CN108364296B - 基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法 - Google Patents

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CN108364296B CN201810136201.2A CN201810136201A CN108364296B CN 108364296 B CN108364296 B CN 108364296B CN 201810136201 A CN201810136201 A CN 201810136201A CN 108364296 B CN108364296 B CN 108364296B
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Abstract

本发明涉及一种基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间场分布情况的构建方法，属于数字全息成像应用领域。该方法包括：设定重建的起始距离、终止距离以及各层步长，逐层重建并记录各层重建情况；对于某一层重建图像进行灰度统计，使用对数正态分布拟合曲线的曲率极值设置灰度阈值并结合形态学处理手段提取目标物区域；建立细胞聚焦判断函数，并经过相邻层间同一细胞成像质心的跟踪匹配后，添加聚焦最佳处的深度信息，构成细胞所处的空间位置；分别计算一幅全息图中各个细胞的聚焦深度和对应层重建图中的水平面质心投影，构建出细胞群的空间分布。本发明为多幅全息重建追踪多细胞运动轨迹奠定了重要基础，且普适于非细胞微观物体的观察测量。

Description

基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法
技术领域
本发明属于数字全息成像应用领域，涉及一种基于多层全息重建与物体聚焦策略的细胞空间场分布构建方法。
背景技术
在实际光学显微观察过程中，由于样本往往具有一定的厚度，于是细胞的分布不仅具有平面投影的二维位置信息，还带有纵向深度位置信息。细胞的活性强弱、是否凋亡、贴壁与否均会使之产生空间分布差异。此外光学显微镜的聚焦面分布在一个极窄的范围内，难以保证视野下所观测细胞同时得到良好的对焦。即便经过反复调焦操作，观察人员往往也很难对大范围的细胞空间分布有直观的了解。
数字全息是近年来新兴的一种精度可达微米级别的成像方法，可由CCD等光学元器件直接记录获取样本图像，具有全视场、非接触、无损伤、实时性、定量化的优点。加之无需对样本染色即可清晰成像，故特别适合于活体生物样品的定量三维重建和快速跟踪，得以在生物医学应用领域尤其是细胞培养观测中发展迅速。
全息图的最大优点在于其自身作为二维图像，但借助光的干涉、衍射作用，加以记录距离、参考光波长等要素，能够重建出目标物体在空间光场的三维分布信息。与光学显微成像离焦、聚焦过程所类似的，通过改变重建距离，物体的成像情况亦会随之改变，而成像效果最佳也就是物体得到聚焦的位置，其对应了物体距离成像面的距离，反映了物体的深度信息。
由于当物体得到良好聚焦时，重建图的整体灰度亮，物体所占面积相对最小(几乎等于实际尺寸所对应像素点数)，用以表征物体的像素点灰度相对最低。借此可以选为重要特征构建聚焦判据。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法，构建出样本区域中细胞群的三维分布情况。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法，首先根据实际样本需要设定重建的起始距离、终止距离以及各层步长，逐层重建并记录各层重建情况；对于某一层重建图像进行灰度统计，使用对数正态分布拟合曲线的曲率极值设置灰度阈值并结合形态学处理手段提取目标物或细胞区域；通过统计目标物重建后的平均灰度、占据面积以及该层重建后全息图平均灰度值，建立细胞聚焦判断策略，并经过相邻层间同一细胞成像质心的跟踪匹配后，添加聚焦最佳处的深度信息就构成了细胞所处的空间位置；当一幅全息图中囊括了多个细胞时，分别计算得到各个细胞的聚焦深度以及对应层重建图中的水平面质心投影，就构建出了样本区域中细胞群的三维分布情况。
该方法具体包括以下步骤：
S1：读入待重建全息图，进行预处理；
S2：设置多层重建起始重建距离、终止重建距离以及层间步长；根据具体所使用的记录光波，设置重建波长lamda；
S3：按照所设置重建条件，逐层对图像完成重建，并对各层重建结果加以记录；
S4：对某一层重建图像进行像素灰度统计，并使用对数正态分布拟合灰度统计曲线，依据曲线曲率极值设置灰度阈值，完成图像二值化，提取目标物或细胞大致区域；
S5：结合空域灰度信息，使用形态学手段将二值图像进一步精确，使之尽可能贴合于物体在该层重建后的物像分布，去除非物体的干扰区域；
S6：构建各细胞成像聚焦判断函数Focus；
S7：不同层同一物体配准；
S8：结合S6与S7逐一整合出每个细胞在不同层面上重建的聚焦情况及空间位置分布，进而构建出细胞群的空间分布。
进一步，所述步骤S1具体包括：
将全息图从RGB彩色空间映射为灰度图像对应像素映射关系：
Gray(i,j)＝0.229×R(i,j)+0.587×G(i,j)+0.114×B(i,j)
其中i、j为行列坐标，R、G、B分别为三原色中红、绿、蓝通道信息。
进一步，所述步骤S2具体包括：
对于全息图重建，针对单个物体，当其重建距离等于或极其接近记录距离时，再现物体像最为清晰，共轭像最为微弱，成像效果最为理想；于是根据实际样本厚度及样本底层距离成像器件距离设置起始重建距离(小)与终止距离(大)，以及层间步长距离；
起始重建距离：样本底部距离CCD面的距离，记为Sdis；
终止重建距离：样本顶部距离CCD面的距离，记为Edis；
层间距离步长：记为Lstep；层间距离越小，细胞纵向信息表征越精确，系统运算量越大。
进一步，所述步骤S3具体包括：
S31：对于全息图像块在记录距离、重建波长下进行卷积重建，得到能够反映细胞清晰形态的重建复数矩阵U；
U(xi,yi)＝R(xi,yi)+O(xi,yi)×ima
其中R与O分别为复矩阵的实部矩阵与虚部矩阵系数，ima在此表示虚数单位，(xi,yi)为重建图在再现像平面上的位置分布；
S32：将重建所得复数矩阵U取模，得实数矩阵I，实数矩阵I数值分布范围分布在[0，1]区间；
Figure GDA0002487696640000031
S33：对实数矩阵I进行归一化和取整处理，得元素数值为整数且拉伸分布在整个图像灰度级[0,level]区间的实整矩阵Is；
Figure GDA0002487696640000032
其中max和min分别代表实数矩阵I中的最大、最小元素数值，level表示图像设备可用于显示的灰度级数量。level通常255。
进一步，所述卷积重建是基于线性系统理论和瑞利-索默菲积分公式而构建的，能够准确反映光的空间衍射分布；由瑞利-索默菲衍射积分公式，全息图中衍射信息再现后对应光波：
Figure GDA0002487696640000033
其中，
Figure GDA0002487696640000034
λ为重建光波长，zi为物体距离CCD的距离，即重建距离；其中，(x,y)为记录面横、纵坐标，(xi,yi)为重建图在再现像平面上的位置分布；H(x,y)为图像传感器所记录的全息图光强分布，即是所采集记录得到的全息图；C(x,y)是重建光波在传感器平面上的分布，取为R(x,y)的共轭：
R(x,y)＝exp[-ima·k(xsinα+ysinβ)]
其中，k为波数，k＝2π/λ，α、β分别为平面参考光波与空间yoz平面和xoz平面的夹角；
而根据线性系统理论，再现像复振幅表示为如下卷积形式：
Figure GDA0002487696640000035
其中，g为自由空间脉冲响应；
Figure GDA0002487696640000036
再由卷积理论，使用傅里叶变换计算得到再现像，即重建图：
U＝FT-1[FT(H·C)·FT(g)]。
进一步，所述步骤S4具体包括：
S41：统计重建图Is灰度分布直方图，记录在一维数组Data中，并采用对数正态分布对该直方图数据做非线性回归，进而拟合出一条单峰近似曲线；由于对数正态分布具有良好的单峰性和非对称性，故选取对数正太分布对灰度分布直方图数据做非线性回归拟合；其概率密度分布函数如下：
Figure GDA0002487696640000041
其中，x表示记录的图像灰度信息，对应于Data。μ为分布的数学期望，σ为分布的方差，两者需要经过非线性拟合方可得以确定。
S42：拟合函数各点数值：F(q)，q＝1,2,...,levey，levey表示拟合后需要得到的灰度级数，表示灰度离散程度，无特别声明一般同level；计算拟合函数各点对应曲率，取第一个曲率极大值处对应下标，即灰度作为灰度阈值THR1；依据在于，无论是白细胞或是血小板，其用于表征物体成像的像素点数量均为极少数，且灰度值低；
一阶导数：
dy(q)＝F(q+1)-F(q)
二阶导数：
d2y(q)＝dy(q+1)-dy(q)
曲率：
Figure GDA0002487696640000042
S43：根据所得灰度阈值THR1将重建图Is二值化，得二值图IBW：
Figure GDA0002487696640000043
进一步，所述步骤S5具体包括：
S51：构建背景纯化图像Is*；对于重建图Is，低于灰度阈值THR1的像素点加以保留，高于灰度阈值THR1的像素点统一赋值为灰度阈值THR1；
Figure GDA0002487696640000044
S52：由于S4初步提取的细胞区域中，一些不处于最佳成像面的物体所产生的共轭孪生像也被提取出来，但其灰度往往较高，与背景灰度较为接近，故使用最大法，即大津阈值法OTSU对经过背景纯化的图像Is*进行处理，得到最佳分类灰度阈值THR2；据此更新二值图IBW；
Figure GDA0002487696640000051
S53：进一步剔除非细胞的干扰区域，具体策略为：使用8连通规则对IBW进行连通域识别，对所得各个独立的连通域区域进行灰度最小值的统计，若对于某一连通域，其对应Is区域中像素点灰度最小值高于灰度拟合曲线所得灰度阈值THR1的二分之一，则认为该连通域为无效区域，不参与后续物体聚焦判断。
进一步，所述步骤S6具体包括：
S61：判据①：当前层重建图Is的灰度均值AVR
当有细胞良好聚焦时，由于细胞对应衍射环所记录的信息得到了较好还原，信号能量集中于细胞的物体像中，即体现为物体对应像素值灰度极低，而散布在背景中的共轭像微弱，且归一化后其他未聚焦细胞的衍射环信息被弱化，因此图像大面积背景区域整体灰度偏亮；
Figure GDA0002487696640000052
其中，M、N分别为图像行、列值；
S62：判据②：二值连通域面积，即像素点数量area
全息重建过程即是将物体分散的衍射信息汇聚还原为空域物体形貌的过程，重建距离的递变类似于光学聚焦的过程；当处于最佳重建距离的条件下，重建物像尺寸与实际细胞尺寸最为接近，相较其他重建距离下占用像元面积最小；
S63：判据③：二值连通域对应重建图Is区域灰度均值avr
Figure GDA0002487696640000053
其中，Ψ为当前处理连通域对应重建图中的像素集合；
S64：构建物体聚焦判断函数Focus
Figure GDA0002487696640000054
对于同一物体聚焦函数值越低代表聚焦效果越好，函数最小值对应的重建距离即是物体的深度信息；
以上步骤对各层重建图中各独立连通域对应重建区域适用，且对每一连通域均采取相同处理方法；所得聚焦结果仅反应单一连通域对应区域的聚焦程度。
进一步，所述步骤S7具体包括：
层间重建距离步长较小时，相邻层同一物体形貌变化不会发生突变，故区域质心位置变化不大；据此结合各细胞区域质心位置将相邻层对应细胞进行匹配，如果在某一层某一细胞区域质心匹配搜索范围内，从未在其他层同样范围内检测到有质心出现，认为从该层一个新的细胞开始发生聚焦；
质心计算方法：
质心横坐标Centroidx是该层连通域内所有像素点横坐标求和再除以区域像素点数；
Figure GDA0002487696640000061
质心纵坐标Centroidy是该层连通域内所有像素点纵坐标求和再除以区域像素点数；
Figure GDA0002487696640000062
相邻层质心搜素范围是该待匹配质心坐标为圆心，半径为10像素的圆形范围。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种经过多层全息重建及对各细胞聚焦判断，进而还原出不同细胞在空间三维位置分布信息的构建方法。当一幅全息图中囊括了多个细胞时，分别计算得到各个细胞的空间位置，就构建出样本区域中细胞群的三维分布情况。此外，本发明还为长时间、多幅全息重建追踪多细胞运动轨迹奠定了重要基础，且普适于其他非细胞微观物体的观察测量。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明所述的细胞群空间分布构建流程图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
图1为基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建流程图，如图1所示，该方法具体包括以下步骤：
S1：读入待重建全息图，进行预处理。
将全息图从RGB彩色空间映射为灰度图像对应像素映射关系：
Gray(i,j)＝0.229×R(i,j)+0.587×G(i,j)+0.114×B(i,j)
其中i、j为行列坐标，R、G、B分别为三原色中红、绿、蓝通道信息。
S2：设置多层重建起始重建距离、终止重建距离以及层间步长；根据具体所使用的记录光波，设置重建波长lamda。
对于全息图重建，针对单个物体，当其重建距离等于或极其接近记录距离时，再现物体像最为清晰，共轭像最为微弱，成像效果最为理想；于是根据实际样本厚度及样本底层距离成像器件距离设置起始重建距离(小)与终止距离(大)，以及层间步长距离。
起始重建距离：样本底部距离CCD面的距离，记为Sdis；
终止重建距离：样本顶部距离CCD面的距离，记为Edis。
本实例中使用样本厚度接近3mm，载物台台面距离CCD表面距离1.1mm，因此实际设置Sdis＝1.1mm，Edis＝1.4mm。
层间距离步长：记为Lstep，实际取Lstep＝0.02mm。层间距离越小，细胞纵向信息表征越精确，系统运算量越大。
S3：按照所设置重建条件，逐层对图像完成重建，并对各层重建结果加以记录。
S31：对于全息图像块在记录距离、重建波长下进行卷积重建，得到能够反映细胞清晰形态的重建复数矩阵U；
U(xi,yi)＝R(xi,yi)+O(xi,yi)×ima
其中R与O分别为复矩阵的实部矩阵与虚部矩阵系数，ima在此表示虚数单位，(xi,yi)为重建图在再现像平面上的位置分布；
S32：将重建所得复数矩阵U取模，得实数矩阵I，实数矩阵I数值分布范围分布在[0，1]区间；
Figure GDA0002487696640000071
S33：对实数矩阵I进行归一化和取整处理，得元素数值为整数且拉伸分布在整个图像灰度级[0,level]区间的实整矩阵Is；
Figure GDA0002487696640000072
其中max和min分别代表实数矩阵I中的最大、最小元素数值，level通常255。
S4：对某一层重建图像进行像素灰度统计，并使用对数正态分布拟合灰度统计曲线，依据曲线曲率极值设置灰度阈值，完成图像二值化，提取目标物或细胞大致区域。
S41：统计重建图Is灰度分布直方图，记录在一维数组Data中，并采用对数正态分布对该直方图数据做非线性回归，进而拟合出一条单峰近似曲线；由于对数正态分布具有良好的单峰性和非对称性，故选取对数正太分布对灰度分布直方图数据做非线性回归拟合；其概率密度分布函数如下：
Figure GDA0002487696640000073
S42：拟合函数各点数值：F(q)，q＝1,2,...,levey。计算拟合函数各点对应曲率，取第一个曲率极大值处对应下标，即灰度作为灰度阈值THR1；依据在于，无论是白细胞或是血小板，其用于表征物体成像的像素点数量均为极少数，且灰度值低；
一阶导数：
dy(q)＝F(q+1)-F(q)
二阶导数：
d2y(q)＝dy(q+1)-dy(q)
曲率：
Figure GDA0002487696640000081
S43：根据所得灰度阈值THR1将重建图Is二值化，得二值图IBW：
Figure GDA0002487696640000082
S5：结合空域灰度信息，使用形态学手段将二值图像进一步精确，使之尽可能贴合于物体在该层重建后的物像分布，去除非物体的干扰区域。
S51：构建背景纯化图像Is*；对于重建图Is，低于灰度阈值THR1的像素点加以保留，高于灰度阈值THR1的像素点统一赋值为灰度阈值THR1；
Figure GDA0002487696640000083
S52：由于S4初步提取的细胞区域中，一些不处于最佳成像面的物体所产生的共轭孪生像也被提取出来，但其灰度往往较高，与背景灰度较为接近，故使用最大法，即大津阈值法OTSU对经过背景纯化的图像Is*进行处理，得到最佳分类灰度阈值THR2；据此更新二值图IBW；
Figure GDA0002487696640000084
S53：进一步剔除非细胞的干扰区域，具体策略为：使用8连通规则对IBW进行连通域识别，对所得各个独立的连通域区域进行灰度最小值的统计，若对于某一连通域，其对应Is区域中像素点灰度最小值高于灰度拟合曲线所得灰度阈值THR1的二分之一，则认为该连通域为无效区域，不参与后续物体聚焦判断。
S6：构建各细胞成像聚焦判断函数Focus。
以下步骤对各层重建图中各独立连通域对应重建区域适用，且对每一连通域均采取相同处理方法。所得聚焦结果仅反应单一连通域对应区域的聚焦程度。
S61：判据①：当前层重建图Is的灰度均值AVR
判断依据：当有细胞良好聚焦时，由于细胞对应衍射环所记录的信息得到了较好还原，信号能量集中于细胞的物体像中，即体现为物体对应像素灰度值低，而散布在背景中的共轭像微弱，且归一化后其他未聚焦细胞的衍射环信息被弱化，因此图像大面积背景区域整体灰度偏亮；
Figure GDA0002487696640000091
其中，M、N分别为图像行、列值。
S62：判据②：二值连通域面积，即像素点数量area
判断依据：全息重建过程即是将物体分散的衍射信息汇聚还原为空域物体形貌的过程，重建距离的递变类似于光学聚焦的过程；当处于最佳重建距离的条件下，重建物像尺寸与实际细胞尺寸最为接近，相较其他重建距离下占用像元面积最小。
S63：判据③：二值连通域对应重建图Is区域灰度均值avr
判断依据：同S61所述，当物体得到良好聚焦时，成像后体现为极低的像素灰度。
Figure GDA0002487696640000092
其中，Ψ为当前处理连通域对应重建图中的像素集合。
S64：构建物体聚焦判断函数Focus
Figure GDA0002487696640000093
对于同一物体聚焦函数值越低代表聚焦效果越好，函数最小值对应的重建距离即是物体的深度信息。
S7：不同层同一物体配准。
步骤S6中对于各层重建图所获得的物像进行聚焦判断，但还需要对不同层中的同一物体加以识别辨认，方能对同一物体在一系列重建距离下的聚焦情况做出判断。
层间重建距离步长较小时，相邻层同一物体形貌变化不会发生突变，故区域质心位置变化不大；据此结合各细胞区域质心位置将相邻层对应细胞进行匹配，如果在某一层某一细胞区域质心匹配搜索范围内，从未在其他层同样范围内检测到有质心出现，认为从该层一个新的细胞开始发生聚焦；
质心计算方法：
质心横坐标Centroidx是该层连通域内所有像素点横坐标求和再除以区域像素点数；
Figure GDA0002487696640000094
质心纵坐标Centroidy是该层连通域内所有像素点纵坐标求和再除以区域像素点数；
Figure GDA0002487696640000101
相邻层质心搜素范围是该待匹配质心坐标为圆心，半径为10像素的圆形范围。
S8：结合S6与S7逐一整合出每个细胞在不同层面上重建的聚焦情况及空间位置分布，进而构建出细胞群的空间分布。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法，其特征在于：首先根据实际样本需要设定重建的起始距离、终止距离以及各层步长，逐层重建并记录各层重建情况；对于某一层重建图像进行灰度统计，使用对数正态分布拟合曲线的曲率极值设置灰度阈值并结合形态学处理手段提取目标物或细胞区域；通过统计目标物重建后的平均灰度、占据面积以及该层重建后全息图平均灰度值，建立细胞聚焦判断函数，并经过相邻层间同一细胞成像质心的跟踪匹配后，添加聚焦最佳处的深度信息就构成了细胞所处的空间位置；当一幅全息图中囊括了多个细胞时，分别计算得到各个细胞的聚焦深度以及对应层重建图中的水平面质心投影，构建出样本区域中细胞群的三维分布情况；
该方法具体包括以下步骤：
S1：读入待重建全息图，进行预处理；
S2：设置多层重建起始重建距离、终止重建距离以及层间步长；根据具体所使用的记录光波，设置重建波长lamda；
S3：按照所设置重建条件，逐层对图像完成重建，并对各层重建结果加以记录；
S4：对某一层重建图像进行像素灰度统计，并使用对数正态分布拟合灰度统计曲线，依据曲线曲率极值设置灰度阈值，完成图像二值化，提取目标物或细胞大致区域；
S5：结合空域灰度信息，使用形态学手段将二值图像进一步精确，使之尽可能贴合于物体在该层重建后的物像分布，去除非物体的干扰区域；
S6：构建各细胞成像聚焦判断函数Focus；
S7：不同层同一物体配准；
S8：结合S6与S7逐一整合出每个细胞在不同层面上重建的聚焦情况及空间位置分布，进而构建出细胞群的空间分布。
2.根据权利要求1所述的基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：
将全息图从RGB彩色空间映射为灰度图像对应像素映射关系：
Gray(i,j)＝0.229×R(i,j)+0.587×G(i,j)+0.114×B(i,j)
其中i、j为行列坐标，R、G、B分别为三原色中红、绿、蓝通道信息。
3.根据权利要求1所述的基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：
对于全息图重建，针对单个物体，当其重建距离等于或接近记录距离时，再现物体像最为清晰，共轭像最为微弱，成像效果最为理想；于是根据实际样本厚度及样本底层距离成像器件距离设置起始重建距离与终止距离，以及层间步长距离；
起始重建距离：样本底部距离CCD面的距离，记为Sdis；
终止重建距离：样本顶部距离CCD面的距离，记为Edis；
层间距离步长：记为Lstep；层间距离越小，细胞纵向信息表征越精确，系统运算量越大。
4.根据权利要求1所述的基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：
S31：对于全息图像块在记录距离、重建波长下进行卷积重建，得到能够反映细胞清晰形态的重建复数矩阵U；
U(xi,yi)＝R(xi,yi)+O(xi,yi)×ima
其中R与O分别为复矩阵的实部矩阵与虚部矩阵系数，ima在此表示虚数单位，(xi,yi)为重建图在再现像平面上的位置分布；
S32：将重建所得复数矩阵U取模，得实数矩阵I，实数矩阵I数值分布范围分布在[0，1]区间；
Figure FDA0002487696630000021
S33：对实数矩阵I进行归一化和取整处理，得元素数值为整数且拉伸分布在整个图像灰度级[0,level]区间的实整矩阵Is，即为重建图；
Figure FDA0002487696630000022
其中max和min分别代表实数矩阵I中的最大、最小元素数值，level表示图像设备可用于显示的灰度级数量。
5.根据权利要求4所述的基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法，其特征在于，所述卷积重建是基于线性系统理论和瑞利-索默菲积分公式而构建的，能够准确反映光的空间衍射分布；由瑞利-索默菲衍射积分公式，全息图中衍射信息再现后对应光波：
Figure FDA0002487696630000023
其中，
Figure FDA0002487696630000024
λ为重建光波长，zi为物体距离CCD的距离，即重建距离；其中，(x,y)为记录面横、纵坐标，(xi,yi)为重建图在再现像平面上的位置分布；H(x,y)为图像传感器所记录的全息图光强分布，即是所采集记录得到的全息图；C(x,y)是重建光波在传感器平面上的分布，取为R(x,y)的共轭：
R(x,y)＝exp[-ima·k(xsinα+ysinβ)]
其中，k为波数，k＝2π/λ，α、β分别为平面参考光波与空间yoz平面和xoz平面的夹角；
而根据线性系统理论，再现像复振幅表示为如下卷积形式：
Figure FDA0002487696630000031
其中，g为自由空间脉冲响应；
Figure FDA0002487696630000032
再由卷积理论，使用傅里叶变换计算得到再现像，即重建图：
U＝FT-1[FT(H·C)·FT(g)]。
6.根据权利要求1所述的基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括：
S41：统计重建图Is灰度分布直方图，记录在一维数组Data中，并采用对数正态分布对该直方图数据做非线性回归，进而拟合出一条单峰近似曲线；由于对数正态分布具有良好的单峰性和非对称性，故选取对数正态分布对灰度分布直方图数据做非线性回归拟合；其概率密度分布函数如下：
Figure FDA0002487696630000033
其中，q表示记录的图像灰度信息，对应于Data，μ为分布的数学期望，σ为分布的方差，两者需要经过非线性拟合方可得以确定；
S42：拟合函数各点数值：F(q)，q＝1,2,…,levely，levely表示拟合后需要得到的灰度级数，反映灰度离散程度；计算拟合函数各点对应曲率，取第一个曲率极大值处对应下标，即灰度作为灰度阈值THR1；
一阶导数：
dy(q)＝F(q+1)-F(q)
二阶导数：
d2y(q)＝dy(q+1)-dy(q)
曲率：
Figure FDA0002487696630000034
S43：根据所得灰度阈值THR1将重建图Is二值化，得二值图IBW：
Figure FDA0002487696630000035
7.根据权利要求1所述的基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法，其特征在于，所述步骤S5具体包括：
S51：构建背景纯化图像Is*；对于重建图Is，低于灰度阈值THR1的像素点加以保留，高于灰度阈值THR1的像素点统一赋值为灰度阈值THR1；
Figure FDA0002487696630000041
S52：使用大津阈值法OTSU对经过背景纯化的图像Is*进行处理，得到最佳分类灰度阈值THR2；据此更新二值图IBW；
Figure FDA0002487696630000042
S53：进一步剔除非细胞的干扰区域，具体策略为：使用8连通规则对IBW进行连通域识别，对所得各个独立的连通域区域进行灰度最小值的统计，若对于某一连通域，其对应Is区域中像素点灰度最小值高于灰度拟合曲线所得灰度阈值THR1的二分之一，则认为该连通域为无效区域，不参与后续物体聚焦判断。
8.根据权利要求1所述的基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法，其特征在于，所述步骤S6具体包括：
S61：判据①：当前层重建图Is的灰度均值AVR
当有细胞良好聚焦时，由于细胞对应衍射环所记录的信息得到了较好还原，信号能量集中于细胞的物体像中，即体现为物体对应像素灰度值低，而散布在背景中的共轭像微弱，且归一化后其他未聚焦细胞的衍射环信息被弱化，因此图像大面积背景区域整体灰度偏亮；
Figure FDA0002487696630000043
其中，M、N分别为图像行、列值；
S62：判据②：二值连通域面积，即像素点数量area
全息重建过程即是将物体分散的衍射信息汇聚还原为空域物体形貌的过程，重建距离的递变类似于光学聚焦的过程；当处于最佳重建距离的条件下，重建物像尺寸与实际细胞尺寸最为接近，相较其他重建距离下占用像元面积最小；
S63：判据③：二值连通域对应重建图Is区域灰度均值avr
Figure FDA0002487696630000044
其中，Ψ为当前处理连通域对应重建图中的像素集合；
S64：构建物体聚焦判断函数Focus
Figure FDA0002487696630000051
对于同一物体聚焦函数值越低代表聚焦效果越好，函数最小值对应的重建距离即是物体的深度信息；
以上步骤对各层重建图中各独立连通域对应重建区域适用，且对每一连通域均采取相同处理方法；所得聚焦结果仅反应单一连通域对应区域的聚焦程度。
9.根据权利要求1所述的基于多层全息重建与聚焦策略的细胞群空间分布构建方法，其特征在于，所述步骤S7具体包括：
层间重建距离步长足够小时，相邻层同一物体形貌变化不会发生突变，故区域质心位置变化不大；据此结合各细胞区域质心位置将相邻层对应细胞进行匹配，如果在某一层某一细胞区域质心匹配搜索范围内，从未在其他层同样范围内检测到有质心出现，认为从某一层一个新的细胞开始发生聚焦；
质心计算方法：
质心横坐标Centroidx是某一层连通域内所有像素点横坐标求和再除以区域内像素点数；
Figure FDA0002487696630000052
质心纵坐标Centroidy是某一层连通域内所有像素点纵坐标求和再除以区域内像素点数；
Figure FDA0002487696630000053
其中，Ψ为当前处理连通域对应重建图中的像素集合，(xi,yi)为重建图在再现像平面上的位置分布，area为Ψ中的像素点数量；相邻层质心搜素范围是以待匹配质心坐标为圆心，半径为10像素的圆形范围。
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