CN107329245A - 基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统与方法 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统与方法，解决了现有干涉式结构光照明显微成像系统偏振控制方法操作复杂、光能透过率低的问题。系统包括偏振分束器、半波片、空间光调制器、第一透镜、空间滤波器、涡旋半波片、双色镜、显微物镜、筒镜和数字相机；半波片和空间光调制器依次设置在偏振分束器的第一出射光路上；第一透镜、空间滤波器、涡旋半波片、双色镜和显微物镜依次设置在偏振分束器与第一出射光路垂直的第二出射光路上；筒镜、数字相机依次设置在双色镜垂直于第二出射光路的光路上。本发明采用的涡旋半波片降低了系统的复杂度，光能利用率高，适用于低功率激光器作为光源，便于结构光照明光学显微系统的集成。

Description

基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统与方法

技术领域

本发明涉及光学显微成像领域，具体涉及基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统与方法。

背景技术

传统的光学显微成像技术空间分辨率受到阿贝瑞利极限的限制，空间分辨率最高只能达到半波长，制约了其在亚细胞水平观测中的应用。虽然电子显微镜和原子力显微镜可以达到亚纳米的分辨率，但是其只能对非活性离体细胞样品进行观测的缺点限制了其在生物领域的广泛应用。近几十年，伴随着荧光探针技术的发展，一系列超分辨光学显微成像方法被提出，使得光学显微镜的空间分辨率突破了阿贝瑞利极限。其中最具代表性的技术包括光激活定位荧光显微技术(Photo-Activation Localization Microscopy，简称PALM)、随机光学重构荧光显微技术(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，简称STORM)、受激辐射损耗荧光显微技术(Stimulated Emission Depletion microscopy，简称STED)和结构光照明荧光显微技术(Structured Illumination Microscopy，简称SIM)。

由于SIM是成像速度最快的超分辨成像技术，自该技术出现伊始，就受到了广泛关注。SIM的基本原理如下：显微物镜的空间分辨率取决于它能采集到的最大空间频率f₀，f₀取决于显微物镜的光学传递函数(optical transfer function，简称OTF)，f₀＝2NA/λ，其中NA表示显微物镜的数值孔径，λ表示成像光波的波长。当样品包含的高频信息f>f₀时，样品的细节将难以被分辨。如果使用空间频率为f₁的正弦条纹结构光照明样品，则会产生空间频率为f_m＝|f-f₁|的低频莫尔条纹。莫尔条纹实际上是样品与结构光的拍频信号，它包含有样品超衍射分辨的高频信息f。当f_m<f₀时，莫尔条纹可以在显微物镜下观察到，通过解码，可以提取出样品的超分辨率信息，重组出样品的高分辨率图像。

为保证结构照明显微系统OTF的各向同性，实验中需要旋转照明光场在多个方向上对称地照明样品。通常在每一个成像平面旋转3个方向，两两夹角互为60度。如图1所示，图1a为普通显微镜的OTF，图1b为单一方向上频谱进行扩展，图1c为三个方向频谱得到扩展。从频域来看，结构光照明拓展了显微系统的OTF，将物镜能收集到的最大空间频率从f₀提高到了f₀+f₁。因此f₁越大，SIM显微的空间分辨率就越高。但是结构照明光场的空间频率f₁同样受衍射极限限制，即f₁≤f₀，所以线性SIM显微技术至多可以将光学显微系统的空间分辨率提高一倍。

由SIM超分辨成像的基本原理可知，其成像系统需要满足以下条件：

(1)产生空间频率接近光学成像系统衍射极限的结构照明光场，以实现最大的频谱扩展；(2)产生多个不同方向的结构光照明光场，以实现接近各向同性的频谱扩展。满足条件的方式通常是采用两束线偏振激光干涉产生的干涉条纹来实现。图2a至图2c为条纹方向和两束激光偏振态的关系，其中点表示两束激光，箭头为所需的偏振态。若要产生图示三个不同方向的干涉条纹，两束激光的空间分布需如图圆点所示。由于干涉条纹周期与两光束夹角有关，其夹角越大条纹周期越小。然而，大角度干涉时条纹对比度和两束线偏光的偏振方向密切相关，只有当两束线偏光偏振方向与两光束的干涉条纹方向平行时，条纹对比度才最大，其余偏振方向都会导致条纹对比度的降低。条纹对比度对于软件解码十分重要，低条纹对比度会导致软件解码产生伪影，甚至无法恢复图像。综上所述，为了实现更高分辨率和更准确的恢复图像，必须对线偏光的偏振方向进行精确控制。

对于偏振方向的控制，通常有两种方法。第一种方法是利用相位延迟器对光的相位进行改变。相位延迟片由双折射材料加工而成，使通过它的两个互相正交的偏振分量产生相位偏移，可用来调整光束的偏振状态。通过使用两个液晶相位延迟器，在其上分别加载不同电压，控制液晶分子长轴取向，可以改变光束通过相位延迟器的相位延迟。对所需的不同方向偏振态，通过调整电压值调整相位延迟，进而改变偏振，实现偏振控制。这一方法的缺点在于液晶相位延迟器为有源器件，需要随光束方向变化而同步改变所加电压值，增加了系统的控制难度。另外，由于需要使用两个液晶相位延迟器和一个1/4波片，系统的总光能量透过率将小于90％。第二种偏振控制方法是利用偏振片直接改变光的偏振态。众所周知，偏振片由二向色性材料制成，当光波通过偏振片时，其中与偏振片透光轴方向一致的光分量可以无损失透过，而与透光轴方向垂直的光分量则被强烈吸收，因此可以用偏振片转换光的偏振态。应用中采用分区组合偏振片，由12个偏振片胶合成比萨饼形状，其中每一个小扇形代表一块偏振片，其透光轴方向沿切线方向分布。实验时先将入射的线偏振激光通过1/4波片调制为圆偏振光，当两束圆偏光入射分区组合偏振片后，出射线偏光的偏振方向即可以调制为所需的偏振方向，即与两光束的干涉条纹方向平行，从而实现SIM系统的偏振控制。然而对于圆偏振光而言，只有一半的光能透过偏振片，所以理论上圆偏光通过偏振片的光能量透过率为50％，如果再考虑到材料的吸收特性，透过率往往低于40％，常常导致亮度不足。

发明内容

为了解决现有SIM成像系统偏振控制方法操作复杂、透过率低的问题，本发明提供一种基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统与方法。

本发明解决上述问题的技术方案是：

一种基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统，包括可调控的光栅结构单元、第一透镜、空间滤波器、涡旋半波片、双色镜、显微物镜、筒镜和数字相机；可调控的光栅结构单元包括偏振分束器、半波片和空间光调制器；半波片和空间光调制器依次设置在偏振分束器的第一出射光路上；第一透镜、空间滤波器、涡旋半波片、双色镜和显微物镜依次设置在偏振分束器的与第一出射光路垂直的第二出射光路上；所述涡旋半波片0°快轴方向为水平方向；筒镜、数字相机依次设置在双色镜的垂直于所述第二出射光路的光路上。

进一步地，还包括设置在涡旋半波片和双色镜之间光路上的共焦系统。共焦系统产生的中继光路使激光汇聚到显微物镜后焦面上，减小系统的设置尺寸。

进一步地，所述共焦系统包括沿光路依次设置的第二透镜和第三透镜。

进一步地，还包括设置在双色镜和显微物镜之间光路上的反射镜，显微物镜设置在双色镜的上方。反射镜可调整光路使激光沿竖直方向传播，使得可以使用倒置物镜以便观测样品。

进一步地，空间光调制器为反射式铁电液晶空间光调制器。

一种基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜成像方法，包括以下步骤：

1)激光器发出的水平线偏振光照射到可调控的光栅结构单元上，产生垂直线偏振的多级衍射光束；

2)将汇聚的多级衍射光束进行阻挡零级和高级衍射光并保留±1级衍射光的处理；

3)被保留的垂直线偏振±1级衍射光通过涡旋半波片改变偏振态，所述涡旋半波片0°快轴方向为水平方向，形成所需的偏振方向，即与两光束的干涉条纹方向平行，从而实现SIM系统的偏振控制；

4)改变偏振态的±1级衍射光进入显微物镜干涉形成所需的结构照明光场，对样品进行照明；

5)样品受激发出荧光，过滤掉荧光中包含的其它波长光，处理后的荧光被收集形成图像。

本发明的优点为：

1、本发明的核心是用涡旋半波片控制光束偏振方向。与普通的偏振控制技术相比，本发明光能利用率很高(接近100％)，适用于低功率半导体激光器作为光源，便于结构照明光学显微系统的集成。

2、本发明采用的涡旋半波片为单一的无源器件，只要放入合适的位置即可使用，不需要额外的控制单元，降低了系统的复杂度，有利于结构照明光学显微系统的推广。

3、本发明所使用的激光功率密度很低，对生物组织的破坏以及激光漂白效应非常小。在超分辨荧光显微成像领域，本发明所采用的结构照明光学显微技术是一种宽场显微技术，与单分子定位成像技术、受激发射损耗成像技术等相比，具有弱的光漂白以及光损伤效应。

附图说明

图1a为普通显微镜的OTF示意图；

图1b为单一方向上频谱进行扩展的OTF示意图；

图1c为SIM从三个方向扩展OTF的示意图；

图2a为60°干涉条纹方向和两束激光偏振态的关系图；

图2b为0°干涉条纹方向和两束激光偏振态的关系图；

图2c为-60°干涉条纹方向和两束激光偏振态的关系图；

图3为涡旋半波片快轴空间分布结构示意图；

图4a为需要产生的60°干涉条纹示意图；

图4b为用涡旋半波片产生60°干涉条纹时入射光的偏振态(垂直线偏振)和位置分布示意图；

图4c为涡旋半波片的快轴空间分布及一对60°入射光(垂直线偏振)在涡旋半波片上的入射位置示意图；

图4d为经过涡旋半波片后一对60°出射光的偏振态分布示意图；

图4e为需要产生的0°干涉条纹示意图；

图4f为用涡旋半波片产生0°干涉条纹时入射光的偏振态(垂直线偏振)和位置分布示意图；

图4g为涡旋半波片的快轴空间分布及一对0°入射光(垂直线偏振)在涡旋半波片上的入射位置示意图；

图4h为经过涡旋半波片后一对0°出射光的偏振态分布示意图；

图4i为需要产生的-60°干涉条纹示意图；

图4j为用涡旋半波片产生-60°干涉条纹时入射光的偏振态(垂直线偏振)和位置分布示意图；

图4k为涡旋半波片的快轴空间分布及一对-60°入射光(垂直线偏振)在涡旋半波片上的入射位置示意图；

图4l为经过涡旋半波片后一对-60°出射光的偏振态分布示意图；

图5为本发明系统结构示意图。

附图标记：1-入射激光，2-偏振分束器，3-半波片，4-空间光调制器，5-第一透镜，6-空间滤波器，7-涡旋半波片，8-第二透镜，9-第三透镜，10-双色镜，11-反射镜，12-显微物镜，13-载物台，14-筒镜，15-数字相机。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的内容作进一步的详细描述：

本发明提供了一种使用径向偏振调制实现偏振控制的结构光照明显微镜系统及方法，该系统具有操作简单(使用无源器件)、光能利用率高(接近100％)的优点，可以方便高效地实现偏振控制。

如图5所示，一种基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统，包括偏振分束器2、半波片3、空间光调制器4、第一透镜5、空间滤波器6、涡旋半波片7、共焦系统、双色镜10、显微物镜12、筒镜14和数字相机15；其中，偏振分束器2、半波片3、空间光调制器4构成一个可调控的光栅结构单元。半波片3和空间光调制器4依次设置在偏振分束器2的第一出射光路上；第一透镜5、空间滤波器6、涡旋半波片7、共焦系统、双色镜10和显微物镜12依次设置在偏振分束器2的与第一出射光路垂直的第二出射光路上；涡旋半波片0°快轴方向为水平方向；筒镜14、数字相机15依次设置在双色镜10的垂直于所述第二出射光路的光路上；共焦系统包括沿光路依次设置的第二透镜8和第三透镜9，共焦系统产生的中继光路使激光汇聚到显微物镜12后焦面上，减小了系统的设置尺寸。空间光调制器为反射式铁电液晶空间光调制器。

将显微物镜12设置在双色镜10的上方，系统还包括设置在双色镜10和显微物镜12之间光路上的反射镜11。反射镜11可调整光路使激光沿竖直方向传播，使得可以使用倒置物镜以便观测样品。

涡旋半波片是一种特殊的半波片，通常用来产生径向偏振光或方位角偏振光，其快轴方向随波片上方位角变化而变化。如图3所示，涡旋半波片上每一点的快轴方向不同，以特定方式旋转分布。本发明利用涡旋半波片对不同位置入射线偏振光的偏振方向旋转不同的方向，对光束进行偏振调制，使出射光束偏振态调整至所需方向。图4a至4l是使用涡旋半波片进行偏振控制的原理示意图，如果需要产生方向如图4a所示干涉条纹，首先将两束入射线偏光的偏振方向调节为图4b双箭头所示垂直方向，灰色圆斑为两光束的入射位置，图4c中的单箭头代表零级涡旋半波片的快轴方向。当两光束通过涡旋半波片调制后，出射光的偏振方向为图4d中灰色圆斑位置处的双箭头方向，即为所需的偏振方向。同理，其余两个方向的偏振控制原理如图4e至图4l，从而实现SIM偏振控制。

一种基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜成像方法，包括以下步骤：

1)激光器发出的水平线偏振光照射到可调控的光栅结构单元上，产生垂直线偏振的多级衍射光束；

2)将汇聚的多级衍射光束进行阻挡零级和高级衍射光并保留±1级衍射光的处理；

3)被保留的垂直线偏振±1级衍射光通过涡旋半波片改变偏振态，所述涡旋半波片0°快轴方向为水平方向，形成所需的偏振方向，即与两光束的干涉条纹方向平行，从而实现SIM系统的偏振控制；

4)改变偏振态的±1级衍射光进入显微物镜干涉形成所需的结构照明光场，对样品进行照明；

5)样品受激发出荧光，过滤掉荧光中包含的其它波长光，处理后的荧光被收集形成图像。

系统工作过程：激光器发出的水平线偏振光由1入射，首先经过一个偏振分束器2和半波片3，垂直入射到反射式铁电液晶空间光调制器上，其中半波片3的快轴方向与水平方向夹角为81.6°。在空间光调制器上加载光栅结构图像，使入射光经其衍射后返回，再次通过半波片3，由偏振分束器2反射后变为垂直偏振光，进入第一透镜5。使用空间滤波器6阻挡零级和高级衍射光，保留±1级衍射光透过，通过涡旋半波片7改变保留的±1级衍射光的偏振态，改变偏振态的衍射光再通过第二透镜8和第三透镜9组成的共焦系统，最后通过双色镜10和反射镜11进入显微物镜12。两束光干涉形成结构照明光场，照明置于载物台13上的样品，样品受激发出荧光经过显微物镜12，再经过反射镜11，被双色镜10反射至筒镜14，由数字相机15收集。控制空间光调制器4，使其分别加载九幅不同相位和不同方向的条纹图样，并依次拍摄收集。对收集到的九幅图像进行处理得到最终的超分辨图像。

本发明的保护范围不限于本发明的具体实施方式，对于本技术领域的技术人员而言，在本发明的启示下，能够从本发明公开内容中直接导出联想一些原理和结构相同的基本变形，或现有技术中常用公知技术的替代，以及特征相同的相互不同组合、相同或相似技术效果的技术特征简单改换，都属于本发明技术的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统，其特征在于：包括可调控的光栅结构单元、第一透镜、空间滤波器、涡旋半波片、双色镜、显微物镜、筒镜和数字相机；

可调控的光栅结构单元包括偏振分束器、半波片和空间光调制器；

半波片和空间光调制器依次设置在偏振分束器的第一出射光路上；

第一透镜、空间滤波器、涡旋半波片、双色镜和显微物镜依次设置在偏振分束器的与第一出射光路垂直的第二出射光路上；

所述涡旋半波片0°快轴方向为水平方向；

筒镜、数字相机依次设置在双色镜的垂直于所述第二出射光路的光路上。

2.根据权利要求1所述的基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统,其特征在于：还包括设置在涡旋半波片和双色镜之间光路上的共焦系统。

3.根据权利要求2所述的基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统,其特征在于：所述共焦系统包括沿光路依次设置的第二透镜和第三透镜。

4.根据权利要求1或2或3所述的基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统,其特征在于：还包括设置在双色镜和显微物镜之间光路上的反射镜。

5.根据权利要求4所述的基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统,其特征在于：所述显微物镜设置在双色镜的上方。

6.根据权利要求5所述的基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜系统,其特征在于：所述空间光调制器为反射式铁电液晶空间光调制器。

7.一种基于径向偏振调制的干涉式结构光照明显微镜成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)激光器发出的水平线偏振光照射到可调控的光栅结构单元上，产生垂直线偏振的多级衍射光束；

2)将汇聚的多级衍射光束进行阻挡零级和高级衍射光并保留±1级衍射光的处理；

3)被保留的垂直线偏振±1级衍射光通过涡旋半波片改变偏振态，所述涡旋半波片0°快轴方向为水平方向；

4)改变偏振态的±1级衍射光进入显微物镜干涉形成结构照明光场，对样品进行照明；

5)样品受激发出荧光，过滤掉荧光中包含的其它波长光，处理后的荧光被收集形成图像。