CN114354466B - 一种测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测量光力刺激下细胞‑基底相互作用的显微成像方法,其结合了表面等离子体共振全息显微术与光镊的优势,可实现光力刺激下细胞‑基底相互作用的实时表征。其中,光镊用于对活细胞施加非侵入、灵活的力学刺激,表面等离子体共振全息显微系统通过实时采集数字全息图并进行数值重建来获取细胞的表面等离子体共振相位信息。此方法可作为一种研究力学刺激下细胞与基底相互作用的免标记、宽场动态的测量手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像方法,尤其涉及一种结合表面等离子体共振全息显微成像与光镊优势,实现光力灵活刺激下活细胞与基底相互作用的近场显微成像。
背景技术
研究力学刺激下细胞-基底相互作用在生物力学等领域具有重要意义。传统的表征细胞-基底相互作用的技术手段包括电子显微术、荧光干涉衬比显微术和全内反射荧光显微术等。其中,电子显微术需要对细胞样本进行复杂的预处理;而荧光干涉衬比显微术和全内反射荧光显微术需要对细胞样本进行荧光标记,属于侵入型的探测手段。相比而言,由于表面等离子体共振对金属表面附近区域物场参量的微小变化非常灵敏,表面等离子体共振显微术可对细胞-基底间的相互作用进行非侵入、免标记的测量表征。另一方面,数字全息显微术可对光波的复振幅信息(包括振幅和相位信息)进行全场、实时、非破坏性和高分辨率的测量;将数字全息显微术与表面等离子体共振相结合,形成表面等离子体共振全息显微术,可同时获得样品的表面等离子体共振强度图像和相位图像(B.Mandracchia,etal.“Surface plasmon resonance imaging by holographic enhanced mapping,”Anal.Chem.87,4124–4128(2015).)。此外,光镊作为一种非侵入的操控技术,具有低损伤、高精度、高灵活性等特点,在生物领域具有广泛应用,如单细胞的捕获、移动、分类及趋化诱导(X.Wang,et al.“Enhanced cell sorting and manipulation with combined opticaltweezer and microfluidic chip technologies,”Lab Chip 11(21),3656–3662(2011).)。
尽管目前已有多种技术实现了细胞-基底相互作用的表征,非侵入的力学刺激下细胞-基底间相互作用的动态监测手段还鲜有报道。因此,如何实现力学刺激下细胞-基底相互作用的宽场实时表征成为一个亟待解决的科学问题。
发明内容
要解决的技术问题
为了解决现有技术的不足,实现力学刺激下细胞-基底相互作用的实时宽场表征,本发明提出一种近场显微成像方法,同时利用光镊与表面等离子体共振全息显微术的优势,其中,光镊可对活细胞施加非侵入且灵活的力学刺激,表面等离子体共振全息显微系统可实时获取细胞的近场相位图像,最终实现光力刺激下细胞-基底间相互作用的宽场动态表征。
技术方案
本发明的思想在于:搭建一套近场显微成像系统,其包含表面等离子体共振全息显微单元与和光镊单元,保证此近场显微成像系统中的元件—高数值孔径油浸物镜同轴,实现光镊单元在对细胞样品施加灵活力学刺激的同时,表面等离子体共振全息显微单元能够动态获取细胞的表面等离子体共振相位图像,进而实现光力刺激下细胞-基底相互作用的实时宽场表征。
一种测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像方法,其特征在于步骤如下:
S1.细胞芯片的制作,具体地,对一个表面蒸镀有一定厚度金层的盖玻片,在靠近其边界处紧密贴合一层环形的双面粘性材料,将包含细胞样品的溶液滴取到金层上后,迅速盖上一片干净的盖玻片,双面粘性材料将上下两个盖玻片紧密粘合;因此,双面粘性材料可实现细胞芯片的封装,防止细胞培养液渗漏;
S2.在光镊单元中,一束近红外光波经显微物镜L(如图1中的显微物镜11)后在细胞芯片内紧聚焦并形成光镊,另一束宽带光源经显微物镜L对细胞芯片内的细胞样品进行成像;在表面等离子体共振全息显微单元中,显微物镜M(如图1中的显微物镜22)通过浸油与细胞芯片耦合,一束激光进入显微物镜M后并在其后焦平面紧聚焦,从显微物镜M出射后成为平面光波并以一定的角度入射到镀有金层的盖玻片上激发表面等离子体共振,反射光波携带细胞与基底相互作用的近场信息;
S3.确保两系统里的显微物镜L,M同轴;对于表面具有特征图案的金层,首先利用表面等离子体共振全息显微单元对其进行宽场成像,此时固定显微物镜M的位置;然后微调光镊单元中显微物镜L的位置,直至视场中出现相同的特征图案;此时,光镊单元和表面等离子体共振全息显微单元测量样品的同一区域,显微物镜L,M同轴;至此,宽场动态测量光力刺激下细胞-基底相互作用的近场显微成像系统搭建完成。
所述步骤S1的双面粘性材料可选用双面胶等对细胞低毒害的材料。
所述步骤S1中的细胞样品可以是悬浮细胞等任何活细胞样品。
所述步骤S1中的细胞芯片厚度由双面粘性材料决定,一般为50~80微米。
所述步骤S2中的显微物镜L和M的放大倍率可选60~100倍。
所述步骤S2中显微物镜L的浸油可选普通的折射率匹配油,显微物镜M的浸油可选二碘甲烷。
有益效果
本发明提出的一种测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像方法,将光镊与表面等离子体共振全息显微术的优势有效结合,在利用光镊对活细胞进行非侵入的操控的同时,表面等离子体共振全息显微系统能实时记录数字全息图并数值重建得到细胞的近场相位分布,最终实现光力灵活操控下细胞-基底相互作用的动态宽场表征。
附图说明
图1是本发明所涉及的研究光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像系统的光路图;
图中:1-Nd:YAG激光器,2-光束放大器,3-透镜,4-透镜,5-万向镜,6-透镜,7-反射镜,8-二向色镜,9-透镜,10-反射镜,11-显微物镜,12-卤素灯,13-反射镜,14-分束镜,15-图像采集器件,16-He-Ne激光器,17-光纤耦合器,18-透镜,19-半波片,20-透镜,21-分束镜,22-显微物镜,23-透镜,24-沃拉斯顿棱镜,25-偏振片,26-图像采集器件,27-细胞芯片,28-入射孔径,29-BK7盖玻片,30-细胞样品,31-双面粘性材料,32-金层,33-铬层,34-蓝宝石盖玻片,35-表面等离子体共振角,36-后焦平面。
图2是本发明实施例中利用光镊动态操控K562细胞过程中细胞与金基底相互作用的宽场动态测量结果。
图中:(a1-a8)明场图像,(b1-b8)表面等离子体共振相位图像。
具体实施方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述:
本发明所涉及的一种测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像系统如图1所示,包括:Nd:YAG激光器1,光束放大器2,透镜3,透镜4,万向镜5,透镜6,反射镜7,二向色镜8,透镜9,反射镜10,显微物镜11,卤素灯12,反射镜13,分束镜14,图像采集器件15,He-Ne激光器16,光纤耦合器17,准直透镜18,半波片19,透镜20,分束镜21,显微物镜22,成像透镜23,沃拉斯顿棱镜24,偏振片25,图像采集器件26,细胞芯片27,入射孔径28,BK7盖玻片29,细胞样品30,双面粘性材料31,金层32,铬层33,蓝宝石盖玻片34,表面等离子体共振角35,后焦平面36。
所述的一种测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像方法的工作流程如下:
在光镊系统里,一束由Nd:YAG激光器1出射的线偏振光波(波长为1064nm)经光束放大器2放大5倍后,进入第一个4f系统,包含透镜3(f=50mm)和透镜4(f=50mm)。然后,光波入射到万向镜5的中心并被其反射。在通过包含透镜6(f=200mm)和透镜9(f=200mm)的第二个4f系统后,BK7盖玻片29通过浸油与显微物镜11耦合,最终光束进入显微物镜11并在其焦平面紧聚焦形成光镊。
旋转万向镜5可在横向方向上调节光镊位置,横向方向指与光束传播方向垂直的面内方向;通过在光束传播方向上前后移动透镜3可实现光镊在轴向方向的移动,轴向方向指的是与光束传播方向平行的方向。此外,为了保证光镊在动态操控样品时的稳定性,需要使入射光波始终充满显微物镜11的入射孔径28。为了实现此目的,万向镜5需位于透镜4的后焦平面处,保证前后移动透镜3时光斑尺寸在入射孔径28处不变;此外,万向镜5需位于透镜6的前焦平面处,入射孔径28位于透镜9的后焦平面处,最终使得万向镜5所在平面与入射孔径28所在平面共轭。
此外,为了实现样品的明场成像,一束由卤素灯12发出的宽带光源被二向色镜8反射后进入显微物镜11以照明样品;携带样品信息的反射光波再次被显微物镜11收集并通过透镜9,最终成像在图像采集器件15上。
在表面等离子体共振全息显微系统中,一束经He-Ne激光器16发出的光波(波长为632.8nm)经光纤耦合器17、准直透镜18和半波片19后成为一束偏振方向为45°的线偏振光波。然后,透镜20将光波聚焦在显微物镜22的后焦平面36上。此光波被显微物镜22准直并以52.2°入射到蓝宝石盖玻片34上以激发表面等离子体共振,其中,通过在水平方向上调节分束镜21的位置来调节入射光波的入射角为表面等离子体共振角35(52.2°),蓝宝石盖玻片34与显微物镜22通过浸油耦合。从显微物镜22反射的光波经成像透镜23、沃拉斯顿棱镜24、偏振片25后成像在图像采集器件26上。此处,沃拉斯顿棱镜24将反射光波分为p偏振光波和s偏振光波,其中p偏振光波能够激发表面等离子体共振并携带样品信息成为物光波,而s偏振光波不能激发表面等离子体共振以作为参考光波。在经过偏振片25后,拥有相同偏振分量的两束光波相互干涉并形成数字全息图,最终被图像采集器件26收集。
在此集成系统中,显微物镜11与显微物镜22同轴,保证此集成装置的光镊单元和表面等离子体共振全息显微单元同时操控和监测同一样品,如图1中的插图所示。
利用上述系统,在视场中没有细胞样品时记录一幅背景全息图,当光镊捕获并轴向移动一个K562细胞时,以1幅/秒的帧频连续记录60幅全息图。对记录的数字全息图进行数值重建,将由后60幅全息图与背景全息图重建出的相位分布作差并得到去除了相位畸变后的相位差分布,此即重建得到的表面等离子体共振相位图像。随着光镊沿着光轴上下移动细胞,细胞将远离或进入近场区域,最终导致相位图像中不存在或者出现细胞样品信息,从相位信息中便可以反推出K562细胞与金基底间的相互作用。图2(a1-a8)和(b1-b8)分别为光镊动态操控K562细胞过程中的明场图像及表面等离子体共振相位图像。特别地,在时刻20、30、40及60秒时,由于光镊将细胞从近场区域“拉出”,导致明场图像的失焦及近场相位图像中不存在细胞样品信息。因此,从表面等离子体共振相位图像中可获得光镊动态操控K562细胞时细胞与金基底间的相互作用,这是传统的明场显微术无法做到的。
Claims (6)
1.一种测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像方法,其特征在于步骤如下:
S1.细胞芯片的制作,具体地,对一个表面蒸镀有一定厚度金层的盖玻片,在靠近其边界处紧密贴合一层环形的双面粘性材料,将包含细胞样品的溶液滴取到金层上后,迅速盖上一片干净的盖玻片,双面粘性材料将上下两个盖玻片紧密粘合;因此,双面粘性材料用于实现细胞芯片的封装,防止细胞培养液渗漏;
S2.在光镊单元中,一束近红外光波经显微物镜L后在细胞芯片内紧聚焦并形成光镊,另一束宽带光源经显微物镜L对细胞芯片内的细胞样品进行成像;在表面等离子体共振全息显微单元中,显微物镜M通过浸油与细胞芯片耦合,一束激光进入显微物镜M后并在其后焦平面紧聚焦,从显微物镜M出射后成为平面光波并以一定的角度入射到镀有金层的盖玻片上激发表面等离子体共振,反射光波携带细胞与基底相互作用的近场信息;
S3.确保两系统里的显微物镜L,M同轴;对于表面具有特征图案的金层,首先利用表面等离子体共振全息显微单元对其进行宽场成像,此时固定显微物镜M的位置;然后微调光镊单元中显微物镜L的位置,直至视场中出现相同的特征图案;此时,光镊单元和表面等离子体共振全息显微单元测量样品的同一区域,显微物镜L,M同轴;至此,测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像系统搭建完成。
2.根据权利要求1所述的测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像方法,其特征在于,所述的双面粘性材料须选用双面胶等对细胞低毒害的材料。
3.根据权利要求1所述的测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像方法,其特征在于,所述的细胞样品包括悬浮细胞和贴壁细胞等任何活细胞样品。
4.根据权利要求1所述的测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像方法,其特征在于,所述的细胞芯片厚度由双面粘性材料决定,为50~80微米。
5.根据权利要求1所述的测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像方法,其特征在于,所述的显微物镜L和M的放大倍率须选用60~100倍。
6.根据权利要求1所述的测量光力刺激下细胞-基底相互作用的显微成像方法,其特征在于,所述的显微物镜L的浸油为折射率匹配油,显微物镜M的浸油为二碘甲烷。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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