BRPI0709018A2

BRPI0709018A2 - leitora de fluorescência

Info

Publication number: BRPI0709018A2
Application number: BRPI0709018-8A
Authority: BR
Inventors: Ove Ihman; Ib Mendel Hartvig; Lindstroem Tomas; Johan Backlund; Kennet Vilhelmsson
Original assignee: Amic Ab
Priority date: 2006-03-22
Filing date: 2007-03-21
Publication date: 2011-06-21
Also published as: JP2009530637A; JP5705432B2; EP1996922B1; EP1996922A1; US20140212984A1; SE0600642L; US8691153B2; US20070231883A1; AU2007227809B2; US9279768B2; CN102636469A; EP1996922A4; AU2007227809A1; CN101405594B; CN102636469B; SE529711C2; CN101405594A; WO2007108752A1

Abstract

LEITORA DE FLUORESCêNCIA Leitora de fluorescência (10) para um arranjo de ensaio ótico compreendendo um substrato de amostra polimérico (1) tendo uma superfície de reação local e uma superfície de substrato (3), a leitora de fluorescência compreendendo uma fonte de luz (5) disposta para iluminar a superfície de reação local através da superfície de substrato, e um dispositivo detector (6) disposto para detectar luz fluorescente emitida a partir da superfície de reação local e transmitida através da superfície de substrato, a superfície de substrato provida com meio de supressão de reflexão interna total (15).

Description

"LEITORA DE FLUORESCÊNCIA"

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a uma leitora defluorescência/fosforescência aperfeiçoada para um substratosimples em um arranjo de ensaio ótico. A invenção também serefere ao uso de referida leitora defluorescência/fosforescência, e a um substrato de amostraadaptado à referida leitora de fluorescência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Determinações analíticas e diagnosticas podem serrealizadas em amostras líquidas por meio de ensaios óticosbaseados na detecção de analitos em uma amostra, tal como,por exemplo, ácidos nucléicos, peptídeos, proteínas,anticorpos, hormônios, ou drogas. Uma aplicação importantede ensaios óticos é o campo de imunologia, em que o analitoé detectado com o auxílio de um anticorpo específico, que écapaz de se ligar ao analito para formar complexosoticamente detectáveis, por exemplo, pelo etiquetamento doanalito com fluoróforo, ou pela provisão de um anticorpoetiquetado com fluoróforo antes da detecção ótica. Adetecção dos fluoróforos pode ser realizada por meio de umaleitora de fluorescência, que é capaz de iluminar osubstrato de ensaio de suporte com uma fonte de luzexcitante, e de detectar a luz fluorescente emitida apartir dos fluoróforos.

Um ensaio ótico envolvendo detecção de luzfluorescente emitida de fluoróforos é realizado por umarranjo de ensaio ótico compreendendo um substrato desuporte de amostra e uma leitora de fluorescência. Aleitora de fluorescência compreende uma fonte e um detectorpara radiação eletromagnética dentro da região decomprimento de onda ótico (isto e, entre aproximadamente 40nm e 1 mm) , e filtros óticos adequados e meios de guia deonda. O suporte de amostra compreende um substrato de, porexemplo, um material polimérico tendo uma altatransmitância ótica nas faixas de comprimento de onda daluz excitante e da luz emitida, e pode ter uma altaabsorvância de outros comprimentos de onda. O substrato éprovido com uma ou mais áreas de reação local,compreendendo pontos e/ou linhas de moléculas de sonda, porexemplo, de um anticorpo, proporcionando locais de ligaçãopara moléculas do analito, isto é, as moléculas alvos, quepodem estar presentes em uma amostra. O substrato pode,adicionalmente, ser provido com o modelo de microestruturasprojetantes que formam, por exemplo, micro pilares ou micropostes, que podem ser dispostos para formar uma trajetóriade fluxo capilar para a amostra.

Quando a amostra é posta em contato com as moléculasde captura na superfície de suporte, e a detecção doanticorpo fluorescente ou fosforescente se conjuga, pontosou linhas opticamente detectáveis serão formados. A luzfluorescente ou fosforescente será emitida quando osubstrato é iluminado com a fonte de luz excitante daleitora de fluorescência, indicando, desse modo, que umareação ocorreu entre as moléculas alvos da amostra e asmoléculas de sonda dos locais de reação.

A fluorescência e fosforescência podem ser definidascomo a emissão de radiação eletromagnética resultante daradiação eletromagnética excitante absorvida, a luzfluorescente dura menos do que 1 χ IO"8 segundos após aexcitação, e a luz fosforescente durando mais, isto é,decaindo mais vagarosamente após a exposição à luzexcitante.

Na fluorescência (e fosforescência), a radiaçãoexcitante normalmente tem um comprimento de onda mais curto(isto é, energia mais alta) do que a radiação emitida,embora o inverso possa ser verdadeiro para fluorescência demúltiplos fótons. O comportamento fluorescente pode serestudado em um estado constante, ou de tempo determinado, eespectroscopia de fluorescência envolve, por exemplo,fluorescência de fóton simples e de múltiplos fótons, FRET(transferência de energia de ressonância de fluorescência),e conversão superior de fluorescência. Nos ensaios defluorescência, o comprimento de onda da radiação excitantee emitida depende do tipo de fluoróforo, que pode ser deuma origem orgânica ou inorgânica, isto é, corantes decianina, corantes de fluorescina ou nanocristais. Como umexemplo, o fluoróforo comum Cy-5™ (GE Healthcare) étipicamente excitado com 649 nm, e a luz emitida é medida a670 nm. A diferença no comprimento de onda entre aexcitação máxima e a máxima emitância é comumente referidacomo alteração de Stokes.

Nos ensaios óticos, a concentração de um analito naamostra pode ser determinada pela medição da intensidade deluz fluorescente ou fosforescente emitida, por meio dodispositivo detector de uma leitora de fluorescência,capacitando, desse modo, medições quantitativas.

Conseqüentemente, a eficiência da iluminação de uma área dereação local com luz excitante, bem como a eficiência dacoleta da luz fluorescente emitida, terá um efeito nodesempenho do ensaio ótico.Adicionalmente, os locais de reação em uma superfíciede substrato podem ser providos com uma série de pontos oulinhas de moléculas de sonda diferentes, ligando moléculasalvos diferentes. Portanto, uma leitora de fluorescênciapode ser designada para ser capaz de determinar a presençade vários analitos em uma amostra, por meio de fluoróforosdiferentes, ou pelo uso de separação de espaço dasmoléculas de sonda.

Uma leitora de fluorescência pode estar disposta pararealizar a detecção de luz emitida fluorescente pelavarredura da área de reação local, ou para detectar umaimagem da área de reação local total como uma sériebidimensional de pixéis. Uma leitora de fluorescência devarredura explora a superfície do substrato de amostra porum movimento relativo entre o meio ótico e o substrato deamostra, e o meio ótico preferivelmente compreende umafonte de luz excitante de faixa estreita, tal como umlaser, um LED, ou uma fonte de luz branca provida comfiltros espectrais, da qual a luz é focalizada em cadalocal de detecção individual. A luz fluorescente emitida decada local de detecção é focalizada em um detector ótico,tal como, por exemplo, um fotodiodo, ou um PMT (tubofotomultiplicador). Uma leitora de fluorescência de imagemé capaz de detectar uma série bidimensional de pixéis, e omeio ótico compreende uma fonte de luz excitante parailuminar uma parte maior da área superficial (ou a áreasuperficial total) do substrato de amostra, e um detectorcapaz de detectar luz emitida a partir da área de detecçãode local total simultaneamente, por exemplo, um formador deimagem-CCD (Dispositivo Carregado-Acoplado), que utilizatecnologia de MOS (Metal-Em-Semicondutor).Uma leitora ótica da técnica anterior é descrita no WO01/575501, que revela imagem ótica de uma amostra contendoanalito em um substrato transparente. A leitora óticacompreende uma fonte de energia excitante para estimularemissão de luz detectável a partir da amostra, e osubstrato é provido com uma superfície refrativa abaixo deuma amostra para refletir a luz emitida no meio dedetecção.

Um dispositivo ótico de detecção de luz é revelado noWO 99/46596, compreendendo um corpo de condução de luzacoplado a um cursor, aperfeiçoando, desse modo, aeficiência de coleta de luz.

0 WO 03/103835 descreve substratos de amostra datécnica anterior providos com micro postes projetantesdispostos para formar uma trajetória de fluxo capilar paraa amostra.

É um objetivo desta invenção proporcionar uma leitorade fluorescência/fosforescência capaz de uma iluminaçãoeficiente da área de reação local do substrato, e umacoleta e detecção eficientes da luz emitida, alcançando,desse modo, um arranjo de ensaio ótico de alto desempenho.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Estes e outros objetivos são alcançados pela leitorade fluorescência e substrato de amostra de acordo com asreivindicações em anexo.

As reivindicações se referem a uma leitora defluorescência para um substrato de amostra tendo umasuperfície de reação local e uma superfície de substratooposta. A leitora de fluorescência compreendendo uma fontede luz excitante posicionada para injetar raios de luzexcitante na superfície de substrato, e um dispositivodetector posicionado para detectar a luz fluorescenteemitida a partir da superfície de reação local etransmitida através da superfície de substrato. Asuperfície de substrato é provida com meios de supressão dereflexão interna total localizados na trajetória ótica daluz fluorescente emitida para aumentar a transmissãoatravés da superfície de substrato para detecção pelodispositivo de detecção, e o meio de supressão de reflexãointerna total é disposto para liberar luz fluorescenteemitida retida no interior do substrato para detecção pelodispositivo de detecção.

Adicionalmente, a fonte de luz pode ser disposta parainjetar raios de luz excitantes na superfície de substratocom um ângulo de incidência relativo à normal da superfíciede reação local coincidindo substancialmente com o ângulode emissão máxima da luz fluorescente emitida. Desse modo,a superfície de substrato pode ser provida com meio decontrole de ângulo de incidência localizado na trajetóriaótica dos raios de luz excitantes.

O meio de controle de ângulo de incidência podecompreender uma seção de entrada estruturada de alívio desuperfície designada para admitir luz excitante nosubstrato com um ângulo de incidência alargado em relação ànormal da superfície local de reação, e a estrutura dealívio pode compreender uma estrutura difrativa ou umaestrutura refrativa.

O meio de supressão de reflexão interna total podecompreender uma seção de saída estruturada de alívio desuperfície designada para difratar ou refratar os raios deluz fluorescente emitida fora do substrato, e pode,adicionalmente, ser designado para focalizar os raios deluz emitidos, a seção de saída estruturada de alívio desuperfície compreendendo uma estrutura difrativa ou umaestrutura refrativa.

0 desenho da estrutura de alívio de superfície podeser disposto para variar sobre a superfície da seção desaída em correspondência com a variação do ângulo deemissão da luz fluorescente infringente, e a posição eextensão da seção de saída determinam a posição e extensãoda área de reação local analisada.

Adicionalmente, um dispositivo de lente de coleta deluz pode estar posicionado para receber a luz fluorescenteemitida transmitida através da superfície de substrato.

Alternativamente, um corpo de coleta de luz pode estarlocalizado em proximidade a uma seção de saída estruturadade alívio de superfície provida na referida superfície desubstrato.

O meio de supressão de reflexão interna total podecompreender um corpo de coleta de luz posicionado emcontato oticamente úmido com referida superfície desubstrato.

O corpo de coleta de luz pode ser designado paracoletar e transmitir luz por meio de reflexão internatotal, e pode ser substancialmente de forma elipsóide. Elepode também ser provido com um orifício de entrada para aluz excitante, e/ou pelo menos um orifício de saída, e oíndice de refração pode corresponder substancialmente a, ouser maior do que, o índice de refração do substrato.

O meio de supressão de reflexão interna total pode,alternativamente, compreender uma camada oticamente úmidatendo um índice de ref ração adequado, e pelo menos umaporção de referida camada oticamente úmida é fixada a umdispositivo de lente disposto para focalizar a luzfluorescente emitida no dispositivo detector. O índice derefração pode ser mais alto do que o índice de refração dosubstrato, e mais baixo do que o índice de refração dodispositivo de lente. Adicionalmente, pelo menos uma porçãode referida camada oticamente úmida pode estar fixada aodispositivo detector. O meio de controle de ângulo deincidência pode compreender uma camada oticamente úmidatendo um índice de refração adequado, e a camada oticamenteúmida pode compreender um material polimérico macio.

Adicionalmente, o dispositivo detector pode serprovido com meio de filtragem espectral disposto paraimpedir detecção dos comprimentos de onda da luz excitante,e/ou com meio de filtragem de polarização.

A fonte de luz pode também ser provida com meio defiltragem espectral disposto para impedir transmissão doscomprimentos de onda que coincidem com a emissão defluorescência, e a excitação e a medição da emissão podeser realizada em planos geométricos diferentes.

As reivindicações também se referem ao uso da leitorade fluorescência em um arranjo de ensaio ótico.

Adicionalmente, as reivindicações se referem a umsubstrato de amostra com uma superfície de reação local euma superfície de substrato oposta, o substrato de amostraadaptado para uma leitora de fluorescência de acordo comesta invenção.

O substrato de amostra pode ser produzido de ummaterial polimérico, e a superfície de reação local podeser disposta para formar linhas e/ou pontos de fluoróforos.Adicionalmente, a superfície de reação local pode serprovida com um modelo de microestruturas projetantes, porexemplo, micro-postes que capacitam um fluxo capilar.

A superfície de substrato pode ser provida com umaseção de saída estruturada de alívio de superfícieconfigurada para suprimir a reflexão interna total de raiosde luz de fluorescência emitidos, e/ou com uma seção deentrada estruturada de alívio de superfície configuradapara ampliar o ângulo de incidência dos raios de luzexcitantes, os alívios de superfície compreendendo umaestrutura difrativa ou uma estrutura refrativa.

Outras características e outras vantagens da invençãotornar-se-ão aparentes a partir das concretizações não-limitativas da invenção reveladas na descrição e figurasque se seguem, bem como a partir das reivindicações emanexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A presente invenção será agora descrita em maioresdetalhes e com referência aos desenhos, dos quais:A Figura 1 é uma vista lateral em perspectiva de um

substrato de amostra, indicando a superfície de reaçãolocal e a superfície de substrato oposta;

A Figura 2 ilustra a simetria de emissão de umfluoróforo localizado em uma superfície de reação local deum substrato de amostra polimérico;

A Figura 3 é um gráfico ilustrando esquematicamente olobo de emissão de fluorescência de um fluoróforo;

A Figura 4 é um gráfico ilustrando esquematicamente aeficiência de excitação de fluorescência em dois ângulos deincidência diferentes da luz excitante;A Figura 5 ilustra esquematicamente uma seçãotransversal de um substrato de amostra e uma fonte de luzexcitante e um detector para a luz fluorescente emitida,indicando o ângulo de incidência e o ângulo de emissão;

A Figura 6 é uma vista de uma estrutura de alívio desuperfície compreendendo ambas uma seção de saída desupressão de reflexão interna total e uma seção de entradade controle de ângulo de incidência, providas em umasuperfície de substrato de um substrato de amostra;

A Figura 7 ilustra esquematicamente um exemploampliado da estrutura de alívio de superfície;

A Figura 8a ilustra esquematicamente uma seçãotransversal de um substrato provido com uma seção deentrada estruturada de alívio de superfície e uma seção desaída;

A Figura 8b ilustra o substrato da Figura 8a,adicionalmente provido com um dispositivo de lente decoleta de luz para a luz emitida;

A Figura 9 ilustra uma leitora de fluorescênciacompreendendo um corpo de coleta de luz de supressão dereflexão interna total com um orifício de entradafuncionando como um dispositivo de direcionamento de luz; e

A Figura 10 mostra um arranjo compreendendo umdetector e lente, a lente provida com uma camada úmida desupressão de reflexão interna total em contato físico com asuperfície de substrato.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

O termo "leitora de fluorescência" é definido como umaleitora capaz de excitar e detectar luz ambas fluorescentee fosforescente, e o termo "luz fluorescente" é definidodaqui por diante para se referir a luz ambas fluorescente efosforescente. Outros termos e expressões usados nadescrição e nas reivindicações são significativos paraterem o significado normalmente usado por um técnico noassunto.

Um desempenho aperfeiçoado é alcançado em um arranjode ensaio ótico compreendendo um substrato de amostrapolimérico tendo uma superfície de reação local provida comuma camada fluorofórica, os fluoróforos formando, porexemplo, linhas ou pontos na superfície, e uma superfíciede substrato oposta, por meio de uma leitora defluorescência de acordo com a invenção. A leitora defluorescência compreende uma fonte de luz excitante, istoé, um LED posicionado para iluminar a superfície desubstrato, e um detector, por exemplo, um fotodiodo,disposto para detectar a luz fluorescente emitida a partirda camada fluorófica. 0 detector está posicionado paracoletar e detectar a luz fluorescente emitida transmitidaatravés da superfície de substrato, e a fonte de luz édisposta para injetar luz excitante na superfície desubstrato.

Um raio de luz impingindo em uma superfície seráespecularmente refletido de referida superfície quando oângulo de incidência do raio de luz em relação à normal àsuperfície excede o ângulo crítico para reflexão internatotal, que depende do relacionamento entre o índice derefração do material em ambos os lados da superfície. Arefração do raio de luz que passa de um primeiro meio,tendo o índice de ref ração nl, para um segundo meio, comíndice de refração n2, é definida pelo relacionamento bemconhecido da Lei de Snell:nl χ sen αιη = η2 χ sen aref (1)

oíin é o ângulo à normal da superfície do raio de luz noprimeiro impingindo na superfície entre e primeiro e osegundo meio, e aref é o ângulo à normal da superfície doraio de luz ref ratado que se propaga no segundo meio.Quando aref = 90 graus, a reflexão interna total ocorre nasuperfície, sen ain = 1. A partir do relacionamento (1)acima, segue que:

sen ain = n2/nl χ sen aref ->sen ain(TIR) = n2/nl —»ain(TiR)= sen"1 (n2/nl) , onde Oiin(TiR) indica o ângulo crítico parareflexão interna total.

Desse modo, reflexão interna total ocorre quando nl émaior do que n2 e oíj.n excede o ângulo crítico para reflexãointerna total, isto é, αιη > ain(TiR).

Em uma leitora de fluorescência convencional adequadapara um substrato dielétrico provido com uma camadafluorófica, muita da luz emitida a partir da camadafluorófica será dirigida no substrato, e uma grande porçãodesta luz fluorescente emitida impingirá na superfície desubstrato com um ângulo que excede referido ângulo críticopara reflexão interna total. Quando um substrato poliméricoconvencional é usado, com um índice de refração típicoentre 1,5 e 1,6, a reflexão interna total ocorrerá, e umafração grande da luz emitida será retida no interior dosubstrato, isto é, suporta reflexões internas totaismúltiplas, não alcançando, desse modo, o detector.

De acordo com esta invenção, meio de supressão dereflexão interna total é provido na superfície de substratopara liberar a luz fluorescente retida a partir dosubstrato, permitindo, desse modo, que uma fração grande daluz fluorescente emitida alcance o detector. O meio desupressão de reflexão interna total é configurado paradifratar ou refratar os raios de luz, ou remover adiferença no índice de refração. Desse modo, os raios deluz fluorescente emitidos tendo um ângulo relativo à normalà superfície de substrato que excede o ângulo crítico parareflexão interna total serão permitidos escaparem atravésda superfície, e alcançarem o detector.

Os raios de luz excitantes de uma fonte de luz que sepropagam no ar e impingem na superfície do substratopolimérico serão refratados no substrato com uma direçãodada pelo relacionamento (1), do qual segue que:

sen oíref = nl/n2 χ sen αιη, onde o ângulo está entre oraio de luz refratado no interior do substrato e a normalda superfície, e oíj.n é o ângulo entre o raio de luz deimpingimento no ar e a normal da superfície.Conseqüentemente, o ângulo da luz refratada é limitado pelofato que nl/n2 será aproximadamente 1/1,55 = 0,65, e que αιηserá menor do que 90 graus, resultando em que aref ^ 40graus.

A Figura 1 ilustra esquematicamente um substrato deamostra 1 para um arranjo de ensaio ótico, o substrato deamostra tendo uma superfície de reação local 2, e umasuperfície de substrato 3, localizada uma oposta à outra. Asuperfície de reação local do substrato pode adicionalmenteser provida com um modelo de microestruturas projetantes,por exemplo, micro-postes (não ilustrados), que podem serdispostos para formar uma trajetória de fluxo capilar paraa amostra. O tamanho do substrato é preferivelmenteadaptado para formar um transportador adequado para uma oumais áreas de reação local para um ensaio ótico, e umcursor de micro-série da técnica anterior é retangular, comum tamanho de 2 5 mm χ 75 mm. A espessura do substrato podeser, por exemplo, aproximadamente 1 mm, e a largura ecomprimento, por exemplo, entre aproximadamente 1 mm e 100mm, formando uma área superficial aproximadamenteretangular e quadrática. O material do substrato pode serum polímero termoplástico, por exemplo, um polímero decicloolefina ou um copolímero de cicloolefina, tendopropriedades óticas adequadas, por exemplo, com relação atransparência da radiação ótica, com um índice de refraçãotipicamente entre 1,5 e 1,6. Um substrato polimérico podeser manufaturado por uma replicação de polímero de umaestrutura mestre, por exemplo, por moldagem de injeção.

Contudo, outro material de substrato pode ser usado, porexemplo, vidro ou silício, tendo propriedades óticasadequadas.

A Figura 2 ilustra esquematicamente os raioseletromagnéticos emitidos de um fluoróforo 4 localizado nasuperfície de reação local 2 de um substrato de amostradielétrico 1. A emissão é assimétrica devido aspropriedades óticas diferentes de ar e o material desubstrato, e a intensidade da luz emitida é maior dentro dosubstrato do que no ar. Desde que o substrato tem uma altatransmitância dos comprimentos de onda dos raios emitidos,é vantajoso detectar a luz fluorescente excitada a partirdo lado do substrato.

A Figura 3 é um gráfico ilustrando esquematicamente aintensidade dos ângulos de emissão diferentes de uma camadadelgada do fluoróforo Cy-5™, o ângulo de emissão definidocomo o ângulo à normal da superfície. (Contudo, para umdado ângulo de emissão, a luz será emitida acima de 360°).

O gráfico indica que a emissão de fluorescência é altamenteanisotrópica, com um pico em um ângulo de aproximadamente50 graus. Este é um ângulo que é maior do que o ângulocrítico para uma reflexão interna total para a superfíciede interfaceamento de substrato/ar, visto que o ângulocrítico de reflexão interna total para um raio de luz quese propaga em um material de substrato com um índice deref ração de If 55, e impingindo na superfície deinterfaceamento de substrato/ar é 40 graus, de acordo com orelacionamento (1) acima. Portanto, muita da luz defluorescência emitida no interior do substrato impingirá nolado interno da superfície de substrato com um ânguloexcedendo o ângulo crítico para reflexão interna total, eserá retido no interior do substrato. Esta luz,conseqüentemente, não alcançará um detector localizado forada superfície de substrato em um modo controlado. Alguma daluz retida no interior do substrato será eventualmenterefratada fora do substrato nas bordas do substrato, masesta luz normalmente não alcançará o detector. Se asuperfície de reação local é provida com microestruturasprojetantes, estas podem também afetar as condições óticaspara reflexão interna total.

Contudo, em uma leitora de fluorescência de acordo comesta invenção, a superfície de substrato é provida com meiode supressão de reflexão interna total de modo a liberar osraios refletidos internos totais capturados, ou refratandoos raios, ou pela mudança da diferença de índice derefração entre o material de substrato e o ar. Desse modo,o dispositivo detector será capaz de coletar e detectar umaporção maior da luz de fluorescência emitida, alcançandouma detecção mais segura, e um desempenho mais alto.A Figura 4 é um gráfico ilustrando a dependência daeficiência de excitação no ângulo de incidência deexcitação, mostrando a intensidade da luz fluorescenteemitida em dois ângulos diferentes de incidência dailuminação, isto é, 50 graus e 180 graus a partir da normalda superfície, respectivamente. O gráfico indica aintensidade em ângulos de emissão diferentes no intervaloentre 30 e 60 graus, com a luz aproximando os fluoróforos apartir da superfície de substrato com um ângulo deincidência de 50 graus em relação a normal da superfície, ea intensidade em ângulos de emissão diferentes com umângulo de incidência de 180 graus, isto é, a luz seaproximando os fluoróforos em uma direção paralela comreferida normal da superfície. Aparentemente, a eficiênciade excitação é maior em um ângulo de incidência de 50graus, isto é, um ângulo de incidência que coincidesubstancialmente com o pico de emissão, que é ilustrado naFigura 3.

De acordo com uma concretização desta invenção, umaeficiência de emissão aumentada é alcançada pela seleção doângulo de incidência da radiação de excitação paracoincidir com o angulo de emissão de fluorescência máximo.Isto é efetuado pela disposição de uma fonte de luz paradirecionar raios de luz excitantes em um substrato 1 parailuminar a camada fluorófica 4 com um ângulo de incidênciacoincidindo com o ângulo de emissão máximo. Contudo, osrios de luz impingindo na superfície do substrato 3 nãopodem refratar na superfície com um ângulo que é mais altodo que o ângulo dado pelo relacionamento (1) : sen aref =nl/n2 χ sen αιη. Desde que ain é menor do que 90 graus, senOiin é menor do que 1. A superfície de substrato/ar terátipicamente um valor de nl/n2 sendo 1/1, 55 = 0,65.

Portanto, sen aref < 0,65 e aref não pode exceder 40 graus.

Desde que o ângulo de incidência relativo a camadafluorófica corresponde ao ângulo de refração, o ângulo deincidência também será menor do que 40 graus, que é menordo que o ângulo de incidência desejado de 50 graus. De modoa ampliar o ângulo de incidência dos raios de luzexcitantes, a leitora de fluorescência, de acordo com estaconcretização da invenção, iluminará a superfície desubstrato 3 através do meio de controle de ângulo deincidência provido na superfície de substrato na trajetóriaótica dos raios de luz excitantes impingentes, aumentando,desse modo, adicionalmente, o desempenho pelo alcance de umângulo de incidência ampliado relativo a normal dasuperfície. O meio de controle de ângulo de incidênciaampliará o ângulo de refração, e, conseqüentemente, tambémo ângulo de incidência, pela difração ou refração dos raiosde luz injetados, ou pela mudança das diferenças de índicede refração entre o material de substrato e ar.

A Figura 5 ilustra esquematicamente um arranjo deensaio ótico, compreendendo um substrato de amostra com umacamada fluorófica 4 de, por exemplo, Cy-5™ ouTransFluoSpheres™ (Invitrogen Corporation). A leitora defluorescência compreende uma fonte de luz 5 que ilumina asuperfície de substrato 3, e um dispositivo detector.6, quedetecta luz transmitida através da referida superfície anormal da superfície indicada pela linha tracejada. Aintensidade da luz fluorescente emitida a partir da camadafluorófica 4 tem um pico no ângulo de emissão máximo 8, queé aproximadamente 50 graus relativo a normal da superfícieindicada. Desde que este ângulo é maior do que o ângulocrítico de reflexão interna total, que é aproximadamente 40graus, no lado interno da superfície de substrato 3, umagrande porção da luz fluorescente emitida será retidadentro do substrato, portanto não alcançando o detector 6.

Desse modo, a intensidade detectada pode ser aumentada pelaaplicação do meio de supressão de reflexão interna total nasuperfície de substrato, na trajetória dos raios de luzemitidos, liberando, desse modo, os raios de luz retidos apartir do substrato.

De modo a alcançar uma emissão aumentada, a fonte deluz 5 deve injetar raios de luz excitantes no substrato comum ângulo de incidência 7, relativo a normal da superfícieindicada, substancialmente correspondente ao referidoângulo de emissão máximo 8 de 50 graus. Contudo, esteângulo não pode ser obtido devido ao relacionamento deíndice de refração entre o ar e o material de substrato. Demodo a ampliar o ângulo de incidência e aumentar a emissão,meio de controle de ângulo de incidência pode ser providona superfície de substrato, na trajetória ótica dos raiosde luz injetados.

Em uma leitora de f luorescência de acordo com estainvenção, meios de supressão de reflexão interna total sãoprovidos na superfície de substrato na trajetória ótica daluz fluorescente emitida, de modo a reduzir a reflexãointerna total, e liberar a luz emitida retida,preferivelmente na trajetória do lobo de emissão máximo daluz emitida. Adicionalmente, de modo a aumentaradicionalmente a emissão de fluorescência, meio de controlede luz de incidência pode ser provido na superfície desubstrato na trajetória dos raios de luz excitantes,ampliando, desse modo, o ângulo de incidência da luzexcitante no interior do substrato para alcançar um ângulode incidência coincidindo substancialmente com o ângulo deemissão máximo da luz de fluorescência.

As Figuras 6-8a ilustram esquematicamenteconcretizações de acordo com um primeiro aspecto dainvenção, em que o meio de supressão de reflexão internatotal e o meio de controle de ângulo de incidência sãoconfigurados para difratar ou refratar os raios de luz emuma direção desejada. 0 meio de supressão de reflexãointerna total e o meio de controle de ângulo de incidênciacompreendem uma estrutura de alívio 9 aplicada nasuperfície de substrato 3 do substrato de amostra, natrajetória ótica dos raios de luz fluorescentes emitidos, edos raios de luz excitantes. A estrutura de alívio desuperfície é designada para ser difrativa ou refrativa, epode compreender, por exemplo, um reticulo ou uma estruturade faceta, proporcionando uma superfície na qual os raiosde luz difratarão ou refratarão nas direções desejadas.

A Figura 6 ilustra uma primeira concretizaçãoexemplar, em que o meio de supressão de reflexão internatotal e o meio de controle de ângulo de incidênciacompreendem uma estrutura de alívio de superfície 9,dividida em três seções, das quais a primeira seção 11constitui o meio de controle de ângulo de incidênciacompreendendo uma seção de entrada formando um canalinterno designado para admitir raios de luz excitantes nosubstrato com um ângulo de incidência adequado, e a seçãoexterna 12 constitui o meio de supressão de reflexãointerna total que forma seções de saída que permitem que osraios de luz de fluorescência com um ângulo excedendo oângulo crítico para reflexão interna total sejamtransmitidos através da superfície de substrato. As seçõesde saída 12 são designadas para liberar raios de luzfluorescente emitidos tendo um ângulo de emissão ambosabaixo e acima do ângulo crítico para reflexão internatotal a partir do substrato, e a seção de entrada 11 édesignada para ampliar o ângulo de incidência dos raiosexcitantes no interior do substrato, para exceder o ângulode refração dado pelo relacionamento entre os índices derefração do ar e do substrato.

A posição da seção de entrada e das seções de saída,respectivamente, é preferivelmente adaptada ao local dosfluoróforos na superfície de reação local, por exemplo,pela localização da seção de entrada 11 diretamente sob osfluoróforos, visto que a luz fluorescente é emitida com umabaixa intensidade em pequenos ângulos de emissão 8, e pelalocalização das seções de saída 12 para circundar a seçãode entrada, especialmente na trajetória do lobo de emissãomáximo da luz fluorescente.

Uma vantagem adicional com esta invenção é que umaárea superficial da área de reação local pode ser analisadapor somente detecção de luz fluorescente emitida de umaárea limitada específica da estrutura de alívio desuperfície, ou pela aplicação do meio de supressão dereflexão interna total para somente cobrir uma árealimitada específica da superfície de substrato.

Os alívios de superfície podem ser produzidos, porexemplo, por litografia de feixe-e, máquinas de comando deretículo, métodos de interferência holográfica, desvio deponto de diamante, micro-usinagem de silício, etc, e aestrutura de alívio pode, por exemplo, ser senoidal,triangular, ou trapezoidal. 0 alívio de superfície pode sertransferido para um substrato de polímero por métodos dereplicação de uma estrutura mestre, similar a moldagem deinjeção. Os alívios de superfície podem, por exemplo, seremformados como modelo uni- ou bi-dimensional de facetas, quepodem ser designadas para transmitir os raio de luz não-desviados, ou para focalizar a luz emitida no dispositivodetector.

A Figura 7 ilustra uma estrutura de faceta, tendo oângulo de faceta a, profundidade D, e passo P, do qual aprofundidade e passo estão na faixa de subum, até váriascentenas de um. Se uma fonte de luz coerente, por exemplo,um laser, é usada, o alívio de superfície será de naturezadiferente. Se uma fonte de luz não-coerente, por exemplo,um LED, é usada, o alívio de superfície será de naturezarefrativa.

Os raios de luz emitidos a partir dos fluoróforosimpingirão na superfície de substrato com um ângulo deincidência que varia sobre a superfície de · substratodependendo do ângulo de emissão, e na posição relativa aosfluoróforos, por exemplo, de uma linha de fluoróforoslocalizada diretamente acima de um canal interno 11,ilustrado na Figura 6. Portanto, de acordo com umaconcretização adicional da estrutura de alívio, o desenhoda estrutura difrativa ou refrativa é disposto para variarsobre a superfície da seção de saída, em correspondênciacom o ângulo de incidência dos raios de luz emitidosimpingentes, de modo a aperfeiçoar adicionalmente a funçãode supressão de reflexão interna total.

De acordo com uma concretização adicional de umaleitora de fluorescência, em que a posição da fonte de luzé fixada relativa ao substrato, o desenho da estruturadifrativa ou refrativa é disposto para variar sobre asuperfície da seção de entrada em correspondência com adistribuição de intensidade do feixe de luz excitante, oude modo a alcançar focalização da luz excitante.

A Figura 8a é uma vista em seção transversal de umsubstrato de amostra, com uma camada fluorófica 4 e umasuperfície de substrato provida com uma estrutura de alíviode superfície 9, da qual uma seção está funcionando comomeio de supressão de reflexão interna total, e outra seçãoestá funcionando como meio de controle de ângulo deincidência, através do qual os raios de luz excitantes eraios de luz emitidos fluorescentes são transmitidos,respectivamente.

A Figura 8b ilustra uma outra concretização de umaleitora de fluorescência de acordo com o primeiro aspecto,mostrando o substrato de amostra de acordo com a Figura 8a,adicionalmente provido com uma lente de coleta de luz 13posicionada para receber a luz fluorescente transmitidaatravés do alívio de superfície 9, de modo a aumentar aintensidade da luz emitida que alcança o dispositivodetector (não ilustrado) e, desse modo, aperfeiçoandoadicionalmente o desempenho.

A Figura 9 ilustra esquematicamente uma leitora defluorescência 10, adequada para um arranjo de ensaio óticocompreendendo um substrato de amostra 1 provido com umacamada fluorofórica 4, de acordo com um segundo aspecto dainvenção, em que o meio de supressão de reflexão internatotal compreende um corpo de coleta de luz 15 de ummaterial adequado, por exemplo, de um material poliméricoou vidro. De acordo com um primeiro aspecto, o corpo decoleta de luz 15 tem um índice de refração que correspondea, ou é maior do que, o índice de refração do material desubstrato. O corpo de coleta de luz está posicionado emcontato físico com a superfície, preferivelmente em contatooticamente unido, de modo a "abrir para cima" na superfíciede substrato, e permitir que os raios de luz fluorescentestendo um angulo de emissão que excede o ângulo crítico parareflexão interna total escapem do substrato e entrem nocorpo 12. Adicionalmente, a forma do corpo de coleta de luzcoletará e focalizará os raios de luz fluorescentes, porexemplo, por meio de reflexão interna total na superfícieinterna do corpo, para alcançar o dispositivo detector 6,montado no corpo de coleta de luz. Desse modo, o corpo decoleta de luz ilustrado age ambos como supressor dereflexão interna total e como um coletor de luz. Dessemodo, a intensidade de luz fluorescente emitida que alcançao dispositivo detector 6 alimentará, e o desempenho doarranjo de ensaio ótico será aperfeiçoado.

De acordo com um segundo aspecto, o corpo de coleta deluz é provido com um orifício de entrada 14 que funcionacomo um dispositivo de direcionamento de luz, que édisposto para controlar a direção dos raios de luz a partirda fonte de luz para guiar a luz excitante no substrato 1,por exemplo, para alcançar um ângulo de incidênciasubstancialmente coincidente com o ângulo de emissão máximoda luz fluorescente. As propriedades óticas do corpo decoleta de luz 15 permitem que os raios de luz excitantesentrem no substrato com um ângulo de incidência apropriadorelativo à camada fluorófica provida na superfície dereação local. Desse modo, a camada fluorófica é maisfavoravelmente excitada, e mais luz fluorescente seráemitida, aperfeiçoando adicionalmente, desse modo, odesempenho do arranjo de ensaio ótico.

De acordo com outras concretizações, o corpo de coletade luz 15 é provido com um ou mais orifícios de saída (nãoilustrados na figura), dispostos para, desse modo,funcionarem como um despejo de feixe para raios de luzexcitantes especularmente refletidos.

A Figura 10 ilustra esquematicamente uma leitora defluorescência adequada para um arranjo de ensaio óticocompreendendo um substrato de amostra 1 provido com umacamada fluorófica 4, de acordo com um terceiro aspectodesta invenção, em que o meio de supressão de reflexãointerna total 16 é configurado para mudar a diferença deíndice de refração na superfície, por compreender umacamada oticamente úmida de um material adequado. Desde quesen α in (TiR) = n2/nl, conforme se segue a partir dorelacionamento (1) acima, mais luz de fluorescência podeser transmitida através da superfície se a diferença deíndice de refração é reduzida, tal que n2/nl é aumentado.

De acordo com uma primeira concretização, a leitora defluorescência compreende uma fonte de luz 5, um detector 6e um dispositivo de lente 17, que é posicionado parafocalizar luz fluorescente emitida no detector 6. Odispositivo de lente 17 é provido com meio de supressão de reflexão interna total 16 compreendendo uma camada de ummaterial adequado, tendo um refrativo, posicionado emcontato físico com a superfície de substrato 3. 0 materialda camada é preferivelmente um polímero macio, por exemplo,silicone, epóxi, poliuretano ou acrilato, que é aplicadocomo uma camada oticamente úmida na superfície dodispositivo de lente 17, com nenhum ar entre a camada e asuperfície. Desse modo, os raios de luz que se propagampara a lente não passarão qualquer camada de ar, o quefaria com que perdas de reflexão ocorressem em ângulosaltos. Uma vantagem adicional com a seleção de um materialpolimérico macio é que ele é capaz de formar uma camadaoticamente úmida em uma superfície que não é completamenteconstante ou plana. Adicionalmente, o material da camada éselecionado para ter propriedades de transmissão de luzadequadas, por exemplo, baixa fluorescência e baixa difusãodos raios de luz emitidos ou excitantes transmitidos, e aespessura da camada 16 pode estar entre uns poucos um e unspoucos mm. Um valor adequado do índice de refração dacamada é entre os valores do índice de refração do materialde substrato polimérico e do dispositivo de lente,respectivamente, o índice de refração do dispositivo delente sendo o maior. A camada oticamente úmida de supressãode reflexão interna total 16 provida em contato físico coma superfície de substrato 3 libera os raios defluorescência de serem retidos no substrato, e capacita umaporção maior dos raios emitidos de serem coletados pelodetector 6.

A fonte de luz 5 é disposta para iluminar a superfíciede substrato 3 do substrato de amostra 1, e o dispositivodetector 6 é disposto para detectar luz florescente emitidaa partir da camada fluorófica 4 na superfície de reaçãolocal do substrato de amostra, e transmitida através dasuperfície de substrato 3. A fonte de luz 5 injeta raios deluz excitantes no substrato, e o ângulo de missão máximo daluz florescente normalmente excede o ângulo para reflexãointerna total. Contudo, a camada oticamente úmida 16 éaplicada como um meio de supressão de reflexão internatotal no dispositivo de lente 17 de modo a aumentar aintensidade da luz que escapa através da superfície peloaumento do ângulo para reflexão total.

De acordo com uma concretização alternativa, nãoilustrada na figura, a camada oticamente úmida 16 éaplicada diretamente em um dispositivo detector 6, no casodo dispositivo detector ser adaptado para coletar a luzemitida sem qualquer meio de focalização. Preferivelmente,o disposi tivo detector e posicionado tal que a camadaoticamente úmida e provida em contato físico com asuperfície de substrato 3.

Adicionalmente, a camada oticamente úmida 16 podecobrir substancialmente a lente total 17 ou dispositivodetector 6, ou alternativamente, uma parte adequada dasuperfície do detector 6 ou lente 17, dependendo daconfiguração do arranjo de ensaio ótico.

De acordo com uma concretização alternativa, nãoilustrada na figura, meio de controle de ângulo deincidência é aplicado na superfície de substrato 3, de modoa ampliar o ângulo de incidência dos raios de luzexcitantes relativos à normal da superfície pela mudança dadiferença de índice difrativo na superfície. Desde que oângul o de incidência corresponda ao ângulo de refração, queé dado pelo relacionamento sen aref = nl/n2 χ sen ain, umamudança na diferença de índice de refração afetará o ângulode incidência.

O meio de controle de ângulo de incidência, de acordocom esta concretização, compreende uma camada oticamenteúmida de um material, tendo um índice de refração adequado,aplicado à superfície de substrato na trajetória ótica dosraios de luz excitantes injetados. Se o índice de refraçãoda camada oticamente úmida é maior do que o índice derefração do ar, nl/n2 alimentará, que resultará em um senaref e em um ângulo de incidência ampliados. 0 ângulo deincidência resultante pode preferivelmente coincidir com oângulo de emissão máximo do fluorescente, tal que mais luzfluorescente será emitida. A camada oticamente úmida pode,alternativamente, ser aplicada na superfície de umdispositivo de direcionamento de luz (não ilustrado nafigura) disposto para controlar a direção dos raios de luzexcitantes.

De acordo com um quarto aspecto da invenção, o meio desupressão de reflexão interna total compreende ambos umaestrutura de alívio de superfície 9, de acordo com oprimeiro aspecto da invenção, conforme descrito comreferência às Figuras 6-8, e um corpo de coleta de luz 15,de acordo com o segundo aspecto, conforme descrito comreferência à Figura 9. O corpo de coleta de luz estápreferivelmente localizado em proximidade à superfície desubstrato, por exemplo, a uma distância menor do queaproximadamente 1 mm a partir da superfície. Pelacombinação de uma estrutura de alívio de superfície 9 e umcorpo de coleta de luz 15, uma supressão aperfeiçoada dareflexão interna total é alcançada, enquanto uma coletaaperfeiçoada da luz emitida é provida por meio do corpo decoleta de luz.

De modo a adicionalmente aumentar o desempenho doarranjo de ensaio ótico, uma leitora de fluorescência,implementada de acordo com qualquer dos aspectos dainvenção, conforme descrita acima, é provida com filtroadequado, por exemplo, filtro espectral e filtros depolarização, de modo a impedir qualquer luz excitante dealcançar o detector. Desde que uma parte dos raios de luzexcitantes será refletida, transmitida através dosubstrato, e liberada a partir da superfície de substrato aser detectada pelo dispositivo detector, o dispositivodetector é preferivelmente provido pelos filtros espectraisque removem os comprimentos de onda dos raios de luzexcitantes. Contudo, o espectro dos raios de luzexcitantes, que pode ser luz de, por exemplo, um diodo delaser ou um diodo de emissão de luz (LED) , normalmente temuma calda que se estende na região de comprimento de ondada luz fluorescente emitida, que depende do tipo defluoróforos na camada fluorofica. Desde que os comprimentosde onda da luz fluorescente não possam ser removidos pelosfiltros detectores, a fonte de luz excitante épreferivelmente provida com filtros espectrais que removema calda. Desse modo, de acordo com concretizaçõesadicionais exemplares da leitora de fluorescência, odetector é provido com filtros espectrais que removem oscomprimentos de onda dos raios de luz excitantes e sequaisquer outras fontes de luz indesejadas, e a fonte deluz é provida com filtros espectrais que removem oscomprimentos de onda coincidentes com a luz fluorescente.Portanto, a freqüência de corte do meio de filtragem dodetector tem que ser adaptado à freqüência de corte do meiode filtragem de fonte de luz, evitando qualquersobreposição entre as faixas de comprimento de onda da luzexcitante e a luz detectada, aperfeiçoando, desse modo,adicionalmente, a eficiência da leitora de fluorescência.

De modo a impedir qualquer luz excitante de alcançar odetector, outra concretização exemplar da leitora defluorescência é disposta para uso diferente, colocadaortogonalmente, em planos geométricos para a luz excitantee para a medição da luz fluorescente emitida, por exemplo,um plano geométrico yz para a excitação, e um planogeométrico xz para a medição da emissão.

De acordo com uma concretização adicional da leitorade fluorescência, os raios de luz excitantes podem serimpedidos de alcançar o detector pela provisão da fonte deluz, se necessário, e o detector com filtros depolarização. Se o substrato de amostra tem uma baixa bi-refringência, uma composição exemplar seria alinhar os doispolarizadores perpendicularmente um com o outro. Dessemodo, apenas luz fluorescente polarizada em paralelo com ofiltro de polarização do detector seria detectada.

Alternativamente, se a bi-refringência é variante e nãodesprezível, um dos polarizadores tem que ser girado paraum ângulo adequado para remover a luz excitante,alcançando, desse modo, um desempenho adicionalaperfeiçoado da leitora de fluorescência.

Desse modo, pela provisão de uma leitora defluorescência de varredura ou de imagem com meio desupressão de reflexão interna total, meio de controle deluz incidente, lentes e dispositivos de direcionamento deluz, bem como filtragem espectral e/ou de polarização,conforme descrito acima, um arranjo de ensaio ótico de altodesempenho pode ser alcançado.

Contudo, a invenção não é restrita às concretizaçõesdescritas nas figuras, mas pode ser variada livrementedentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims

1.- Leitora de fluorescência (10) para um substrato deamostra (1) tendo uma superfície de reação local (2) e umasuperfície de substrato oposta (3), a leitora defluorescência compreendendo uma fonte de luz excitante (5)posicionada para injetar raios de luz excitantes nasuperfície de substrato (3), e um dispositivo detector (6)posicionado para detectar a luz fluorescente emitida apartir da superfície de reação local e transmitida atravésda superfície de substrato, caracterizada pelo fato de quereferida superfície de substrato (3) é provida com meios desupressão de reflexão interna total (12, 15, 16)localizados na trajetória ótica da luz de fluorescenteemitida para aumentar a transmissão através da superfíciede substrato para detecção pelo dispositivo de detecção (6).

2.- Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que referidomeio de supressão de reflexão interna total é disposto paraliberar luz fluorescente emitida retida no interior dosubstrato (2) para detecção pelo dispositivo de detecção (6).

3.- Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de quereferida fonte de luz (5) é disposta para injetar raios deluz excitantes na superfície de substrato (3) com um ângulode incidência (7) relativo à normal da superfície de reaçãolocal coincidindo substancialmente com o ângulo de emissãomáxima (8) da luz fluorescente emitida.

4.- Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fatode que referida superfície de substrato (3) é provida commeio de controle de ângulo de incidência (11) localizado natrajetória ótica dos raios de luz excitantes.

5.- Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 4, caracterizada pelo fato de que referidomeio de controle de ângulo de incidência (11) compreendeuma seção de entrada estruturada de alívio de superfície(9) designada para admitir luz excitante no substrato comum ângulo de incidência alargado (7) em relação à normal dasuperfície local de reação.

6.- Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de quereferida seção de entrada estruturada de alívio desuperfície (11) compreende uma estrutura difrativa.

7.- Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de quereferida seção de entrada estruturada de alívio desuperfície (11) compreende uma estrutura refrativa.

8.- Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fatode que referido meio de supressão de reflexão interna totalcompreende uma seção de saída estruturada de alívio desuperfície (12) designada para difratar ou refratar osraios de luz fluorescentes emitidos fora do substrato.

9.- Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que referidaseção de saída (12) é designada para focalizar os raios deluz emitidos.

10.- Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de quereferida seção de saída estruturada de alívio de superfície(12) compreende uma estrutura difrativa.

11.- Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de quereferida seção de saída estruturada de alívio de superfície(12) compreende uma estrutura difrativa.

12.- Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações 8-11, caracterizada pelo fato de queo desenho da estrutura de alívio de superfície é dispostopara variar sobre a superfície da seção de saída (12) emcorrespondência com a variação do ângulo de emissão (8) daluz fluorescente infringente.

13.- Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações 8-12, caracterizada pelo fato de quea posição e extensão da seção de saída (12) determinam àposição e extensão da área de reação local analisada.

14.- Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fatode que um dispositivo de lente de coleta de luz (13) estáposicionado para receber a luz fluorescente emitidatransmitida através da superfície de substrato.

15. - Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações 8-13, caracterizada pelo fato de queum corpo de coleta de luz (15) está localizado emproximidade a uma seção de saída estruturada de alívio desuperfície (9) provida na referida superfície de substrato.

16. - Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de queo meio de supressão de reflexão interna total compreende umcorpo de coleta de luz (15) posicionado em contatooticamente úmido com referida superfície de substrato.

17. - Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de quereferido corpo de coleta de luz (15) é designado paracoletar e transmitir luz por meio de reflexão internatotal.

18. - Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações 15-17, caracterizada pelo fato deque referido corpo de coleta de luz (15) é substancialmentede forma elipsóide.

19. - Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações 15-18, caracterizada pelo fato deque referido corpo de coleta de luz (15) é provido com umorifício de entrada (14) para a luz excitante.

20. - Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações 15-19, caracterizada pelo fato deque referido corpo de coleta de luz (15) é provido com pelomenos um orifício de saída.

21.- Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações 16-20, caracterizada pelo fato deque referido corpo de coleta de luz (15) tem um índice derefração que corresponde substancialmente a, ou é maior doque, o índice de refração do substrato.

22.- Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de quereferido meio de supressão de reflexão interna totalcompreende uma camada oticamente úmida tendo um índice derefração adequado.

23.- Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 22, caracterizada pelo fato de que pelo menosuma porção de referida camada oticamente úmida é fixada aum disposi tivo de lente (17) disposto para focalizar a luzfluorescente emitida no dispositivo detector (6) .

24.- Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 23, caracterizada pelo fato de que referidacamada oticamente úmida (16) tem um índice de refração queé mais alto do que o índice de refração do substrato (1), emais baixo do que o índice de refração do dispositivo delente (17).

25.- Leitora de fluorescência, de acordo com areivindicação 22, caracterizada pelo fato de que pelo menosuma porção de referida camada oticamente úmida é fixada aodispositivo detector (6).

26.- Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de quereferido meio de controle de angulo de incidênciacompreende uma camada oticamente úmida tendo um índice derefração adequado.

27. - Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações 22-26, caracterizada pelo fato deque referida camada oticamente úmida (16) compreende ummaterial polimérico macio.

28. - Leitora de fluorescência, de acordo com qualquerlima das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fatode que referido dispositivo detector (6) é provido com meiode filtragem espectral disposto para impedir detecção doscomprimentos de onda da luz excitante.

29. - Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fatode que referido dispositivo detector (6) é provido com meiode filtragem de polarização.

30. - Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fatode que referida fonte de luz (5) é provida com meio defiltragem espectral disposto para impedir transmissão doscomprimentos de onda que coincidem com a emissão defluorescência.

31. - Leitora de fluorescência, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fatode que a excitação e a medição da emissão são realizadas emplanos geométricos diferentes.

32. - Uso de uma leitora de fluorescência de acordo comqualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadopelo fato de ser em um arranjo de ensaio ótico.

33.- Substrato de amostra (1) com uma superfície dereação local (2) e uma superfície de substrato oposta (3),caracterizado pelo fato de que referido substrato deamostra (1) é adaptado para uma leitora de fluorescência deacordo com qualquer uma das reivindicações 1-31.

34.- Substrato de amostra, de acordo com areivindicação 33, caracterizado pelo fato de que éproduzido de um material polimérico.

35.- Substrato de amostra, de acordo com areivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que asuperfície de reação local (2) é disposta para formarlinhas e/ou pontos de fluoróforos.

36.- Substrato de amostra, de acordo com qualquer umadas reivindicações 33-35, caracterizado pelo fato de que asuperfície de reação local (2) é provida com um modelo demicroestruturas projetantes.

37.- Substrato de amostra, de acordo com areivindicação 36, caracterizado pelo fato de que referidasmicroestruturas projetantes compreendem micro-postes quecapacitam um fluxo capilar.

38.- Substrato de amostra, de acordo com qualquer umadas reivindicações 33-37, caracterizado pelo fato de que asuperfície de substrato (3) é provida com uma seção desaída estruturada de alívio de superfície (12) configuradapara suprimir a reflexão interna total de raios de luz defluorescência emitidos.

39.- Substrato de amostra, de acordo com qualquer umadas reivindicações 33-3 8, caracterizado pelo fato de que asuperfície de substrato (3) é provida com uma seção deentrada estruturada de alívio de superfície (11)configurada para ampliar o ângulo de incidência (7) dosraios de luz excitantes.

40. - Substrato de amostra, de acordo com qualquer umadas reivindicações 38 ou 39, caracterizado pelo fato de queo alívio de superfície é uma estrutura difrativa.

41. - Substrato de amostra, de acordo com qualquer umadas reivindicações 3 8 ou 39, caracterizado pelo fato de queo alívio de superfície é uma estrutura difrativa.