CN115389474A - 一种近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于近红外倏逝波激发的上转换三维超分辨成像方法，所述方法包括以下步骤：制备基于荧光共振转移(FRET)的稀土掺杂上转换纳米探针，将其标记至待成像样品上，以实现荧光信号涨落；利用全内反射荧光显微成像(TIRFM)系统装置发生全反射时所产生的倏逝波激发待成像样品；通过调整激光入射角度，改变倏逝波的透射深度，以激发更深层待成像样品中的荧光探针；不同透射深度的倏逝波分别照射到待成像样品时，进行闪烁荧光信号的图像数据采集；采集不同深度的图像序列，利用光学径向涨落超分辨成像算法对图像进行预处理，得到横向超分辨图像；将不同深度的超分辨图像进行三维重构，实现待成像样品的三维超分辨成像。
Description
技术领域
本发明涉及光学超分辨显微成像的技术领域，具体涉及一种近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像方法及装置。
背景技术
全内反射荧光显微镜(Total Internal Reflection Microscopy，TIRFM)是近年来新兴的一种提高轴向分辨率的技术，通过利用全内反射时产生的倏逝波将激发范围限制在200nm轴向范围内，从而大大降低了背景光噪声干扰，实现了很好的光学层切能力和轴向分辨率，适用于对较薄的生物组织如细胞膜表面物质的观察。然而传统全内反射荧光显微镜的横向分辨能力仍然衍射受限，同时其轴向分辨能力也待进一步提高。
光学径向涨落的超分辨成像算法是一种有效提高横向分辨率的统计分析方法。在不需要专门设备的情况下，光学径向涨落超分辨成像可通过求解分析荧光涨落信号的径向梯度变化，以定位出荧光分子中心区域的位置，最终实现生物亚细胞结构突破光学衍射极限的二维超分辨成像。但光学径向涨落超分辨成像无法实现三维超分辨成像。
使用稀土掺杂上转换纳米材料(Upconversion nanoparticles，UCNPs)作为细胞纳米探针，利用其荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)性质产生荧光信号波动现以进行光学径向涨落超分辨成像。通过TIRF照明产生的倏逝波来限制照明区域的深度，降低了背景噪声的影响，信噪比得到了较大的提高。但由于该方法的成像区域受限于倏逝波的穿透深度，因此传统TIRF与光学径向涨落超分辨成像的组合无法对生物样品进行三维超分辨成像。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像方法及装置。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像方法及装置，所述方法包括以下步骤：
S1制备基于荧光共振能量转移(FRET)的稀土掺杂上转换纳米探针，将其标记至待成像样品上，以实现荧光信号涨落；
S2荧光共振能量转移主要通过两种发光粒子实现分别为供体D和受体A，供体D为稀土离子可被近红外光激发，辐射可见光，受体A可为稀土离子或有机染料。
S3供体D的辐射光范围要与受体A的激发光范围重叠，荧光信号涨落主要包括两种形式，一是供体D或受体A中的任意一个被标记与样品上，另外一种粒子处于游离状态(D或D)，由于布朗运动，在浓度足够时，供体D与受体A会相接触，从而D的辐射光强会降低，受体A的荧光辐射会增强，二者不接触时则D不发光，从而生成荧光涨落。二是，供体D与受体A通过化学键相连接，受体A可自发产生荧光涨落波动
S4利用全内反射荧光显微成像(TIRFM)系统装置发生全反射时所产生的倏逝波激发待成像样品。通过调整激光入射角度，改变倏逝波的透射深度，选择性激发处于不同深度的待成像样品，实现三维切片显微成像；
S5倏逝波照射到待成像样品时，进行闪烁荧光信号的图像数据采集。采集不同深度的图像序列，利用光学径向涨落超分辨成像算法对图像进行预处理，得到横向超分辨图像；
S6将不同深度的超分辨图像进行三维重构，实现待成像样品的三维超分辨成像。
需要说明的是，所述步骤S4中包括：
S4.1 TIRF照明发生全反射时入射光的最小射角度为θ1，渗透深度为d1，通过sCMOS相机采集的荧光图像序列为S1；
S4.2增大入射角度为θ2，此时渗透深度为d2，通过sCMOS相机采集的荧光图像序列为S2；其中d2<d1；
S4.3计算渗透深度d1-d2对应的待成像样品图像为S1-S2；
S4.4逐渐增大入射角度，直到得到渗透深度d1-dn+1对应的待成像样品图像S1-Sn+1，实现不同深度的待成像样品成像。
需要说明的是，所述基于FRET的稀土掺杂上转换纳米探针供体-受体对，以NaGdF4为基质，掺杂稀土元素Yb3+离子为敏化离子，Tm3+为活化离子，将NaGdF4:Tb3+UCNPs标记至待成像样品上；其中NaGdF4:Yb3+/Tm3+为能量供体，NaGdF4:Tb3+为能量受体，通过Gd3+亚晶格介导的能量迁移实现高效的上转换发光，利用自由扩散发生荧光共振能量转移，从而使待成像样品产生荧光闪烁信号。
需要说明的是，所述基于FRET的稀土掺杂上转换纳米探针供体-受体对，同样可以以NaYF4为基质，掺杂稀土元素Yb3+离子为敏化离子，Tm3+为活化离子，将NaYF4:Yb/Tm上转换稀土探针通过化学键羧基与羟基与有机染料相连接，如Alexa 488相连接。其中NaYF4:Yb/Tm为能量供体，Alexa 488为能量受体，通过供体被近红外光激发辐射可见光，然后高效传能于Alexa 488，实现染料发光，而染料会自发实现荧光涨落波动，从而使待成像样品产生荧光闪烁信号。
需要说明的是，所述步骤S5中包括：
S5.1将所采集的荧光波动信号记录成图像序列，每个所述图像序列包含预定个数的帧；
S5.2所述利用光学径向涨落超分辨成像算法，通过求解分析荧光涨落信号的径向梯度变化以定位出荧光分子中心区域的位置；
S5.3经算法处理后所得图像为横向超分辨图像。
本发明还提供一种近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块，其中，所述激发光路模块包括：近红外激光器，以及沿激光光束前进方向依次放置的激发滤光片、高反低通二向色镜与高NA物镜；激光器发出的近红外激光通过激发滤光片后经高反低通二向色镜反射，再调整聚集光束在TIRF物镜背焦面的位置，透射后照射到玻片上实现全反射，产生倏逝波照射到待成像样品上；所述成像光路模块包括发射滤光片和sCMOS相机；当所述高NA物镜收集上转换纳米探针由于FRET效应所产生的荧光闪烁信号，经过高反低透二向色镜、发射滤光片后，由sCMOS相机进行图像数据采集。
需要说明的是，近红外激光器是通过外部端口耦合到显微镜，输入光纤连接器与显微镜光路的对准是可调节的，其中端口的位置由螺旋测微杆进行控制，通过旋转螺旋测微杆，可改变近红外激光照射通过高NA物镜的入射角，以产生不同透射深度的倏逝波；通过记录能调节端口移动位置的螺旋测微杆的示数和此时样品所在成像位置深度，可计算获得螺旋测微杆示数和成像位置的关系曲线。
与现有技术相比，将多角度TIRFM和光学径向涨落超分辨成像算法相结合来提高多向分辨率，本发明的优势为：
1、相较于传统的全内反射显微镜，多角度全内反射照明的深度成像方法可以在不改变显微镜任何结构的情况下，使待成像样品的轴向分辨率得到了极大提高。
2、稀土掺杂上转换纳米材料除了具有特异性窄带发射和低细胞毒性的优势，也具有实现近红外光激发的特点，可将倏逝波光场厚度提高至为～500nm，以提高成像照明深度，解决现有可见光激发全内反射荧光成像中成像深度低于200nm的问题。
3、光学径向涨落超分辨成像技术具有系统简单易搭建、光毒性小，可实现横向超分辨成像(～100nm)的优势，在活细胞成像及动态检测中有着广阔的应用前景。但其没有轴向超分辨的能力，无法实现三维超分辨成像。而多角度TIRFM与光学径向涨落超分辨成像技术的结合可以解决上述问题，实现三维超分辨成像。
附图说明
图1为本发明的一种近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像方法流程示意图；
图2为本发明的一种近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像装置示意图；
图3为本发明的多角度全内反射照明的不同深度成像模式示意图；
图4为本发明在不同激发波长下(近红外光与传统可见光)，入射角度与倏逝波穿透深度的关系示意图；
图5为实施例1中重建的轴向超分辨率图和螺旋测微杆示数与样品所在成像位置深度的关系曲线；
图6为实施例2中NaGdF4:Yb3+/Tm3+与NaGdF4:Tb3+UCNPs间的能量传递机制示意图；
图7为实施例2中NaGdF4:Yb3+/Tm3+与NaGdF4:Tb3+UCNPs的发光光谱与透射电镜图；
图8为实施例2中NaGdF4:Yb3+/Tm3+与NaGdF4:Tb3+UCNPs的闪烁性质分析图；
图9为实施例2中待成像样品的光学径向涨落超分辨成像结果图。
附图标记说明：1、近红外激光器；2、三维可调光纤耦合校准口；3、激发滤光片；4、高反低通二色镜；5、高NA物镜；6、载物台(含成像玻片)；7、待成像样品；8、发射滤光片；9、sCMOS相机。
具体实施方式
以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
如图1所示，本发明为一种近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像方法，所述方法包括以下步骤：
S1制备基于荧光共振能量转移(FRET)的稀土掺杂上转换纳米探针，将其标记至待成像样品上，以实现荧光信号涨落；
S2荧光共振能量转移主要通过两种发光粒子实现分别为供体D和受体A，供体D为稀土离子可被近红外光激发，辐射可见光，受体A可为稀土离子或有机染料。
S3供体D的辐射光范围要与受体A的激发光范围重叠，荧光信号涨落主要包括两种形式，一是供体D或受体A中的任意一个被标记与样品上，另外一种粒子处于游离状态(A或D)，由于布朗运动，在浓度足够时，供体D与受体A会相接触，从而D的辐射光强会降低，受体A的荧光辐射会增强，二者不接触时，则D不发光，从而生成荧光涨落。二是，供体D与受体A通过化学键相连接，受体A可自发产生荧光涨落波动
S4利用全内反射荧光显微成像(TIRFM)系统装置发生全反射时所产生的倏逝波激发待成像样品。通过调整激光入射角度，改变倏逝波的透射深度，选择性激发处于不同深度的待成像样品，实现三维切片显微成像；
S5倏逝波照射到待成像样品时，进行闪烁荧光信号的图像数据采集。采集不同深度的图像序列，利用光学径向涨落超分辨成像算法对图像进行预处理，得到横向超分辨图像；
S6将不同深度的超分辨图像进行三维重构，实现待成像样品的三维超分辨成像。
进一步的，如图3所示，本发明的所述步骤S4中包括：
S4.1 TIRF照明发生全反射时入射光的最小射角度为θ1，渗透深度为d1，通过sCMOS相机采集的荧光图像序列为S1；
S4.2增大入射角度为θ2，此时渗透深度为d2，通过sCMOS相机采集的荧光图像序列为S2；其中d2<d1；
S4.3计算渗透深度d1-d2对应的待成像样品图像为S1-S2；
S4.4逐渐增大入射角度，直到得到渗透深度d1-dn+1对应的待成像样品图像S1-Sn+1，实现不同深度的待成像样品成像。
需要说明的是，根据Snell定律，当一束光穿透折射率由大到小的两种介质时，入射角增大到临界角θc：
此时的折射光将完全消失，发生全反射现象。其中，θ为入射光的入射角度，d为倏逝波的渗透深度，n1为玻片6的折射率，n2为待成像样品7的折射率。
对给定的物镜，最大入射角由TIRFM成像系统物镜5的数值孔径NA确定：
当入射角范围θc＜θ＜θmax时，绝大多数光发生全反射，但有一部分光会以平行界面的方向传播。其中，倏逝波的频率与入射光线的频率相同，光的强度I(z)随临界面的垂直距离z呈指数衰减：
I(z)＝I(0)e-z/d (3)
其中，入射光的入射角度与倏逝波的渗透深度的关系表达式为：
根据上述公式得出，随着入射角的不断增大，倏逝波的透射深度将不断减小，如图4所示。
进一步的，本发明的所述基于FRET的稀土掺杂上转换纳米探针供体-受体对，以NaGdF4为基质，掺杂稀土元素Yb3+离子为敏化离子，Tm3+为活化离子，将NaGdF4：Tb3+UCNPs标记至待成像样品上；其中NaGdF4：Yb3+/Tm3+为能量供体，NaGdF4：Tb3+为能量受体，通过Gd3+亚晶格介导的能量迁移实现高效的上转换发光，利用自由扩散发生荧光共振能量转移，从而使待成像样品产生荧光闪烁信号。
同样地，本发明的所述基于FRET的稀土掺杂上转换纳米探针供体-受体对，也可以以NaYF4为基质，掺杂稀土元素Yb3+离子为敏化离子，Tm3+为活化离子，将NaYF4:Yb/Tm上转换稀土探针通过化学键羧基与羟基与有机染料相连接，如Alexa 488相连接。其中NaYF4:Yb/Tm为能量供体，Alexa 488为能量受体，通过供体被近红外光激发辐射可见光，然后高效传能于Alexa 488，实现染料发光，而染料会自发实现荧光涨落波动，从而使待成像样品产生荧光闪烁信号。
进一步的，本发明的所述步骤S5中包括：
S5.1将所采集的荧光波动信号记录成图像序列，每个所述图像序列包含预定个数的帧；
S5.2所述利用光学径向涨落超分辨成像算法，通过求解分析荧光涨落信号的径向梯度变化以定位出荧光分子中心区域的位置；
S5.3经算法处理后所得图像为横向超分辨图像。
如图2所示，本发明还提供一种基于近红外倏逝波激发的上转换三维超分辨成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块。
其中，所述激发光路模块包括：近红外激光器1，以及沿激光光束前进方向依次放置的激发滤光片3、高反低通二向色镜4与高NA物镜5；980nm单模激光器1发出的近红外的激光通过激发滤光片3后经高反低通二向色镜4反射，再调整聚集光束在TIRF物镜5背焦面的位置，透射后照射到玻片6上实现全反射，产生倏逝波照射到待成像样品7上。
需要说明的是，所述近红外激光器1是通过外部端口2耦合到显微镜，输入光纤连接器与显微镜光路的对准是可调节的，其中端口2的位置由螺旋测微杆进行控制，通过旋转螺旋测微杆，可改变近红外激光照射通过高NA物镜5的入射角，以产生不同透射深度的倏逝波。通过记录能调节端口2移动位置的螺旋测微杆的示数和此时样品所在成像位置深度，可计算获得螺旋测微杆示数和成像位置的关系曲线。
其中，所述成像光路模块包括发射滤光片8和sCMOS相机9；当所述高NA物镜5收集上转换纳米探针由于FRET效应所产生的荧光闪烁信号，经过高反低透二向色镜4、发射滤光片8后，由sCMOS相机9进行图像数据采集。
实施例1
采用图2所示的一种基于近红外倏逝波激发的上转换三维超分辨成像装置工作方法如下：
近红外激光器1发出的近红外激光光束入射到激发滤光片3后经高反低通二向色镜4反射，再调整聚集光束在物镜5背焦面的位置，透射后照射到玻片6上实现全反射，产生倏逝波照射到由稀土掺杂上转换纳米探针标记好的待成像样品7上。待成像样品7发出荧光信号被物镜5收集起来，通过高反低通二向色镜4，经过发射滤光片8滤去收集到的荧光中的杂散光，然后由sCMOS相机9进行图像数据采集，得到待成像样品7内部的荧光标记分子闪烁的荧光信号。
为了建立螺旋测微杆示数和样品所在成像深度之间的关系，本文利用被上转换纳米颗粒标记后的聚丙乙烯小球进行定标成像。将标记好的UCNPs-PS小球沉积在成像玻片8上，采用近红外激光器1激发，在TIRF物镜5镜头上滴入镜油，以匹配其折射率，通过调节外部端口2，调节近红外激光光束至垂直入射角度，得到宽场成像模式，如图5(a)所示。通过调节外部端口2，方向由原本竖直向上转变为水平面方向，得到临界角成像模式，如图5(b)所示。通过调节端口2，继续调节近红外激光束入射角度，逐渐增大入射到待成像样品7的入射角度，直至最大入射角，使透射深度不断降低，以实现不同深度的待成像样品成像，如图5(d)所示。通过对多个UCNPs-PS进行测量和分析计算，拟合出了螺旋测微杆示数与此时样品所在成像位置深度的关系曲线，如图5(e)所示。
实施例2
基于UCNPs粒子对之间的能量迁移上转换机制，如图6所示，构建了利用扩散辅助的闪烁发光体系，具体方法如下：
采用共沉淀法制备NaGdF4:Yb3+/Tm3+与NaGdF4:Tb3+UCNPs作为能量供受体。采用近红外激光器1激发，NaGdF4:Yb3+/Tm3+上转换纳米材料可辐射出多种波长的荧光，而NaGdF4:Tb3+上转换纳米材料则不发光。同时在相同功率的980nm激光激发下，检测NaGdF4:Yb3+/Tm3+与NaGdF4:Tb3+UCNPs混合后的发光光谱，如图7所示。利用NOBF4水溶性处理对二者表面进行修饰，以去除其表面的疏水有机配体；同时采用PAA对NaGdF4:Tb3+上转换纳米探针进行包覆，使探针表面具备与待成像样品7相结合的官能团，并将其置于含NaGdF4:Yb3+/Tm3+UCNPs溶液中。
在TIRFM下采用980nm激光照射待成像样品7，通过添加多种特定滤光片，选择性地收集NaGdF4:Tb3+辐射出的荧光信号波段进行闪烁分析。每帧图像的曝光时间为30ms，如图8所示，从待成像样品7的荧光图像截取两部分区域，选取包含标记部位的5×5像素作为信号区域，计算该区域内像素的平均值代表标记处的荧光强度，可得到其荧光强度随时间变化的曲线，表现出一定的荧光波动信号。对其进行光学径向涨落超分辨成像算法处理后，结果与传统TIRFM成像相比，图像横向分辨率得到了一定的提升，如图9所示。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1制备基于荧光共振能量转移(FRET)的稀土掺杂上转换纳米探针，将其标记至待成像样品上，以实现荧光信号涨落；
S2荧光共振能量转移主要通过两种发光粒子实现分别为供体D和受体A，供体D为稀土离子可被近红外光激发，辐射可见光，受体A可为稀土离子或有机染料。
S3供体D的辐射光范围要与受体A的激发光范围重叠，荧光信号涨落主要包括两种形式，一是供体D或受体A中的任意一个被标记与样品上，另外一种粒子处于游离状态(A或D)，由于布朗运动，在浓度足够时，供体D与受体A会相接触，从而A的辐射光强会降低，受体A的荧光辐射会增强，二者不接触时则D不发光，从而生成荧光涨落。二是，供体D与受体A通过化学键相连接，受体A可自发产生荧光涨落波动
S4利用全内反射荧光显微成像(TIRFM)系统装置发生全反射时所产生的倏逝波激发待成像样品。通过调整激光入射角度，改变倏逝波的透射深度，选择性激发处于不同深度的待成像样品，实现三维切片显微成像；
S5倏逝波照射到待成像样品时，进行闪烁荧光信号的图像数据采集。采集不同深度的图像序列，利用光学径向涨落超分辨成像算法对图像进行预处理，得到横向超分辨图像；
S6将不同深度的超分辨图像进行三维重构，实现待成像样品的三维超分辨成像。
2.根据权利要求1所述一种基于近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤S2中包括：
S2.1 TIRF照明发生全反射时入射光的最小射角度为θ1，渗透深度为d1，通过sCMOS相机采集的荧光图像序列为S1；
S2.2增大入射角度为θ2，此时渗透深度为d2，通过sCMOS相机采集的荧光图像序列为S2；其中d2<d1；
S2.3计算渗透深度d1-d2对应的待成像样品图像为S1-S2；
S2.4逐渐增大入射角度，直到得到渗透深度d1-dn+1对应的待成像样品图像S1-Sn+1，实现不同深度的待成像样品成像。
3.根据权利要求1所述一种基于近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述基于FRET的稀土掺杂上转换纳米探针供体-受体对，以NaGdF4为基质，掺杂稀土元素Yb3+离子为敏化离子，Tm3+为活化离子，将NaGdF4:Tb3+UCNPs标记至待成像样品上；其中NaGdF4:Yb3+/Tm3+为能量供体，NaGdF4:Tb3+为能量受体，通过Gd3+亚晶格介导的能量迁移实现高效的上转换发光，利用自由扩散发生荧光共振能量转移，从而使待成像样品产生荧光闪烁信号。
4.根据权利要求1所述一种基于近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述基于FRET的稀土掺杂上转换纳米探针供体-受体对，可以以NaYF4为基质，掺杂稀土元素Yb3+离子为敏化离子，Tm3+为活化离子，将NaYF4:Yb/Tm上转换稀土探针通过化学键羧基与羟基与有机染料相连接，如Alexa 488相连接。其中NaYF4:Yb/Tm为能量供体，Alexa488为能量受体，通过供体被近红外光激发辐射可见光，然后高效传能于Alexa 488，实现染料发光，而染料会自发实现荧光涨落波动，从而使待成像样品产生荧光闪烁信号。
5.根据权利要求1所述一种基于近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤S5中包括：
S5.1将所采集的荧光波动信号记录成图像序列，每个所述图像序列包含预定个数的帧；
S5.2所述利用光学径向涨落超分辨成像算法，通过求解分析荧光涨落信号的径向梯度变化以定位出荧光分子中心区域的位置；
S5.3经算法处理后所得图像为横向超分辨图像。
6.一种基于近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，包括激发光路模块和成像光路模块，其中，所述激发光路模块包括：近红外激光器，以及沿激光光束前进方向依次放置的激发滤光片、高反低通二向色镜与高NA物镜；激光器发出的近红外激光通过激发滤光片后经高反低通二向色镜反射，再调整聚集光束在TIRF物镜背焦面的位置，透射后照射到玻片上实现全反射，产生倏逝波照射到待成像样品上；所述成像光路模块包括发射滤光片和sCMOS相机；当所述高NA物镜收集上转换纳米探针由于FRET效应所产生的荧光闪烁信号，经过高反低透二向色镜、发射滤光片后，由sCMOS相机进行图像数据采集。
7.根据权利要求6所述一种基于近红外倏逝波激发的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，近红外激光器是通过外部端口耦合到显微镜，输入光纤连接器与显微镜光路的对准是可调节的，其中端口的位置由螺旋测微杆进行控制，通过旋转螺旋测微杆，可改变近红外激光照射通过高NA物镜的入射角，以产生不同透射深度的倏逝波；通过记录能调节端口移动位置的螺旋测微杆的示数和此时样品所在成像位置深度，可计算获得螺旋测微杆示数和成像位置的关系曲线。
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