が含まれる。例示の光源２２２は、蛍光発光を引き起こす試薬（例えば、染色剤、フルオロフォアなど）および／または組織を、励起し、変化させ、あるいは活性化する、波長および／または波長帯と対応する、または少なくともこれらと重なり合う波長および／または波長帯を出力することができる。例えば、励起光は、電子遷移をより高いエネルギーレベルに励起するのに必要および／または十分な、特定の波長および／または波長帯の光とすることができる。一例では、励起光は、蛍光発光を生じるために、組織に結合されたフルオロフォアを、フルオロフォアが励起光の波長と異なる（より長いなどの）光の波長を放射するような状態に励起するのに必要および／または十分な特定の波長を有する。蛍光発光は、より高い状態からより低い状態に移る原子または分子による放射光の放射とすることができる。原子または分子が、励起エネルギーを吸収し、次いで可視放射光などの放射光としてエネルギーを放射するとき蛍光発光が起り得る。いくつかの実施形態では、光源２２２が、フルオロフォアを励起するために紫外線刺激ビーム（例えば、約３７０ｎｍ＋／−２０ｎｍの範囲の波長のビーム）を出力することができ、このフルオロフォアは、限定しないが、半導体ナノ結晶量子ドット、蛍光染色剤、もしくは組織２２０に結合された他のフルオロフォア、または、自己蛍光を引き起こす組織中の他の天然起源分子とすることができる。

スライド１８０は、試験用に試料を担持することができる実質上平面な基板とすることができる。例えば、スライド１８０は、平面の上側表面２４０および下側表面２４２を有する透明材料の概ね方形状片とすることができる。スライド１８０および／またはカバーガラス１８２の光学的特性は、所望の内部反射率に到達するように選択され得る。光線（矢印２４３、２４５、２４７で示す）は、下側表面２４２、およびカバーガラス１８２の上側表面２４９と下側表面２５０のどちらでも内部反射される。内部反射光は、高強度照明を実現するために、組織２２０を複数回通って伝わることができる。例えば、光は、組織２２０を通って伝わる光に関連する強度の低下を制限する、または最小限にするように内部全反射することができる。内部反射光は、光源と組織との間の距離に基づいて強度の変化を制限するまたは防ぐように、組織２２０全体にわたって概ね均一な照明をもたらすために、組織２２０を反復して通って伝わることができる。有利には、励起光２４３、２４５、２４７は、組織２２０からの比較的弱い蛍光放射を制圧しがちな、画像キャプチャ装置１６０に対して向けた励起照明を最小限にするまたは制限するように、顕微鏡スライド１８０および／またはカバーガラス１８２内に制約され得る。励起光がカバーガラス１８２の上側表面２４９およびスライド下側表面２４２に当てる角度が、境角（例えば、対応する面２４２、２４９に垂直な軸に対する境角）より大きくなるように、顕微鏡スライド１８０および／またはカバーガラス１８２の屈折率は選択され得る。いくつかの実施形態では、顕微鏡スライド１８０の屈折率が、３６５ｎｍの波長で約１．５４とすることができる。屈折率１をもつ空気が、スライド１８０を囲むことができ、境角αは、約４０．６度とすることができる。いくつかの実施形態では、スライド１８０、カバーガラス１８２および／または組織／封入剤２５１の屈折率が、互いに概ね均等とすることができる。例えば、スライド１８０の屈折率対カバーガラス１８２の屈折率の比は、約０．９から約１．１の範囲とすることができる。他の比および屈折率も使用され得る。

一実施形態では、スライド１８０が、ホウケイ酸ガラス（例えば、ＢＫ７ガラス）などのガラスから作製された標準の顕微鏡スライドとすることができる。スライド１８０は、約７５ｍｍ（３インチ）の長さ、約２５ｍｍ（１インチ）の幅、および約１ｍｍの厚さを有することができる。異なる材料および異なる寸法で製作されたスライドが使用されてもよい。カバーガラス１８２も、ガラス（例えば、ホウケイ酸ガラス）、または他の光学的に透明もしくは半透明の材料（例えば、プラスチックまたはポリマー）から製作され得る。スライド１８０とカバーガラス１８２の両方が、実質的な平面基板とすることができる。用語「実質的平面基板」とは、限定しないが、少なくとも１つの実質上の平面を有する任意の物体、より典型的には物体の両側に２つの実質的平面を有する任意の物体、さらに典型的には対向する実質的平面を有する任意の物体を言い、これらの対抗する面は、サイズが概ね均等であるがその物体のいずれかの他の面より大きい。

図６は、スライドを撮像するための方法３００の流れ図である。一般に、光がスライドおよび／またはカバーガラスによって内部反射されるように、光は、スライド中に向けられる。反射光は、スライドの画像を生成するために使用される１つまたは複数の蛍光放射を生じるようにスライドによって担持された標本を照射する。画像は、自動的な組織の検出または分析ルーチンを用いて使用され得る。方法３００は、図１〜図５に関して検討されるが、他の撮像システムを用いて実行されてもよい。

ステージ３０６で、顕微鏡スライドが、図１のホルダ１８１上に積まれ得る。スライド１８０は、１つまたは複数のフルオロフォアを含む試薬を用いて取り扱われる１つまたは複数の標本を担持することができる。フルオロフォアには、限定しないが、１つまたは複数の有機フルオロフォア、量子ドット、ＤＮＡ結合部、または例えば標本の特性もしくは特徴（例えば、組織試料境界、細胞構造など）を蛍光で定義し表すことのできる他の物質が含まれ得る。量子ドットは、光安定性の蛍光信号または他のタイプの蛍光放射をもたらすことができる。広域の吸収スペクトル（例えば、量子ドット吸収スペクトルは、上側または下側の紫外線領域を跨ぐことができ、量子ドットのサイズに応じて、可視領域に広がることができる）および高い量子収量（例えば、＞３０％、＞５０％または＞８０％）は、例えばアッセイ（例えば、蛍光ＨＥＲ２およびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧアッセイ）と併せて、組織中の細胞核の蛍光染色のために使用され得る。いくつかの手順では、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織学的組織部が、例えば、半導体ナノ結晶量子ドット（ＱＤоｔ）検出を用いて取り扱うこと、および蛍光染色剤４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて対比染色することに関与する、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プロトコル（例えば、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（アリゾナ州ツーソン）ＦＩＳＨプロトコルによるプロトコル）に従って用意され得る。図３は、ＤＡＰＩおよびＱＤｏｔ試薬を用いて染色された前立腺試料２２０を示す。ＱＤоｔ検出およびＤＡＰＩ蛍光は、約３７０ｎｍ＋／−２０ｎｍの波長域の紫外線光（ＵＶ光）を用いて生成することができる。いくつかのルーチンでは、光源２２２からの紫外線光が、（ＤＡＰＩなどの）紫外線吸収核対比染色ならびに多重ＱＤｏｔプローブの同時多重励起を引き起こすことができる。

ＱＤｏｔは、量子閉込めに因りサイズ依存の電子特性および光学特性を呈するナノ寸法の粒子とすることができ、例えば１つまたは複数の半導体材料（例えば、セレン化カドミウムおよび硫化鉛）、微結晶（例えば、分子線エピタキシー法を介して成長した微結晶）などから構成され得る。種々の界面化学および蛍光特性を有する様々なＱＤｏｔが、オレゴン州ユージーンのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（例えば、米国特許第６，８１５，０６４号、第６，６８２，５９６号および第６，６４９，１３８号を参照）から市販されている。量子ドットは、Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ニューヨーク州トロイ）からも市販されている。他の量子ドットには、ＺｎＳＳｅ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＳＴｅ、ＣｄＳＳｅ、ＣｄＳｅＴｅ、ＳｃＳＴｅ、ＨｇＳＳｅ、ＨｇＳｅＴｅ、ＨｇＳＴｅ、ＺｎＣｄＳ、ＺｎＣｄＳｅ、ＺｎＣｄＴｅ、ＺｎＨｇＳ、ＺｎＨｇＳｅ、ＺｎＨｇＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＳｅ、ＣｄＨｇＴｅ、ＺｎＣｄＳＳｅ、ＺｎＨｇＳＳｅ、ＺｎＣｄＳｅＴｅ、ＺｎＨｇＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳＳｅ、ＣｄＨｇＳｅＴｅ、ＩｎＧａＡｓ、ＧａＡｌＡｓおよびＩｎＧａＮ量子ドットなどの、合金量子ドットが含まれる。

図６のステージ３１０で、光は、顕微鏡スライドに対して向けられる。図１〜図５を参照すると、励起光が、図４および図５に関して検討したように、顕微鏡スライド１８０および／またはカバーガラス１８２を通って伝わることができる。蛍光撮像では、光が、例えば、標本の検出の画像処理、標本の特性特徴の同定のための画像処理、または、他の画像処理を向上させるために、高感度用の蛍光放射を生じるように蛍光試薬を刺激することができる。

図６のステージ３４０で、イメージャ１３０が、コンピューティングデバイス１４０（図１）に送信される画像を生成することができる。コンピューティングデバイス１４０は、その画像を分析し、その画像分析に基づいてイメージャ１３０に命令する。イメージャ１３０が、倍率の異なる値を提供することができる顕微鏡である場合、イメージャ１３０は、異なる倍率で、画像をキャプチャすることができる。

図６の方法３００は、幅広い異なる試料を検出するために実行され得る。用語「試料」とは、任意の液体、半固体または固体の物質（もしくは材料）を言い、その物質中または上に標的が存在し得る。特に、試料は、生物学的試料または生物学的材料から得られた試料とすることができる。生物学的試料の例には、組織試料および細胞学的試料が含まれる。いくつかの例では、生物学的試料が、ヒト被検体などの動物被検体から得られる。生物学的試料は、任意の生存中有機体から得られる、排泄されるまたは分泌される、任意の固体または液体の試料であり、その有機体には、限定しないが、バクテリア、酵母、原生生物および中でもアメーバなどの単細胞有機体、多細胞有機体（植物または動物など、これには健康なもしくは健康とみられるヒト被検体、または、がんなどの診断もしくは調査された状態もしくは疾患によって影響を受けた患者からの試料が含まれる）が含まれる。例えば、生物学的試料は、例えば血液、血漿、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の分泌液、浸出液、滲出液（例えば、膿瘍または他の感染もしくは炎症部位から得られる液体）、または、関節（例えば、正常関節もしくは疾患から影響を受けた関節）から得られた液体などから得られた生物学的液体とすることができる。生物学的試料は、任意の臓器または組織（腫瘍生検などの、生検もしくは剖検標本を含む）から得られる組織試料とすることもでき、あるいは、細胞（初代細胞であれ培養細胞であれ）、または、任意の細胞、組織もしくは臓器によって調節された培地を含むことができる。いくつかの例では、生物学的試料が、核抽出液である。いくつかの例では、生物学的試料が、バクテリア細胞質である。他の例では、試料が、試験試料である。例えば、試験試料が、被検体から得られた生物学的試料から調整された、細胞、組織または細胞ぺレットセクションである。一例では、被検体が、特定の状態または疾患の危険があるまたは患っている被検体である。

図７は、一実施形態による自動撮像システム４００の正面図である。アクセスドア４０２は、撮像システム４００にカバーガラスが覆うスライドを積むために開けられ得る。スライドを積んだ後、アクセスドア４０２が、閉じられて処理し始める。移送装置４３０（点線で概略を示す）は、撮像システム４２１、４２２（点線で概略を示す）間でスライドを移送することができる。撮像システム４２１は、組織の検出のための画像を作成することができ、撮像システム４２２は、組織分析のための画像（例えば、判読のための高解像度画像）を作成することができる。

いくつかの実施形態では、コントローラ４２０が、低解像度全スライド画像をキャプチャするように撮像システム４２１に命令することができる。撮像システム４２１は、図１の撮像システム１００と類似または同一とすることができる。コントローラ４２０は、組織試料を検出するために、低解像度画像分析することができ、検出した組織試料のより高い解像度画像をキャプチャするように撮像システム４２２に命令することができる。有利には、撮像システム４００が、スライド全体（例えば、組織試料のないスライドの範囲）をスキャンせずに、組織試料の全て（または識別された組織サンプル）の高解像度画像を得て、それによって、全体にわたる撮像時間を制限し、スループットを増大することができる。全体にわたる撮像時間は、別々のスライドの標本の個数およびサイズの相違があり得るので、サイド間で相違があり得る。

いくつかの手順では、撮像システム４２１からの蛍光強化画像が、標本についての情報を得るために使用され得る。次いで、撮像システム４２２が、スライドの明視野画像などの非蛍光強化画像をキャプチャすることができる。したがって、組織試料が、蛍光および／または明視野撮像に適した試薬を用いて染色され得る。用語「試薬」とは、組織中の標的分子または構造に添加されるとき、器具を使用して組織を検出可能にするような、生物学的または化学的物質を言う。染色剤には、限定しないが、検出可能な核酸プローブ、抗体、ヘマトキシリン、エオシン、および染料（例えば、ヨウ素、メチレンブルー、ライト染色料など）が含まれる。いくつかの手順では、標本が、撮像システム４２１を用いて撮像するためにフルオロフォア試薬を、また、撮像システム４２２を用いて撮像するために非フルオロフォア試薬を用いて染色され得る。いくつかの事例では、標本が、いずれの試薬も添加せずに撮像システム４２１によって撮像され得る先天的な自己蛍光分子を有する。いくつかの事例では、明視野試薬も、他の蛍光試薬を添加せずに撮像システム４２１によって撮像され得る有益な蛍光発光を引き起こす。いくつかの実施形態では、撮像システム４００が、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（アリゾナ州ツーソン）によるｉＳｃａｎ Ｃｏｒｅｏスキャナなどの、スキャナとすることができる。撮像システム４２１は、所望の倍率（例えば、倍率４×、１０×、２０×または４０×）で組織の範囲をスキャンする以前に、スライドを撮像するスキャナに設置され得る。本明細書で開示された撮像システムまたは構成部品は、標準スキャナを含む他のタイプの撮像機器にも組み込まれ得る。

図７を参照すると、コントローラ４２０が、撮像システム４２１、４２２および移送装置４３０に通信結合され命令することができる。コントローラ４２０には、限定しないが、一般に、１つまたは複数のコンピュータ、中央処理装置、処理デバイス、マイクロプロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、リーダなどが含まれ得る。情報（例えば、実行可能指令）を記憶するために、コントローラ４２０には、限定しないが、コンピュータ可読媒体、揮発性メモリ、不揮発性メモリ、読出し専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）などの１つまたは複数の記憶素子が含まれ得る。コントローラ４２０は、固定型コンピュータ可読媒体に記憶される一連のコンピュータ実行可能指令を用いてプログラムされる１つまたは複数のプロセッサを含むことができる。記憶されたコンピュータ実行可能指令は、検出プログラム、最適化プログラム、較正プログラム、画像処理プログラム、または他の実行可能プログラムを含むことができる。検出プログラムは、標本の境界もしくは縁部を識別する、および／またはドットを検出するように実行され得る。最適化プログラムは、性能を最適化する（例えば、撮像時間を短縮する、撮像の一貫性を強化するなど）ように実行され得る。処理は、例えば、（１）撮像スピードおよびスループットを増大する（例えば、一定の時間の長さで処理されるスライドの個数を増加させる）、および、（２）試料を正確に検出する、ように最適な境界検出ルーティングを決定することによって最適化され得る。

図７の移送装置４３０には、限定しないが、１つまたは複数のスライドハンドラ、スライドトレイ、スライドホルダなどが含まれ得る。スライドハンドラには、限定しないが、スライドマニピュレータ、Ｘ−Ｙ−Ｚ移送システム、ロボットシステム、または他のスライドを受け取り、移送できる自動システムが含まれ得る。ロボットシステムには、限定しないが、１つまたは複数のピックアンドプレイスロボット、ロボットアームなどが含まれ得る。

図８は、一実施形態による顕微鏡スライド５０２および／またはカバーガラス５０３に光を送達するように配置された光発生装置５００の平面図である。光発生装置５００は、顕微鏡スライド５０２および／またはカバーガラス５０３の縁部５１０の近位の光源５０４と間隔の空いたアレイを含むことができる。組織試料５３０（点線で示す）は、光源５４０の少なくとも１つによって出力される光によってそれぞれ励起可能な複数のフルオロフォアを含むことができる。いくつかの実施形態では、２つまたはそれより多くのフルオロフォアが、組織試料５３０に結合される。光発生装置５００はこれらのフルオロフォアのそれぞれを刺激するように、２つまたはそれより多くの波長または波長帯で光を放射することができる。このように、光源５４０からの光の個数、位置および波長／波長帯が、組織および／またはフルオロフォアの特性に基づいて、選択され得る。

図９は、一実施形態による顕微鏡スライド６１４の対向する縁部６４０、６４２に光を送達するように配置された光発生装置６００の平面図である。光発生装置６００は、縁部６４０、６４２の近位にそれぞれ配向された一対の光発生装置６３０、６３２を含むことができる。それぞれの光発生装置６３０、６３２は、光源のアレイ６４６、６４８を含む。例示の実施形態では、それぞれのアレイが、３つの光源を含むが、光源の所望の任意の個数が使用され得る。有利には、伝送損失に関連する影響は、スライド６１４を通る別個の方向で光を使用することによって最小限にまたは制限され得る。光源の任意の個数は、所望の均一な照明を得るようにスライド６１４（およびカバーガラス）を囲むことができる。

前述から、本発明の具体的な実施形態について、例証の目的のために本明細書で説明してきたが、本発明の少なくともいくつかの実施形態の説明を不必要に不明瞭にすることを避けるために、よく知られた構造および機能については詳細に示さずまたは説明しなかったことが理解されよう。例えば、光ブロックバッフルは、特定の波長または波長帯を遮断する１つまたは複数のフィルタを用いて代用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示された撮像光学系が、放射の波長を通過させながらも、光発生装置からの光の波長を遮断することができる。本明細書で開示された撮像システムは、幅広い範囲の様々なタイプの標準顕微鏡の一部でありまたは組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、撮像システム１００が、顕微鏡である。文脈が許す場合は、単数または複数の用語は、それぞれ複数または単数の用語も含むことができる。単語「または」は、単語が、２つまたはそれより多くの品目のリストを参照して他の品目から排他的に単一の品目のみを意味するように限定されるべきであることを示す表現節に関連しない限り、こうしたリスト中の「または」の使用は、（ａ）リスト中の任意の単一の品目、（ｂ）リスト中の全ての品目、または（ｃ）リスト中の品目の任意の組合せ、を含むとして解釈されるものである。単数形「１つの」および「その」は、文脈でそうでないことを明らかに示さない限り、複数の参照先を含む。したがって、例えば、「１つの標本」という記述は、１つまたは複数の標本、２つまたはそれより多くの標本、３つまたはそれより多くの標本、あるいは４つまたはそれより多くの標本を言う。

一般に、以降の特許請求の範囲では、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲で開示される特定の実施形態に特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではなく、この特許請求の範囲が権利をもつ均等物の全範囲に沿って全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

Claims (25)

1. 上側表面、下側表面および複数の縁部を有する顕微鏡スライド上に位置する標本の組織検出のための撮像システムであって、前記標本が前記上側表面に位置づけられ、
   光を前記顕微鏡スライドの１つまたは複数の前記縁部に向けるように、前記顕微鏡スライドの前記１つまたは複数の縁部の近位に配向された光源であって、それによって前記光が、前記顕微鏡スライドの前記下側表面と前記スライド上に位置する前記標本の近位のカバーガラスとの間で内部全反射し、前記光が、前記標本を刺激するように設計された波長を有するように選択される、光源と、
   カメラと
   前記標本から放射された放射光を前記カメラに向けるように配置された撮像レンズと
   を備え、
   前記光の前記内部全反射が、前記標本からの蛍光放射および／または光散乱を引き起こす、撮像システム。
2. 前記光の前記内部全反射により、励起エネルギーが前記スライドのカバーガラスで覆う範囲の少なくとも９５％に送達される、請求項１に記載の撮像システム。
3. 前記光の前記内部全反射により、励起エネルギーの空間的に実質上均一な分布をもたらす、請求項１または２に記載の撮像システム。
4. 前記カメラが単一画像で前記スライド全体をキャプチャするように、前記カメラおよび前記撮像レンズが構成される、請求項１から３のいずれか一項に記載の撮像システム。
5. 前記光源が、紫外線光源を備える、請求項１から４のいずれか一項に記載の撮像システム。
6. 前記光源が、発光ダイオード（ＬＥＤ）を備える、請求項１から５のいずれか一項に記載の撮像システム。
7. 前記標本が、組織と、フルオロフォアとを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の撮像システム。
8. 前記フルオロフォアが前記組織に結合された有機フルオロフォアを含む、請求項７に記載の撮像システム。
9. 前記フルオロフォアが、量子ドットを含む、請求項７に記載の撮像システム。
10. 前記光が、前記標本の色素原蛍光を引き起こす、請求項１から６のいずれか一項に記載の撮像システム。
11. 前記光が、前記標本の組織の自己蛍光を引き起こす、請求項１から６のいずれか一項に記載の撮像システム。
12. 前記光源からの照明が前記カメラに直接入射することを阻止する光バッフルをさらに備える、請求項１から１１のいずれか一項に記載の撮像システム。
13. ２つまたはそれより多くのフルオロフォアが、前記組織に結合され、前記光源が、前記２つまたはそれより多くのフルオロフォアのそれぞれを刺激するように、１つまたは複数の波長で光を放射するように構成された１つまたは複数の光源を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の撮像システム。
14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の前記撮像システムを組み込む、顕微鏡。
15. 前記カメラが、単一画像で実質的に前記顕微鏡スライド全体をキャプチャするサムネイルカメラを含む、請求項１４に記載の顕微鏡。
16. 顕微鏡スライドを撮像するための方法であって、
    前記顕微鏡スライドと前記顕微鏡スライドを覆うカバーガラスとの間の光の内部全反射を誘発するのに十分な角度で、前記顕微鏡スライドの縁部に光を向けるステップと、
    前記顕微鏡スライドおよび／または前記カバーガラスから放射される光をカメラに対して向けるステップと、
    前記カメラを用いて前記顕微鏡スライドの画像を生成するステップとを含む、方法。
17. 単一画像で、前記スライド全体をキャプチャするステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記顕微鏡スライドの前記縁部に前記光を向けるステップが、紫外線光を前記縁部に対して向けるステップを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
19. １つまたは複数の発光ダイオード（ＬＥＤ）から前記光を出力するステップをさらに含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記スライドおよび／またはカバーガラスから前記光を放射するために、前記顕微鏡スライドとカバーガラスとの間に位置づけられた組織に関連する、フルオロフォア、色素原、または天然起源分子のうちの少なくとも１つを刺激するステップをさらに含む、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記顕微鏡スライドの前記縁部に前記光を向けるステップが、光源から前記光を出力するステップを含み、前記方法が、前記光源からの光が前記カメラに直接入射することを阻止するステップをさらに含む、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記顕微鏡スライドの前記縁部に前記光を向けるステップが、
    前記スライド上に位置する組織に結合された第１のフルオロフォアを刺激するように、第１の波長または第１の波長帯で光を向けるステップと、
    前記組織に結合された第２のフルオロフォアを刺激するように、第２の波長または第２の波長帯で光を向けるステップとを含む、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記カメラを用いて前記スライドの前記画像を生成するステップが、単一画像で実質的に前記顕微鏡スライド全体をキャプチャするステップを含む、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記スライド上の組織および前記組織に結合されたフルオロフォアに対して、励起エネルギーの空間的に実質上均一な分布を生成するステップをさらに含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記縁部に送達される前記励起光のほとんどが、前記顕微鏡スライドおよび前記カバーガラスによって内部反射される、請求項１６から２４のいずれか一項に記載の方法。

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