CN101727059B - 基于表面等离子体共振的数字全息显微成像方法及显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于表面等离子体共振的数字全息显微成像方法及显微镜。显微成像方法中，线偏振激光束经扩束准直后再经分束器分成两束，其中一束为参考光束，另一束入射到棱镜，经设置有金属膜的棱镜面反射后成为物光束，被测样品置于镀有金属膜的棱镜面，物光束和参考光束经合束器后进入摄像装置中，得到全息图，然后通过数字全息重建算法，同时得到被测样品表面的强度分布图和位相分布图。本发明为选择入射角提供了较大的灵活性，因此具有较大的优越性。由全息图所得的位相显微图像和强度显微图像所显示的细胞膜表面图像是传统显微镜无法获得的，所发明的显微镜应用前景广泛。

Description

基于表面等离子体共振的数字全息显微成像方法及显微镜

技术领域

本发明涉及一种基于表面等离子体共振效应的数字全息显微成像技术，属显微成像技术领域。

背景技术

数字全息(Digital Holography)，是普通全息术、计算机技术、电子成像技术相结合的产物。数字全息术和普通全息术的记录过程基本相同，不同的是用CCD摄像机、CMOS摄像机等电子成像器件代替全息干版来记录全息图，并将记录的全息图存人计算机；数字全息术的再现过程和普通全息术完全不同，是用数字计算方法对存人计算机的全息图进行数字再现。和普通全息术比较，有以下明显优点：(一)由于用电子成像器件代替全息干版来记录全息图，所需的曝光时间可以很短，没有化学银盐干版的湿处理过程，可连续记录运动物体的各个瞬间过程，实现视频下的连续实时在线全息记录；(二)通过数字再现，可以再现出物光波的复振幅，根据物光波的复振幅可以同时得到物光波的强度分布和位相分布的定量图像。定量的分布显示是数字全息相对于普通全息的优点，使传统的全息术又焕发出新的应用活力。数字全息显微镜是数字全息技术和显微成像技术结合的产物，可以对微小物体进行显微成像，在生物医学等方面具有重要的应用前景。

在生物医学领域，对生物样品表面结构(如活细胞膜)的研究一直以来是一个非常重要的课题。目前用于对活细胞膜显微成像的主要有全内反射荧光显微镜。全内反射荧光显微镜需要荧光染料标记，为了避免标记，最近有研究者利用全内反射效应和数字全息技术结合提出了一种全内反射数字全息显微术[William M.Ash III and Myung K.Kim，“Digital holography of total internalreflection，”Opt.Express，16，9811- 9820(2008).]，用于细胞膜等微小生物样品表面的位相显微成像，其结构示意图如图1所示。但是这种全内反射数字全息显微镜存在一些局限性。例如生物样品和用于产生全内反射的玻璃棱镜之间折射率的差别在0.1到0.4左右，这就可能使得对同一入射角而言，样品表面的一些局域满足全内反射条件而另一些局域不满足全内反射条件，因此通常要设置一个较大的入射角，使所有局域都满足全内反射条件，这就给数字全息显微成像带来非常大的不方便，主要表现在由于反射角较大，反射界面的法线和成像光轴的夹角也较大，使得像面在一个方向上出现较大的压缩畸变。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生物样品表面结构的显微观察的基于表面等离子体共振的数字全息显微成像方法。

本发明的目的还在于提供一种实现上述方法的显微镜。

本发明的基于表面等离子体共振的数字全息显微成像方法，

线偏振激光束经扩束准直后再经分束器分成两束，其中一束为参考光束，另一束入射到棱镜，经设置有金属膜的棱镜面反射后成为物光束，被测样品置于镀有金属膜的棱镜面，物光束和参考光束经合束器后进入摄像装置中，得到全息图，然后通过数字全息重建算法，同时得到被测样品表面的强度分布图和位相分布图。

进一步的，所述线偏振激光束的偏振方向平行于镀有金属膜的棱镜面的入射面(p偏振光束)。

进一步的，物光束和参考光束进入合束器之前均经过显微物镜进行放大处理。

在棱镜的一个棱镜面设置有一层金属膜，被测样品置于金属膜表面。当光束进入棱镜内入射到设置有金属膜的棱镜面时将产生表面等离子体共振效应，该棱镜面的反射光束的位相分布和强度分布将携带被测样品表面折射率分布信息。物光束和参考光束经合束器后进入摄像装置中，两光束相互干涉生成全息图，通过数字全息重建算法，可同时得到被测样品表面的强度分布图和位相分布图。

基于表面等离子体共振的数字全息显微镜，包括线偏振激光束产生装置、扩束准直器、分束器、一棱镜面设置有金属膜的棱镜、合束器以及摄像装置；线偏振激光束产生装置产生的线偏振激光束经扩束准直器以及分束器后分成两束，其中一束为参考光束，另一束入射到棱镜，经设置有金属膜的棱镜面反射后成为物光束，物光束和参考光束经合束器后进入摄像装置中生成全息图。

进一步的，所述的显微镜还包括第一显微物镜和第二显微物镜，物光束经第一显微物镜进入合束器，参考光束经第二显微物镜进入合束器。第一显微物镜和第二显微物镜可以相同也可以不同。

进一步的，所述一棱镜面设置有金属膜的棱镜，金属膜直接镀在棱镜面上，或金属膜镀在一薄玻璃片上，薄玻璃片通过折射率匹配液粘贴在棱镜面上。

进一步的，为了使整个装置更加紧凑和集成化，线偏振激光束产生装置为内置起偏器的激光器。

进一步的，所述线偏振激光束的偏振方向平行于设置有金属膜的棱镜面的入射面(p偏振光束)。

所述棱镜可为三角棱镜，也可为多角棱镜。

本发明的方法基于一种表面等离子体共振效应：

表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是一种发生在金属与电介质分界面上的物理光学现象。表面等离子体共振的基本原理如下：按照麦克斯韦方程组，在一定的条件下，可以出现沿着具有负实数介电常数材料(如金属)和正实数介电常数电介质分界面上传播的平面电磁波，其振幅随离开分界面的距离按指数衰减，把这个沿着分界面传播的电磁波称为表面等离子体波(surface plasma wave，SPW)。在一定条件下，激励产生等离子体波的现象，称之为表面等离子体共振效应。采用如图3所示的棱镜耦合方式，当p偏振光以一特殊角度入射到棱镜16与金属膜17的交界面时，在金属膜17和被测样品18界面可以激发这种等离子体波。当p偏振光以θ角入射到棱镜16与金属膜17的交界面时，其反射光束的振幅分布、位相分布和被测样品18表面的折射率分布有关，通过数字全息显微成像技术可同时获得反射光束的振幅分布、位相分布的定量显微图像，进而分析被测样品18的表面折射率分布及表面结构。图4为根据理论计算得到的不同折射率(n1＝1.000和n2＝1.335)样品的反射光的反射率(反映反射光束的强度)与入射角的关系曲线；图5为根据理论计算得到的不同折射率(n1＝1.000和n2＝1.335)样品的反射光束的位相与入射角的关系曲线。作为对比，图6给出了在棱镜表面没有镀金属膜的情况下，不同折射率(n1＝1.000和n2＝1.335)的样品的反射率与入射角的关系曲线。从图6可看出，若采用折射率为1.516的棱镜，当被测样品的折射率为1.335(大多数生物细胞的折射率在此附近)时，出现全内反射的临界角为61.66度，在小于临界角的入射光束其反射光较弱，不利于全息干涉图的形成，而对于较大的入射角，其成像面的压缩畸变将较大，同时对物光显微物镜的工作距离也要求较长，而显微物镜的工作距离也越长，其放大倍数越小。而从图4可明显看出，当棱镜表面镀有一厚度45nm的金膜时，对于折射率为1.516的棱镜，和折射率为1.335的被测样品，除在表面等离子体共振入射角71.4度时的反射光较弱外，其余入射角的反射光都较强，这为选择入射角提供了较大的灵活性，例如可以采用一个直角棱镜，选择一个方便的45度入射角。因此，相比全内反射数字全息显微镜，基于表面等离子体共振效应的数字全息显微镜具有较大的优越性。由全息图所得的位相显微图像和强度显微图像所显示的细胞膜表面图像是传统显微镜无法获得的，所发明的显微镜应用前景广泛。

附图说明

图1为全内反射数字全息显微术的实验装置图。图中，1-激光器；2-分束器；3-反射镜；4-参光显微物镜；5-CCD；6-成像透镜；7-合束器；8-物光显微物镜；9-被测样品；10-棱镜；11-反射镜。

图2为本发明的显微镜示意图。图中，12-激光器；13-起偏器；14-扩束准直器；15-消偏振分光棱镜；16-棱镜；17-金属膜；18-被测样品；19-第一显微物镜；20-消偏振分光棱镜；21-摄像机；22-第二显微物镜；23-反射镜；24-计算机。

图3为激发表面等离子共振的棱镜耦合方式示意图。

图4为不同折射率的样品的反射光的反射率与入射角的关系曲线。

图5为不同折射率的样品的反射光位相与入射角的关系曲线。

图6为无金属膜时不同折射率的样品的反射率与入射角的关系曲线。

图7为金膜/细胞界面示意图。图中，25-金膜表面；26-空气；27洋葱细胞。

图8为基于表面等离子体共振的数字全息显微镜获得的洋葱细胞的全息图。

图9为图8的数字全息强度再现像。

图10为图8的数字全息位相再现像。

图11为图10的三维显示图。

图12为由全内反射数字全息显微镜获得的洋葱细胞的全息图。

具体实施方式

图2为本发明的显微镜示意图。激光器12发出的光束经起偏器13生成线偏振激光束，其偏振方向平行于镀有金属膜17的棱镜面的入射面(p偏振光束)，该偏振光束经扩束准直器14后被分束器15分成两束，使一束光入射到置有被测样品18的棱镜16上，经镀有金属膜17的棱镜面反射后从棱镜另一表面射出，成为携带有被测样品表面信息的物光束。从分束器15出来的另一束光作为参考光束。物光束通过一物光显微物镜19放大后，再经一合束器20进入摄像机21中。参考光束经一反射镜23反射后通过一参光显微物镜22，再经合束器20进入摄像机21中与物光束进行干涉生成全息图，全息图用摄像机21记录，并储存于计算机24中。计算机24通过数字全息重建算法，同时得到待测样品表面的强度分布图和位相分布图。

数字全息重建待测样品表面的强度分布和位相分布原理如下：

物光束与参考光束在摄像机记录面上叠加后的光强度分布为

I(x_H，y_H)＝R·R^*+O·O^*+O·R^*+O^*·R

＝|R₀|²+|O₀(x_H，y_H)|²                     (1)

+O₀(x_H，y_H)R₀exp{j[2π(ξ_rx_H+η_ry_H)]+φ(x_H，y_H)}

+O₀(x_H，y_H)R₀exp{-j[2π(ξ_rx_H+η_ry_H)]+φ(x_H，y_H)}

式中“＊”表示复共轭，O₀(x_H，y_H)和R₀分别表示物光波和参考光波的振幅，φ(x_H，y_H)为物光波的位相分布，ξ_r＝sinθ_x/λ，η_r＝sinθ_y/λ分别为参考光在x和y方向的空间频率，λ为参考光的波长，θ_x、θ_y分别为参考光传播方向与x轴和y轴的夹角。头两项仅依赖于参考光与物光各自的强度，第三、四项依赖于物光波与参考光波的相对相位关系，结果物光波的振幅与相位信息均被记录。

用计算机模拟原参考光与全息图相乘，得到重构的物光波前在全息图平面的复振幅分布为

U(x_H，y_H)＝|R₀|²R+|O₀(x_H，y_H)|²R+(OR^*)R+(O^*R)R      (2)

＝U₁+U₂+U₃+U₄

式中U₁+U₂为再现像的零级衍射项；由于参考波的强度是均匀的，因此，U₃是原物光波前的精确重现，是+1级衍射像，为虚像；U₄是-1级衍射像，为共轭实像。

设U(x_i，y_i；0)是重建距离z_i＝0的平面上的重构复场，(x_i，y_i)是再现像的平面坐标，U(x_i，y_i；0)的角谱为

(3)

式中ξ，η是与x_i，y_i相对应的频率，

表示傅立叶变换，A₃是物光波的+1级频谱，可通过空间滤波取出。根据角谱理论，A₃在z_i＝d的平面上分布为

$A_3(\mathrm{\ξ},\mathrm{\η};d)=A_3(\mathrm{\ξ},\mathrm{\η};0)\·\exp \left[j\frac{2\mathrm{\πd}}{\mathrm{\λ}}\sqrt{1-{\left(\mathrm{\λ\ξ}\right)}^2-{\left(\mathrm{\λ\η}\right)}^2}\right]---\left(4\right)$

则物光波在z_i＝d平面上的复振幅为

从而得到重构物光波的强度和位相为

I(x_i，y_i；d)＝|U₃(x_i，y_i；d)|²，

即从重构的物光波波前，获得生物样品表面的强度分布和位相分布图像。

实施例

激光器12为输出功率为3mW、波长为

的线偏振氦氖激光器，首先将其偏振方向调整到相对棱镜16的镀金属膜面的P方向(即偏振光入射到棱镜16的镀金属膜面，其偏振方向平行于入射面)，由于采用线偏振氦氖激光器，所以不需要另加起偏器；扩束准直器14为一针孔滤波器和一准直透镜组成；分束器15和合束器20采用分光比为1∶1的消偏振分光棱镜；棱镜16为K9玻璃45度直角棱镜，在一K9玻璃的盖玻片上镀有50nm厚的金膜，用香柏油将盖玻片粘贴在45度直角棱镜底面；反射镜23为平面反射镜；物光显微物镜19和参光显微物镜22都为4倍0.1NA物镜；用于记录全息图的摄像机为具有有效像元数720×576的CCD摄像机。将此显微镜用于观测新鲜的洋葱内层表皮细胞。洋葱内层表皮直接贴在金膜上，由于细胞壁连接在一起，且细胞中间与边缘厚度不同，因此在金膜表面细胞与细胞之间的空隙中充满了空气，图7为金膜表面细胞的示意图。所用棱镜的折射率为1.516，棱镜/空气界面的全反射临界角为41.3°，共振角为43.6°，物光波以45°角度入射到棱镜/样品界面，从图4可知棱镜/空气界面的反射率大约为0.8，由于细胞的折射率略大于水的折射率(常温下，蒸馏水的折射率约为1.335)，由图4可知棱镜/细胞界面的反射率大于0.9，因此，以45°入射到本装置中的棱镜/样品界面上的光的反射率都比较高。图8是实验记录的细胞膜表面的显微数字全息图，图9是数字全息再现强度图像、图10是数字全息再现位相图像，图11是图10三维定量显示图。

对比实施例

作为对比，一全内反射数字全息显微镜与实施例中所用光源相同，实验装置相似，只是棱镜16与样品之间没有金膜层，新鲜的洋葱内层表皮直接贴在棱镜上。当p偏振光以45°入射到本装置中的棱镜/样品界面上时，对于折射率为1.000的空气而言，入射到棱镜/空气界面上的光满足全反射条件，对折射率大于1.335的细胞而言，此时不满足全反射条件，由图6可知此时入射到棱镜/细胞界面上的光的反射率仅为0.25左右，图12是用此装置得到的洋葱细胞膜的全息图，由此图可以看出，细胞表面内的干涉条纹明显不清晰，由此全息图进行数字全息再现将会出现较大的错误。

Claims (9)

1.基于表面等离子体共振的数字全息显微成像方法，其特征在于：

线偏振激光束经扩束准直后再经分束器分成两束，其中一束为参考光束，另一束从棱镜的第一面入射到棱镜内部，并在该棱镜内部经设置有金属膜的棱镜面反射后成为物光束，然后从第二面射出棱镜，被测样品置于镀有金属膜的棱镜面，物光束和参考光束经合束器后进入摄像装置中，得到全息图，然后通过数字全息重建算法，同时得到被测样品表面的强度分布图和位相分布图。

2.根据权利要求1所述的基于表面等离子体共振的数字全息显微成像方法，其特征在于：所述线偏振激光束的偏振方向平行于镀有金属膜的棱镜面的入射面。

3.根据权利要求1或2所述的基于表面等离子体共振的数字全息显微成像方法，其特征在于：物光束和参考光束进入合束器之前均经过显微物镜进行放大处理。

4.基于表面等离子体共振的数字全息显微镜，其特征在于包括线偏振激光束产生装置、扩束准直器、分束器、一棱镜面设置有金属膜的棱镜、合束器以及摄像装置；线偏振激光束产生装置产生的线偏振激光束经扩束准直器以及分束器后分成两束，其中一束为参考光束，另一束从棱镜的第一面入射到棱镜内部，并在该棱镜内部经设置有金属膜的棱镜面反射后成为物光束，然后从第二面射出棱镜，物光束和参考光束经合束器后进入摄像装置中生成全息图。

5.根据权利要求4所述的显微镜，其特征在于还包括第一显微物镜和第二显微物镜，物光束经第一显微物镜进入合束器，参考光束经第二显微物镜进入合束器。

6.根据权利要求4或5所述的显微镜，其特征在于所述一棱镜面设置有金属膜的棱镜，金属膜直接镀在棱镜面上。

7.根据权利要求4或5所述的显微镜，其特征在于所述一棱镜面设置有金属膜的棱镜，金属膜镀在一薄玻璃片上，薄玻璃片通过折射率匹配液粘贴在棱镜面上。

8.根据权利要求4或5所述的显微镜，其特征在于线偏振激光束产生装置为内置起偏器的激光器。

9.根据权利要求4或5所述的显微镜，其特征在于所述线偏振激光束的偏振方向平行于设置有金属膜的棱镜面的入射面。

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