DE102012016346B4

DE102012016346B4 - Laser-Scanning-Mikroskop

Info

Publication number: DE102012016346B4
Application number: DE102012016346.0A
Authority: DE
Inventors: Artur Degen; Daniel Schwedt; Michael Gölles
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2012-08-16
Filing date: 2012-08-16
Publication date: 2023-01-05
Anticipated expiration: 2032-08-17
Also published as: US10345567B2; DE102012016346A1; US20140055851A1

Abstract

Laser-Scanning-Mikroskop miteiner Laserlichtquelle (L) zur Fluoreszenzanregung mittels Beleuchtungslicht (Anregungslicht), insbesondere einer Kurzpulslichtquelle zur Mehrphotonenanregung, einer Scanspiegelanordnung (SC) zur rasterartigen Beleuchtung einer Probe und einer Scanoptik (SO, 11) zur Erzeugung einer beugungsbegrenzten Referenzbildebene (8) als eine erste Zwischenbildebene,einem optischen System, vorzugsweise mit großer numerischer Apertur, zur vorzugsweise verkleinernden Abbildung der Referenzbildebene (8) in ein zweites Zwischenbild in einer in einem Bildraum vorhandenen zweiten Zwischenbildebene (6),einem axial, also entlang einer optischen Achse des optischen Systems, bewegbaren Spiegel (S) in der zweiten Zwischenbildebene (6), in der sich das zweite Zwischenbild befindet,einer Strahlteileranordnung (12) zwischen der Referenzbildebene (8) und dem besagtem optischen System,einer ersten Tubuslinse (3) und einem ersten Mikroskopobjektiv (2) zur aberrationsfreien Abbildung der Referenzbildebene (8) in eine in einem Objektraum befindlichen Probe, dadurch gekennzeichnet, dasseine Vergrößerung M von der zweiten Zwischenbildebene (6) in die Probe gemäß derM=y'/y=n/n'ξ mit ξ≠1, durch ξ ≠ 1 vom Quotienten der Brechzahlen n, n' der Immersionsmedien im Obj ektraum an der Probe und im Bildraum am Spiegel (S) abweicht;wobeiy und y' die Koordinaten eines Punktes auf einer senkrecht zur optischen Achse gerichteten Achse sind, undξ ein Faktor ist.

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Laserscanningmikroskopie hat sich in den vergangenen Jahrzehnten zu einem mächtigen Werkzeug in der biomedizinischen Forschung entwickelt. Grundlage dieser Entwicklung ist insbesondere die hervorragende Tiefendiskriminierung, die sich durch konfokale Detektionsmethoden oder Mehrphotonenanregung ergeben. Da biologische Proben durchaus dreidimensionale Objekte sind und Bewegungsabläufe wie beispielsweise Vesikelwanderungen in Zellen im Allgemeinen auch eine Komponente in Richtung der optischen Achse des Mikroskopobjektives aufweisen oder bspw. die Vernetzung innerhalb eines dreidimensionalen neuronalen Netzwerkes untersucht werden soll, ist ein schneller Wechsel der untersuchten Probenebene wünschenswert. Des weiteren ist es gerade bei der Lebendzellforschung von Vorteil, das Untersuchungsobjekt möglichst wenigen Störungen auszusetzen.
Nach dem Stand der Technik (z.B. Zeiss LSM510, 710, DE 19702753 A1 ) wird der anregende Laser durch ein Mikroskopobjektiv, dessen Abstand zur Probe vorzugsweise mit einem Piezostellelement eingestellt wird, in die Probe fokussiert. Aufgrund der nicht unerheblichen Masse eines Objektivs ist die Stellgeschwindigkeit des Objektivs begrenzt, so dass die Scanrate entlang der optischen Achse wenige zehn Hertz nicht übersteigt. Die durch die Probe bestimmte, zu erreichende Eindringtiefe bestimmt schließlich, ob lineare oder Mehrphotonenanregung am sinnvollsten einzusetzen ist. Im Folgenden wird ein typisches Beispiel beschrieben, in dem ein schnelles dreidimensionales Scannen besonders von Interesse ist.
Mikroskopie mit Mehrphotonenanregung (z.B. EP 0500717 B2 ) wird bevorzugt beim Mikroskopieren dicker Proben mit Dicken von einigen Hundert Mikrometern eingesetzt, bei denen es somit auf große Eindringtiefen ankommt. Mehrphotonenmikroskopie eignet sich dazu besonders, da diese auf Anregungslicht im nahen Infraroten zurückgreift und daher deutlich weniger bzgl. elastischer Streuung anfällig ist und somit auch bei größeren Eindringtiefen in der Lage ist, einen sauberen Fokus zu erzeugen. Da die Anregung der Fluoreszenzmoleküle nur bei großen Leistungsdichten mittels der Mehrphotonenprozesse möglich ist, kann diese nur dem Fokus selbst entstammen. Zwar unterliegt die Fluoreszenz aufgrund ihrer geringeren Wellenlänge wieder einem vergrößerten Streuquerschnitt in der Probe, so dass ihre Ortsinformation eigentlich verloren geht, jedoch ist der Entstehungsort aufgrund der Mehrphotonenanregung a priori bekannt. Somit muss lediglich eine Abbildung sämtlicher Photonen, die durch die Objektivapertur eingesammelt werden, auf einen in einer zur Objektivpupille konjugierten Ebene befindlichen Detektor gewährleistet werden.
Ein typisches Anwendungsgebiet dieser Technologie ist die Hirnforschung, welche neuronale Netzwerke an lebenden Gehirnen von Kleintieren untersucht. Hierbei ist eine Parallelisierung der Untersuchung optischer und elektrischer Signale nötig, wobei beide Kanäle - der optische und der elektrische - für Stimulationen und Nachweise der neuronalen Tätigkeiten herangezogen werden. Ein Experiment derart wird somit in der Regel an einem offenen Hirn eines narkotisierten Kleintieres stattfinden, in welches Nadeln als elektronische Sonden an gewisse Neuronen angesetzt werden. Über ein Hoch-NA-Objektiv mit großem Arbeitsabstand wird dann sowohl mit dem Mehrphotonenlaser, in der Regel ein Femtosekundenlaser im nahen Infrarot, angeregt als auch die erzeugte Fluoreszenz eingesammelt und in Richtung eines Detektors, vorzugsweise nicht descannt, abgebildet. Das Objektiv ist entweder ein Trockenobjektiv oder eines mit Wasser als Immersionslösung. In den meisten Fällen wird ohne Deckglas gearbeitet. Aber auch eine Deckglasversiegelung des Hirns, dann aber ohne elektrischen Zugang, ist applikativ denkbar. In jedem Fall ist es wichtig, bei der Aufnahme von axialen Bildstapeln die empfindliche Probe nicht zu stören oder Raumkonflikte mit den angeschlossenen hochempfindlichen elektrischen Sonden zu vermeiden.
Des weiteren ist es gerade bei Experimenten, bei denen optisch eine neuronale Stimulanz vorgenommen werden soll, wichtig, sehr schnell zuvor definierte Punkte in einem dreidimensionalen interessierenden Ausschnitt der Probe anzufahren und das betreffende Neuron gezielt zu beleuchten. Somit ist eine schnelle und wechselwirkungsfreie Fokussierung wünschenswert.
Stand der Technik und dessen Nachteile
Fokussierung mittels piezomechanischer Verstellung des Objektives Die einfachste Möglichkeit, eine Defokussierung der untersuchten Probenebene im Bereich einiger Hundert Mikrometer zu erreichen, ist das Objektiv mit einer piezomechanisch gelagerten Fassung zu haltern, so dass eine Variation der Piezospannung ein Verschieben des Objektives entlang der optischen Achse bewirkt. Der applikative Nutzen ist beispielsweise in GÖBEL, W. et al.: Imaging cellular network dynamics in three dimensions using fast 3D laser scanning. In: Nature Methods, 4, 2007, Seiten 73–79. https://doi.org/10.1038/nmeth989 eindrucksvoll demonstriert worden. Die Nachteile sind jedoch sofort ersichtlich. Das anregende und beobachtende Objektiv schwingt in Bezug zur Probe, überträgt über das Immersionsmedium mechanische Wellen auf die Probe und schränkt das Setzen elektrischer Sonden massiv ein. Zudem muss der Piezoantrieb die Masse des Objektivs bewegen, was die erreichbare axiale Stellgeschwindigkeit limitiert.
WO 2008/078083 A1 (siehe auch 1)
Um beliebige Ebenen im Objekt vollständig auskorrigiert auf den Sensor abzubilden und bei Umfokussierung den Abstand zwischen Probe und Objektiv konstant zu belassen, umfasst dieses Konzept vorzugsweise drei sequentiell durchstrahlte, identische Mikroskope (jeweils Objektiv und Tubuslinse wie in 1 dargestellt), wobei zwei davon Rücken an Rücken zueinander stehen, so dass sich deren Aberrationen aufheben. Das gemeinsame auskorrigierte Zwischenbild (gestrichelt dargestellt) stellt dabei die Schnittstelle zwischen beiden Mikroskopen dar. In der Folge entsteht eine aberrationsfreie 3D-Kopie des Objektes, welche um das Brechzahlenverhältnis der Immersionsmedien vergrößert ist. Dieses virtuelle Objekt wird durch ein drittes Mikroskop auf einen Detektor abgebildet, wobei die axiale Lage des Objektives die Fokalebene innerhalb des virtuellen Objektes bestimmt. In einer weiteren Variante können mithilfe eines Spiegels im virtuellen Objekt 2. und 3. Mikroskop durch ein einziges Mikroskop ersetzt sein.
Durch die Nutzung von Hoch-NA-Objektiven verfügt das erzeugte Zwischenbild über einen hohen Grad an Detailtreue. Erfolgt die Auswahl der interessierenden Fokalebene über einen im Zwischenbild eingebrachten Spiegel und entsprechender Strahlteilungsmittel im Raum zwischen Objektiv und kann eine Variation der betrachteten Bildebene extrem schnell erfolgen, da der Spiegel sehr klein gehalten werden kann und somit nur wenig Masse beschleunigt werden muss. Nachteilig an dieser Lösung ist, dass die beiden Objektive, die das Zwischenbild erzeugen, aufeinander abgestimmt sein müssen und somit ein Wechsel der Objektive nur synchron erfolgen kann. Die Nutzung eines Spiegels in der Zwischenbildebene bewirkt zudem, dass der Spiegel im Zwischenbild stehend, je nach selektierter Fokusebene, scharf auf den Detektor abgebildet wird und somit Bildartefakte unumgänglich sind. Insbesondere wirken sich Staubablagerungen und Kratzer auf dem Spiegel negativ aus und auf der Spiegelschicht kann es zu Einbrennungen von Staub kommen.
EP 0835423 A1
Betrifft ein konfokales Mikroskop zur schnellen Höhenmessung bei der Qualitätskontrolle während der Herstellung von integrierten Schaltkreisen. Hierzu wird in einem Zwischenbild, analog zu WO 2008/078083 A1 , eine miniaturisierte Spiegelanordnung in axialer Richtung schnell und sinusförmig bewegt. Jedoch ist in diesem Fall kein einfacher Planspiegel, sondern ein Retroreflektor vorgesehen, der einen Strahlversatz erzeugt. Aufgrund dieser Feldteilung entfällt die Notwendigkeit einer Strahlteilung im Unendlichraum zwischen Objektiv und Tubuslinse, was zwar einen Vorteil bezüglich der Lichteffizienz mit sich bringt, die Verwendbarkeit der Anordnung aber auf recht geringe numerische Aperturen einschränkt. Diese Anordnung ist somit für die Fluoreszenzmikroskopie mit verlangten Aperturen von NA > 1 nicht anwendbar.
EP 2146235 A1
erweitert WO 2008/078083 A1 um eine Zoomoptik mit geringen Zoomfaktoren, wodurch die harte Anpassungsbedingung zwischen den beiden Rücken an Rücken stehenden Mikroskopen aufgeweicht wird. Es sind auf diese Weise Fertigungstoleranzen bzgl. der Vergrößerung der Objektive oder probenseitige Brechungsindexvariationen (Temperatur oder pH-Wert) abfangbar. Das oben angesprochene Problem der Bildartefakte wird dagegen nicht gelöst.
DE 102008049885 A1
behandelt die Problematik, die erheblichen Verluste zu reduzieren, die das Objektlicht erfährt, wenn es eine Anordnung nach WO 2008/078083 A1 durchläuft, in dem Anordnungen zur Pupillenteilung oder zur Polarisationsteilung mit nicht axialem Eintritt in die Rückseitenapertur des Mikroskopobjektives geschützt werden. Problematisch an der Pupillenteilung ist, dass diese auf kleinere numerische Aperturen bzw. reduzierte Sehfeldgrößen beschränkt bleibt. Die Variante mit der Polarisationsstrahlteilung und der nicht axialen Objektivnutzung erzeugt wiederum Artefakte aufgrund der Spiegelpositionierung im Zwischenbild.
EP 0932845 B1 (2)
Zielstellung dieses Ansatzes ist es, die Oberfläche eines Objektes vergrößert (oder verkleinert) und beugungsbegrenzt auf einen Sensor abzubilden, wobei die axiale Lage des Objektes in gewissen Grenzen schwanken kann, a priori also unbekannt ist. Als Lösung wird vorgeschlagen, ein optisches System so zu entwerfen, dass dieses nach einmaligem Durchstrahlen das Licht aus einem maximalen Volumen aus dem Objektraum auf den Sensor beugungsbegrenzt abbildet, indem zwischen dem Erfüllungsgrad von Sinus- und Herschelbedingung vermittelt wird. Das Bild auf dem Sensor ist demnach in Bezug auf laterale Feldgröße und axiale Schärfentiefe kompromißbehaftet, es wird aber zu einem gewissen Grade eine Variabilität der axialen Objektlage abgefangen.
Es wird nicht das optische System als solches, sondern ein Verfahren, dieses zu entwerfen bzw. herzustellen, beschrieben.
Problemstellung
Der hier beschriebenen Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein scannendes Mikroskop zu entwickeln, welches verhältnismäßig dicke lebende biologische Proben schnell in drei Dimensionen bildgebend untersuchen kann, wobei der Einfluss der optischen Anordnung auf das detektierte Probenbild minimiert wird.
Vorgeschlagene Lösung
Das gestellte Problem wird durch die Merkmale des unabhängigen Patentanspruchs gelöst. Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche. Die Patentansprüche sind vollumfänglich Teil der Offenbarung.
Gegenstand des in 3 und weiteren Darstellungen schematisch dargestellten Ansatzes ist es, beliebige Ebenen im Objekt chromatisch beugungsbegrenzt, insbesondere bezüglich monochromatischer Aberrationen auf der Achse und im Feld sowie bezüglich chromatischer Fehler, auskorrigiert auf den Sensor abzubilden. Ebenso umfasst die Erfindung auch die chromatisch beugungsbegrenzte Abbildung einer mittels gescannten und intensitätsmodulierten Laser beleuchteten Referenzebene in das Objekt, wobei die so erzeugte Fluoreszenz ggf. auf einen Sensor in einer zur Objektivpupille konjugierten Ebene nicht descannt abgebildet wird. Bei Umfokussierung wird der Abstand zwischen Probe und Objektiv konstant belassen. Des weiteren werden keine Laserfoki auf optischen Oberflächen abgelegt.
Dazu wird das auskorrigierte Bild eines Mikroskops (oder besagter Referenzebene) mittels eines optischen Systems in einen weiteren, jedoch stark aberrierten Bildraum abgebildet. Ein darin axial verschiebbarer Spiegel reflektiert das Licht in sich zurück. Nach erneutem Durchlaufen des optischen Systems wird die Bildinformation über entsprechende Polarisationsoptik PSB ausgespiegelt. Auf einem Sensor S (oder in der Bildebene des Mikroskops) liegt ein chromatisch beugungsbegrenztes Bild vor, da die vom optischen System verursachten Aberrationen durch die rückwärtige Nutzung aufgehoben werden. Die betrachtete (oder beleuchtete) Objektebene wird durch den Spiegel in der aberrierten Bildebene bestimmt.
Die hier vorgeschlagene Lösung baut auf dem unter anderem in WO 2008/078083 A1 beschriebenen Prinzip auf, verändert dieses aber entscheidend und überraschend, so dass eine schnelle, wechselwirkungsfreie 3D-Bildgebung von dicken, lebenden Proben über axiale Stapeltiefen von mehr als 100 µm möglich ist, ohne dass jemals der Spiegel zur Auswahl der betrachteten Fokalebene scharf abgebildet wird. Zudem sind Objektivwechsel in gewissen Grenzen unter Einhaltung der Vergrößerungsvorgaben durch eine motorisierte Anpassung des Beleuchtungsstrahlweges möglich, ohne das wesentliche Kompromisse bzgl. der Bildqualität hingenommen werden müssen.
Ein erfindungsgemäßes Mikroskop ist insbesondere vorteilhaft durch folgende Komponenten und technische Ausbildungen charakterisiert:

• eine Lichtquelle zur Fluoreszenzanregung in biomedizinischen Proben,
• ein Scanspiegel zum Abrastern der Proben mittels des Laserstrahls,
• ein Scanobjektiv zur Erzeugung eines Zwischenbildes mit dem Anregungslaser zur Definition einer Referenzbildebene,
• ein Polarisationsstrahlteiler und eine Viertelwellenplatte zur Trennung hin- und rücklaufenden Anregungslichtes,
• ein angepasstes optisches System aus Tubuslinse und Mikroskopobjektiv, welches ein verkleinertes und aberriertes Zwischenbild der Referenzebene erzeugt,
• ein Element in besagter Zwischenbildebene, welches den Laserstrahl durch das angepasste optische System aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse zurückreflektiert,
• ein weiteres, nicht erfindungsgemäßes System aus Tubuslinse und Mikroskopobjektiv, welches die Laserstrahlung in die Probe fokussiert, wobei die Abbildung von besagter Zwischenbildebene in die Probe mit einer Vergrößerung von M ≠ n / n' (Gleichung 10) erfolgt,
• ein Element zur spektralen Trennung von Fluoreszenzlicht und von der Probe zurücklaufenden Anregungslichtes,
• ein Detektor zur Registrierung von aus der Probe emittierten Fluoreszenzlichtes, welcher hinter dem Element zur spektralen Trennung sowie geeigneter Abbildungsoptik angeordnet ist,
• die Lichtquelle ist ein NIR-Laser zur Multiphotonenanregung von Fluoreszenz in biomedizinischen Proben,
• die Lichtquelle ist ein VIS-Laser zur Anregung von Fluoreszenz in biomedizinischen Proben,
• Polarisationsstrahlteiler und Viertelwellenplatte sind miteinander verkittet,
• das System aus Tubuslinse und Mikroskopobjektiv ist ein einheitliche kompakte Objektivoptik ausgelegt,
• das System aus Tubuslinse und Mikroskopobjektiv ist als Einheit entlang der optischen Achse verschiebbar angeordnet,
• das Element in der Zwischenbildebene, welches den Laserstrahl durch das System aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse zurückreflektiert, ist ein ebener Spiegel,
• das Element in der Zwischenbildebene, welches den Laserstrahl durch das System aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse zurückreflektiert, ist ein sphärischer Spiegel,
• das Element in der Zwischenbildebene, welches den Laserstrahl durch das System aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse zurückreflektiert, ist ein asphärischer Spiegel,
• das Element in der Zwischenbildebene, welches den Laserstrahl durch das System aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse zurückreflektiert, ist ein Reflexionsprisma,
• das Element in der Zwischenbildebene, welches den Laserstrahl durch das System aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse zurückreflektiert, ist ein Freiformspiegel,
• das Element in der Zwischenbildebene, welches den Laserstrahl durch das System aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse zurückreflektiert, ist ein Freiformreflexionsprisma,
• das Element in der Zwischenbildebene, welches den Laserstrahl durch das System aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse zurückreflektiert, ist axial verstellbar montiert,
• das Element in der Zwischenbildebene, welches den Laserstrahl durch das System aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse zurückreflektiert, ist axial verstellbar montiert, wobei die Verstellung vorzugsweise über einen Piezoantrieb erfolgt,
• zwischen Polarisationsstrahlteiler und probenseitigen System aus Tubuslinse und Mikroskopobjektiv ist eine verschiebbare Strahlumlenkung angeordnet, welche die Lage des probenseitigen Zwischenbildes für das gewählte System aus Tubuslinse und Mikroskopobjektiv inkl. Immersionsmedium im Zusammenspiel mit der axialen Lage des Zwischenbildspiegels zur Abbildung des Anregungslasers in die Probe optimiert,
• ein Mittel zur nicht-descannten Detektion des erzeugten Fluoreszenzlichtes
• das Element zur spektralen Trennung von Fluoreszenz und Anregungslicht ist ein Kantenfilter, welcher hinter dem probenseitigen Mikroskopobjektiv zur nicht-descannten Detektion angeordnet ist,
• das Element zur spektralen Trennung von Fluoreszenz und Anregungslicht ist ein Farbfilter, welcher innerhalb des Systems aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse angeordnet ist und sichtbares Laserlicht reflektiert und linear angeregtes Fluoreszenzsignal aus der Probe transmittiert,

Lineare Fluoreszenz:

• Ein zweites Mikroskopobjektiv ist innerhalb des Systems aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse in Transmission hinter besagtem Farbfilter angeordnet und bildet linear angeregte Fluoreszenz in eine Bildebene ab.
• Ein pixellierter Detektor ist in einer Bildebene hinter dem zweiten Mikroskopobjektiv, welcher die linear angeregte Fluoreszenz registriert, angeordnet.
• Der pixellierte Detektor ist axial verschiebbar montiert.
• Der pixellierte Detektor ist axial verschiebbar montiert, wobei die Verschiebung vorzugsweise über ein Piezoelement erfolgt.
• Die Verschiebung von Detektor in der Bildebene des zweiten und reflektierendem Element in der Bildebene des ersten Mikroskopobjektivs innerhalb des Systems aus Mikroskopobjektiv und Tubuslinse erfolgt synchronisiert.
• Der pixellierte Detektor ist ein CCD.
• Der pixellierte Detektor ist ein CMOS.
• Der pixellierte Detektor ist ein EMCCD.
• Zur konfokalen Bilderzeugung werden nur wenige Pixel des pixellierten Detektors verwendet (elektronisch oder über Software selektiert).

Das Prinzip der in WO 2008/078083 A1 beschriebenen Anordnung basiert auf der gleichzeitigen Erfüllung von Sinus- und Herschel-Bedingungen. Die Sinusbedingung ist die Bedingung für perfekte Abbildung kleiner lateraler Flächen. Die Herschel Bedingung ist die Bedingung für perfekte Abbildung entlang der optischen Achse. Gemeinsam erfüllt ergeben sie die perfekte Abbildung eines kleinen Volumens. Die Sinusbedingung lässt sich wie folgt darstellen: $n \cdot y \cdot sin α= n' \cdot y' \cdot sin α'$
n ist der Brechungsindex im Objektraum und n' der Brechungsindex im Bildraum.
Die Herschel-Bedingung ergibt sich zu: $n \cdot z \cdot {sin}^{2} α / 2 = n' \cdot z' \cdot {sin}^{2} α' / 2$
Die Bezeichnungen sind im Bild 3a ersichtlich, wobei gestrichene Größen den Bildraum darstellen.
Für kleine z und z' gilt $z' / z = n' / n {(y'/y)}^{2} = {n'/n M}^{2}$
Wobei M die Vergrößerung ist: $M = y'/y$
(3) eingesetzt in (2) ergibt: $n \cdot y \cdot sin α / 2 = n' \cdot y' \cdot sin α' / 2$
Der Quotient aus (1) und (5) mit Vereinfachung unter der Bedingung: α,α'≠0, ergibt: $cos α= cos α'$
Daraus folgt für die Winkel in : $α = | α' |$
Letzteres gilt auch für α,α'=0. Die Bedingung (7) ist die Bedingung für das gleichzeitige Erfüllen von Sinus- und Herschel-Bedingung. Das bedeutet somit, dass eine aberrationsfreie Abbildung eines kleinen Volumens erfordert, dass die Strahlwinkelspektren in Objekt- und Bildraum identisch sein müssen.
Die Vergrößerung des Systems mit perfekter Volumenabbildung folgt dann aus (1) unter Einsetzen von (7) zu: $M = y'/y = n/n'$
zeigt eine Z-Fokus Verstellung nach WO 2008/078083 A1 .
Es bedeuten: Pr - Objekt; O1 - Objektiv1, TL1 - Tubuslinse 1; TL2 - Tubuslinse 2, O2 - Objektiv 2; SP - entlang der optischen Achse beweglicher Spiegel, PST Polarisationsstrahlteiler (Teilerspiegel), CCD - Detektor (CCD).
Wenn man das optische System wie in zur schnellen Fokussierung mit den Brennweiten und Brechzahlen wie im Bild aufbaut, dann gilt für die perfekte Volumenabbildung: $(n/n') (f1/f2) (f'2/f'1) = 1$
Erfindungsgemäße Lösung für die Multiphotonenanregung
Bei der erfindungsgemäßen Lösung korrigiert nun beispielsweise ein ZEISS Objektiv 5 (hier PlanApo 20x/0.8) Fehler (Öffnungsfehler und Defokus), die bei einem Tiefenscan in einer wässrigen Probe mit dem Objektiv 2 (z.B. WPlanApo 20x/1.0) entstehen.
Erfindungsgemäß wurde jedoch für das Korrekturobjektiv in einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung eine speziell angepasste Tubuslinse TL2 realisiert 4, die zunächst zusätzlich Gaussfehler korrigiert, weil das Objektiv WPlanApo 20x/1.0 für den VIS-Bereich gut korrigiert ist, jedoch zur NLO-Anregung im NIR Bereich (700-1200 nm) benutzt wird.
Die Korrektur des hier beschriebenen Systems erstreckt sich über einen Bereich von Anregungslaserwellenlängen von 800-1000nm und einem Erfassungsbereich der Fluoreszenzanregung von ca. 380-800nm.
Im Rahmen der Erfindung können weitere optische Ausführungen ausgebildet werden, die davon abweichende Wellenlängenbereiche abdecken.
Überraschend ist nun das beschriebene Abbildungssystem vorteilhaft zusätzlich so korrigiert, dass der axial verschiebbare, im Raum des aberrationsfreien Zwischenbildes angeordnete Spiegel nicht scharf in die Probe abgebildet wird, sondern

1. das Bild hier vorzugsweise mehr als 50 Tiefenschärfen defokussiert ist,
2. das System jedoch dennoch so korrigiert wird, dass ein scharfes Bild im Zwischenbild vor dem Scan-Objektiv 1 1 entsteht,
3. das System korrigierbar ist für WPlanApo 20x/1.0 mit und ohne Deckglas,
4. die Vergrößerung vom Objekt bis in den aberrationsfreien Zwischenbildraum am Spiegel gemäß Gleichung 8 erfindungsgemäß für aberrierten Zwischenbildraum am Spiegel abweichend folgende Form annimmt: mit der Lösung

\begin{array}{l} M = y'/y = n/n' ξ \\ ξ| \neq 1 \end{array}

Die - zeigen schematische Darstellungen zur vorgeschlagenen Lösung. In 4 und 5 ist der erfindungsgemäße Strahlengang eines Scanmikroskopes, vorzugsweise mit gepulster Laserbeleuchtung zur Multiphotonenanregung, schematisch dargestellt.
Die Bezugszeichen bedeuten:

1: Objektebene ,
2: Objektiv 1,
3: Tubuslinse 1,
4: Tubuslinse 2;
5: Objektiv 2,
6: Zwischenbildebene und Spiegel S ;
7: Strahlumlenkung/ Reflektorspiegel;
8: Referenzebene;
9: Zwischenbildebene;
10: Viertelwellenplatte;
11: Scan-Objektiv;
12.1,12.: Polarisationsstrahlteiler,
TS: Teilerspiegel,
DE: Detektor,
S1, S2: Umlenkspiegel,
A: Ansteuereinheit

zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Anordnung zur Fluoreszenzmikroskopie mittels Einphotonen-Fluoreszenzanregung oder Multiphotonenanregung. Bei der Muliphotonenanregung wird mittels eines modulierbaren Kurzpulslasers L, X/Y - Scanspiegel SC und Scanoptik SO über einen Spiegel SP zur Umlenkung in der Referenzebene (8) eine zeitlich veränderliche Lichtverteilung erzeugt, welche beugungsbegrenzt in die Objektebene (1) abgebildet werden soll. Tubuslinse 2 (4) und Objektiv 2 (5) bilden diese zunächst in die Zwischenbildebene (6) ab, in der ein axial schnell beweglicher Spiegel (S) positioniert ist, welcher das Licht in sich zurück reflektiert. Das zweimalige Durchlaufen der Viertelwellenplatte (10) verursacht eine Polarisationsdrehung, so dass am Polarisationsstrahlteiler (12) zurücklaufendes Licht reflektiert wird. Die Strahlumlenkung (7) sowie die Umlenkspiegel (S1, S2) führen dem eigentlichen Mikroskop bestehend aus Tubuslinse 1 (3) und Objektiv 1 (2) das Beleuchtungslicht zu, welches so in die Objektebene (1) abgebildet wird.
Dort im Fokus erzeugtes Fluoreszenzlicht wird durch das Objektiv 1 (2) kollimiert und am Teilerspiegel (TS) in Richtung des in einer Pupillenebene befindlichen Detektors (DE) abgelenkt.
Mittels einer axialen Verschiebung der Strahlumlenkung (7) und des Systems aus Tubuslinse (4), Platte (10), Objektiv (5) und Spiegel S lässt sich zudem die sphärische Korrektur der optischen Anordnung einstellen.
Die Einstellbarkeit ist jeweils schematisch durch Pfeile dargestellt. Somit können objektseitig bspw. Untervarianten des Designobjektives 20x/1.0 Apochromat gegeneinander getauscht und durch das gleiche optische System unterstützt werden. Es sind so z.B. Objektive mit und ohne Deckglaskorrektur einsetzbar und Brechungsindexfehlanpassungen bspw. über dessen Temperaturgang korrigierbar.
Mittels eines teildurchlässigen dichroitischen Spiegels SP im Rückstrahlengang von der Probe erfolgt bei Einphotonenanregung durch einen entsprechenden Anregungslaser L eine Ausblendung des Fluoreszenzlichtes in Richtung einer konfokalen Detektion S conf, bestehend aus einer Lochblende und einem Detektor oder einem ortsauflösenden Detektor dessen Elemente in bekannter Weise konfokal geschaltet werden.
In 5 ist zusätzlich der optische Strahlengang dargestellt sowie auf der dem Polteiler 12 abgewandten Seite bezüglich der Referenzebene 8 die Scanoptik 11 eines Laser Scanning - Mikroskops, über die die scannende Beleuchtung der Probe mittels eines nicht dargestellten Kurzpulslasers L zur Mehrphotonenanregung über einen nicht dargestellten zweidimensionalen Scanner SC erfolgt.
In ist ein Beispiel für eine Tubuslinse 2 (4) dargestellt, die zusammenwirkend mit dem Objektiv PlanApo 20x/0.8 ein optisches System gemäß der Erfindung erzeugt, welches die auskorrigierte Referenzebene hinter dem Scanobjektiv bzw. das auskorrigierte Bild des Mikroskopes in ein stark aberriertes Zwischenbild überführt, in welchem der Spiegel S in der zweiten Zwischenbildebene (6) die zu beleuchtende bzw. zu betrachtende Objektebene auswählt.
Am Schluss der Beschreibung sind Optikbeispiele mit fachüblichen Toleranzen in der Tabelle 1 für die Einzelelemente von TL2 aufgeführt, unter Angabe der Flächennummer, der Dicke und des verwendeten Linsenmaterials.
Im konkreten Fall des hier gezeigten Ausführungsbeispiels (n=1.32 und n'=1) ist gemäß der Gleichung (10) ξ=1.27 und die Vergrößerung M = 1.68 anstatt mit (8) M = 1.32.
Fachmännische Veränderungen im Rahmen der Erfindung sind jedoch ohne Einschränkung möglich und einbezogen.
In 7 ist ein Ausschnitt der optischen Verhältnisse nach dem Mikroskopobjektiv 5 in 4 -6 schematisch dargestellt.
Der Laserfokus F im erzeugten Zwischenbild ZB liegt in einem Abstand zur Spiegelebene S, so dass der Laser auf der Spiegelschicht erfindungsgemäß einen vergrößerten Spotdurchmesser aufweist und damit die Energie des Lasers über eine größere Fläche verteilt wird. Die Energiedichte auf der Spiegelschicht bleibt so unterhalb der Zerstörungsschwelle für die verwendete Spiegelschicht.
In 8 ist die Laserenergiedichte in Abhängigkeit vom Laserspotradius zusammen mit Schwellwerten für die Zerstörung einer Silberschicht bzw. Goldschicht aufgetragen.
Die obere Kurve ist die maximal auf dem Spiegel ankommende Laserspotenergie Io eines Ti: Saphir-Lasers wie er bei der Multiphotonenanregung im Mikroskop Verwendung finden würde, während die untere Kurve von einem Verlust durch durchlaufene Optikkomponenten auf Io / 2 ausgeht.
Für diesen Fall verwendeter Laser müssen wir davon ausgehen, dass bei maximaler Laserintensität von 3 W/cm² bis zu 1.5 W/cm² zeitlich integrierte Leistung in der Spiegelebene ankommen können. Die kritische Pulsenergie, die so eine metallische Spiegelschicht verträgt, liegt zwischen 0.1 und 1 J/cm² Daraus ergibt sich, dass in diesem konkreten Fall der Laserspot sicherheitshalber nicht kleiner als 3 µm im Durchmesser werden sollte, so dass der Spiegelabstand zum Zwischenbild mindestens vier Schärfentiefen betragen muss. Größer ist immer zugelassen. Das Ganze skaliert natürlich mit den Spezifikationen des verwendeten Lasersystems.
In 9 ist der Spotdurchmesser (vertikal) auf der Spiegelschicht für das aufgeführte konkrete Beispiel in Abhängigkeit vom Abstand des Spiegels zum Zwischenbild in Vielfachen der Schärfentiefe (horizontal) dargestellt.
Aus der Kurve kann gemäß der Erfindung der durch entsprechende fachmännische Auslegung der verwendeten Optik ausgeführte Mindestabstand der Spiegelschicht von der rückwärtigen Zwischenbildebene festgelegt werden.
Da der Spiegel eine schnelle Bewegung entlang der optischen Achse ausführt, wird vorteilhaft der Bewegungsraum des Spiegels in die Festlegung des Mindestabstandes einfließen, so dass beispielsweise Abstände vom 40fachen der Tiefenschärfe durch die verwendete Optik realisiert werden könnten und werden.
Geht man von den konkreten Beispielen in 8 aus, so würde bei erforderlichen (zerstörungsfreien) 3µm Spotradius gemäß 9 ein Mindestabstand von etwa 3-4 T (1/e^2) oder 4T bei FWHM (Halbwertsbreite) den Anforderungen vorteilhaft genügen.

Zur Vervollständigung sei beispielhaft angeführt, dass es sich bei verwendeten Spiegeln hinter dem Objektiv um im Handel erhältliche Breitband- Metallspiegel der Firma Newport handeln könnte. Bei den erforderlichen Gold- oder Silberspiegel variieren die dort angegebenen Schwellen für eine mögliche Zerstörung zwischen 0.2 J/cm² und 2 J/cm². Dielektrische Spiegelschichten sind bzgl. des Spiegels S (6) nicht verwendbar, weil deren spektrale Reflexionscharakteristik vom Einfallswinkel abhängt und somit die hohe numerische Apertur des optischen Systems nicht vollständig unterstützt würde. Tabelle 1 (Zu Fig.6)

ε=1.27
Fläche	Radius		Dicke	Abbezahl	Brechzahl
S49	35.873371	D1:	9.559405	53.83	1.716166
S50	-24.036897	D2:	8.540876	23.88	1.855017
S51	-51.304435	D3:	11.504554
S52	-24.227765	D4:	10.000000	28.53	1.734311
S53	-7.865645	D5:	8.755412	34.70	1.725398
S54	367.390348	D6:	2.613555
S55	-19.071717	D7:	3.000000	53.27	1.625081
S56	5.883967	D8:	5.263015	44.49	1.616645

^=0.9
Fläche	Radius		Dicke	Abbezahl	Brechzahl
S49	177.108155	D1:	5.000000	53.83	1.716166
S50	-25.489662	D2:	3.000000	23.88	1.855017
S51	-56.018234	D3:	41.849587
S52	-22.689035	D4:	5.000000	28.53	1.734311
S53	-6.516752	D5:	3.000000	34.70	1.725398
S54	-176.733640	D6:	1.692480
S55	-24.640317	D7:	3.000000	53.27	1.625081
S56	29.310558	D8:	3.143901	44.49	1.616645

^=1.5
Fläche	Radius		Dicke	Abbezahl	Brechzahl
S49	43.702487	D1:	5.695846	53.83	1.716166
S50	-23.800686	D2:	5.000000	23.88	1.855017
S51	-52.732228	D3:	21.343734
S52	-19.202347	D4:	3.000000	28.53	1.734311
S53	7.377045	D5:	3.000000	34.70	1.725398
S54	-30.003611	D6 :	1.397660
S55	-11.136817	D7:	5.000000	53.27	1.625081
S56	4.897050	D8:	3.309730	44.49	1.616645

Claims

Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Laserlichtquelle (L) zur Fluoreszenzanregung mittels Beleuchtungslicht (Anregungslicht), insbesondere einer Kurzpulslichtquelle zur Mehrphotonenanregung, einer Scanspiegelanordnung (SC) zur rasterartigen Beleuchtung einer Probe und einer Scanoptik (SO, 11) zur Erzeugung einer beugungsbegrenzten Referenzbildebene (8) als eine erste Zwischenbildebene, einem optischen System, vorzugsweise mit großer numerischer Apertur, zur vorzugsweise verkleinernden Abbildung der Referenzbildebene (8) in ein zweites Zwischenbild in einer in einem Bildraum vorhandenen zweiten Zwischenbildebene (6), einem axial, also entlang einer optischen Achse des optischen Systems, bewegbaren Spiegel (S) in der zweiten Zwischenbildebene (6), in der sich das zweite Zwischenbild befindet, einer Strahlteileranordnung (12) zwischen der Referenzbildebene (8) und dem besagtem optischen System, einer ersten Tubuslinse (3) und einem ersten Mikroskopobjektiv (2) zur aberrationsfreien Abbildung der Referenzbildebene (8) in eine in einem Objektraum befindlichen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vergrößerung M von der zweiten Zwischenbildebene (6) in die Probe gemäß der $M=y'/y = n / n' ξ mit ξ \neq 1,$
durch ξ ≠ 1 vom Quotienten der Brechzahlen n, n' der Immersionsmedien im Obj ektraum an der Probe und im Bildraum am Spiegel (S) abweicht; wobei y und y' die Koordinaten eines Punktes auf einer senkrecht zur optischen Achse gerichteten Achse sind, und ξ ein Faktor ist.
Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1, wobei ein Farbteilerspiegel (TS) zur Ausblendung des Probenlichts in Richtung eines vorzugsweise in einer Pupillenebene des ersten Mikroskopobjektives (2) befindlichen Detektors (DE) zur nicht-descannten Detektion des Fluoreszenzlichtes von der Probe vorgesehen ist.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Spiegel zur Auskopplung des Probenlichtes, insbesondere der Einphotonen-Fluoreszenzanregung in Richtung einer konfokalen Detektoranordnung (S_conf) vorgesehen ist.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei über den im Wesentlichen gesamten axialen Bewegungsbereich des Spiegels (S) in der zweiten Zwischenbildebene (6) die vom optischen System erzeugte Fokusebene des Anregungslasers der Laserlichtquelle (L) von der axialen Lage des Spiegels (S) abweicht, insbesondere so, dass die maximale Energiedichte im Laserspot auf der Spiegelfläche stets unterhalb der Zerstörschwelle der Spiegelschicht liegt, und/oder wobei das Abbild der Spiegeloberfläche im Objektraum in axialer Richtung mindestens vier Schärfentiefeneinheiten von der Fokusebene des Lasers (L) im Objektraum entfernt liegt und/ oder wobei das zweite Zwischenbild starke Aberrationen aufweist.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Strahlteileranordnung (12) der Lenkung eines von der Laserlichtquelle (L) ausgehenden Beleuchtungslichtes in Richtung der Probe dient.
Laser- Scanning - Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Strahlteileranordnung (12) hin- und zurücklaufendes Laserlicht räumlich trennt.
Laser- Scanning - Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ξ ≠ 1 einen Wert von 0,9 oder 1,5 oder 1,27 annimmt.
Laser- Scanning - Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das besagte optische System ein zweites Mikroskopobjektiv (5) mit im Wesentlichen gleichen optischen Eigenschaften ist.
Laser- Scanning - Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Polarisationsstrahlteiler (12) und eine Viertelwellenplatte (10) zur Trennung hin- und rücklaufenden Anregungslichtes vorgesehen sind.
Laser- Scanning - Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, soweit auf Anspruch 8 rückbezogen, wobei mittels eines angepassten optischen Systems aus einer Tubuslinse (4) und dem zweiten Mikroskopobjektiv (5) ein verkleinertes und defokussiertes zweites Zwischenbild der Referenzbildebene (8) in der zweiten Zwischenbildebene (6) erzeugt ist.
Laser- Scanning - Mikroskop nach Anspruch 10, wobei ein Element in besagter zweiter Zwischenbildebene (6), vorzugsweise der axial bewegbare Spiegel (S), den Laserstrahl durch das angepasste optische System aus zweitem Mikroskopobjektiv (5) und Tubuslinse (4) zurückreflektiert.
Laser- Scanning - Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Element, vorzugsweise ein dichroitischer Spiegel (TS), zur spektralen Trennung von Fluoreszenzlicht und von der Probe zurücklaufenden Anregungslichtes vorgesehen ist.