CN114216887B - 偏振调制提高受激发射损耗显微系统分辨率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了偏振调制提高受激发射损耗显微系统分辨率的方法,包括:1、在受激发射损耗显微系统的激发光路上,加入激光偏振调制模块用以旋转激发光的偏振方向,引入荧光偏振调制,同一个荧光标记的样品获得不同激发偏振态的受激发射损耗显微镜成像;使用反卷积迭代算法,重构出多张图片并叠加,最终恢复原始图像;2、使用STED原理构建突破光学极限的有效点扩函数,形成极小的激光光斑。本发明利用超分辨率营造的极小的激发焦斑,加强偏振调制的荧光稀疏性,增加荧光偏振调制的角度敏感性,增强偏振调制的分辨率,在实现不增加损耗光功率的情形下提高STED显微系统的空间分辨率,克服其在生物成像时面临的分辨率受限于高激光功率的瓶颈问题。
Description
技术领域
本发明属于超分辨荧光成像技术领域,具体涉及偏振调制提高受激发射损耗显微系统分辨率的方法,采用偏振调制进一步提高现有的超分辨成像技术——受激发射损耗成像技术的空间分辨率,实现更高精度的成像,其适用于医学、生命科学研究中对样品的高分辨率成像。
背景技术
随着生物医学领域的快速发展,显微成像技术已经越来越受到生物和医学领域的关注,由于光学显微术不仅可以实现对活体生物组织的无损伤、非侵入及实时的探测和成像,还可以获取样品重要的光学信息(如反射率,折射率,偏振态以及光谱等信息)和一些特性参数测量(如吸收系数,散射系数等)。例如,在生物样品中使用荧光分子标记特定的蛋白质,荧光显微镜就可以追踪定位单个蛋白质分子,开展对活细胞进行实时监测观察,实现其生命活动特征的探测。因此它已经成为生命科学研究中的重要手段。由于光学衍射极限指出普通的光学显微镜只能分辨尺寸大于200nm的物质。为了打破光学衍射极限,科学家从光学性质出发,利用波长、偏振,相位等光学性质,设计了超分辨荧光显微,偏振显微等光学显微技术。
最近几年,荧光偏振调制被提出用于实现超分辨成像。其原理是在荧光成像中,只有在荧光分子的极化方向与入射光的偏振方向平行时,荧光分子才能被完全激发;当旋转入射光的偏振状态时,荧光分子的辐射强度受到其极化方向与入射光偏振方向之间的角度调制,荧光强度以余弦平方的响应发生变化,衍射极限内不同方向的荧光分子在不同时刻辐射最大荧光强度,增加了采集图像的稀疏性。稀疏性也是单分子定位显微镜实现超分辨成像的有效方法。因此,荧光的偏振调制就具备了实现超分辨成像的潜力。2014年,德国马普所walla研究小组首次提出基于偏振调制的荧光超分辨成像技术,通过对入射激光的偏振调制,获取多个激光偏振角度下的荧光图像系列,利用稀疏去卷积的算法重构出超越衍射极限的图像,在宽场荧光显微镜上实现了亚衍射分辨率。随后,2016年,北京大学席鹏教授的课题组提出了基于偏振调制的偶极子方向的荧光超分辨成像技术,该方法通过偏振调制获取荧光图像序列,在处理数据时,改进了算法,通过加强稀疏的去卷积和最小二乘估计的算法获取了超越衍射极限的荧光偶极子的取向分布。相比于宽场显微镜,激光共聚焦扫描显微镜有着更好的轴向和横向分辨率,能够减少离焦噪声的影响,浙江大学超分辨课题小组将偏振调制应用至共聚焦扫描成像显微镜,实现了大约λ/5分辨率的超分辨成像。随后,在2018年,该课题组将偏振调制结合多角全内反射显微镜实现了横向和纵向的三维超分辨成像。利用偏振调制增加荧光发光的稀疏性,稀疏解调实现了超分辨成像的能力,该方法的实现只需对硬件系统进行简单改造,即在激发光路中插入偏振调制模块(比如安装在旋转台上的半波片)。同时,荧光的偏振特性是普通荧光染料具备的基本特性之一,因此,偏振调制的超分辨方法具有系统简单、适用样品范围广等优点。
受激发射损耗(STED)显微技术是由2014年度诺贝尔化学奖获得者Stefan W.Hell教授提出,并被广泛用于生化研究的重要超分辨成像工具。该方法的最大优点是一种纯光学调控的方法,直接获得小于衍射极限的点扩散函数。与PALM和STORM等单分子定位超分辨技术相比,具有更快的时间分辨率,更加精细的三维解析能力。STED系统通常使用两束激光实现超分辨成像,一束作为激发光,另一束为环形的损耗光通过受激辐射效应去激励耗尽激发焦斑外围的荧光分子发光,仅留下衍射极限中心的荧光,扫描采集该荧光信号,获得超分辨成像。该系统可以在激光共聚焦显微系统的基础上,增加损耗光路进行升级来实现,有较好的实验室适用性。STED分辨率与损耗光强呈现非线性关系,原理上,无限提高损耗光功率可以实现STED分辨率的无限提高。但实际成像中,受激辐射损耗光强非常高,一般为激光共聚焦成像的100倍,损耗光功率过大容易导致荧光团的光漂白和光毒性等问题,在生物成像应用中受到限制。1994年,Stefan W.Hell课题组提出受激发损耗显微成像的基本与原理,第一次提出远场超分辨的基本技术思路。直到2000年,Stefan W.Hell课题组在PNAS发表论文,第一次在生物样品上取得了97nm的分辨率。2007年,Hell课题组使用STED技术与R-L去卷积技术结合,成功获得线粒体Tom20蛋白和F1F0-ATP合成酶的空间相对关系。2011年,Stefan W.Hell课题组提出了使用时间门来降低连续光受激发射损耗显微镜(CW-STED)的损耗光功率,但该方法牺牲了荧光信号,降低成像的信噪比。2013年,Hell课题组提出了了一种基于光纤激光器的受激发射耗竭显微镜,它在原始数据图像中提供了~20nm的分辨率,在荧光相关光谱中提供了15-19nm直径的探测区域。采用纳秒周期和775nm波长的受激发射耗尽脉冲同时沉默两个荧光团,确保无偏移共局域分析。通过揭示爪蟾核孔复合物的八聚体排列和定量标记脂质分子在人工和活细胞膜中的扩散,证明了这种超分辨方法的多功能性。而近年来,发展优越抗光漂白性质、高亮度的荧光探针或者使用特殊的氧化还原系统(ROXS)、还原剂(抗坏血酸或Trolox)和氧化剂(甲基维生素或Trolox-醌)等来提高荧光团的光稳定性的方法,可以在一定程度上缓解此类问题。
因此,如何通过不增加激光功率、寻找一种合适的方案进一步提高受激发射损耗显微镜超分辨系统的成像分辨率,仍然是目前光学显微成像领域面临的重要问题。
发明内容
针对现有技术中的不足与难题,本发明旨在提供一种偏振调制提高受激发射损耗显微系统分辨率的方法。
本发明通过以下技术方案予以实现:
偏振调制提高受激发射损耗显微系统分辨率的方法,该方法包括两部分:
第一部分,在受激发射损耗显微系统的激发光路上,加入激光偏振调制模块用以旋转激发光的偏振方向,进而旋转激发光偏振角度,引入荧光偏振调制,荧光标记的样品在激发光偏振角度下,获得不同激发偏振态的受激发射损耗显微镜成像;最后使用反卷积迭代算法,重构出横向分辨率;
第二部分,使用STED原理构建突破光学极限的有效点扩函数,利用上述构建的有效点扩函数形成极小的激光光斑,进一步加强偏振调制的荧光稀疏性,增加荧光偏振调制的角度敏感性,最终提高受激发射损耗显微系统的分辨率。
本发明的理论依据为:
1、本发明在受激发射损耗显微镜中,通过对激发光的偏振态的调制,控制荧光分子的辐射强度,荧光分子的辐射强度受到自身的极化方向与入射光的偏振方向的相对角度调制。由于光的矢量特性,它与荧光分子之间相互作用是对偏振敏感的;在荧光成像中,只有荧光分子的极化方向与激发光的偏振方向平行的时候,荧光分子够被充分激发;使用线偏振光作为激发光路,随之线偏振转动,发射强度随着入射偏振角发生改变;经过验证,荧光分子的辐射强度与极化方向和偏振角度之间呈现一个如公式(1)所示的类余弦函数:
式中:u(α)是荧光分子最终的分布情况,I0是激发光强与探测器测试曝光的常数,h(α)是系统总体点扩散函数;S是荧光分子分布情况,也就是原始图像;α是激发光变化的线偏振方向,β是荧光分子极化方向,b是成像过程中产生的噪声;
2、受激发射损耗术的光路被分为激发光和中心光强为零的环形损耗光两部分,然后将激发光与中心光强为零的损耗光重合并叠加,中心光强为零的损耗光迫使激发光焦斑外围的荧光分子发生受激发射现象而损耗,从而得到尺寸小于衍射极限的激发光;受激发射损耗成像的有效强度点扩散函数为:
IE(x,y,z)=Iexc(x,y,z)exp(-Isted(x,y,z)(Imax/Is)) (2)
式中:IE(x,y,z)为受激发射损耗的有效强度点扩散函数,Iexc(x,y,z)为激发场强度点扩散函数,Isted(x,y,z)为归一化的损耗场强度点扩散函数,Imax/Is为饱和因子,Imax为损耗光的最大光强,Is为最大饱和光强;
3、由于光的量子特性,使得光子的传播符合泊松分布,最终探测器得到的原始图像为:
I(α)~Poission(u(α)) (3)
为了重构荧光分子的分布情况,我们采用了基于反卷积的偏振调制算法,重建图像就是不断减小一个负泊松对数似然函数:
l(u,I)=u-Ilog(u) (4)
式中:I是荧光成像序列,u是上述的荧光分布情况。
为了避免这个病态问题的过拟合化,必须加上正则化参数。由于稀疏性的存在,在惩罚函数中引入两项L1范数,第一项保证分子分布的稀疏性,第二项则是来自缓慢变化的背景噪声。目标函数为:
似然函数为凸函数,通常可以用梯度下降法求解,但梯度下降速度比较慢,为了加快最小化过程收敛,本发明使用快速迭代收缩阈值算法,每次迭代后,加入软阈值;由于两个L1范数是相互独立的,每次迭代时可以交替求解。
本发明方法具体步骤为:
S1、在构建好的受激发射损耗显微镜中,线偏振的激发光路上插入偏振调制模块,偏振调制模块通过旋转半波片或者使用液晶延迟器来实现旋转激发光偏振角度,通过使用偏振装置均匀改变激发光的偏振状态α,控制荧光分子的辐射强度,引入荧光的稀疏性,使得荧光分子的光强分布符合公式(1)的类余弦函数;
在该成像模型中,未知量为S,b和θ,要求出这三个未知量,至少需要三个不同方向下的线偏振光照射;本发明将激发光偏振状态的旋转角度调制为均匀分布在0°到180°的N个角度,其中N≥3;同一个荧光标记的样品在N个激发光偏振角度下,获得N次不同激发偏振态的受激发射损耗显微镜成像;最后使用反卷积迭代算法,重构出横向分辨率进一步提高的图像。
S2、将损耗光调节至一定功率强度,产生空心焦斑,通过二向色镜,将损耗光与激发光叠加,构建突破光学衍射极限的极小点扩散函数E(x,y,z),见公式(2),利用N个方向的线偏振光荧光标记的样本,获取具有荧光偏振特性的荧光成像序列I;
令
E(α)=I0h(α)
式中,E(α)为
得
S3、获得荧光成像序列I,再通过空域和频域变化,分别分析图像中荧光偶极之间的相对关系,并使用反卷积算法,迭代求解公式(5),重构出N张图片并叠加,最终恢复原始图像。
与现有技术相比,本发明的有益效果包括:
(1)本发明可以在不增加激光功率的前提下提高受激发射损耗显微镜超分辨系统的成像分辨率,克服STED用于生物成像时面临的分辨率受限于高激光功率的瓶颈问题。
(2)本发明利用偏振调制进一步提高受激发射超分辨成像系统的分辨率的方法,将偏振调制的荧光激发应用于超分辨显微成像,利用超分辨系统的高分辨率营造的极小的激发焦斑内,更少的荧光团数目参与偏振响应,进一步增加了荧光的稀疏性,加强的偏振调制的荧光稀疏性,更容易实现偏振调制的分辨率增强,该分辨率增强效果叠加在超分辨成像系统上,进一步提高现有超分辨系统的分辨率。
附图说明
图1为受激发射损耗显微成像的光斑模拟;
图2为荧光偏振原理图;
图3为荧光偏振的的不同偏振光辐射样品的示意图;
图4为将荧光偏振调制应用于受激发射显微成像系统的Matlab仿真图,其中图4(a)是FWHM为200nm的去卷积结果,图(b)是FWHM为100nm的去卷积结果;
图5为基于偏振调制的受激发射损耗显微成像系统的具体实施图。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明作进一步地说明。
图2为荧光偏振原理图,为了更好地说明本发明的成像原理,即超分辨系统增强偏振调制稀疏性,进而实现偏振调制对分辨率的进一步提高的原理,我们使用距离30nm,取向角度为0°、30°和40°的三个荧光团,使用0°、45°、90°和135°的线偏振光辐照样品,进行了偏振调制的激光共聚焦扫描成像(分辨率约208nm)和连续光受激发射损耗显微镜成像(分辨率为56nm)的仿真,如图1所示。
和图1(a)中激光共聚焦图像相比,图1(b)中不同线偏振角度下的STED图像展示了荧光辐射强度的变化,借助超分辨显微镜的高空间分辨率实现了偏振调制的稀疏增强;同时,相比于普通的STED成像中荧光小球的像重叠在了一起的情况〔如图1(c)所示),图1(b)中偏振调制的图像稀疏性给出了更多的空间信息,能够进一步获得更高的分辨率。对偏振调制的荧光图像进行反卷积解调的算法处理,进行图像重建,如图1(d)所示,实现了三个荧光小球的分辨。
图4为Matlab软件仿真的效果图,分别展示FWHM为200nm原始光斑的去卷积效果图和FWHM为100nm的经过空心光斑猝灭的100nm光斑的去卷积效果图。为了说明偏振调制对分辨率的作用,使用图1中的原始光斑和经过损耗之后的STED光斑对仿真角度为30°,50°,70°和90°的荧光偶极子对比作为样本,令它们分别相距50nm,100nm,150nm的距离,在荧光显微成像系统中,对比原始光斑和基于偏振调制的超分辨显微成像。
如图3所示,其展示了FWHM为200nm的原始光斑辐射样品,经过从0°到162°,步长为18°的偏振调制之后的样品呈现不同形状,样本图像经过荧光显微成像之后,不同距离不同方向角的两个荧光分子被模糊成一个光斑。不同的是原始光斑经过偏振调制之后,当两个荧光偶极的相对角度大于70°时,只能分辨出150nm。而经过STED光斑经过怕偏振调制之后可以分辨出50nm。
图5为基于偏振调制的受激发射损耗显微成像系统的具体实施图,本实例展示了通过在激发光路中加入偏振调制装置,均匀调节线偏振的偏振状态,通过第一个DC反射。将损耗光调节至一定的功率强度,形成空心焦斑。在第二个DC处,与激发光路中线偏振光叠加,构建极小光斑。利用多个角度的线偏振光依次激发荧光探针标记的样品,获得不同偏振状态下的相同荧光偏振成像序列。通过探测光路的光子探测器收集荧光图像,再做空域和频域变化,分析不同偏振状态之间各图像之间的荧光偶极子之间相对关系,并通过反卷积算法,重构荧光图像。
实验表明,使用偏振调制技术,给激发光引入一定的偏振角,经过像素重构之后的图像,图像的空间分辨率提高了不少。本发明使用同一个物镜聚焦,操作方便,比较灵活,可以独立控制两束光的波长、强度和偏振等。
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形、改进及替代,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.偏振调制提高受激发射损耗显微系统分辨率的方法,其特征在于,包括两部分:
第一部分,在受激发射损耗显微系统的激发光路上,加入激光偏振调制模块用以旋转激发光的偏振方向,进而旋转激发光偏振角度,引入荧光偏振调制,同一个荧光标记的样品在激发光偏振角度下,获得不同激发偏振态的受激发射损耗显微镜成像;最后使用反卷积迭代算法,重构出横向分辨率,重构出多张图片并叠加,最终恢复原始图像;
第二部分,使用STED原理构建突破光学极限的有效点扩函数,利用上述构建的有效点扩函数形成极小的激光光斑,进一步加强偏振调制的荧光稀疏性,增加荧光偏振调制的角度敏感性,最终提高受激发射损耗显微系统的分辨率;
具体步骤为:
S1、在构建好的受激发射损耗显微镜中,在激发光路上插入偏振调制模块,偏振调制模块实现旋转激发光偏振角度,通过使用偏振调制模块均匀改变激发光的偏振状态α,控制荧光分子的辐射强度,引入荧光的稀疏性,使得荧光分子的光强分布符合公式(1)的类余弦函数
式中:u(α)是荧光分子最终的分布情况,I0是激发光强与探测器测试曝光的常数,h(α)是系统总体点扩散函数;S是荧光分子分布情况,也就是原始图像;α是激发光变化的线偏振方向,β是荧光分子极化方向,b是成像过程中产生的噪声;
将激发光偏振状态的旋转角度调制为均匀分布在0°到180°的N个角度,其中N≧3;同一个荧光标记的样品在N个激发光偏振角度下,获得N次不同激发偏振态的受激发射损耗显微镜成像;使用反卷积迭代算法,重构出横向分辨率进一步提高的图像;
S2、将损耗光调节至一定功率强度,产生空心焦斑,通过二向色镜,将损耗光与激发光叠加,构建突破光学衍射极限的极小点扩散函数,见公式(2),利用N个方向的线偏振光荧光标记的样本,获取具有荧光偏振特性的荧光成像序列I;
IE(x,y,z)=Iexc(x,y,z)exp(-Isted(x,y,z)(Imax/Is)) (2)
式中:IE(x,y,z)为受激发射损耗的有效强度点扩散函数,Iexc(x,y,z)为激发场强度点扩散函数,Isted(x,y,z)为归一化的损耗场强度点扩散函数,Imax/Is为饱和因子,Imax为损耗光的最大光强,Is为最大饱和光强;
S3、获得荧光成像序列I,再通过空域和频域变化,分别分析图像中荧光偶极之间的相对关系,并使用反卷积算法,迭代求解下述公式,重构出N张图片并叠加,最终恢复原始图像;
2.根据权利要求1所述的偏振调制提高受激发射损耗显微系统分辨率的方法,其特征在于:使用线偏振光作为激发光构建受激发射损耗显微镜系统。
3.根据权利要求1或2所述的偏振调制提高受激发射损耗显微系统分辨率的方法,其特征在于:偏振调制模块通过旋转半波片或者使用液晶延迟器来实现旋转激发光偏振角度。
4.根据权利要求1所述的偏振调制提高受激发射损耗显微系统分辨率的方法,其特征在于:所述荧光标记采用多种刚性连接的荧光标记,其为共价连接荧光探针的样品或极性荧光分子标记的细胞膜双磷脂分子层、肌动蛋白丝;所述荧光标记在偏振调制后构建的受激发射损耗显微系统中进行实验测试。
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Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104062750A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-09-24 | 浙江大学 | 一种双光子荧光受激发射微分超分辨率显微方法与装置 |
CN106198466A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-12-07 | 北京大学 | 一种实现超分辨偶极子取向解析的方法 |
CN107329245A (zh) * | 2017-07-06 | 2017-11-07 | 中国科学院西安光学精密机械研究所 | 基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统与方法 |
CN107490568A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-12-19 | 四川大学 | 基于受激发射损耗特性的超分辨率显微成像装置和方法 |
CN107941763A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-04-20 | 浙江大学 | 一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法和装置 |
CN108254340A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-07-06 | 苏州国科医疗科技发展有限公司 | 基于线偏振调制的扫描显微镜 |
CA2973361A1 (en) * | 2017-07-14 | 2019-01-14 | Peter A. Vokhmin | Multichannel line scan sted microscopy, method and device |
CN111879234A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-11-03 | 浙江大学 | 基于偏振调制空心光斑照明的三维亚十纳米定位方法和装置 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CZ2009706A3 (cs) * | 2009-10-27 | 2011-01-05 | Ústav systémové biologie a ekologie AV CR, v.v.i. | Zpusob získání strukturních a funkcních informací o proteinech na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie a zarízení k provádení tohoto zpusobu |
DE102011087770A1 (de) * | 2011-12-05 | 2013-06-27 | Technische Universität Braunschweig | Hochauflösendes Mikroskop |
GB201121514D0 (en) * | 2011-12-14 | 2012-01-25 | Univ Dundee | Improvements in and relating to three dimensional stimulated emission depletion microscopy |
IT201700118432A1 (it) * | 2017-10-19 | 2019-04-19 | Fondazione St Italiano Tecnologia | Metodo di microscopia a deplezione mediante emissione stimolata ad alta risoluzione spaziale |
DE102017131249A1 (de) * | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Verfahren zum Abbilden einer Probe unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit stimulierter Emissionsdepletion |
-
2021
- 2021-12-02 CN CN202111471711.3A patent/CN114216887B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104062750A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-09-24 | 浙江大学 | 一种双光子荧光受激发射微分超分辨率显微方法与装置 |
CN106198466A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-12-07 | 北京大学 | 一种实现超分辨偶极子取向解析的方法 |
CN107329245A (zh) * | 2017-07-06 | 2017-11-07 | 中国科学院西安光学精密机械研究所 | 基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统与方法 |
CA2973361A1 (en) * | 2017-07-14 | 2019-01-14 | Peter A. Vokhmin | Multichannel line scan sted microscopy, method and device |
CN107490568A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-12-19 | 四川大学 | 基于受激发射损耗特性的超分辨率显微成像装置和方法 |
CN107941763A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-04-20 | 浙江大学 | 一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法和装置 |
CN108254340A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-07-06 | 苏州国科医疗科技发展有限公司 | 基于线偏振调制的扫描显微镜 |
CN111879234A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-11-03 | 浙江大学 | 基于偏振调制空心光斑照明的三维亚十纳米定位方法和装置 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
受激发射损耗显微术(STED)的机理及进展研究;李帅;匡翠方;丁志华;郝翔;顾兆泰;葛剑虹;刘旭;;激光生物学报(第02期);全文 * |
基于环形光瞳提高荧光辐射差分超分辨显微镜的成像分辨率;邓素辉 等;光学学报;第39卷(第7期);全文 * |
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Publication number | Publication date |
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