CN104535296B - 一种多光束同轴检测与调整方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多光束同轴度的调整方法，步骤1)通过在多个激光光源的光路上设置若干个反射镜或分束器，使得所述多个激光光源发出的光合并为一束肉眼无法区分开的光线；步骤2)选取一个能够反射激光的颗粒物，该颗粒物中每个颗粒的粒径小于所述的一束肉眼无法区分开的光线的光斑直径；步骤3)利用激光扫描共聚焦显微镜中自带的成像装置，将所述的一束肉眼无法区分开的光线对所述颗粒物进行扫描成像；步骤4)若得到的图像含有重影，则判定所述的一束肉眼无法区分开的光线不是一束同轴的光线，调节所述反射镜或分束器，回到步骤3)；若得到的图像没有重影，则判定所述的一束肉眼无法区分开的光线是一束同轴的光线，调整结束。

Description

一种多光束同轴检测与调整方法

技术领域

本发明涉及激光扫描共聚焦显微成像技术领域，特别是一种多光束同轴检测与调整方法。

背景技术

激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope，CLSM)用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像信息，这些图像信息经成像装置接收并储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示样品的立体结构。

在显微成像应用中，特别是以激光扫描共聚焦显微技术为基础的应用中，双光束乃至多光束的成像应用非常普遍，包括荧光多标记成像、荧光共定位、相干反斯托克斯拉曼散射显微成像等等，都需要使用多路光束，多光束的同轴检测与调整是保证多路光束观察和与物质作用位置准确定位的基本条件。

现有技术中，如中国专利：201010177761.6提出了一种双光束同轴实时调整的装置与方法，分别将每条入射光束分出部分能量作为检测光，分出部分的能量再一分为二分别通过平行偏移探测器和角偏移探测器，通过探测器得到的实测光斑位置与预设标定光斑位置进行比对得到光束的平行偏移量和角偏移量，并发出反馈信号，控制单元根据反馈信号控制调整机构进行相应调整，使得每条入射光束与标定路径同轴，从而实现双光束的同轴检测与调整，此发明存在以下不足之处：1)设备复杂、成本高，需要增设大量的附加设备来对双光束进行同轴度检测和调整；2)操作过程繁琐，调整速率慢，且无法有效适用于多光束的同轴调整。

发明内容

针对上述不足之处，本发明公开了一种多光束同轴度的调整方法，利用金纳米颗粒作为探针，经过系统自带的成像装置扫描成像，所得图像反映了物镜焦点处多光束的重合状态，由此来调整反射镜使得多光束保持同轴，解决了在激光扫描共聚焦显微技术中多光束光源的同轴度不易检测和调整的问题。

具体而言，本发明提供的技术方案为：一种多光束同轴度的调整方法，其用于在激光扫描共聚焦显微镜对物质进行成像前，将所述激光扫描共聚焦显微镜中由多个激光光源发出的光调整为一束同轴的光线；包括：

步骤1)通过在多个激光光源的光路上设置若干个反射镜或分束器，使得所述多个激光光源发出的光合并为一束肉眼无法区分开的光线；

步骤2)选取一个能够反射激光的颗粒物，该颗粒物中每个颗粒的粒径小于所述的一束肉眼无法区分开的光线的光斑直径；

步骤3)利用激光扫描共聚焦显微镜中自带的成像装置，将所述的一束肉眼无法区分开的光线对所述颗粒物进行扫描成像；

步骤4)若得到的图像含有重影，则判定所述的一束肉眼无法区分开的光线不是一束同轴的光线，调节所述反射镜或分束器，回到步骤3)；若得到的图像没有重影，则判定所述的一束肉眼无法区分开的光线是一束同轴的光线，调整结束。

优选的，所述颗粒物为透光载体，其内至少含一颗金纳米颗粒，激光只能在所述颗粒物中的金纳米颗粒上反射光线。

优选的，所述颗粒物含多个金纳米颗粒，每个金纳米颗粒之间的距离大于所述的一束肉眼无法区分开的光线的光斑直径。

优选的，在步骤1)和步骤2)之间还包括：

步骤a)通过增设分束器将所述的一束肉眼无法区分开的光线分割出一部分，形成一个新的预调光路；

步骤b)增设一个低分辨的成像装置，对所述预调光路进行成像；

步骤c)若步骤b)所成的像是同心光斑，则进入步骤2)；若步骤b)所成的像不是同心光斑，则调整所述反射镜或分束器，回到步骤b)。

优选的，所述多个激光光源中至少有一个激光光源的路径上设置有第一反射镜和第二反射镜，激光经所述第一、第二反射镜反射后与其他各光路合并为所述的一束肉眼无法区分开的光线。

优选的，所述步骤c)对应调整所述第一反射镜，使预调光路中所成的像为同心光斑。

优选的，所述步骤4)对应调整所述第二反射镜，消除所得图像中的阴影。

优选的，所述第一反射镜和第二反射镜的调整同时进行，经过多次迭代调整和光线逼近，直至多光束实现同轴。

本发明相较于现有技术的有益效果是，提供的一种多光束同轴度的调整方法，

1)充分利用系统自带的成像系统，根据所得图像进行多光束同轴度的检测和调整，额外添加的元件较少，降低了系统的复杂度和成本；

2)采用金纳米颗粒作为检测同轴度的探针，检测和调整精度可达到十纳米以下，大幅度增加了多光束的同轴精度；

3)采用双成像系统配合工作的方式，对多光束的同轴度进行粗略和精密的检测和调整，调整效率更高；

4)可拓展应用至多光源系统，使用范围更广。

附图说明

图1是本发明应用于一实施例中的光路示意图；

图2是所述预调光路上聚焦光斑的示意图；

图3是所述成像装置对同一个金纳米颗粒用第一束激光独立成像、第二束激光独立成像与双光束同时成像时实心光斑的示意图；

图4是本实施例中光束的入射路径与预期路径的光路示意图；

图5是所述第一反射镜的调整原理图；

图6是所述第二反射镜的调整原理图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明提供的一种多光束同轴度的调整方法，如图1所示的是应用本发明的一实施例的光路示意图，本实施例以双光束入射系统来说明，当然显而易见的是，本发明可以拓展至多光束入射系统同轴度的调整，只需相应增设如第一束激光1的入射路径，并分别采用本发明提供的方法一一调整即可。

本发明的具体实施方式包括：

步骤1)将第一束激光1依次通过第一反射镜3和第二反射镜4反射，并通过第二分束器6透射传播至物镜10上，第二束激光2直接入射到所述第二分束器6上，并经其反射，与第一束激光1经过所述第二分束器6透射的光线会合成一束用肉眼无法区分开的光线，通过物镜10，会聚至所述物镜10的焦点处；

步骤2)选取一个颗粒物11放置在所述物镜10的焦平面上，用肉眼无法区分开的入射光线经所述物镜10会聚于所述颗粒物11上形成聚焦光斑，所述颗粒物11为透明载体，如透明液体和透明玻璃，其内包含有若干个金纳米颗粒，作为检测入射双光束同轴度的探针，入射激光只能在所述金纳米颗粒上反射光线，而在颗粒物11的其他部位不反射光线。每个金纳米颗粒之间的距离大于所述的一束肉眼无法区分开的光线的光斑直径，并且所述金纳米颗粒的粒径小于所述的一束肉眼无法区分开的光线的光斑直径；

步骤3)所述颗粒物11设置在三维位移台12上，所述位移台12带动所述颗粒物11在XY平面上进行逐点逐行扫描运动，使得会聚在颗粒物11上的聚焦光斑遍历所述颗粒物11某一平面上的所有范围，反射回的光线穿回所述物镜10，传播至激光扫描共聚焦显微镜中自带的成像装置，本实施例中具体是将带有颗粒物11信息的光被点探测器15接收，将接收到的信号和扫描运动的位置进行重建，得到所述颗粒物11的图像，所得图像反应了金纳米颗粒在颗粒物11中某一层面上的位置分布情况，具体来说，聚焦光斑扫描至金纳米颗粒时，反射光强度会显著提高，而扫描在所述颗粒物11的其他位置时基本上不反光射光线，在所得图像中会形成高亮实心光斑，此高亮实心光斑即是金纳米颗粒的像，由此在颗粒物11中区别出金纳米颗粒，并确定其位置分布。并且所得图像还显示了在颗粒物11上入射光束聚焦光斑的形状和强度分布，具体来说，金纳米颗粒的直径小于入射光束聚焦光斑的直径，当聚焦光斑逐点逐行扫过金纳米颗粒时，相当于是用尺寸更小的金纳米颗粒作为探针，逐点逐行对聚焦光斑扫描成像，扫描图像上即可显示出聚焦光斑的形状，当聚焦光斑上的能量分布不均时，相应在所述金纳米颗粒上反射线的光强也会变化，所述实心光斑显示的亮度会有相对强弱，以此得知入射光束聚焦光斑的强度分布，当双束入射光不同轴时，也就是说在扫描图像上形成若干个不重合的高亮实心光斑，看上去就会有阴影，完全分立的双入射光束对同一个金纳米颗粒同时成像时，扫描图像上会形成两个分立的高亮实心光斑，如图3所示，当双束入射光不同轴但有重叠部分时，两个高亮实心光斑也会有部分重叠，而重叠部分的光强会进一步增强，由此可以检测双光束的同轴度。也就是说把同一个金纳米颗粒来作为对双光束同轴度检测的探针，而金纳米颗粒的粒径很小，在几十纳米，所得图像上的分辨率可达到10纳米以下，检测和调整精度非常高；

步骤4)若扫描图像上双光束对同一个金纳米颗粒所成的高亮实心光斑完全分立或有部分重叠，则调整所述第二反射镜4，再回到步骤3)，双光束的聚焦光斑对颗粒物11再次扫描成像；若得到的扫描图像上双光束对同一个金纳米颗粒所成的高亮实心光斑完全重叠，则判定双光束是同轴的，调整结束。

在步骤1)和步骤2)之间还包括：

步骤a)在激光扫描共聚焦显微镜中增设所述的第三分束器7，会合后的入射光线在第三分束器7上分出部分能量形成一个新的预调光路，而大部分能量通过所述物镜10会聚于颗粒物11上；

步骤b)在预调光路上增设中间透镜8和面阵探测器9来形成一个低分辨的成像装置，并对所述预调光路上的光束进行成像；所述面阵探测器9位于所述中间透镜8的焦平面上，根据在所述面阵探测器9上所成的像可观测到会合后的入射光束的聚焦光斑，根据此聚焦光斑的重叠程度来对两光束的同轴状态作粗略检测；

步骤c)若步骤b)所成的像是同心光斑，则进入步骤2)；若步骤b)所成的像不是同心光斑，如图2所示，则调整所述第三反射镜3，回到步骤b)。

本实施例的具体光路如下：

将第一束激光1依次通过第一反射镜3和第二反射镜4反射，并依次经第一分束器5和第二分束器6透射传播至物镜10上，所述第一、第二反射镜平行设置并且角度二维可调，通过旋转调整所述两个反射镜来使得双光束保持同轴。所述第二束激光2直接入射到所述第二分束器6，其入射点与第一束激光1在所述第二分束器6上的透射点重合，第二束激光2经第二分束器6反射后，与第一束激光1会合成一束入射光束，同向传播至第三分束器7。所述入射光束的大部分能量透过所述第三分束器7，并经过所述物镜10会聚于所述颗粒物11上，形成聚焦光斑，此聚焦光斑随着所述位移台12带动颗粒物11在XY平面上的运动，遍历所述颗粒物11某一平面上的所有范围，并且携带颗粒物11信息的光反射到所述点探测器15；所述入射光束的小部分能量经所述第三分束器7反射至所述中间透镜8，并会聚于所述面阵探测器9上，根据面阵探测器9探测到的两光束聚焦光斑的重合情况，来相应调整所述第一反射镜3，使得两光束保持同轴，由于受到衍射与面阵成像器件像元尺寸影响，检测精度为微米量级，因此用于粗调整。所述颗粒物11的反射光分别经过所述物镜10、所述第三分束器7、所述第二分束器6、所述第一分束器5、回路透镜13、针孔光阑14传播至所述点探测器15，点探测器15每次只能接收颗粒物11上光束聚焦点处的光信息，随着位移台12带动颗粒物在XY平面进行逐点逐行扫描运动，聚焦光遍历了颗粒物11在该平面上的所有范围，每点的光信号由点探测器15接收，将接收到的光信号与扫描运动的位置进行重建，可得到颗粒物11的平面图像。所述针孔光阑14设置在所述回路透镜13的焦平面上，用于滤除颗粒物反射光中的杂散光，使得颗粒物11的成像效果更好，这样充分利用了系统自带的成像装置来进行同轴度的检测，附加设备少，同时可以实现高精度的调整。

具体调整原理如下：如图4-6所示，虚线表示的是预期的光线走向，实线是实际走向，虚线框表示调整后的反射镜，实线框表示调整前的反射镜。当光线和预期走向不同时，说明双光束不同轴，如图4所示。首先调整反射镜3，使其二维旋转，反射出的光线在反射镜4上与预期点重合；然后调整反射镜4，同样旋转，使反射出的光线在方向上与预期全完重合，调整完毕，双光束实现同轴。

具体调整过程如下：首先利用面阵探测器9来做双光束同轴度的粗略检测，当面阵探测器9检测到双光束的聚焦光斑不同轴时，如图2所示，调整第一反射镜3，使其二维旋转，反射出的光线在第二反射镜4上与预期点重合，如图5所示，也就是使得在面阵探测器9上的聚焦光斑完全重合；然后利用点探测器15获取两光束对同一金纳米颗粒形成的高亮实心光斑，如图3所示，双光束未完全同轴时，双光束对同一金纳米颗粒将形成两个分立或不完全重合的高亮实心光斑，此时，调整第二反射镜4，同样二维旋转，使反射出的光线在方向上与预期重合，如图6所示，也就是调整所述第二反射镜4，使得所述两个分立或不完全重合的高亮实心光斑使之完全重合。按照面阵探测器9对应第一反射镜3，点探测器15对应第二反射镜4的对应关系，并且由于第三分束器7的作用，面阵探测器9与点探测器15可同时工作，调整过程中，可实时观察并根据情况调整反复调整第一、第二反射镜，经过多次迭代之后和光线逼近，面阵探测器9与点探测器15上的光斑均重合时，即可使得双入射光束高度同轴，以此对双光束的同轴状态作精密检测和调整。对于多光束同轴度的调整方法也是一样，假如有N束入射光束，即调整(N-1)束的入射光束的光路使得N束入射光束保持同轴。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.一种多光束同轴检测与调整方法，其用于在激光扫描共聚焦显微镜对物质进行成像前，将所述激光扫描共聚焦显微镜中由多个激光光源发出的光调整为一束同轴的光线，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)通过在多个激光光源的光路上设置若干个反射镜或若干个分束器，使得所述多个激光光源发出的光合并为一束肉眼无法区分开的光线；

步骤2)选取一个能够反射激光的颗粒物，该颗粒物内至少含一颗金纳米颗粒，每个金纳米颗粒的粒径小于所述的一束肉眼无法区分开的光线的光斑直径；

步骤3)利用激光扫描共聚焦显微镜中自带的成像装置，将所述的一束肉眼无法区分开的光线对所述颗粒物进行扫描成像；

步骤4)若得到的图像含有重影，则判定所述的一束肉眼无法区分开的光线不是一束同轴的光线，调节所述反射镜或分束器，回到步骤3)；若得到的图像没有重影，则判定所述的一束肉眼无法区分开的光线是一束同轴的光线，调整结束。

2.如权利要求1所述的多光束同轴检测与调整方法，其特征在于，所述颗粒物为透光载体，激光只能在所述颗粒物中的金纳米颗粒上反射光线。

3.如权利要求2所述的多光束同轴检测与调整方法，其特征在于，所述颗粒物含多个金纳米颗粒，每个金纳米颗粒之间的距离大于所述的一束肉眼无法区分开的光线的光斑直径。

4.如权利要求1所述的多光束同轴检测与调整方法，其特征在于，在步骤1)和步骤2)之间还包括：

步骤a)通过增设分束器将所述的一束肉眼无法区分开的光线分割出一部分，形成一个新的预调光路；

步骤b)增设一个低分辨的成像装置，对所述预调光路进行成像；

步骤c)若步骤b)所成的像是同心光斑，则进入步骤2)；若步骤b)所成的像不是同心光斑，则调整所述反射镜或分束器，回到步骤b)。

5.如权利要求4所述的多光束同轴检测与调整方法，其特征在于，所述多个激光光源中至少有一个激光光源的路径上设置有第一反射镜和第二反射镜，激光经所述第一、第二反射镜反射后与其他各光路合并为所述的一束肉眼无法区分开的光线。

6.如权利要求5所述的多光束同轴检测与调整方法，其特征在于，所述步骤c)对应调整所述第一反射镜，使预调光路中所成的像为同心光斑。

7.如权利要求5所述的多光束同轴检测与调整方法，其特征在于，所述步骤4)对应调整所述第二反射镜，消除所得图像中的阴影。

8.如权利要求5所述的多光束同轴检测与调整方法，其特征在于，所述第一反射镜和第二反射镜的调整同时进行，经过多次迭代调整和光线逼近，直至多光束实现同轴。