CN107907513B - 一种基于偏振解调的点扫描超分辨成像方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于偏振解调的点扫描超分辨成像装置，其特征在于，包括光源、承载待测样品的样品台，所述光源与样品台之间依次设有：用于将光源发出的光束改变为线偏振光的1/4波片和1/2波片，用于将线偏振光转变为切向偏振光的偏振转换器，用于对相位进行调制最终将会聚光斑调制成多个线偏振光斑的空间光调制器，用于将激发光聚焦到样品上的显微物镜；并设有收集所述待测样品发出的信号光的探测系统，以及控制所述空间光调制器内位相调制函数的控制器。本发明还公开一种基于偏振解调的点扫描超分辨成像方法，利用多偏振角度激发光对样品的照射实现对荧光偶极子极化方向的解调，获得了更多维度的信息，与共聚焦系统的结合具有层析功能。

Description

一种基于偏振解调的点扫描超分辨成像方法和装置
技术领域
本发明属于超分辨显微成像领域，尤其涉及一种在点扫描模式下对不同线偏振光成像并进行偏振解调的超高分辨成像方法与装置。
背景技术
一直以来，通过对生物分子的特殊标记，荧光光学显微镜在观察亚细胞结构扮演着重要的角色，然后常规的宽场光学显微镜由于受到衍射效应的影响，横向分辨率被限制在激发光的半波长左右，因此在纳米技术、材料、生物以及医学领域等的应用受到很大的限制。
荧光信息具有四个基本的物理维度，包括强度信息，波长(吸收光谱和发射光谱)，寿命信息和偏振信息。目前超分辨显微技术主要利用的是强度上的“开关”调制，包括STED技术，PALM/STORM技术等，或者利用结构上的强度调制技术包括SIM技术或者饱和SIM技术，这些技术都是利用不同波长之间的强度调制来实现超分辨显微成像。而在利用寿命信息方面，荧光寿命成像(FLM)可以对分子所处的微环境中的许多生物物理、生物化学参数如PH值、离子浓度等的分布进行定量测量，也可以与共聚焦、STED技术相结合，为生物医学研究提供新的研究手段。而在偏振信息方面，目前世界上对它的研究还不够深入，虽然存在着一些技术例如荧光偏振显微成像技术(FPM)可以对荧光分子偶极子方向进行分辨，但是受限于宽场的分辨率，应用范围并不广泛。
荧光偶极子是荧光的固有特征，它不需要特殊荧光样品的标记，具有普适性，其偶极子的方向决定了荧光的偏振信息，因此偏振信息确实可以为超分辨成像提供另一个维度的信息，在生物医学研究领域上提供一个新的思路。每一个荧光分子都有自己的偶极子极化方向，当激发光斑的偏振方向与偶极子极化方向相同时，荧光的激发效率最高，而当激发光斑的偏振方向与偶极子极化方向垂直时，荧光激发效率最低。因此通过调整合适的激发光的偏振方向可以理论上提高成像的分辨率和信噪比。在目前的研究当中，利用旋转入射线偏振光的偏振方向来调制荧光的偏振强度，再通过相应的解调算法，可以将相应的偏振信息和偏振强度信息解调出来，同时实现分辨率的提高。但是由于需要对入射光的偏振进行即时的旋转，并且获得纯净偏振的会聚光场，因此目前的实验方法均是在宽场的条件下进行，分辨率的提高也有限。
发明内容
本发明提供了一种基于偏振解调的点扫描超分辨成像方法和装置，结合偏振解调反卷积算法和点扫描方式，利用空间光调制器实现纯净偏振方向的旋转，在类似于共聚焦的系统下实现对普适性样品的偏振解调和超分辨成像，并具备层析功能。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、操作方便、样品普适性高等特点，可以很好地应用于荧光样品的超分辨成像之中。
一种基于偏振解调的点扫描超分辨定位与成像装置，包括光源、承载待测样品的样品台，所述光源与样品台之间依次设有：
用于保证激光出射偏振方向不变的保偏光纤；
用于准直激光源发出的光束的准直透镜；
用于将光源发出的光束改变为纯净线偏振光的1/2波片和1/4波片；
用于将线偏振光转变为切向偏振光的偏振转换器；
用于对相位进行调制最终将会聚光斑调制成任意线偏振光斑的空间光调制器；
用于实现对样品的快速扫描的二维扫描振镜系统；
用于实现振镜与物镜入瞳共轭的4f系统，包括扫描镜和场镜；
用于将激发光聚焦到样品上的显微物镜；
用于反射激发光、透射荧光信号的二色镜；
并设有用于控制所述扫描振镜系统和空间光调制器的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。
本发明中通过探测系统接收样品发出的信号光，该探测系统包括：
用于滤去背景噪声、提高成像信噪比的窄带滤波片；
用于将信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；
用于探测信号光的光强信号的探测器，如光电倍增管(PMT)。
一种基于偏振解调的点扫描超分辨定位与成像方法，包括以下步骤：
1)对激光器发出的激光光束在经过保偏光纤后进行准直；
2)光束通过二分之一波片和四分之一波片，变成任意角度的线偏振光；
3)线偏振光经过偏振转换器后被调制成为切向偏振光，切向偏振光再经过空间光调制器进行位相调制，位相调制函数为
Figure GDA0002568877440000031
其中
Figure GDA0002568877440000032
为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，
Figure GDA0002568877440000033
对应的是最终得到的线偏振光与x轴的夹角；
4)通过调整相位得到偏振方向从0°到180°旋转的12个线偏振光斑，在二维扫描过程中收集不同线偏振光激发下待测荧光样品各扫描点发出的信号荧光；在进行偏振调制时，探测器上的光强分布符合泊松分布，且随偏振的改变呈周期性变化，可表示为：
Figure GDA0002568877440000034
Figure GDA0002568877440000035
Figure GDA0002568877440000036
其中，μ为到达探测器的光子数，r为探测器上位置，r'为成像样品的位置，
Figure GDA0002568877440000037
为激发光的偏振角度，I0为由于系统响应不稳定引入的与偏振相关的周期性校正因子，U为系统的点扩散函数，g0(ri)和αi分别为位置为ri的第i个辐射偶极子的极化强度和极化方向，b(r′)为短时间内偏振不稳定的背景噪声，
Figure GDA0002568877440000038
为随入射光偏振方向改变的有效辐射光子率。
5)根据扫描过程中收集的荧光信息，以及成像系统的偏振相位信息，通过估计偶极子的极化强度和极化方向来估计有效PSF，再经过去卷积实现对样品偏振信息进行解调并获得超分辨成像结果。本发明所采用的偏振解调算法的核心是估计偶极子的极化强度g0(ri)和极化方向αi，最后通过估计出来的有效PSF来进行去卷积实现偏振信息的解调。
本发明采用最大后验概率估计作为极化强度的泊松统计模型，表达式为：
Figure GDA0002568877440000041
其中，
Figure GDA0002568877440000042
为背景噪声余弦变化后得到的函数，其与极化强度相对独立但是有着相同的大小分布，μ为标准泊松分布函数，I为探测器探测到的光强，λ1和λ2为相应的可优化系数。因此该模型利用已知的I，通过调整
Figure GDA0002568877440000043
和b(r)来得到L的最优值，从而实现对
Figure GDA0002568877440000044
的估计。
然后根据在偏振角度为
Figure GDA0002568877440000045
的线偏振光照射下所激发出来的极化强度为
Figure GDA0002568877440000046
其中，Mj为像素i上的光子数，为像素i的偶极子方向，因此根据已知的g，利用最小二乘曲线拟合能将计划方向αi提取出来，获得更多的有效信息。根据估计出来的
Figure GDA0002568877440000047
可以得到最终的超分辨图形。
本发明原理如下：
显微系统成像的分辨率受光学系统衍射的影响，如何提高分辨率是生物医学研究的一个重要命题和挑战。目前世界上有许多超分辨成像方法，但都存在着各种不同的问题，包括对样品伤害大，成像时间长，对染料有特殊要求等。由此对超分辨方向的研究依然有着很大的发展潜力，尤其是在偏振信息这一方面，由于荧光偶极子的固有特性让偏振信息对于任何荧光样品具有普适性，因此对成像偏振信息的解调是研究超分辨成像的一个重要方向。
在本发明方法中，采用的原理是利用当激发光斑的偏振方向与荧光分子偶极子的极化方向相同时，荧光的激发效率最高，而偏振方向与偶极子方向不同时，荧光激发效率会有所下降，当偏振方向与偶极子方向垂直时荧光效率最低。通过调整激发光的偏振方向使得其与荧光分子偶极子极化方向相同使得荧光激发效率最高，从而实现分辨率的提高。为了实现在点扫描共聚焦成像条件下对激发光的纯净偏振进行调制，首先利用线偏振光经过偏振转换器产生一种柱状矢量光——切向偏振光，然后将所产生的切向偏振光经过空间光调制器，利用空间光调制器产生0-π相位调制函数，将切向偏振光在物镜焦平面上调制获得所需的纯净线偏振光；同时为了对荧光偶极子的极化方向(偏振信息)进行解调，通过实时改变空间光调制器上的调制函数实现线偏振角度从0°到180°进行旋转，从而可以即时获得多个偏振角度的线偏振光激发成像结果，有利于最终实现对偏振信息的完整解调。通过实时调整空间光调制器的调制函数，实现在聚焦光场上线偏振角度的旋转，探测器接收从0°到180°多角度旋转的线偏振光激发出来的荧光信息，通过相关算法的解调，将每个荧光分子对应的最佳偏振激发强度和极化方向信息解调出来，从而实现分辨率的提高，同时与共聚焦系统的小孔结合，具备层析功能。
相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)首次提出了结合偏振调制、点扫描和偏振解调算法实现对荧光样品的偏振解调和超分辨成像；
(2)利用多偏振角度激发光对样品的照射实现对荧光偶极子极化方向的解调，获得了更多维度的信息(即偏振信息)，与共聚焦系统的结合使本发明具有层析功能；
(3)对样品染料具有普适性，装置简单，操作方便。
附图说明
图1为本实施例的基于偏振解调的点扫描超分辨成像装置的结构示意图；
图2为本实施例中的方法流程图；
图3为本实施例中空间光调制器所加载0-π的6个角度的相位调制图案，图3(a)-(f)分别为0°，30°，60°，90°，120°，150°6个角度的0-π相位调制灰度图案；
图4为本实施例中经过空间光调制器调制之后物镜的会聚光斑偏振方向转过的其中的6个角度，图4(a)-(f)分别为经过0°，30°，60°，90°，120°，150°6个角度偏振调制后聚焦光斑的偏振情况横向分布图；
图5为本实施例中对细胞微管的共聚焦成像和偏振解调成像结果示意图，其中，(a)图为对细胞微管的共聚焦成像，(b)为对细胞微管经过多偏振方向激发解调后的成像结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
如图1所示的基于偏振解调的点扫描超分辨定位和成像装置，包括：激光光源1，保偏光纤2，准直透镜3，1/4波片4，1/2波片5，偏振转换器6，反射镜7，空间光调制器8，二色镜9，二维扫描振镜系统10，扫描透镜11，场镜12，显微物镜13，样品台14，窄带滤波片15，会聚透镜16，小孔17，探测器18和电脑及控制器19。
准直透镜3、1/4波片4、1/2波片6和偏振转换器6依次位于激光光源1出射光束的光轴之上。光束被反射镜7反射后进入空间光调制器8，然后被二色镜反射进入垂直的光轴；二维扫描振镜系统10、扫描镜11、场镜12和显微物镜13位于二色镜9反射后光束的光轴上，依次位于经反射后光束的光轴之上，其中，扫描镜11和场镜12组成了一个4f系统，使振镜与显微物镜入瞳共轭。窄带滤波片15、会聚透镜16和探测器17位于经二色镜9透射光束的光轴之上。控制器19与二维扫描振镜和空间光调制器相连，用于控制扫描振镜系统的扫描和相位调制函数。
本实施例中，显微物镜13的数值孔径NA＝1.4。
采用图1所示的装置进行超分辨显微的方法流程大致如图2所示，具体实施如下：
从激光光源1发出的激光光束，经过保偏光纤2出射后经准直透镜3完成准直。经过准直后的光束经过1/4波片4和1/2波片5的调整变为线偏振光，线偏振光经过偏振转换器6后将线偏振光转变为切向偏振光。切向偏振光再经过空间光调制器8的相位调制函数进行调制，利用0-π相位调制函数可以将线偏振光在聚焦光场上调制成纯净的线偏振光。二色镜9将经过空间光调制器的光束反射进入二维扫描振镜系统10，在通过扫描镜11和场镜12组成的4f系统，让入射光在被显微物镜13聚焦后可以在视场范围内对样品14进行无畸变的扫描，激发荧光样品产生荧光，荧光信号再通过原光路返回至二色镜9处，并透过二色镜9和窄带滤波片15对背景噪声进行过滤，最终被会聚透镜16收集至探测器17内。
本发明的关键在于对线偏振光的调制，利用空间光调制器产生相位调制函数，产生不断旋转的0-π相位调制函数，从而实现聚焦光场纯净线偏振光的偏振方向的转动。如图3展示了从0°到180°中6个角度的0-π相位调制图案，在经过空间光调制器相应的位相调制图案调制后，会聚光斑的偏振方向同样进行旋转，其对应聚焦光斑的偏振情况如图4所示。
在经过多个偏振角度激发光斑的激发后，可以得到不同强度分布的荧光信号，在被探测器收集后得到不同的成像结果图，然后利用偏振解调算法，将每个荧光分子的最佳激发光强和偶极子极化方向解调出来，实现分辨率的提高.如图5所示，(a)中为对细胞微管的共聚焦成像，(b)为对细胞微管经过多偏振方向激发解调后的成像结果图，结果图可以看出分辨率的显著提高。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于偏振解调的点扫描超分辨成像装置，其特征在于，包括光源、承载待测样品的样品台，所述光源与样品台之间依次设有：
用于将光源发出的光束改变为线偏振光的1/4波片和1/2波片，
用于将线偏振光转变为切向偏振光的偏振转换器，
用于对相位进行调制最终将会聚光斑调制成多个线偏振光斑的空间光调制器，位相调制函数为：
Figure FDA0002568877430000011
其中
Figure FDA0002568877430000012
为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，
Figure FDA0002568877430000013
对应的是最终得到的线偏振光与x轴的夹角；
用于将激发光聚焦到样品上的显微物镜；
并设有收集所述待测样品发出的信号光的探测系统，以及控制所述空间光调制器内位相调制函数的控制器。
2.如权利要求1所述的点扫描超分辨成像装置，其特征在于，在所述空间光调制器与显微物镜间设有用于样品扫描的二维扫描振镜系统。
3.如权利要求1所述的点扫描超分辨成像装置，其特征在于，所述的探测系统包括：
用于滤去背景噪声、提高成像信噪比的窄带滤波片；
用于探测信号光的光强信号的探测器；
用于将信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜。
4.一种基于偏振解调的点扫描超分辨成像方法，其特征在于，包括步骤：
1)将激光光束调制为线偏振光；
2)线偏振光经过偏振转换器后被调制成为切向偏振光，切向偏振光再经过空间光调制器进行位相调制；
步骤2)中位相调制采用的位相调制函数为：
Figure FDA0002568877430000021
其中
Figure FDA0002568877430000022
为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，
Figure FDA0002568877430000023
对应的是最终得到的线偏振光与x轴的夹角；
3)通过调整相位得到偏振方向从0°到180°旋转的多个线偏振光斑，在扫描过程中收集不同线偏振光激发下待测荧光样品各扫描点发出的信号荧光；
4)根据扫描过程中收集的荧光信息，以及成像的偏振相位信息，通过估计偶极子的极化强度和极化方向来估计有效PSF，再经过去卷积实现对样品偏振信息进行解调并获得超分辨成像结果。
5.如权利要求4所述的点扫描超分辨成像方法，其特征在于，在进行偏振调制时，探测器上的光强分布符合泊松分布，且随偏振的改变呈周期性变化，可表示为：
Figure FDA0002568877430000024
Figure FDA0002568877430000025
Figure FDA0002568877430000026
其中，μ为到达探测器的光子数，r为探测器上位置，
Figure FDA0002568877430000027
为激发光的偏振角度，r'为成像样品的位置，I0由于系统响应不稳定引入的与偏振相关的周期性校正因子，U为系统的点扩散函数，g0(ri)和αi分别为位置为ri的第i个辐射偶极子的极化强度和极化方向，b(r′)为短时间内偏振不稳定的背景噪声，
Figure FDA0002568877430000028
为随入射光偏振方向改变的有效辐射光子率。
6.如权利要求4所述的点扫描超分辨成像方法，其特征在于，在步骤4)中，采用最大后验概率估计作为极化强度的泊松统计模型，表达式为：
Figure FDA0002568877430000029
其中，
Figure FDA00025688774300000210
为背景噪声余弦变化后得到的函数，其与极化强度相对独立但是有着相同的大小分布，μ为标准泊松分布函数，I为探测器探测到的光强，λ1和λ2为相应的可优化系数。
7.如权利要求6所述的点扫描超分辨成像方法，其特征在于，在步骤4)中，根据在偏振角度为
Figure FDA0002568877430000031
的线偏振光照射下所激发出来的极化强度为
Figure FDA0002568877430000032
其中，Mj为可能到达像素i上的最大光子数，αj为像素i的偶极子方向，因此根据已知的g，利用最小二乘曲线拟合能将计划方向αi提取出来；
根据估计出来的
Figure FDA0002568877430000033
可以得到最终的超分辨图形。
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