JP2009530637A - 蛍光式読み取り装置 - Google Patents

Abstract

反応サイト表面と基板表面（３）とを有しているポリマー試料基板（１）を含んでいる光学アッセイ装置のための蛍光式読み取り装置（１０）であって、基板表面を通じて反応サイト表面を照射するために配置された光源（５）と、前記反応サイト表面から放射されて、基板表面を通じて伝送される蛍光を検出するよう配置された検出装置（６）と、を含んでおり、基板表面は、全内部反射抑制手段（１５）を備えている。

Description

本発明は、光学アッセイ装置中の試料基板のために改善された、蛍光式／燐光式読み取り装置に、関する。本発明は、更に、前記蛍光式／燐光式読み取り装置の使用、及び、前記蛍光式読み取り装置に適した試料基板に、関する。

核酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ホルモン類、又は薬剤等の、液体試料についての分析及び診断測定は、試料中の分析物の検出に基づく光学アッセイを用いて行うことができる。光学アッセイの１つの重要な用途は、免疫学の分野である。そこでは、分析物は、特定の抗体を用いて検出され、その抗体は、例えば蛍光体で分析物にラベルをつけることにより、又は、光学的検出の前に、蛍光体でラベル付けされた抗体を与えることにより、分析物に結合することができて、光学的に検出可能な複合体を形成する。蛍光体の検出は、アッセイ支持基板を励起光源で照射し、蛍光体から放射される蛍光を検出することが可能な蛍光式読み取り装置により、行うことができる。

蛍光体から放射される蛍光の検出を含む光学アッセイは、試料支持基板と蛍光式読み取り装置とを含んでいる光学アッセイ装置により、行われる。蛍光式読み取り装置は、光学波長領域内（すなわち、約４０ｎｍ〜１ｍｍ）の電磁放射のための光源及び検出器、適切な光学フィルタ、並びに導波手段を含む。試料支持台は、例えば、励起光及び放射光の波長範囲において高い光学透過率を有しているポリマー材料の基板を、含み、更に他の波長の高い吸収率を有してもよい。基板は、１つ以上の反応サイト領域を備えており、プローブ分子例えば抗体のスポット及び／又はラインを含んでおり、分析物の分子すなわち試料中で存在することがあり得る標的分子に対する結合部位を提供する。基板は、試料に対して毛細管流路を形成するように配置されてもよく、例えばマイクロ・ピラー又はマイクロ・ポストを形成する突起状の微細構造のパターンを、更に備えてもよい。

試料が支持面上の捕獲分子と接触するとき、蛍光性又は燐光性の抗体検出用複合体の光学的検出可能なスポット又はラインが、形成されることになる。基板が蛍光式読み取り装置の励起光源で照射されるとき、蛍光性又は燐光性の光が放射されることになり、それにより、試料の標的分子と反応サイトのプローブ分子との間で反応が起こったことを示す。蛍光と燐光は、吸収される励起電磁放射に由来する電磁放射の放射として定義することができ、蛍光は、励起後１×１０^−８秒未満持続し、燐光は、励起光での露光後より長く持続する、すなわち、より緩慢に減衰する。

蛍光（及び燐光）では、励起放射は、放射される放射線よりも短い波長（すなわちより高いエネルギー）を通常有しているが、反対のことが、多光子蛍光については真であり得る。蛍光の挙動を、定常状態で又は時間分解的に調査することができ、蛍光分光法は、例えば、単一光子蛍光及び多光子蛍光、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、及び蛍光周波数上方変換を含む。蛍光アッセイでは、励起される放射線及び放射される放射線の波長は、蛍光体の種類に依存し、蛍光体は、有機起源又は無機起源、例えばシアニン染料、フルオレシン染料、又はナノクリスタルであり得る。例として、一般の蛍光体Ｃｙ−５（商標）（ＧＥ ヘルスケア）は、通常６４９ｎｍで励起され、放射光は、６７０ｎｍで測定される。励起最大値と放射最大値との間の波長の違いは、ストークスシフトと一般に呼ばれている。

光学アッセイでは、蛍光式読み取り装置の検出装置を用いて、放射蛍光又は燐光の強度を測定することにより、試料中の分析物の濃度を測定することができ、それにより、定量的な測定が可能になる。したがって、励起光による反応サイト領域の照射効率、同様に、放射蛍光の収集効率は、光学アッセイの性能に影響を及ぼすことになる。

更に、基板表面の反応サイトは、異なるプローブ分子のスポット又はラインのアレイを備えてもよく、異なる標的分子が結合する。したがって、蛍光式読み取り装置は、異なる蛍光体を用いて、又は空間的に分離されたプローブ分子を利用して、試料中の幾つかの分析物の存在を測定することができるように設計されていてもよい。

蛍光式読み取り装置は、反応サイト領域を走査することによって蛍光放射光の検出を行うように、又は、２次元のピクセルアレイとして全反応サイト領域の像を検出するように、配置することができる。走査型蛍光式読み取り装置は、光学手段と試料基板との間の相対的運動によって試料基板の表面を走査し、光学的手段は、好ましくは、スペクトルフィルタを備えた、レーザ、ＬＥＤ、又は白色光源、のような狭帯域励起光源を含み、その光源から個々の検出サイトに光が焦束される。各々の検出サイトからの放射蛍光は、例えば、フォトダイオード又はＰＭＴ（光電子増倍管）のような光学検出器上に焦束される。撮像型蛍光式読み取り装置は、２次元のピクセルアレイを検出することができ、光学的手段は、試料基板の表面領域の大部分（又は全表面領域）を照射するための励起光源と、全検出サイト領域からの放射光を同時に検出することができる検出器、例えば、ＭＯＳ（金属−オン−半導体）技術を利用したＣＣＤ（電荷結合デバイス）撮影装置を含む。

先行技術の光学式読み取り装置は、国際公開０１／５７５５０１に記載されており、それは、透明な基板上での、試料を含んでいる分析物の光学撮像を、開示している。光学式読み取り装置は、試料からの検出可能な光の放射を誘導するために、励起エネルギー源を含み、基板は、放射光を検出手段の内に反射させるために、試料の下に位置する反射面を備えている。

光検出光学式装置は、国際公開９９／４６５９６に開示されており、スライドに結合する光伝導体を含み、それにより集光効率を改善する。

国際公開０３／１０３８３５は、試料に対して毛細管流路を形成するよう配置された、突起状のマイクロ・ポストを、備えた先行技術の試料基板を、記載している。
国際公開０１／５７５５０１ 国際公開９９／４６５９６ 国際公開０３／１０３８３５

本発明の目的は、基板の反応サイト領域を効率的に照射することができ、放射光を効率的に集光及び検出することができる、改善された蛍光式／燐光式読み取り装置を、提供することであり、それにより、高性能な光学アッセイ装置が得られる。

これらの目的及び他の目的は、添付の請求項の蛍光式読み取り装置と試料基板とによって、達成される。

請求項は、反応サイト表面と対向する基板表面とを有している試料基板のための蛍光式読み取り装置に関する。蛍光式読み取り装置は、励起光線を基板表面に入射させるために配置された、励起光源と、反応サイト表面から放射されて、基板表面を通じて伝送される蛍光を検出するよう配置された、検出装置と、を含む。基板表面は、放射蛍光の光路中に位置する全内部反射抑制手段を備えており、検出装置による検出のための基板表面を通じた伝送を増加させる。全内部反射抑制手段は、検出装置による検出のための基板内に捕獲される放射蛍光を放出するように配置されてもよい。

更に、光源は、反応サイト表面の法線に対して、放射蛍光の最大放射角と実質的に一致する、入射角で、励起光線を基板表面に入射させるように配置されてもよい。このように、基板表面は、励起光線の光路中に位置する入射角制御手段を備えてもよい。

入射角制御手段は、反応サイト表面の法線に対する拡大された入射角で、励起光が基板に入るように設計された、表面起伏構造の入口部分を、含んでもよく、起伏構造は、回折性の構造又は屈折性の構造を含んでもよい。

全内部反射抑制手段は、基板からの放射蛍光光線が回析又は屈折するように設計された、表面起伏構造の出口部分を、含んでもよく、それは、更に、放射光線を焦束させるように設計されていてもよく、表面起伏構造の出口部分は、回折性の構造又は屈折性の構造を含んでいる。

表面起伏構造の設計は、衝突する蛍光の変化する放射角に相応して、出口部分の表面上で変化するように、設定されてもよく、出口部分の位置と延長は、分析される反応サイト領域の位置と延長を定めることができる。

その上、集光レンズ装置は、基板表面を通じて伝送される放射蛍光を受光するように、配置されてもよい。或いは、集光体は、前記基板表面上に設けられた、表面起伏構造の出口部分、の近傍に位置してもよい。

全内部反射抑制手段は、前記基板表面と光学的に濡れて接触するように配置された、集光体を、含んでもよい。

集光体は、光を、集光し、全内部反射により伝送させるように、設計されてもよく、実質的に楕円形でもあってもよい。その集光体は、励起光のための入力ポート及び／又は少なくとも１つの出力ポートを、更に備えてもよく、屈折率は、基板の屈折率に実質的に対応してもよく、又は、それよりも大きくてもよい。

全内部反射抑制手段が、代わりに、適切な屈折率を有している光学的濡れ層を含んでもよく、前記光学的濡れ層の少なくとも一部が、放射蛍光を検出装置上に焦束させるよう配置された、レンズ装置に、取り付けられてもよい。屈折率が、基板の屈折率より高くてもよく、レンズ装置の屈折率より低くてもよい。更に、前記光学的濡れ層の少なくとも一部は、検出装置に取り付けられてもよい。入射角制御手段が、適切な屈折率を有している光学的濡れ層を、更に含んでもよく、光学的濡れ層が、軟性ポリマー材料を含んでもよい。

更に、検出装置は、励起光の波長の検出を妨げるために配置された、スペクトルフィルタリング手段及び／又は分極フィルタリング手段を、備えてもよい。

光源は、蛍光放射と一致する波長の透過を妨げるために配置された、スペクトルフィルタリング手段を、更に備えてもよく、励起と放射の測定は、異なる幾何学形状の平面で行われてもよい。

請求項は、更に、光学アッセイ装置の中での蛍光式読み取り装置の使用に関する。

更に、請求項は、反応サイト表面と対向する基板表面とを有している試料基板に関し、試料基板は、本発明による蛍光式読み取り装置に適している。

試料基板は、ポリマー材料で作製されてもよく、反応サイト表面は、蛍光体のライン及び／又はスポットを形成するように、配置されてもよい。更に、反応サイト表面は、突起状の微細構造、例えば毛細管流を可能にするマイクロ・ポストのパターンを、備えてもよい。

基板表面は、放射蛍光光線の全内部反射を抑制するように構成された、表面起伏構造の出口部分、及び／又は、励起光線の入射角を拡大するように構成された、表面起伏構造の入口部分を、備えてもよく、表面起伏は、回折性の構造又は屈折性の構造を含んでいる。

本発明の他の特徴と更なる利点は、以下の説明と図の中で開示される本発明の限定されない実施形態から、同様に添付の請求項から明らかになる。

本発明は、次の図面を参照しながら、より詳細に記載される。

用語「蛍光式読み取り装置」は、蛍光性及び燐光性の光を、励起及び検出することが可能な、読み取り装置として、定義される。用語「蛍光」は、以下、蛍光性の光及び燐光性の光の両方を指すように定義される。本記載と請求項で使用される他の用語と表現は、同業者によって通常使用される意味を有しているものとする。

本発明による蛍光式読み取り装置を用いて、ポリマー試料基板を含む光学アッセイ装置内で、向上された性能が得られる。そのポリマー試料基板は、蛍光体層を備えている反応サイト表面と、対向する基板表面と、を有しており、反応サイト表面では、蛍光体が例えばライン又はスポットを形成している。蛍光式読み取り装置は、基板表面を照射するために配置された、励起光源、例えばＬＥＤと、蛍光体層から放射される蛍光を検出するために配置された、検出器、例えばフォトダイオードと、を含む。検出器は、基板表面を通じて伝送される放射蛍光を集光及び検出するように配置され、光源は、励起光を基板表面に入射させるように配置される。

表面に衝突する光線は、表面の法線に対する光線の入射角が全内部反射のための臨界角を上回るとき、前記表面から鏡面的に反射されることになり、その全内部反射は、表面の両側での材料の屈折率の間の関係に依存している。屈折率ｎ１を有する第１の媒体から屈折率ｎ２の第２の媒体内を通過する光線の屈折は、スネルの法則の有名な関係式により定義される：

ｎ１×ｓｉｎα_ｉｎ．＝ｎ２×ｓｉｎα_ｒｅｆ． …（１）

α_ｉｎは、第１の媒体と第２の媒体との間の表面に衝突する、第１の媒体中の光線の、表面法線に対する角度であり、α_ｒｅｆは、第２の媒体中を伝搬している屈折光線の、表面法線に対する角度である。α_ｒｅｆ＝９０ 度のとき、全内部反射が表面上で起こり、ｓｉｎα_ｒｅｆ＝１である。上記の関係式（１）から、次式に続く：

式中、α_{ｉｎ（ＴＩＲ）}は、全内部反射のための臨界角を示す。

したがって、全内部反射は、ｎ１がｎ２より大きいときに起こり、α_ｉｎは、全内部反射のための臨界角を上回る、すなわち、次式となる。

蛍光体層を備えた誘電体基板に適した従来の蛍光式読み取り装置では、蛍光体層から放射される大部分の光は、基板内に導かれることになり、この放射蛍光の大部分は、全内部反射のための前記臨界角を上回る角度で、基板表面に衝突することになる。代表的な屈折率１．５〜１．６を有する従来のポリマー基板が使用されるとき、全内部反射が起こることになり、放射光の大部分は、基板内に捕獲されることになり、すなわち多数回の全内部反射を生じ、それにより、検出器に到達しない。

本発明によると、全内部反射抑制手段が、捕獲された蛍光を基板から放出するための基板表面に備えられており、それにより、放射蛍光の大部分が検出器に到達することが可能になる。全内部反射抑制手段は、光線を回析又は屈折させるように、又は、屈折率の差を取り除くように、構成されている。それにより、基板表面の法線に対する、全内部反射のための臨界角を上回る角度を有している蛍光性光線は、表面を通じて逃れて、検出器に到達することが可能になる。

光源からの励起光線は、空気中を伝搬し、ポリマー基板の表面に衝突し、関係式（１）により与えられる方向で基板内に屈折することになり、その関係式から、次に続く：
ｓｉｎα_ｒｅｆ＝ｎ１／ｎ２×ｓｉｎα_ｉｎ
式中、α_ｒｅｆは、基板内の屈折光線と表面法線との間の角度であり、α_ｉｎは、空気中の衝突する光線と前記表面法線との間の角度である。したがって、屈折光の角度は、ｎ１／ｎ２が約１／１．５５＝０．６５になることにより限定されて、α_ｉｎが９０度未満であることになり、その結果、次式となる。

図１は、光学アッセイ装置のための試料基板１を概略的に示し、試料基板は、互いに対向して位置する反応サイト表面２と基板表面３を有している。基板の反応サイト表面が、突起状の微細構造のパターンを、例えば試料に対して毛細管流路を形成するように配置されることがあり得るマイクロ・ポスト（図示されず）を、更に備えている。基板の寸法は、好ましくは、光学アッセイのための１つ以上の反応サイト領域に好適な担体を形成することに適しており、先行技術のマイクロアレイスライドは、２５ｍｍ×７５ｍｍの寸法の長方形である。基板の厚さが、例えば約１ｍｍで、幅及び長さが、約１ｍｍ〜１００ｍｍであり、略長方形の又は正方形の、表面領域を、形成することがあり得る。基板の材料は、熱可塑性ポリマーであってもよく、例えばシクロオレフィンポリマー又はシクロオレフィンコポリマーであり、適切な光学特性を有しており、例えば光学放射の透過性に関して、通常１．５〜１．６の屈折率を有する。ポリマー基板は、マスター構造のポリマーの複写により、例えば射出成形によって製造されてもよい。しかし、他の基板材料が使用されてもよく、例えば適切な光学特性を有している、ガラス又はシリコンである。

図２は、誘電性試料基板１の反応サイト表面２上に位置する蛍光体４から放射される励起電磁気線を概略的に示す。放射は、空気及び基板材料の、異なる光学特性のために、非対称であり、放射光の強度は、空中よりも基板内で大きい。基板が放射光線の波長に対して高い透過率を有するので、基板側面から励起された蛍光を検出するのが都合がよい。

図３は、蛍光体Ｃｙ−５（商標）の薄層からの異なる放射角の強度を概略的に示しているグラフであり、放射角は、表面法線に対する角度として定義されている。（しかし、所与の放射角について、光は、３６０°に渡って放射されることになる。）グラフは、蛍光放射が、極めて異方性であることを示し、約５０度の角度でピークを有している。この角度は、屈折率１．５５を有する基板材料中を伝搬して基板／空気接触表面上に衝突する光線に対する全内部反射の臨界角が、上記の関係式（１）によって４０度であるので、基板／空気の接触表面に対する全内部反射に対する臨界角よりも大きな角度である。したがって、基板内に放射される大部分の蛍光は、全反射のための臨界角を上回る角度で、基板表面の内側に衝突することになり、基板内部に捕獲されることになる。したがって、この光は、制御された方法では、基板表面の外に位置する検出器に到達しないことになる。基板内部に捕獲された若干の光は、結局、基板の縁部で基板から屈折することになるが、この光は、普通、検出器に達しないことになる。反応サイト表面が突起状の微細構造を備えている場合、これらの微細構造は、全内部反射のための光学条件も作用することなる。

しかし、本発明による蛍光式読み取り装置において、基板表面は、全内部反射抑制手段を備えており、光線を回析又は屈折させることにより、又は、基板材料と空気との間の屈折率の差を変えることにより、捕獲された全内部反射光線を放出する。それにより、検出装置は、放射蛍光の大部分を集光及び検出し、より信頼性のある検出と、より高い性能と、が得られることになる。

図４は、励起入射角の励起効率依存性を概略的に示しているグラフであり、２つの異なる照射入射角での、すなわち、それぞれ表面法線から５０度と１８０度での、放射蛍光の強度を示す。グラフは、光が表面法線に対して５０度の入射角で基板表面から蛍光体に接近する場合の３０〜６０度の間の異なる放射角での強度と、光が１８０度の入射角で前記表面法線に平行な方向で蛍光体に接近する場合の異なる放射角での強度と、を示す。明らかに、励起効率は、５０度の入射角において、すなわち図３に示されている放射ピークと実質的に一致する入射角において、より大きい。

本発明の実施形態によると、増加した放射効率が、最大蛍光放射角と一致するように励起放射線の入射角を選択することによって、得られる。これは、励起光線を基板１内に導き、最大放射角と一致する入射角で蛍光体層４を照射するように、光源を配置することによって、達成される。しかし、基板表面３上に衝突する光線は、関係式（１）：ｓｉｎα_ｒｅｆ＝ ｎ１／ｎ２×ｓｉｎα_ｉｎによって与えられる角度よりも大きな角度で、表面内に屈折することができない。α_ｉｎが９０度未満であるので、ｓｉｎα_ｉｎは１未満である。空気／基板の表面は、通常、ｎ１／ｎ２が１／１．５５＝０．６５である値を有することになる。したがって、ｓｉｎα_ｒｅｆ＜０．６５であり、α_ｒｅｆは、４０度を上回ることができない。蛍光体層に対する入射角は、屈折角に対応するので、入射角も、４０度未満であることになり、それは、所望の入射角５０度よりも小さい。励起光線の入射角を拡大するために、本発明のこの実施形態の蛍光式読み取り装置は、衝突する励起光線の光路中の基板表面上に設けられた入射角制御手段を通じて基板表面３を照射することになり、そのために表面法線に対する拡大された入射角を達成することにより、性能が更に増す。入射角制御手段は、入射光線を回析又は屈折させることにより、又は、基板材料と空気との間の屈折率の差を変えることにより、屈折角を、したがって入射角も、拡大することになる。

図５は、光学アッセイ装置を概略的に示しており、例えばＣｙ−５（商標）又はトランスフルオロスフェア（TransFluoSpheres）（商標）（インビトロジェン社）の蛍光体層４を備えた試料基板を、含んでいる。蛍光式読み取り装置は、基板表面３を照射する光源５と、前記表面３を通じて伝送される光を検出する検出装置６と、を含み、表面法線が、点線により示されている。蛍光体層４から放射される蛍光の強度は、図示された表面法線に対する、約５０度である最大放射角８で、ピークを有する。この角度は、基板表面３の内側で約４０度である全内部反射の臨界角より大きいので、放射蛍光の大部分は、基板内に捕獲されることになり、したがって、検出器６に到達しない。このように、検出される強度は、放射光線の経路中の基板表面上に全内部反射抑制手段を加えることによって、増加させることができ、それにより、捕獲された光線が基板から放出される。

放射の増強を成し遂げるために、光源５は、図示された表面法線に対する入射角７で、励起光線を基板内に入射しなければならず、その入射角は、５０度の前記最大放射角８に実質的に対応している。しかし、空気と基板材料との間の屈折率の関係により、この角度を得ることができない。入射角を拡大し、放射を増加させるために、入射角制御手段を、入射光線の光路中の基板表面上に設けることができる。

本発明による蛍光式読み取り装置では、全内部反射抑制手段は、全内部反射を低減し、捕獲された放射光を放出するために、放射蛍光の光路中の、好ましくは放射光の最大放射ピークの経路中の、基板表面上に、設けられる。その上、蛍光放射を更に増加させるために、入射光制御装置が、励起光線の経路中の基板表面上に設けられてもよく、それにより、基板内部の励起光の入射角を拡大し、蛍光の最大放射角と実質的に一致する入射角を得る。

図６〜８ａは、本発明の第１の態様による実施形態を概略的に示し、全内部反射抑制手段及び入射角制御手段は、所望の方向に光線を回析又は屈折させるように構成されている。全内部反射抑制手段及び入射角制御手段は、放射蛍光光線及び励起光線の光路中の試料基板の基板表面３上に加えられる起伏構造９を、含む。表面起伏構造は、回折性又は屈折性であるように設計されていて、例えば、光線が所望の方向に回析又は屈折することになる表面を提供する、格子又は刻面構造を、含んでもよい。

図６は、第１の例示的な実施形態を示し、全内部反射抑制手段及び入射角制御手段が、３つの部分に分割される表面起伏構造９を含んでおり、そのうちの第１の部分１１が、入口部分を含む入射角制御手段を構成しており、その入口部分は、励起光線が基板内に適切な入射角で入れるように設計された内部経路を形成し、外部部分１２が、出口部分を形成する全内部反射抑制手段を構成し、その出口部分は、全内部反射のための臨界角を上回る角度を有する蛍光光線が基板表面を通じて伝送するのを可能にする。出口部分１２は、基板からの全内部反射のための臨界角よりも、下の及び上の、放射角を、有する放射蛍光光線を、放出するように設計されており、入口部分１１は、基板内部への励起光線の入射角を拡大し、その入射角が空気の屈折率と基板の屈折率との間の関係によって与えられる屈折角を上回るように設計されている。

入口部分及び出口部分の位置は、それぞれ、好ましくは、蛍光体を反応サイト表面上に配置するのに適しており、例えば、蛍光が小さな放射角８で低い強度で放射されるので、入口部分１１を直接蛍光体の下に配置し、出口部分１２を、特に蛍光の最大放射ピークの経路中の入口部分を囲むように配置する。

本発明の更なる利点は、表面起伏構造の特定の限定された領域からの放射蛍光のみを検出することにより、又は、基板表面の特定の限定された領域のみを覆うように全内部反射抑制手段を加えることにより、反応サイト領域の特定の領域を分析することができるということである。

表面起伏は、例えば電子ビームリソグラフィー、格子みぞ彫刻装置、ホログラフィー干渉方法、ダイヤモンド超精密切削加工、シリコン微細機械加工等によって、作製されてもよく、起伏構造は、例えば正弦波、三角形、又は台形でもよい。表面起伏は、射出成形のようなマスター構造からの複写方法により、ポリマー基板上に移されてもよい。表面起伏は、例えば、１次元又は２次元のパターンの刻面として形成でき、その刻面は、光線が逸れずに伝送するように、又は、放射光が検出装置上に焦束するように、設計されていてもよい。

図７は、刻面角度α、深さＤ、及びピッチＰを有する、刻面構造を示す。その構造の深さ及びピッチは、サブμｍ範囲にあり、数百μｍまでになる。コヒーレント光源、例えばレーザが使用される場合、表面起伏は回折性であることになる。非コヒーレント光源、例えばＬＥＤが使用される場合、表面起伏は屈折性であることになる。

蛍光体から放射される光線は、放射角と、蛍光体に対する位置例えば図６に示される内部チャンネル１１上に直接位置する蛍光体のラインの位置と、に応じて、基板表面上で変化する入射角で、基板表面に衝突することになる。したがって、起伏構造の更なる実施形態によると、回折性又は屈折性の構造の設計は、全内部反射抑制機能を更に向上させるために、衝突する放射光線の入射角と相応して、出口部分の表面上で変化するように設定される。

光源の位置が基板に対して固定される蛍光式読み取り装置の実施形態によると、回折性又は屈折性の構造の設計は、励起光の焦束を得るために、励起光ビームの強度分布に相応して、入口部分の表面上で変化するように設定される。

図８ａは、蛍光体層４と表面起伏構造９を備えた基板表面３とを有する試料基板の断面図である。一方の部分は、全内部反射抑制手段として機能し、別の部分は、入射角制御手段として機能しており、それらの手段を通じて、励起光線及び蛍光性放射光線が、それぞれ伝送される。

図８ｂは、第１の態様による蛍光式読み取り装置の更なる実施形態を示し、図８ａによる試料基板を示している。その試料基板は、表面起伏９を通じて伝送される蛍光を受光するように配置された、集光レンズ１３を、更に備えており、検出装置（図示されず）に到達する放射光の強度を増加させ、それにより性能が向上する。

図９は、蛍光体層４を備えた試料基板１を含んでいる光学アッセイ装置に適している、本発明の第２の態様による蛍光式読み取り装置１０を、概略的に示す。全内部反射抑制手段は、適切な材料、例えばポリマー材料又はガラスの、集光体１５を含む。第１の実施形態によると、集光体１５は、基板材料の屈折率に相応する又はそれよりも大きな、屈折率を有する。集光体は、表面と物理的に接触するように、好ましくは光学的に濡れて接触するように、配置され、基板表面は「上に開き」、全内部反射のための臨界角を上回る放射角を有している蛍光性光線は、基板を逃れて、本体１２に入ることができる。その上、集光体の形状は、例えば本体の内部表面上の全内部反射によって蛍光光線を集光及び焦束することになり、その光線は、集光体上に備え付けられた検出装置６に到達する。このように、図示される集光体は、全内部反射抑制器として及び集光器として、作用する。それにより、検出装置６に到達する放射蛍光の強度は、増加することになり、光学アッセイ装置の性能は、向上することになる。

第２の実施形態によると、集光体は、光指向装置として機能する入力ポート１４を備えており、その入力ポートは、光源からの光線の方向を制御するために配置され、励起光を基板１に誘導し、例えば蛍光の最大放射角と実質的に一致する入射角が得られる。集光体１５の光学特性は、励起光線が、反応サイト表面上に設けられた蛍光体層に対する適切な入射角で基板に入ることを可能にする。それにより、蛍光体層は、より有利に励起され、より多くの蛍光が放射されることになり、それにより、光学アッセイ装置の性能が向上する。

更なる実施形態によると、集光体１５は、１つ以上の出力ポート（図示されず）を備え、例えば、鏡面的に反射される励起光線に対するビームダンプとして機能するように配置される。

図１０は、蛍光体層４を備えた試料基板１を含んでいる光学アッセイ装置に適した、本発明の第３の態様による蛍光式読み取り装置を概略的に示す。全内部反射抑制手段１６は、適切な材料の光学的濡れ層を含むことにより、表面で屈折率の差が変化するように構成されている。上記の関係式（１）のようにｓｉｎα_{ｉｎ（ＴＩＲ）}＝ｎ２／ｎ１であるので、ｎ２／ｎ１が増加するように屈折率の差を小さくする場合、表面を通じてより多くの蛍光を伝送することができる。

第１の実施形態によると、蛍光式読み取り装置は、光源５、検出器６、及び検出器６上に放射蛍光を焦束するために配置されたレンズ装置１７を、含む。レンズ装置１７は、全内部反射抑制手段１６を備えており、その手段は、適切な屈折性を有し、基板表面３と物理的に接触するよう配置された適切な材料の層を、含んでいる。その層の材料は、好ましくは、軟性ポリマー、例えばシリコン、エポキシ、ポリウレタン、又はアクリル酸塩であり、そのポリマーは、層と表面との間に空気を設けずに、光学的濡れ層として、レンズ装置１７の表面上に塗布される。それにより、レンズに伝搬する光線は、大きな角度で反射損失を起こすことになるところの、いずれの空気層も、通過しないことになる。軟性ポリマー材料を選択する更なる利点は、完全には均一ではない又は平面ではない、表面上に、光学的濡れ層を形成することができるということである。更に、層の材料は、適切な光伝送特性、例えば伝送される放射光線又は励起光線の、低い蛍光及び低い拡散を、有するように選択される。層１６の厚さは、数μｍ〜数ｍｍであり得る。層の屈折率の適切な値は、ポリマー基板材料の屈折率の値とレンズ装置の屈折率の値との間であり、レンズ装置の屈折率は最大のものである。基板表面３と物理的に接触するように結合された、全内部反射抑制光学的濡れ層１６は、基板内に捕獲された蛍光光線を放出し、検出器６が放射光線の大部分を収集することを可能にする。

光源５は、試料基板１の基板表面３を照射するように配置されており、検出装置６は、試料基板の反応サイト表面上の蛍光体層４から放射されて基板表面３を通じて伝送される蛍光を、検出するように配置されている。光源５は、励起光線を基板内に入射させ、蛍光の最大放射角は、通常、全内部反射のための角度を上回る。しかし、光学的濡れ層１６は、全内部反射抑制手段としてレンズ装置１７上に塗布され、全内部反射のための角度が増加することにより、表面を通じて逃れる光の強度は増加する。

図示されていないが、他の実施形態によると、光学的濡れ層１６が検出装置６上に直接塗布され、その場合、検出装置は、放射光を集光するのに適しており、いずれの集束手段も有していない。好ましくは、検出装置は、光学的濡れ層が基板表面３と物理的に接触して結合するように配置される。

更に、光学的濡れ層１６は、レンズ１７全体又は検出装置６を実質的に覆ってもよい。代わりに、光学アッセイ装置の構成に応じて、検出器６又はレンズ１７の、表面の適切な部分が覆われてもよい。

図示されていないが、代わりの実施形態によると、入射角制御手段が、基板表面３上に加えられ、相対的表面での回折率の差を変えることにより、表面法線に対する励起光線の入射角が拡大される。入射角が、関係式ｓｉｎα_ｒｅｆ＝ｎ１／ｎ２×ｓｉｎα_ｉｎによって与えられる屈折角に対応するので、屈折率の差の変化は、入射角に影響を及ぼすことになる。入射角制御手段は、この実施形態によると、適切な屈折率を有しており、入射された励起光線の光路中の基板表面上に加えられる材料の光学的濡れ層を含む。光学的濡れ層の屈折率が空気の屈折率よりも大きい場合、ｎ１／ｎ２が増加することになり、その結果、α_ｒｅｆが拡大し、入射角が拡大することになる。結果として生じる入射角は、好ましくは、蛍光の最大放射角と一致してもよく、そのために、より多くの蛍光が放射されることになる。光学的濡れ層は、代わりに、励起光線の方向を制御するために配置された光指向装置（図示されず）の表面上に加えられてもよい。

本発明の第４の態様によると、全内部反射抑制手段は、図６〜８を参照して記載されるような本発明の第１の態様による表面起伏構造９と、図９を参照して記載されるような第２の態様による集光体１５と、の両方を含む。集光体は、好ましくは、基板表面の近傍に、例えば表面から約１ｍｍ未満の距離に位置する。表面起伏構造９と集光体１５とを結合させることにより、全内部反射の向上された抑制が得られ、一方では放射光の向上された集光が、集光体により与えられる。

光学アッセイ装置の性能を更に高めるために、上記のような、本発明の態様のいずれか１つによって実施される蛍光式読み取り装置は、適切なフィルタ、例えばスペクトルフィルタ及び偏光フィルタを備えており、任意の励起光が検出器に到達するのを妨げる。励起光線の一部が、反射され、基板を通じて伝送され、検出装置により検出される基板表面から放出されることになるので、検出装置は、好ましくは、励起光線の波長を除去するスペクトルフィルタにより与えられる。しかし、励起光線のスペクトルは、例えばレーザダイオード又は発光ダイオード（ＬＥＤ）からの光であってもよく、通常、蛍光体層中の蛍光体の種類に依存する放射蛍光の波長領域に延びる尾部を有している。蛍光の波長を検出フィルタにより除去することができないので、励起光源は、好ましくは、尾部を除去するスペクトルフィルタを備えている。このように、蛍光式読み取り装置の更なる例示的な実施形態によると、検出器は、励起光線及び他のいずれの不必要な光源の波長を除去する、スペクトルフィルタを、備えており、光源は、蛍光と一致する波長を除去するスペクトルフィルタを、備えている。したがって、検出器フィルタリング手段の遮断周波数は、光源フィルタリング手段の遮断周波数に適応していなければならず、励起光の波長範囲と検出光の波長範囲との間のいずれの重複部分も回避され、それにより、蛍光式読み取り装置の効率が更に改善される。

任意の励起光が検出器に到達するのを妨げるために、蛍光式読み取り装置の別の例示的な実施形態は、励起光に対して及び放射される蛍光の測定に対して、直交して配置された、異なる幾何学形状の平面を、使用するように設定されて、例えば励起に対しては幾何学的なｙｚ平面を、放射の測定に対しては幾何学的なｘｚ平面を、使用する。

蛍光式読み取り装置の更なる実施形態によると、光源を提供することにより、必要な場合は、偏光フィルタ付きの検出器を提供することにより、励起光線が検出器に到達するのを妨げることができる。試料基板が低い複屈折を有する場合、１つの例示的な設定は、２つの偏光子を互いに垂直に整列することになる。それにより、検出器の偏光フィルタと平行に偏光された蛍光のみが、検出されることになる。代わりに、複屈折が変化して無視できない場合、偏光子の一方は、励起光を除去するのに適した角度に回転可能でなければならず、それにより、蛍光式読み取り装置の更に向上された性能が得られる。

このように、走査型又は撮像型蛍光式読み取り装置に、上記のような、適切な全内部反射抑制手段、入射光制御装置、レンズ、及び光指向装置、同様にスペクトル及び／又は偏光フィルタリングを、備え付けることにより、高性能な光学アッセイ装置を得ることができる。

しかし、本発明は、図中に記載された実施形態に制限されず、添付の請求項の範囲内で自由に変化してもよい。

試料基板の斜視側面図であり、反応サイト表面と対向する基板表面とを示している。 ポリマー試料基板の反応サイト表面上に位置する蛍光体の放射の非対称を示す。 蛍光体の蛍光放射ピークを概略的に示しているグラフである。 励起光の２つの異なる入射角で蛍光励起効率を概略的に示しているグラフである。 試料基板、励起光源、及び放射蛍光用の検出器の、断面を概略的に示しており、入射角及び放射角を示している。 試料基板の基板表面上に設けられた、全内部反射抑制出口部分及び入射角制御入口部分の両方を含んでいる、表面起伏構造の図である。 表面起伏構造の拡大例を概略的に示す。 表面起伏構造の入口部分及び出口部分を備えた基板の断面を概略的に示す。 放射光のための集光レンズ装置を更に備えた、図８ａの基板を示す。 光指向装置として機能する入力ポートを備えた、全内部反射抑制集光体を、含んでいる蛍光式読み取り装置を、示す。 検出器及びレンズを含んでいる装置を示し、レンズは、基板表面と物理的に接触する全内部反射抑制濡れ層を備えている。

Claims (41)

1. 反応サイト表面（２）と対向する基板表面（３）とを有している試料基板（１）のための蛍光式読み取り装置（１０）であって、
   励起光線を前記基板表面（３）に入射させるよう配置された、励起光源（５）と、
   前記反応サイト表面から放射され、前記基板表面を通じて伝送される蛍光を検出するよう配置された、検出装置（６）と、を含んでおり、
   前記基板表面（３）が、前記検出装置（６）による検出のための、前記基板表面を通じた伝送を、増加するために、前記放射蛍光の光路中に配置された、全内部反射抑制手段（１２、１５、１６）を、備えていることを特徴とする蛍光式読み取り装置。
2. 前記全内部反射抑制手段が、前記検出装置（６）による検出のための、前記基板（２）内に捕獲された放射蛍光を、放出するように配置されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光式読み取り装置。
3. 前記光源（５）が、入射角（７）で、励起光線を前記基板表面（３）に入射させるように配置されており、入射角（７）は、前記反応サイト表面の法線に対して、前記放射蛍光の最大放射角（８）と実質的に一致していることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光式読み取り装置。
4. 前記基板表面（３）が、前記励起光線の光路中に配置された、入射角制御手段（１１）を、備えていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
5. 前記入射角制御手段（１１）が、前記反応サイト表面の法線に対する拡大された入射角（７）で、励起光が前記基板内に入るように設計された、表面起伏構造の入口部分（９）を、含むことを特徴とする請求項４に記載の蛍光式読み取り装置。
6. 前記表面起伏構造の入口部分（１１）が、回析性の構造を含むことを特徴とする請求項４又は５に記載の蛍光式読み取り装置。
7. 前記表面起伏構造の入口部分（１１）が、屈折性の構造を含むことを特徴とする請求項４又は５に記載の蛍光式読み取り装置。
8. 前記全内部反射抑制手段が、前記基板からの前記放射蛍光光線を回折又は屈折させるように設計された、表面起伏構造の出口部分（１２）を、含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
9. 前記出口部分（１２）が、前記放射光線を焦束するように設計されていることを特徴とする請求項８に記載の蛍光式読み取り装置。
10. 前記表面起伏構造の出口部分（１２）が、回折性の構造を含むことを特徴とする請求項８又は９に記載の蛍光式読み取り装置。
11. 前記表面起伏構造の出口部分（１２）が、屈折性の構造を含むことを特徴とする請求項８又は９に記載の蛍光式読み取り装置。
12. 前記表面起伏構造の設計が、衝突する蛍光の変化する放射角（８）に相応して、前記出口部分（１２）の表面上で変化するように、設定されていることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
13. 前記出口部分（１２）の位置及び延長が、分析される前記反応サイト領域の位置及び延長を定めることを特徴とする請求項８〜１２のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
14. 集光レンズ装置（１３）が、前記基板表面を通じて伝送された前記放射蛍光を、受光するように配置されていることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
15. 集光体（１５）が、前記基板表面上に設けられた、表面起伏構造の出口部分（９）の、近傍に位置することを特徴とする請求項８〜１３のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
16. 前記全内部反射抑制手段が、前記基板表面と光学的に濡れて接触するように配置された、集光体（１５）を、含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
17. 前記集光体（１５）が、全内部反射により、光を、集光し、伝送するように、設計されていることを特徴とする請求項１５又は１６に記載の蛍光式読み取り装置。
18. 前記集光体（１５）が、実質的に楕円形であることを特徴とする請求項１５〜１７に記載の蛍光式読み取り装置。
19. 前記集光体（１５）が、前記励起光のための入力ポート（１４）を備えていることを特徴とする請求項１５〜１８のいずれかに１項に記載の蛍光式読み取り装置。
20. 前記集光体（１５）が、少なくとも１つの出力ポートを備えていることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
21. 前記集光体（１５）が、前記基板（１）の屈折率に、実質的に対応している又はそれよりも大きい、屈折率を、有することを特徴とする請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
22. 前記全内部反射抑制手段が、適切な屈折率を有している光学的濡れ層（１６）を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光読み取り装置。
23. 前記光学的濡れ層の少なくとも一部分が、前記検出装置（６）上に前記放射蛍光を焦束させるよう配置された、レンズ装置（１７）に、取り付けられていることを特徴とする請求項２２に記載の蛍光式読み取り装置。
24. 前記光学的濡れ層（１６）が、前記基板（１）の屈折率よりも高く、且つ、前記レンズ装置（１７）の屈折率よりも低い、屈折率を、有することを特徴とする請求項２３に記載の蛍光式読み取り装置。
25. 前記光学的濡れ層の少なくとも一部分が、前記検出装置（６）に取り付けられていることを特徴とする請求項２２に記載の蛍光式読み取り装置。
26. 前記入射角制御手段が、適切な屈折率を有している光学的濡れ層を、含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
27. 前記光学的濡れ層（１６）が、軟性ポリマー材料を含むことを特徴とする請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
28. 前記検出装置（６）が、前記励起光の波長の検出を妨げるよう配置された、スペクトルフィルタリング手段を、備えていることを特徴とする請求項１〜２７のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
29. 前記検出装置（６）が、分極フィルタリング手段を備えていることを特徴とする請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
30. 前記光源（５）が、前記蛍光放射と一致する波長の透過を妨げるよう配置された、スペクトルフィルタリング手段を、備えていることを特徴とする請求項１〜２９のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
31. 前記放射の励起及び測定が、異なる幾何学形状の平面で行われることを特徴する請求項１〜３０のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置。
32. 光学アッセイ装置中での、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置の使用。
33. 反応サイト表面（２）と対向する基板表面（３）とを有する試料基板（１）であって、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の蛍光式読み取り装置に適していることを特徴とする試料基板。
34. ポリマー材料で作製されていることを特徴とする請求項３３に記載の試料基板。
35. 反応サイト表面（２）が、蛍光体のライン及び／又はスポットを形成するように配置されていることを特徴とする請求項３３又は３４に記載の試料基板。
36. 前記反応サイト表面（２）が、突起状の微細構造のパターンを備えていることを特徴とする請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の試料基板。
37. 前記突起状の微細構造が、毛細管流を可能にするマイクロ・ポストを含むことを特徴とする請求項３６に記載の試料基板。
38. 前記基板表面（３）が、放射される蛍光光線の全内部反射を抑制するように構成された、表面起伏構造の出口部分（１２）を、備えていることを特徴とする請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の試料基板。
39. 前記基板表面（３）が、 前記励起光線の前記入射角（７）を拡大するように構成された、表面起伏構造の入口部分（１１）を、備えていることを特徴とする請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の試料基板。
40. 表面起伏が、回折性の構造であることを特徴とする請求項３８又は３９に記載の試料基板。
41. 表面起伏が、屈折性の構造であることを特徴とする請求項３８又は３９に記載の試料基板。

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