CN110455799A - 一种用于活细胞成像的高分辨率全息显微镜及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于活细胞成像的高分辨率全息显微镜及方法，属于全息显微成像技术领域。在全息光路中，次级点光源经过活细胞样品时发生衍射的物光和未发生衍射的参考光产生干涉，形成同轴全息图，图像经高倍显微物镜放大后由CCD相机接收并存储于计算机中，利用计算机数值重建得到再现图像。本发明使用低倍显微物镜将平行光源转化为次级点光源结合记录过程中物光、参考光同向，充分利用了CCD相机的有限空间带宽，大大提高了全息显微镜系统的分辨率，使用三维微米级位移平台精确调节显微分辨率并且通过缩短记录距离接收到更多干涉外圈条纹，其中包括对重建图像起关键作用的样本高频信息，结合CCD相机前的高倍显微物镜，能够对活细胞样品实现非接触、无损伤、快速、定量的高分辨率全息显微成像。
Description
技术领域
本发明涉及全息显微成像技术领域，特别涉及一种用于活细胞成像的高分辨全息显微镜及方法。
背景技术
传统的光学显微镜在测量样品时，由于探测器只能记录物光波的强度信息，所以只能获得物体的二维形貌。电子显微镜和扫描探针显微镜由于在测量前需要对被测样品进行预处理，扫描过程需要一定的时间，因此无法对样品进行非接触、无损伤、快速、实时测量。近些年来发展的数字全息显微成像技术，对生物样品成像具有非接触、无损伤、快速、实时、定量等独特优势，克服了传统显微成像技术应用在日益发展的生物医学领域中存在的局限性。
同轴全息显微术利用光源经过物体时发生衍射的物光和未衍射的参考光相干叠加形成全息图，并由CCD相机对全息图进行数字记录，由于全息图记录了物光波前的振幅和相位信息，因此利用计算机进行数值重建可以准确还原出物体的振幅和三维相位信息，从而定量获取被测物体的三维形貌。由于它不需要对被测样品进行特殊预处理，所以被广泛应用于生物样品尤其是活细胞样品的测量和可视化观测。
一般同轴全息显微镜系统主要包括激光器、针孔或者显微物镜、CCD相机。激光器发出的相干光源通过针孔或者显微物镜使平行光源聚焦成次级点光源，充分利用了CCD的有限空间带宽，提高了系统分辨率，次级点光源经过活细胞样品时，一部分发生衍射的光称为物光，另一部分未衍射的光称为参考光，两部分光束发生干涉形成全息图，通过调节记录距离或者加入高倍显微物镜对全息图放大，放大后的图像被CCD相机接收并存储于计算机，利用计算机进行数值重建。
同样被广泛使用的离轴数字全息显微镜，系统光路具有结构复杂、光源相干性要求高、后端光学元件多、不易调节等缺点；且其物光、参考光分离，提高了干涉条纹密度，没有充分利用CCD相机的有限空间带宽[1-2]，因此系统分辨率也很难得到进一步提高；而且光路中样本与记录面间的距离很难靠得很近，不利于记录样本的高频信息。同类型的同轴全息显微镜在成像分辨率方面可以达到十几微米到一微米的分辨率[3-5]，而本系统经过USAF1951和周期为0.5um的光栅结构测试分析得到本发明可以达到低于0.5um的横向分辨率，更有利于观察活细胞样品的生物特征。
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发明内容
本发明技术解决问题：克服现有技术的不足，提供一种用于活细胞成像的高分辨率全息显微镜及方法，具有光路简单、光源相干性要求低、后端光学元件少、容易调节等特点；由于光路中物光、参考光同向，降低了干涉条纹密度，从而充分地利用了CCD相机的有限空间带宽，进一步提高了系统分辨率，且活细胞样品与记录面间的距离可以调节得很近，便于充分记录样本的高频信息，结合CCD相机前的高倍显微物镜，能够对活细胞样品实现非接触、无损伤、快速、定量的高分辨率全息显微成像。
本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：一种用于活细胞成像的高分辨全息显微镜，包括：激光器(1)，衰减片(2)，第一反射镜(3)、第二反射镜(4)、第三反射镜(5)，10×显微物镜(6)，三维微米级位移平台(7)，40×显微物镜(8)，CCD相机(9)，计算机(10)。
激光器(1)，用于提供相干光源，光源经过活细胞样品时发生衍射的物光和未衍射的参考光产生干涉，形成全息图。
衰减片(2)，用于对激光器功率进行连续调节，避免过高功率对活细胞样品造成损伤。
第一反射镜(3)、第二反射镜(4)、第三反射镜(5)，用于对光线方向进行调节，经过三次反射令光线方向由水平转为竖直，实现了全息显微镜系统的光路倒置，尤其适用于对活细胞的观察。
10×显微物镜(6)，用于对激光器平行光源聚焦成次级点光源，当次级点光源照射到活细胞样品时，一部分发生衍射的光称为物光，另一部分未发生衍射的光称为参考光，二者发生干涉形成同轴全息图。
三维微米级位移平台(7)，利用位移平台对搭载的活细胞样品进行三维微米级调节，通过改变记录距离，精确调节系统的分辨率和放大率。
40×显微物镜(8)，用于对全息图放大，结合可调的记录距离对系统放大率进一步调节。
CCD相机(9)，用于对全息图进行数字记录，并将其存储于计算机(10)，利于计算机对其进行数值重建，得到再现图像。
另外，根据本发明实例中提供的一种用于活细胞成像的高分辨率全息显微镜，次级点光源(指激光器经过第一个显微物镜后聚焦形成的点光源称为次级点光源)、被观察活细胞样品、10×显微物镜和CCD相机的中心均处于共轴状态，降低了干涉条纹密度，充分利用了CCD的有限空间带宽，提高了全息显微镜系统分辨率，且光路简单紧凑容易调节。
进一步地，在本发明实例中，将载有活细胞样品的培养皿置于三维微米级位移平台上，调节记录距离可实现对活细胞的全息显微成像。由于整个过程不需要标记样品和扫描，因此可实现对活细胞样品的实时、动态、快速、定量测量，节省了大量时间。
一种用于活细胞成像的高分辨全息显微方法，实现如下：利用激光器(1)提供相干光源，光源经过活细胞样品时发生衍射的部分称为物光，未衍射的部分称为参考光；为避免激光器过高功率对活细胞样品造成损伤，激光器(1)首先经过衰减片(2)对功率进行连续衰减调节，衰减后的平行相干光源经过三个与水平方向成45°夹角的第一反射镜(3)、第二反射镜(4)、第三反射镜(5)后，光线方向由水平转为竖直，利于对活细胞样品的观察；平行光源经10×显微物镜(6)聚焦为此级点光源，以降低干涉条纹的密度，充分利用CCD的有限空间带宽；次级点光源经过三维微米级位移平台(7)上的活细胞样品时，物光与参考光发生干涉，将物光波前的振幅和相位信息以干涉条纹强度的形式存储于全息图中；利用三维微米级位移平台(7)改变记录距离，精确调节系统的分辨率和放大率，结合40×显微物镜(8)对全息图实现进一步放大，放大后的图像被CCD相机(9)接收并存储于计算机(10)，利用计算机对全息图数值重建得到再现的振幅图像和解包裹的定量三维相位图像，实现了非接触、无损伤、快速、定量测量活细胞样品，可以实时、动态测量活细胞三维形貌和可视化监测活细胞，还可进一步应用于观察活细胞生长以及药效反应等研究。
本发明的有益效果是：本发明光路简单、光源相干性要求低、后端光学元件少、容易调节，由于光路中物光、参考光同向，降低了干涉条纹密度，充分地利用了CCD相机的有限空间带宽并进一步提高了系统分辨率，且细胞样本与记录面间的距离能够调节得很近，利于充分记录样本的高频信息，结合三维微米级位移平台精确调节记录距离，令系统达到了优于一般同轴全息显微镜的低于500nm的高分辨率(常规同轴全息显微镜分辨率一般在十几微米到一微米之间)，然后利用CCD相机前的高倍显微物镜，能够对活细胞样品实现非接触、无损伤、快速、定量的高分辨率全息显微成像。
附图说明
图1为本发明的高分辨率全息显微镜结构示意图；
图2为高分辨率全息显微镜成像原理图；
图3为利用本发明得到的7721贴壁活细胞全息图以及再现图像；(a)为7721贴壁活细胞全息图，(b)为再现的振幅图像，(c)为解包裹的定量三维相位图；
图4为利用本发明得到的Hacat贴壁活细胞全息图以及再现图像；(a)为Hacat贴壁活细胞全息图，(b)为再现的振幅图像，(c)为解包裹的定量三维相位图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明例子做进一步详细说明。
如图1所示，本发明的高分辨率全息显微镜包括：激光器1，衰减片2，第一反射镜3、第二反射镜4、第三反射镜5，10×显微物镜6，三维微米级位移平台7，40×显微物镜8，CCD相机9和计算机10；激光器1发出的平行相干光源经过三个与水平方向成45°夹角的反射镜3、4、5后，光线方向由水平转为竖直，利于对活细胞的观察，经过衰减片2对激光器功率进行连续调节，避免过高功率对活细胞样品造成损伤，平行光源经10×显微物镜6聚焦为次级点光源，以降低干涉条纹的密度，充分调用CCD的有限空间带宽；点光源经过三维微米级位移平台7上的活细胞样品时物光与参考光发生干涉，将物光波前的振幅和相位信息以干涉条纹强度的形式存储于全息图中；利用三维微米级位移平台7改变记录距离，精确调节系统的分辨率和放大率，结合40×显微物镜8对全息图实现进一步放大，放大后的图像被CCD相机9接收并存储于计算机10，利用计算机对全息图数值重建得到再现的振幅图像和解包裹的定量三维相位图像。同轴全息显微镜利用激光透过被测活细胞样品时发生衍射的物光和未发生衍射的参考光产生干涉，将细胞的振幅和相位信息包裹于全息图，然后利用计算机对其进行衍射重建得到再现振幅和解包裹三维相位图像，实现了非接触、无损伤、快速、定量测量活细胞样品三维形貌，利用本发明实现了实时、动态测量活细胞三维形貌和可视化监测活细胞，还将进一步应用于观察活细胞生长以及药效反应等研究。
激光器1波长为532nm，相干长度为1m，可调功率范围为400-1500mW；利用10×，NA＝0.25的显微物镜6可以将激光器平行光源聚焦成次级点光源，充分利用CCD相机的有限空间带宽，提高系统分辨率，实现系统的高分辨率成像；通过三维微米级位移平台7在Z轴方向以10um精度改变次级点光源与物体的距离以及物体和记录面间的距离，精确调节全息显微镜系统分辨率和放大率同时获得不同放大倍率和离焦面的全息图；利用CCD相机9对放大的全息图像进行数字记录，并将其存储于计算机10，利用全息重建算法，数值模拟菲涅尔衍射过程，获得了再现的振幅图像和包裹相位图像，其次利用质量导图引导的相位解包裹算法，将包裹相位解包裹，从而得到定量三维相位图像。
图2为高分辨率全息显微镜成像原理示意图，当点光源照射到载有活细胞样品22时，透过活细胞样品的衍射光携带了物体的信息称为物光23，未衍射的光称为参考光21，二者发生干涉，将物光波前的振幅和相位信息记录于全息图24中。通过调节三维微米级位移平台Z轴方向的距离，改变了点光源与物体之间的距离L1和物体与记录平面之间的距离L2，也改变了全息显微镜系统的分辨率和放大率。
利用同轴数字全息显微镜系统，具有光路简单、光源相干性要求低、后端光学元件少、容易调节等特点；又由于系统中物光、参考光同向，降低了干涉条纹密度，从而充分利用了CCD相机的有限空间带宽，提高了系统的分辨率，且细胞样本与CCD面间的距离能够靠得很近，易于记录样本的高频信息，结合CCD相机前的40×，NA＝0.65的显微物镜，能够实现对活细胞样品的高分辨率显微成像。
实施例1:
如图3为利用图1所示的高分辨率全息显微镜得到的7721活细胞全息图和再现图像。激光器1发出相干光束，经过衰减片2对功率进行连续衰减，避免损伤活细胞样品，光源经过三个与水平方向成45°夹角的反射镜3、4、5改变了光线传播方向，使光线方向由水平变为竖直，经过10×显微镜物镜6聚焦为次级点光源，当次级点光源通过载有7721活细胞样品的三维微米级位移平台7时，物光和参考光发生干涉，形成同轴全息图，图像再经40×显微镜物镜8放大，最后被CCD相机9接收并存储于计算机10中，如图3中(a)所示。图3中的(b)为利用计算机在重建距离大约为6.4mm处得到的复振幅图像，从中可以看出7721细胞的二维形貌并估计其长度大概21μm左右，图3中的(c)为相应的解包裹三维相位图，从中可以看出7721细胞的三维形貌并且得到细胞相位差大约是6.54rad。
实施例2:
如图4为利用图1所示的高分辨率全息显微镜得到的Hacat活细胞全息图和再现图像。激光器1发出相干光束，经过衰减片2对功率进行连续衰减，避免损伤活细胞样品，光源经过三个与水平方向成45°夹角的反射镜3、4、5改变了光线传播方向，使光线方向由水平变为竖直，经过10×显微镜物镜6聚焦为次级点光源，当次级点光源通过载有Hacat活细胞样品的位移平台7时，物光和参考光发生干涉，形成同轴全息图，图像再经40×显微镜物镜8放大，最后被CCD相机9接收并存储于计算机10中，如图4中(a)所示。图4中的(b)为利用计算机在重建距离大约为6.5mm处得到的复振幅图像，从中可以看出Hacat细胞的二维形貌并估计其长度大概37μm左右，图4中的(c)为相应的解包裹三维相位图，可以看出Hacat细胞三维形貌并且得到细胞相位差大约是6.1rad。
总之，本发明使用低倍显微物镜将平行光源转化为次级点光源结合记录过程中物光、参考光同向，充分利用了CCD相机的有限空间带宽，大大提高了全息显微镜系统的分辨率，使用三维微米级位移平台精确调节显微分辨率并且通过缩短记录距离接收到更多干涉外圈条纹，其中包括对重建图像起关键作用的样本高频信息，结合CCD相机前的高倍显微物镜，能够对活细胞样品实现非接触、无损伤、快速、定量的高分辨率全息显微成像。
以上对本发明提供的一种用于活细胞成像的高分辨全息显微镜进行了详细介绍，提供以上实例仅仅是为了帮助理解本发明的方法，而并非要限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定，不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改，均应涵盖在本发明的范围之内。
Claims (6)
1.一种用于活细胞成像的高分辨全息显微镜，其特征在于，包括：激光器(1)，衰减片(2)，第一反射镜(3)、第二反射镜(4)、第三反射镜(5)、10×显微物镜(6)、微米级三维位移平台(7)、40×显微物镜(8)、CCD相机(9)和计算机(10)；
激光器(1)，用于提供相干光源，光源经过活细胞样品时发生衍射的物光和未衍射的参考光产生干涉，形成全息图；
衰减片(2)，用于对激光器功率进行连续调节，避免过高功率对活细胞样品造成损伤；
第一反射镜(3)、第二反射镜(4)、第三反射镜(5)，用于对光线方向进行调节，经过三次反射令光线方向由水平转为竖直，实现全息显微镜的光路倒置，尤其适用于对活细胞样品的观察；
10×显微物镜(6)，用于对激光器平行光源聚焦成次级点光源(激光器经过第一个显微物镜后聚焦形成的点光源称为次级点光源)，当次级点光源照射到活细胞样品时，一部分发生衍射的光称为物光，另一部分未发生衍射的光称为参考光，二者发生干涉形成同轴全息图；
三维微米级位移平台(7)，利用位移平台对搭载的活细胞样品进行三维微米级调节，通过改变记录距离，精确调节系统的分辨率和放大率；
40×显微物镜(8)，用于对全息图放大，结合可调的记录距离对系统放大率进一步调节；
CCD相机(9)，用于对全息图进行数字记录，并将其存储于计算机(10)，利于计算机对其进行数值重建，得到再现图像。
2.根据权利要求1所述的一种用于活细胞成像的高分辨全息显微镜，其特征在于：所述激光器(1)的波长为532nm，相干长度为1m，可调功率范围为400-1500mW。
3.根据权利要求1所述的一种用于活细胞成像的高分辨全息显微镜，其特征在于：所述10×显微物镜(6)的NA＝0.25，显微物镜聚焦激光器平行光源，充分利用CCD相机的有限空间带宽，同时结合三维微米级位移平台(7)精确调节次级点光源到活细胞样品以及活细胞样品到CCD面间的距离，使全息显微镜系统达到了低于500nm的高分辨率优于一般的同轴全息显微镜。
4.根据权利要求1所述的一种用于活细胞成像的高分辨全息显微镜，其特征在于：所述三维微米级位移平台(7)在Z轴方向以每次10um的精度精确调节次级点光源与活细胞样品以及活细胞样品与CCD记录面间的距离，依据全息显微镜放大率公式以及全息显微镜横向放大率公式全息显微镜系统放大率和横向分辨率也实现了精确调节，同时获得了不同放大倍率和离焦面的全息图，其中L1为次级点光源到活细胞样品的距离，L2为活细胞样品到CCD接收面的距离，λ为激光器波长，W指CCD单个像素尺寸。
5.根据权利要求1所述的一种用于活细胞成像的高分辨全息显微镜，其特征在于：所述计算机(10)利用全息重建算法数值模拟菲涅尔衍射过程，获得再现的振幅图像和包裹相位图像，再利用质量导图引导的相位解包裹算法，将包裹相位解包裹，从而得到定量三维相位图像。
6.一种用于活细胞成像的高分辨全息显微方法，其特征在于，实现如下：利用激光器(1)提供相干光源，光源经过活细胞样品时发生衍射的部分称为物光，未衍射的部分称为参考光；为避免激光器过高功率对活细胞样品造成损伤，激光器(1)首先经过衰减片(2)对功率进行连续衰减调节，衰减后的平行相干光源经过三个与水平方向成45°夹角的第一反射镜(3)、第二反射镜(4)、第三反射镜(5)后，光线方向由水平转为竖直，利于对活细胞样品的观察；平行光源经10×显微物镜(6)聚焦为此级点光源，以降低干涉条纹的密度，充分利用CCD的有限空间带宽；次级点光源经过三维微米级位移平台(7)上的活细胞样品时，物光与参考光发生干涉，将物光波前的振幅和相位信息以干涉条纹强度的形式存储于全息图中；利用三维微米级位移平台(7)改变记录距离，精确调节系统的分辨率和放大率，结合40×显微物镜(8)对全息图实现进一步放大，放大后的图像被CCD相机(9)接收并存储于计算机(10)，利用计算机对全息图数值重建得到再现的振幅图像和解包裹的定量三维相位图像，实现了非接触、无损伤、快速、定量测量活细胞样品，可以实时、动态测量活细胞三维形貌和可视化监测活细胞，还可进一步应用于观察活细胞生长以及药效反应等研究。
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