DK166639B - Fremgangsmaade og apparat til bestemmelse af en analyt og apparat til maaling af kinetiske parametre - Google Patents

Description

i

DK 166639 B

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af en bølgeleder til bestemmelse af koncentrationen af et stof (eller en analyt) i opløsning i en væske ved at måle hastigheden (koncentrationsafhængig) for dets kombination 5 med eller dissociation fra en specifik reaktant derfor, f.eks. en konjugatdel i en kompleksdannelsesreaktion. Mere specifikt angår opfindelsen en metode til bestemmelse af en analyt i opløsning, ved hvilken fremgangsmåde der dannes et lag af et analytreaktantprodukt på overfladen 10 af en belyst bølgeleder, der bærer et totalt og flere gange reflekteret elektromagnetisk bølgesignal, hvilket produkt ændrer de optiske egenskaber for bølgelederen, hvorved signalet modificeres, hvilken modifikation måles og anvendes til bestemmelsen. Opfindelsen kan således 15 bruges til en række forskellige kemiske og biologiske systemer og særlig godt til bestemmelsen af bioaktive molekyler i lav koncentration ved immunoprøvetypereaktioner, f.eks. reaktioner baseret på dannelsen af komplekser ved tilsætning af antistof (AB) til antigen (AG) molekyler 20 eller vice-versa.

Opfindelsen angår også et apparat til udøvelse af fremgangsmåden .

25 Der findes allerede mange metoder på området til opnåelse af ovennævnte bestemmelse baseret på den klassiske teknik i biokemien. F.eks. kan der anvendes kemiske reaktioner til detekering af en given analyt på en række forskellige måder. Klassiske systemer omfatter titrering 30 eller reaktion med et specifikt reagens, som giver et farvet produkt eller et bundfald. Kravet til dette detekteringssystem er, at reagenset er i en ækvivalent mængde eller i overskud, så at produktet kan måles ved konventionel fotometri, uklarhed, kolorimetri, etc. Måle-35 systemet vælges efter størrelsen af det signal, der skal måles. Ved meget lave analytkoncentrationer kan detektering blive vanskelig, og større skelnen kan f.eks. opnås 2

DK 166639 B

ved at koncentrere reaktionsproduktet lokalt, f.eks. ved opløsningsmiddelekstraktion, centrifugering, etc., hvilket kan blive langsommeligt og kostbart. Ovennævnte ulempe blev imidlertid stærkt reduceret, 5 da der i 1960 fremkom et praktisk system til måling af biokemiske analytter i yderst lave koncentrationer. Dette mikroanalytiske system (radioimmuno-prøve) drog fordel af egenskaberne for biologiske systemer til molekylbestemmelse (antigen-antistof-10 reaktioner) og den ekstreme følsomhed for radio aktive målinger (radioaktiv isotopmærkning). Et væsentligt træk ved dette gennembrud var begrebet -begrænset reagens prøve med spormærke, der blev anvendt til måling af fordelingen af analytten, der 15 skulle måles, mellem de reagensbundne dele og de frie dele (se f.eks. Review Paper "The theoretical aspects of saturation analysis" R.P. Ekins i "In vitro procedures u/ith radioisotopes in medicine", International Atomic Energy Agency, juni 1970). Skønt 20 immunoprøver først blev beskrevet som begrænsede reagensprøver, blev lige så praktiske systemer senere beskrevet for reagensoverskudsmetoder (se Miles et al., Biochem. J. 108, 611 (1968)).

Foruden volumetrisk og gravimetrisk analyse omfat-25 ter de omhandlede metoder yderst følsomme metoder, såsom kolorimetri, spektroskopi og radioaktive målinger. Mange af sådanne teknikker bliver imidlertid nu forældede, da de er langsommelige, kræver en forholdsvis stor mængde analyt for at være nøjagtige, 30 er baseret på reagenser, der er vanskelige at frem stille og at opbevare, eller som kræver kostbart og uhåndterligt udstyr og yderst veluddannede operatører.

Der er således nu en tendens til at udvikle mere forfinede metoder, som kræver mindre reagens, og som kan 35 udføres sikkert, effektivt og akkurat af moderat ud-

DK 166639B

3 dannet personale. Blandt sådanne metoder, som er blevet offentliggjort på det seneste, involverer nogle anvendelsen af optiske bølgeledere indeholdende reaktanten. Til analyse kontaktes bølgelede-5 ren med analytten i opløsning, hvorved der forekom mer reaktion med reaktanten på bølgelederen med den konsekvens, at sidstnævntes optiske egenskaber modificeres. Måling af sådan modificering giver derpå de krævede data for analytbestemmelsen.

10 Ifølge læren i nogle nylige referencer (f.eks.

US patentskrift nr. 4 050 895 (Hardy) og W0 81 00 912 (Buckles)) kan lederne (Buckles) bestå af en porøs lystransmitterende kerne imprægneret med reaktanten, .ind i hvilken analytten spredes under reak- 15 tionen. Eller, bølgelederen kan (Buckles eller

Hardy) bestå af en ikke-porøs lystransmitterende kerne (f.eks. glas) overtrukket med et porøst eller permeabelt overtræk imprægneret med reaktanten, og ind i hvilket analytten vil sprede sig. I et speci-20 fikt tilfælde anvendt til immunoprøve (Hardy, eks.· 3) overtrækkes endvidere en stavformet bølgeleder med et antistoflag bundet af diphenyldimethoxy-silan og omsat med polystyren-latexkugler behandlet med et antigen. De antigenbehandlede perler vil der-25 på hænge ved lederen og modificere lyssignaloutput'et for denne, hvilken variation anvendes til den analytiske bestemmelse.

Ovennævnte teknikker har værdi, men de er ikke gode at anvende til nogle typiske analyser, der involve-30 rer reaktionskinetik. Det er faktisk velkendt, at hastigheder kan give væsentlige analytiske data, specielt i tilfælde af automatiserede prøvesystemer, og da reaktioner forekommende inde i permeable eller porøse legemer altid involverer en indledende dif-35 fusion af analytten ind i legemet, og da diffusions processer generelt er meget langsommere end kemiske

DK 166639 B

4 reaktioner, kan hastigheden af sidstnævnte ikke måles direkte; i et sådant tilfælde kan kun opnås ligevægtsdata. I den kendte teknik undgås ligeledes udførelses-former involverende anvendelse af en transparent kerne 5 overtrukket med et reagenslag eller -hylster med et brydnings-index mindre end indexet for kernen af den grund, at der kunne ventes at resultere lav følsomhed, hvilket er rigtigt. I sådan et tilfælde vil størstedelen af lyssignalet indført i indgangen af lederen faktisk vandre 10 inde i kernen ved en total reflektionsproces, og i et sådant tilfælde vil interaktionen af signalet med reaktionsprodukterne i hylsteret, dvs. uden på kernen, kun være mindre, hvilket almindeligvis accepteres.

Følgelig blev der i den kendte teknik draget omsorg for, 15 at brydningsindexet for hylsteret r\^ (hvor der ikke finder nogen reaktion sted) altid er større end inde-xet (n^) for kernen for at tillade det lys, der kastes ind i kernen ved input at brydes ind i hylsteret, og fra det punkt at fortsætte med at vandre inde i hyl-20 steret lige til output for lederen. I modsætning til en del af den tidligere kendte litteratur vil outputsignalet nu (resultatet af det lys, der blev modificeret ved at passere gennem produkterne fra reaktionen:·, reaktant + analyt inde i hylsteret) ikke særlig let 25 gå ind i kernen igen og nå dens bageste ende (denne opførsel skyldes elementære optiske principper, der vil blive diskuteret nærmere i det følgende), og til målingerne må output-lysdetektoren være anbragt meget nær ved prøvesonden (dvs. bagenden af hylsteret). Et sådant 30 arrangement er ikke altid praktisk konstruktionsmæssigt, navnlig når lederen (plus hylsteret) er dyppet ned i en væske til måling af en analyt i opløsning.

Den foreliggende opfindelse afhjælper disse ulemper, da den ikke involverer nogen porøs kerne eller noget 35 hylster og ingen diffusion gennem en matrixstruktur (hylster eller kerne). Ved den foreliggende opfindelse

DK 166639 B

5 bliver det lyssignal, der vandrer inde i bølgelederen ved total reflektion, heller ikke- hverken transmitteret af eller ledt inde i reaktant-analytproduktet; kun den kortvarige bølgekomponent af signalinput'et 5 (dvs. den del af bølgen, der strækker sig ind i området uden for kernen i tilfælde af total reflektion) involveres. Da virkningsintervallet for den kortvarige bølge således kun er en brøkdel af bølgelængden (V. er den mængde produkt, der behøves (reaktant + 10 analyt), yderst lille, og der kan opnås den yderste følsomhed (med hensyn til den totale mængde stof, der skal analyseres).

Således tilsigtes det med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde til hurtig og akku-15 rat bestemmelse af koncentrationen af et kemisk stof eller en analyt i opløsning i en væske med en optisk bølgeleder. Det tilsigtes også med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en analytisk metode til bestemmelse af biologiske analytter med stor speci-20 ficitet og følsomhed. Derudover tilsigtes det med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en analytisk metode, som let kan udføres af moderat uddannet personale, og som kun kræver en mindre mængde analytisk opløsning. Endvidere tilsigtes det med den forelig-25 gende opfindelse at tilvejebringe et alsidigt og automatiseret måleapparat til udførelse af ovennævnte metode .

Alt dette og andet, som er forklaret i det følgende, opnås på passende måde ved hjælp af fremgangsmåden, der er 30 suTtiariseret i krav 1, og son omfatter anvendelsen af en bølgeleder— kerne, hvis brydningsindex (ηχ) er valgt højere end in- dexet (n2) for analytopløsningen og således, at forholdet ηχ/η2 bevirker, at penetrationsdybden i opløsningen for det elektromagnetiske felt, der er for- 6

DK 166639 B

bundet med det lyssignal, der vandrer i lederen, praktisk taget svarer til eller overskrider tykkelsen af laget af analyt-reaktantprodukt. Fremgangsmåden involverer således f.eks. kontakt af en 5 del af en belyst (ikke-porøs) bølgelederkerne overtrukket med en tynd film af en reaktant, der er specifik for en analyt, med en opløsning af analyt-ten, som derved gør det muligt for analytten at reagere med reaktanten i filmen og danne et reaktant-10 analytproduktlag, iagttage de tilsvarende optiske ændringer i tidens løb, som forekommer for lyssignalet, der vandrer gennem kernen, ved output for kernen som følge af produktlagsdannelsen og sammenligne hastighedsdata opnået med standardreference-15 data opnået på lignende måde ud fra kalibrerings-prøver af analytten, idet brydningsindex (n^) af kernen er større end indexet (n£) af opløsningen, og tykkelsen af filmen er kun en brøkdel af signalbølgelængden.

20 Det vil på dette trin være nyttigt at tilvejebringe en eller anden form for generel information øm transmissionen af lys i en kerne ved den såkaldte totaireflektionsproces. Dette kan bedre gøres ved hjælp af en del af den medfølgende tegning, 25 hvorpå fig. 1 skematisk viser den totale reflektionsproces for en tilfældig stråle N ved grænsen mellem et tæt (n^) og et tyndt (n£) medium ved en vinkel Θ større end ©e» den kritiske totalreflektionsvinkel. På den-30 ne figur er Eq begyndelsesstørrelsen af den elektriske feltkomponent for lyset ved en dybde på nul i det tyndere medium, Z er penetrationsaksedybden, og d^ er som defineret i det følgende; R er den reflekterede stråle,

DK 166639 B

7 fig. 2 viser brøkdelen af penetrationsdybden af det elektromagnetiske felt i det tyndere massemedium for total begyndelsesreflektion mod indfaldsvink len for et antal grænseflader; penetrationsdybden er 5 uendelig stor ved den kritiske vinkel og er omkring 1/10 af bølgelængden ved strejfindfald for mediet med det forholdsvis større index. = λ/η^ er bølgelængden i det tættere medium. (Taget fra N.Y. Harrick,

Internal Reflection Spectroscopy, Wiley 1967), 10 fig. 3 viser den indbyrdes virkning mellem en kortvarig bølge og et lag af reaktionsproduktet.

Fysisk indsigt i interaktionsmekanismerne eller de indbyrdes virkningsmekanismer ved en reflekterende overflade kan opnås fra en mere fundamental tilnærmel-15 se ved hjælp af Maxwell’s ligninger. I det foreliggende tilfælde, dvs. reflektion i et tæt medium ved grænsen til et tyndere medium, må følgende spørgsmål besvares:

Hvad er den elektromagnetiske felt fordeling i det tyndere medium ud over den reflekterende grænseflade 20 for den totale indre reflektion* I dette tilfælde eksisterer der en bølgefunktion i det tyndere medium, som udvikles parallelt med grænsefladen. Dets elektriske feltamplitude falder eksponentielt med afstanden fra overfladen (se fig. 1); den kaldes 25 derfor en kortvarig bølge. I det ideelle tilfælde, og hvis det tyndere medium ikke har nogen absorptionsevne i sig selv ved den betragtede bølgelængde, er der ingen nettostrømning af energi ind i det ikke-absorberende tyndere medium, da tidsgennemsnittet for den energi, 30 der er beskrevet af Poynting's vektor (se f.eks. M.

Born & E. Wolf, "Principles of Optics" Pergamon Press (1959)) nul. Matematisk kan det elektriske felt beskrives med eksponentialfunktionen:

Z

8

DK 166639 B

E = Eo-e* o?

Penetrationsdybden d^, defineret som den afstand, der kræves for den elektriske feltamplitude for at falde til e-^ af dens værdi ved overfladen, er givet ved λΐ ' dp = -5-5- 2 * (sin V2 5 hvor λ j =λ/η^ er bølgelængden i det tættere medium, og n2_i = n2/n2 er f°rholdet mellem brydningsindex for det tyndere medium og brydningsindex for det tættere medium. Betydningen af disse relationer er vist i fig. 2, hvor penetrationsdybden divideret med 10 den indfaldende og reflekterede bølgelængde λ er afbildet mod indfaldsvinkelen e for en række grænser (dvs. for forskellige forhold n2/ni)· Det skal bemærkes, at penetrationsdybden kun er ca. 1/10 af bølgelængden i de tilfælde, hvor forskellen mellem refraktions-15 indices er stor, dvs. når n2/n^ er lille, hvilket forekommer nær strejfvinkelen (e = 90°). Denne penetration bliver uendelig stor, efterhånden som.fl nærmer sig θ . Ved en fast vinkel er penetrationsdybden større i tilfælde af små indexforskelle (dvs. når 20 n2_i nærmer sig 1). Penetrationsdybden er også proportional med bølgelængden og er derfor større ved længere bølgelængder. Hvis det tætte medium f.eks. er glas (n^=s 1,5, og det tynde medium er en vandig analyt (n2 s 1,3), så er n2/n^ = 0,867, hvilket tilnærmelsesvis 25 svarer til kurve 11 på fig. 2. I dette tilfælde ville penetrationen være ca. 1/3 af bølgelængden ved strejfvinklen, teoretisk uendelig ved den kritiske vinkel 60°), men allerede under 1 ved 65°.

Da E falder eksponentielt, svarer området ud over grænse-30 fladen, i hvilken mængden af energi for interaktion med 9

DK 166639 B

produktet stadig er betydelig, til dybden Z, hvor den elektriske feltstørrelse stadig er en rimelig brøkdel af E , f.eks. en værdi på mindst 0,1 E , bedre, det område, o o i hvilket E er mellem Eq og E0/3. Til optimal interak-5 tionseffektivitet skal tykkelsen af reaktionsproduktfilmen således tilnærmelsesvis svare til dybden af det område. Dette er vist på fig. 3, som viser en indfaldende stråle (N) og en reflekteret stråle (R), nuldybdevektoren Eq for den forsvindende eller kortvarige bølge og en film 10 af produktreagens plus analyt (A), hvis tykkelse tilnærmelsesvis svarer til penetrationsdybden d , hvor E er ca.

Eq/3. I fig. 3 er indflydelsen af brydningsindexet for filmen A ikke betragtet som værende af betydning, fordi tykkelsen af denne film ikke strækker sig ud over dybden 15 af penetrationen af den for kortvarige bølge. Ændringen af brydnignsindex for det tynde medium på grund af væksten af analyt-reaktantfilmen i reaktionsområdet er faktisk så lille, at den tilsvarende ændring af værdien for den kritiske reflektionsvinkel er praktisk taget negli-20 gerbar undtagen for de reflekterende bølgetyper helt nær ved reflektionsvinklen. Støtte for dette synspunkt, som udgør en uventet fordel ved den foreliggende opfindelse frem for den hidtil kendte teknik, kan f.eks. findes i førnævnte N.Y. Harrick reference, p. 51.

25

Et andet punkt, som skal understreges til sammenligning med den hidtil kendte teknik, angår effektiviteten for interaktionen af lyssignalet med reaktionsproduktet. I de klassiske spektrometriske systemer passeres et lys-30 signal gennem en transparent holder indeholdende ana-lytten (bæger eller cuvette), og en del af energien ab sorberes af prøven, hvilket fører til nogen grad af absorption, som måles. Denne metode er dog ikke særlig effektiv, da mængden af analyt skal være forholdsvis stor 35 for at give betydelig interaktion med lyssignalet under 10

DK 166639 B

sædvanlige betingelser. I modsætning hertil er effektiviteten ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvor interaktionen af en kortvarig bølge med en film, hvis tykkelse tilnærmelsesvis svarer til penetrationen af 5 den involverede bølge, betragteligt større, da der er en stærk lysforstærkningsvirkning i interaktionsom-rådet. Som vist f.eks. i den tidligere nævnte Harrick-reference er feltstyrken for den kortvarige bølge inde i interaktionsområdet med analyt-reaktantlaget faktisk meget 10 stærkere end for det indkommende signal. Dette skyldes faktisk den samtidige tilstedeværelse af både indkommende og udgående strålefeltamplituder.

De i det foregående diskuterede optiske fundamentale egenskaber er nyttige for forståelsen af operationsprin-15 cipperne for opfindelsen og henviser til anvendelsen af upolariseret lys. I praksis er det vigtigt at bemærke, at begyndelsesstørrelsen af det elektriske felt ved nuldybden (Eq) er afhængig af polarisationsstadiet for den indfaldende lysbølge. I nogle tilfælde kan polari-20 seret lys med fordel anvendes i stedet for almindeligt lys ved udøvelse af opfindelsen (det vil ses i det følgende, at i tilfælde af måling af signalændringer ved ellipsometri er polariseret lys væsentligt), og i sådanne tilfælde kan forskellige optiske parametre kon-25 trolleres og optimeres for maksimalt respons og maksimal følsomhed; f.eks. kan et valg af en passende indfaldspolarisationsvinkel (f.eks. polarisation parallel med eller vinkelret på indfaldsplanet) foretages til maksimering af Eq.

30 Med henblik på de i det foregående anførte betragtninger kan følgende fordele ved opfindelsen i forhold til kendt teknik fuldt ud vurderes. I tilfælde af et forsøg involverende en særlig specifik reaktant for en analyt vil tykkelsen af produktlaget sædvanligvis blive 11

DK 166639 B

bestemt ved den respektive størrelse af produktmolekylerne. F.eks. i en typisk immunoprøve kan produktlaget bestå af en første film af et antistof og en anden film af et antigen. Tykkelsen deraf kan afhængigt af mole-5 kyltyperne ligge i området fra flere Angstrom (1 Angstrom - 10 m) til flere hundrede Angstrom eller mere. Med henblik på tykkelsen af laget kan brydningsindexet for kernen nu.vælges, og i nogle tilfælde også bølgelængden, således at ovennævnte parametre afpasses i så 10 høj grad som mulig.t. For at give et eksempel herpå, hvis det involverede lag er forholdsvis tyndt, vil kerner med høje brydningsindices blive valgt (f.eks. sapphire, n = .1,8; Silicon, n = 3,4), og hvis foreneligt med de optiske processer, der er involveret, (dvs. absorption, 15 spredning, fluorescens, etc.), vil også kortere bølgelængder blive valgt. Dette vil muliggøre minimering af interaktion for den kortvarige bølge med områder af analytopløsningen dybere end tykkelsen for det mellemrum, hvor den analytiske reaktion finder sted, hvilket 20 således minimerer indflydelsen af uønskede udefra kommende faktorer (baggrundsstøj, tilstedeværelse af urenheder i opløsningen og lignende). Det er indlysendes, at man ikke kan opnå sådanne muligheder ved nogle af de til teknikkens stade hørende metoder. Det skal også 25 bemærkes ved angivelse af forskellene mellem den foreliggende opfindelse og den kendte teknik, hvor tykkelsen af hylsteret strækker sig godt ud over penetrationen af den kortvarige bølge (hvorved brydningsindexet (n^) for hylsteret bliver bestemmende i modsætning til, hvad 30 der sker ved den foreliggende opfindelse), og ved hvilken n2 er større end indexet (n^) for kernen, at det lyssignal, der til at begynde med sendes ind i kernen og reflekteres ind i hylsteret, ikke særlig let går ind i kernen igen og er til stede ved output derfra, som det 35 tilsyneladende menes af nogle (se f.eks. W0 81/00 912).

DK 166639 B

12 Når et lyssignal vandrer ind i et tyndere medium omgivet af et tættere medium, vil refraktion af lyssignalet ind i hylsteret faktisk forekomme. Derpå vil denne brudte bølge reflekteres totalt af den ydre 5 grænse af hylsteret og vil kastes tilbage mod kernen.

Nu, da indexet n^ for kernen er mindre end indexet for hylsteret, vil bølgen gøre en af følgende to ting: hvis indfaldsvinkelen er større end den kritiske vinkel, vil bølgen igen reflekteres og blive endeligt i 10 hylsteret. Hvis indfaldsvinkelen er mindre end den kritiske vinkel, vil bølgen gå gennem kernen og pene-trere på den anden side ind i hylsteret osv. Således vil .en bølge kastet ind i kernen og brudt i hylsteret i intet tilfælde returnere udelukkende i kernen og 15 være tilstede deri ved output fra kernen, med mindre den stadig er omgivet af hylsteret. Dette er perfekt vist i fig. 3B i US patentskrift nr. 4 050 895. Ingen mangler af den slags forefindes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, i hvilken nøgle-lyssignalet 20 kun vandrer inde i kernen og ikke i ydersidelaget indeholdende reaktanten og analytten.

De optiske ændringer, der er involveret i fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan angå forskellige slags fænomener; f.eks. kan følgende fænomener være invol-25 veret: absorption af det lys, dervandrer i kernen; spredning af lyssignalet ved reaktionsproduktet;' fluorescens af reaktionsproduktet efter anslåning med lyssignalet i kernen. Endvidere kan anslåningssig-nalet i kernen være polariseret, og elliptisk polari-30 sations faktorer kan undergå modificering ved den analytiske reaktion og vises. Hver af disse muligheder er omhandlet og beskrevet mere detaljeret i den følgende beskrivelse.

DK 166639B

13

De typer analytiske målinger, som kan udføres ved hjælp af den omhandlede fremgangsmåde, er så mange, at det er praktisk umuligt at opremse dem alle. Der vil imidlertid i det følgende blive givet nogle få eksempler. Før der 5 gås nærmere ind på disse eksempler, vil det imidlertid være nyttigt i nogen grad at redegøre for de grundbegreber, der hører til anvendelsen af opfindelsen til prøver for "begrænset reagens" og "overskudsreagens", der ønskes anvendt i biologisk og diagnostisk analyse. Til dette 10 formål skal vi konventionelt kalde analytten "antigen" AG og reagenset "antistof" AB. Det er unødvendigt at sige, at det omvendte forhold også gælder.

"Overskudsreagens" prøve refererer til tilfælde, i hvilke 15 et overskud af et reagens med hensyn til analytten anvendes. "Begrænset reagens" involverer i alt væsentligt anvendelsen af et system, i hvilket prøvestoffet eller analytten (indeholdende det antigen, der skal måles) behandles med en begrænset mængde af et specifikt reagens (an-20 tistoffet) til opnåelse af et analytreaktantprodukt (f.eks. et AG-AB-kompleks) plus resterende analyt. Når reaktionen får lov at gå til fuldendelse, dvs. hvis prøven skrider frem til ligevægt ("mætningsforsøg"), dvs. det begrænsende konjugatreagens (AB) er mættet med ana-25 lytten, er det nødvendigt før reaktionen (eller i sekvensprøver nogen tid før den endelige ligevægt er nået, dvs. før målingen) at sætte en fastsat mængde af en mærket form for analytten (AG*) til reaktionsblandingen under prøven. I eksemplet med et antigen, der skal prøves for 30 med et antistofreagens, skal forholdet mellem mærket antigen (AG*) og det umærkede antigen (ukendt) forblive det samme i restanalytten, som det var ved starten. Da den kendte mængde anvendt AB vil binde en kendt mængde AG + AG* blanding, er det tilstrækkeligt at bestemme den reste-35 14

DK 166639 B

rende mængde AG* eller AG* bundet til AB (ved hjælp af dets mærke) for at beregne mængden af AG oprindeligt til stede i prøven. For at give et simplificeret eksempel antager man, at prøven indeholder x ækvivalenter af et en-5 zym (AG), der skal måles ved hjælp af en kendt mængde g af et enzymkonjugat (AB), der danner et AG-AB-kompleks (med f.eks. et 1:1 molært forhold af begge komponenter).

Derpå sættes til prøven før reaktionen a ækvivalenter af det samme enzym, som skal måles, men på mærket form 10 (AG*). Under reaktionens forløb forbruges således en del af g ækvivalenter antigen (AG + AG*) af de g ækvivalenter antistof. Nu, efter fjernelse af komplekset fra blandingen,- bestemmes den resterende mængde AG* på konventionel måde. Hvis det ved at subtrahere den målte værdi for res-15 terende AG* findes, at den faktisk anvendte mængde var b ækvivalenter, er det indlysende, da AG og AG* er kemisk identiske og forbruges med samme hastighed, at forholdet mellem forbrugt AG* og forbrugt AG, dvs. b/g-b skal være lig med det oprindelige forhold a/x, hvorfra man kan be-20 regne x = a(q-b)/b.

Denne form for tilnærmelse er fuldt ud tiltalende, skønt i de til teknikkens stade hørende ansøgninger lider den af nogle ulemper, hvoraf en er det almene krav 25 om, at komplekset (blanding af AG*-AB + AG AB) må skilles fra reaktionsmediet, hvilket sommetider er langsommeligt og en mulig fejlkilde. Denne ulempe findes ikke ved den foreliggende opfindelse, fordi det kompleks, der dannes, automatisk fjerner analytten fra opløsnin-30 gen, da den aflejres på bølgelederen. For at illustrere anvendelsen af den foreliggende metode på "prøver af mættethedstypen" må man igen begynde med en bølgeleder, f.eks. en optisk fiber overtrukket med et specifikt antistof AB, som er neddykket i en pufferopløsning og 35 får lov at indtræde i ligevægt dermed. Den ukendte

DK 166639 B

15 mængde af komplementært antigen AG, der skal bestemmes, tilsættes derpå som før, men samtidig med en kendt mindre mængde af det samme antigen mærket med et molekyle med specifikke optiske egenskaber (AG*), 5 f.eks. optisk absorption, fluorescens, etc., som kan detekteres ved den kortvarige bølgeinteraktion ved overfladen af den overtrukne fiber under anvendelse af egnede optiske arrangementer, der vil blive beskrevet nærmere i det følgende. Da mærket og umærket AG 10 er i det væsentlige identisk i reaktivitet over for den AB-overtrukne fiber optisk, men kun det mærkede stof kan bestemmes via dets mærke, vil den tilsyneladende ændring i den optiske egenskab, der detekteres ved fiberen (f.eks. fald i absorbans, hvis der anven-15 des et absorberende mærke) være omvendt proportional med den ukendte koncentration af AG og kan bestemmes med reference til en egnet række kendte standarder.

Denne form for anvendelse er illustreret i et af de efterfølgende eksempler.

20 Her er det nyttigt klart at oplyse om det mærke, der anvendes til måling af den reaktion, der finder sted.

I immunoprøver er det normalt ikke muligt at måle ana-lytten direkte, fordi koncentrationerne af analytter og reagenser er yderst lav. Da ligevægtsblandingen i 25 begrænsede reagensprøver i alt væsentligt kun indeholder overskudsanalyt og en fastsat mængde bundet kompleks, når førstnævnte ikke kan måles direkte, og sidstnævnte er en fastsat mængde, kan der ikke opnås nogen kvantitativ bedømmelse af den oprindelige analytkoncentra-30 tion, selv efter fraskillelse af komplekset og overskudsantigenet. Det tilsatte mærkede sporstof (en lille smule mærket analyt) er nødvendig for at muliggøre måling via mærket efter dets fordeling mellem den bundne del og den frie del.

DK 166639 B

16

Hvis analytten imidlertid har en indre egenskab, der kan detekteres, når den koncentreres lokalt, dvs. in situ fraskillelse og in situ koncentration, f.eks. på overfladen af en optisk fiberprobe, så er tilsætningen 5 af et mærket analytsporstof ikke længere nødvendigt. I den foreliggende opfindelse kan in situ koncentrationen af analyt-reagenskomplekset således muliggøre detektering af analytten uden brug af et mærket sporstof.

Lokal koncentration af analyt-reagenskomplekset vil 10 imidlertid ikke (da mængden af reagens er fast) muliggøre kvantitativ bestemmelse af den oprindelige analyt-koncentration, med mindre reaktionen mellem analyt og reagens måles kinetisk, eller med mindre den totale mængde analyt er mindre end antallet af reagensbin-15 dingssteder. Anvendelse af in situ. adskillelse og koncentrering af det kompleks, der er bundet til analytten, i forbindelse med et følsomt detekterings-system i den kinetiske måde som ved den foreliggende opfindelse muliggør således kvantitativ detektering af 20 analytten i begrænset reagenssystem uden brug af et mærket sporstof.

Hvad angår mærkede systemer kan der skelnes mellem sporstofsystemer, i hvilke der tilsættes en mærket form for analytten i sporstofmængder til reaktionen, 25 og de mærkede reagenssystemer, i hvilke et mærke er knyttet til det specifikke reagens·. Førstnævnte sporstof-reagens anvendes normalt i begrænsede reagensprøver (f.eks. standardradioimmunoprøver), mens sidstnævnte normalt anvendes i overskudsreagensprøver (f.eks.

30 standard sandwichprøver) og kan anvendes i visse former for kinetiske reagensprøver (f.eks. Kronick et al., US patentskrift nr. 3 939 350); mærkede analyt- og mærkede reagenssystemer er egnede i forbindelse med den foreliggende opfindelse, hvis det anvendte mærke

DK 166639 B

17 kan detekteres i et optisk bø1ge]edersys tem (f.eks. absorberende eller fluorescerende mærker).

I det følgende henvises til en anden del af tegningen, 5 hvorpå fig. 4 er et diagram, der viser en første type prøve, der kaldes "direkte" prøvetype, fig. 5 er et diagram, der viser en konkurrerende "begrænset reagens" prøvetype, 10 fig. 6 er et diagram, der viser en indirekte konkurrerende "begrænset reagens" prøvetype.

fig. 7 er et diagram, der viser- en sekventiel "mættet-heds" prøvetype, fig. 8 er et diagram, der viser en "sandwich" prøvetype.

15 Det mest ligefremme prøvetilfælde, hvori opfindelsen kan anvendes, er vist skematisk på fig. 4. Dette kaldes den "direkte" prøvetype. I denne prøve er en bølgelederkerne 1, hvoraf kun en del (med brydnings-index n^) er vist, udstyret med en film af antistof AB, 20 og denne kerne er neddykket i en analytopløsning med et brydningsindex (n^>n2) indeholdende et antigen AG?, der skal bestemmes. Antigenet vil knytte sig til AB-molekylerne med en hastighed, der er proportional med antigenkoncentrationen [AG?] (da mængden af AB-film 25 på kernen er en fast enhed), og når denne hastighed er bestemt, kan den korreleres med standardhastigheder opnået ved at kalibrere AG-op1øsninoer, og [AG?] kan bestemmes. Således kan den mængde AB, der er tilgængelig, være "begrænset", eller den kan være i overskud,

DK 166639B

18 og reaktionen kan gå til en ligevægt. Til detektering af AB-AG-kompleksdannelsen ved hjælp af de optiske ændringer, der forekommer i kernen, kan der anvendes forskellige af de i det foregående nævnte 5 teknikker (dvs. extinction af signalet ved absorption, spredning og fluorescensfænomener, etc.), forudsat at dannelsen af AB-AG danner de påkrævede optiske ændringer. Prøven er således særlig god til store molekyler, der er i stand til at sprede lys, 10 eller som har observerbare egenskaber ved bestemte bølgelængder eller udsender fluorescens under an-slåning ved visse bølgelængder. Hvis sådanne egenskaber mangler,-er prøven af ringe værdi, og en "begrænset reagens" konkurrerende testtype vil være at 15 foretrække anvendt med en mængde mærket AG (AG*) sat til analytten. Dette er vist i fig. 5, i hvilken tegnene (bogstaver og tal) som anvendt er som i fig.

4. I dette forsøg behøver mængden af AG* ikke være kendt, forudsat at den standardiseres (dvs. altid 20 er konstant for et sæt kalibreringskurver og forsøg), da hastighederne · for analytiske reaktioner med forskellige mængder AG? altid vil være. i direkte forhold til AG*/AG?-forholdet (idet man selvsagt husker, at den observerbare optiske ændring i bølgelederen kun skyldes 25 det mærkede reaktionsprodukt AG*-AB).

I en anden meget nyttig variation af "begrænset reagens" prøvetypen er bølgelederkernen overtrukket med en kendt eller fast mængde af samme antigen (foretruk-kent på ren form), som skal bestemmes i den analy-30 tiske prøve, hvorefter kernen bringes i kontakt med prøven og samtidig tilsættes en fast mængde frit, de-tekterbart antistof. Dette er vist i fig. 6, hvori tegnene er de samme som anvendt i det foregående. Det ses på figuren, at referencemængden af antistof AB 35 samtidig vil reagere med reference AG på kernen og med

DK 166639 B

19 AG?, der skal måles. Den observerede hastighed (som afbildet ved de optiske ændringer foregående i kernen) vil således stå i forhold til AB/AG?-molforholdet, og korrelation med standardreferencehastighedskurver 5 vil give de ønskede resultater. I dette tilfælde må AB selvsagt have observerbare egenskaber i den optiske metode, der anvendes til prøven, dvs. AB kan have absorbans ved egnede -^-værdier eller være tilpasset til at sprede lys eller lignende. Alternativt, hvis AB ikke direkte 10 er observerbar på lederen, når man omsætter med AG, kan den mærkes, f.eks. kobles med et fluorescerende eller et andet optisk detekterbart mærke.

Endnu et system involverer den såkaldte sekvensafprøvning som vist i fig. 7. I denne prøve tilvejebringes 15 der en kerne med en fast mængde AB, hvilken mængde er i overskud i forhold til den tilsvarende ækvivalens påkrævet til at binde AG?, der skal bestemmes. I første trin bringes den overtrukne kerne således i kontakt med prøven, hvorved tilgængelig AG? bindes og således 20 fjernes fra prøven. Derpå bringes kernen i kontakt med mærket AG*, som vil fylde hulrummene i antistoflaget på kernen. Måling derefter eller under reaktionen af de optiske ændringer på grund af mærket af AG* vil give de nødvendige data til beregning af den oprinde-25 lige mængde AG?.

Endelig er den foreliggende opfindelse også velegnet til det prøvetilfælde, der kaldes "sandu/ich" prøve vedrørende bestemmelsen af antigener, der har mere end et bindingssted for antistoffer, dvs. antigener med 30 steder nummereret (1), (2)... (n), der kan bindes med 1, 2 eller n forskellige antistoffer. Dette er skematisk vist på fig. 8, hvor det første antistof er angivet som ABI, det andet antistof som AB2 og et tostedsantigen som (2)AG(1). I dette tilfælde antages det, at 20

DK 166639 B

antigenet ikke kan detekteres som sådant optisk, hvorimod AB2 kan detekeres efter omsætning af det passende andet sted i AG. I det tilfælde, hvori (2)AG(1)? skal bestemmes, anvendes således en kerne med et begyndelsesreferen-5 ceovertræk af et første antistof (ABI), og det bringes i kontakt med antigenopløsningen. Sidstnævnte vil således blive bundet til kernen med sit første bindingssted, hvorefter det andet antistof AB2 i referencemængde tilsættes, og dets bindingshastighed på stedet 2 i antigenet 10 måles under hensyn til de optiske ændringer, der foregår i kernen som følge af denne binding. Ved denne procedure kan den første reaktion ABI + (1)AG(2) selvsagt få lov at gå til ligevægt, før man tilsætter referencemængden af AB2; eller også kan der foretages en samtidig typeprøve, 15 dvs. AB2 kan sættes til opløsningen samtidig med, at den bringes i kontakt med den med ABI overtrukne lederkerne.

Dette gælder specielt, hvor AB^ og AB£ er forskellige mo-noclonale antistoffer (se f.eks. Uotila et al., Journal of Immunological Methods 42 (1981) 11-15). Variationer i 20 det forudbeskrevne prøvesystem kan også tilpasses af fagmanden på området uden at afvige fra opfindelsens ånd, idet driftsparameteren for en sådan variation er defineret under hensyn til kalibreringsopløsningsprøverne for analytten. Et apparat til udøvelse af fremgangsmåden 25 ifølge krav 1 er beskrevet i krav 15.

I denne forbindelse skal påpeges forskellene mellem dette apparat og det til teknikken stadigt hørende apparat, jf.

US patentskrift nr. 3 939 350. Det kendte apparat består 30 af et transparent fast lag optisk forbundet til et prisme og virkende som følgeleder, en lyskilde indstillet i en 35 21

DK 166639 B

vinkel, så der opnås total indre reflektion ved laget, en celle, som omfatter den reflekterende overflade som en væg og en fluorescensdetektor. Denne detektor er lokaliseret sideværts i forhold til følgelederen og beregnet 5 til at samle det lys, der dannes ved siden af dette. Modsætningsvis er detektoren i apparatet ifølge opfindelsen lokaliseret således, at den samler det lys, der kommer ud ved et punkt bag bølgelederen, d.v.s. det lys, der har vandret inde i bølgelederen. X det kendte apparat anven- 10 des kun det lys, der er dannet ved grænsefladen analyt/-bølgeleder og kastet bort derfra.

Eksempler på anlæg til udøvelse af forskellige udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen på områ- 15 derne optisk absorption, fluorescens og spredning såvel som ellipsometriske målinger vil blive forklaret nærmere under henvisning til den følgende del af den medfølgende tegning, hvorpå 20 fig. 9 skematisk viser et apparat til måling in situ af ændringer i det lyssignal, der vandrer gennem en optisk fiber, forårsaget af aflejringen af en kompleks film på den optiske fiber.

25 fig. 10 viser skematisk i forstørret skala en optisk fi-berprobe, der kan anvendes i det i fig. 9 viste apparat; fig. 10a viser set fra oven en del af proben, og fig. 10b viser set fra siden et snit deri langs linien B-B i fig.

30 10&r 35 22

DK 166639 B

fig. 11 viser skematisk i forstørret skala en anden udførelsesform for proben, der er særligt tilpasset til måling af lysvariationer, fig. 11a viser proben set forfra og fig. 11b fra siden, 5 fig. 12 viser et diagram for lyssignalerne ved detek toren i et apparat svarende til det i fig. 9 viste, men anvendt til fluorescensmålinger, fig. 12a angår situationen før reaktionen er startet, fig. 12b angår situationen nogen tid ind i forsøget, 10 fig.13a viser skematisk (set fra oven) et apparat til måling af optiske ændringer forårsaget i en bølgeleder ved lysspredning, fig 13b viser skematisk en del af det i fig. 13a viste apparatur set fra siden, 15 fig. 14 viser skematisk i forstørret skala en del af en modifikation af udførelsesformen ifølge fig. 13a og 13b, fig. 15 viser skematisk en del af en anden modifikation af denne udførelsesform, 20 fig. 16 viser skematisk et apparat til måling af optiske ændringer forårsaget i en bølgeleder af fluorescens-fænomener , fig. 17 viser skematisk i meget forøget skala en del af apparatet ifølge fig. 16, idet man ser reflektions-vinklerne for det indfaldende og det fluorescerende 25 lys, der er involveret,

DK 166639 B

23 fig. 18a viser skematisk (set fra oven) et apparat til måling af ellipsometrisk optiske ændringer i en optisk fiber forårsaget af dannelsen af en kompleks film på fiberen, 5 fig. 18b er et tværsnit af en del af et sådant apparat langs linien A-A i fig. 18a.

Det på fig. 9 skematisk viste apparat omfatter i alt væsentligt følgende komponenter: a) En fiberoptik 1, hvis centrale del passerer 10 gennem en beholder eller cuvette 2 til at rumme en væskeformig analyt, der skal bestemmes; beklædningen af den fiberdel, der er neddykket i væsken, er blevet fjernet, så denne del kan overtrækkes før drift med en tynd hinde eller film af et specifikt kompleks-15 dannende reagens af det stof, der er opløst i væsken, og som skal bestemmes. Samlingen af fiberen 1 og beholderen 2 udgør testproben for apparatet.

b) En chOpperskive 3, der roteres af en motor 4, og som er udstyret med to diametralt modsatte vinduer 20 med filtre 5 og 6 plus et hul 7.

c) En hovedlyskilde 8, en kollimerende linse 9, et ringformet hul 10 og en fokuserende linse 11 til indføring i probefiberkernen af en vinkelbøjet valgt lysstråle. I denne særlige udførelsesform er fiberen 25 mangebølgetypet, og hullet 10 er anbragt til passage af specifikke bølgetyper ifølge nogle krav, der vil blive diskuteret nærmere i det følgende. Med modifikationer, der også vil blive diskuteret nær-

DK 166639 B

24 mere i det følgende, kan det omhandlede apparat også anvendes i forbindelse med lavere bølgetypefibre, f.eks. enkeltbølgetyper. Den fokuserende linse, der er vist skematisk på tegningen, er faktisk et op-5 tisk system analogt med et mikroskopobjektiv, men som kan indstilles, foruden ved forskydning langs den optiske vej sidelæns og op og ned til akkurat indstilling af strålen foran fiberens forende.

d) Derpå omfatter apparatet en hovedlysdetek-10 tor 12 til transformering af udgangslyssignalet fra kernen til efc elektrisk signal, en indelukningsforstærker 13 og et displayorgan 14. Et referencesignal tilvejebringes også med en anden kilde 15, hvis lys pulseres ved at passere gennem hullet 7 i 15 chopperen og rettes mod en detektor 16, hvilken detektor derpå fører tilsvarende elektriske impulser til indelukningsforstærkeren 13.

En udførelsesform for en analytisk probe, der er anvendelig i forbindelse med det omhandlede apparat, 20 er skitseret på fig. 10 (fig. 10a plus 10b), som viser en plastbeholder 2 i to modsatte sider, af hvilke 5-formede kanaler eller slidser 21a og 21b er blevet skåret. En del af en fiberoptik 1 med sin beklædning 22 er blevet indsat i og holdes af nævnte kana-25 ler. Beklædningen af midterdelen af fiberen er blevet fjernet, f.eks. ved ætsning med et egnet opløsningsmiddel, og derefter overtrukket med en tynd film 23 af et specifikt komplekst konjugat af det stof, der skal bestemmes, hvilket stof vises ved små kvadrater 30 24.

Beskrivelsen af driften af det omhandlede anlæg er som følger: Filter 5 vælges først til passage gennem kernen af en bølgelængde Λ^> som modificeres ved 25

DK 166639 B

absorption ved hvert indre reflektionssted på grund af absorption af en del af den kortvarige bølge ved overtrækning af det komplekse materiale, der vil dannes mellem filmen 23 og de opløste molekyler, der 5 skal analyseres, 24. Til nærmere illustration kan det siges, at 23 betegner et meget tyndt lag af et antistof (AB), og 24 betegner molekyler af et specifikt antigen (AG), der skal bestemmes, og prøven er af slagsen "direkte type" som illustreret på fig.

10 4. Filter 6 vælges til passage af en bølgelængde ^ gennem kernen, der i alt væsentligt ikke absorberes af et sådant komplekst overtræk og derfor ikke påvirkes af den immunologe reaktion, der er involveret.

Når således chopperen 3 roterer, føres skiftevis 15 to signalerAj 09X2 til probekernen, e't signalX^, der vil absorberes progressivt med vækst af laget 23 + 24, og et andet signalj^» som νϋ tjene som refe-rancesignal, dvs. til kalibrering og kompensations-formål (celle- eller fibererstatning, etc.). Proben 20 fremstilles ved at vælge en egnet længde af optisk fiber (multibølgetype i det på fig. 10 viste tilfælde), indsætning deraf i kanalerne 21a og 21b, så at midterdelen holdes vandret i cuvetten 2; der tilvejebringes vandtæthed ved derpå at fylde kanalerne 25 med en gummigrutning eller cementopløsning og lade den tørre. Derpå ætses beklædningen væk fra midterdelen. For en harpiksbeklædt fiber gøres dette med et egnet organisk opløsningsmiddel for denne beklædning; for en glasklædt fiber udføres ætsningen med fortyn-30 d-e,t hydrogenfluoridsyre. I det sidstnævnte tilfælde er det ikke nødvendigt, at beklædningen ætses fuldstændig af grunde forklaret i det følgende. Efter fjernelse af opløsnings- eller ætsningsopløsningen 26

DK 166639 B

og omhyggelig rensning af cellen med destilleret vand overtrækkes fiberkernen så med en film af antistof (AB) på sædvanlig måde, dvs. ved fyldning af cellen med en AB-opløsning, så at AB aflejres på kernen som et ensar-5 tet lag (hvis i noget tilfælde overfladen af fiberen ikke har tilstrækkelig affinitet for molekylet til aflejring derpå, kan den forud gøres bindende ved de specielle behandlinger, der er kendt i teknikken, f.eks. podning af bindesteder, påføring af et mellemprodukt-10 reaktivt lag, etc. I denne henseende forefindes der en rigelig litteratur om området (som omhandlet i europæisk patentansøgning nr. 29411). Efter tømning af cellen og skylning anbringes den i apparatet på det sted, der er angivet mellem linsen 8 og detektoren 12, og en egnet 15 pufferopløsning indføres deri. Apparatet aktiveres der på, og chopperen roteres derpå med en passende hastighed, f.eks. 120 omdr./min. Signalerne λχ og Λ2 føres til kernen af proben, og detektoren 12 overfører dem i tilnærmelsesvis kvadratiske elektriske impulser, der 20 føres til indelukningsforstærkeren 13. Der tilvejebringes også et referencelukkesignal for hver omdrejning, via hullet 7, af kilden 15, og detektoren 16 gør det muligt for forstærkeren at skelne mellem impulserne fra A^ og A2 (ved overensstemmelse). I praksis opsættes kontrol-25 lerne foretrukkent, således at impulserne har omtrent samme størrelse før start af reaktionen. Ved nul-tidspunktet sættes den prøve, der skal analyseres (en opløsning af AG), så til cuvetten i proben 2 og blandes hurtigt med pufferen (f.eks. med en omrører eller en 30 gasbobler, der ikke er vist). Signalet på grund af A^ starter derpå progressivt at ændres ved udgangen af probens kerne som følge af, at molekylerne i analytten AG binder sig til fiberkernen (til dannelse af AB-AG-komplekset), og dette kompleks absorberer en del af den 35 kortvarige bølgeenergi for A 1 med en hastighed propor tional med koncentrationen af AG, idet tilsvarende variationer føres til forstærkeren i form af de til- a

DK 166639 B

27 svarende elektriske impulser fra detektoren 12. De beregnende kredsløb, der er forbundet med indeluknings-forstærkeren 13» vil således beregne de data, der resulterer fra forholdet mellem A2-Signalerne °9 giver 5 resultaterne til display-systemet 14, f.eks. i form af en hastighedskurve optegnet på et kort (idet man selvsagt kan anvende enhver anden type display om ønsket: digital eller et oscilloskop, etc.). De opnåede hastighedsdata sammenlignes derpå med standarddata opnået 10 fra opløsninger af AG med kendte koncentrationer, og den ukendte koncentration tilvejebringes ved interpole-ring. Sådanne beregninger kan udføres manuelt eller kan gøre automatisk ved hjælp af en mikrocomputer, idet referencedata opbevares i dens hukommelse. Ved udvælgelse 15 af passende perioder under tidsforløbet for reaktionen kan de ønskede reaktionshastighedsdata vælges og skelnes fra andre hastighedsdata på grund af reaktionen af interfererende og uønskede reaktioner, der skrider frem mere eller mindre samtidigt, men med forskellige hastigheder.

20 Yderligere eller alternativt kan ligevægtsbetingelserne afledes ved extrapolation og derved nedsættes den tid, der bruges til at foretage hver måling i sammenligning med normale ligevægtsmålinger. Yderligere betragtninger af dette spørgsmål kan findes i "Kinetic Versus Equili-25 brium Methods of Analysis" af B.W. Renoe et al., i "Centrifugal Analysis in Clinical Chemistry, Price &

Spencer, Praeger (1980) og Analytical Chemistry 50/02, ( 1978) , 1611-1618.

Det er nyttigt at notere på dette tidspunkt, at følsom-30 heden af målingerne kan varieres afhængigt af lysbølge- type-ordenen, der påtrykkes fiberinput, d.v.s. ved at ændre nngformig (10) indstilling og bredde. Dette er let at forstå, når man husker, at absorptionsfænomenerne hørende til en totalt reflekteret stråle inde i en kerne og 35 på grund af en beklædning uden på denne kerne kun påvirker den kortvarige strålekomponent i nævnte stråle, dvs. de'

DK 166639 B

28 elektriske komponenter, der trænger ind i beklædningen.

De totale refleksionsuinkler for de valgte bølgetyper må således være overfladiske nok med hensyn til fiber-aksen til at sikre fuld refleksion (selv når refraktions-5 indekset for den vandige opløsning er let modificeret ved væksten af overtrækket omgivende fiberkernen) og brat nok til at give en tilstrækkelig tæthed ved refleksions-steder langs fiberen (det er faktisk kun ved sådanne steder, at den kortvarige bølge er i interaktion med kom-10 pleksovertrækket). Der kan således nås en prøvefølsom- hedsoptimering ved passende indstilling af hulparametrene, hvilket afhænger af den respektive k.erne, prøveopløsningens og kompleksets brydningsindex. Sådanne indstillinger kan bestemmes af fagmanden på området for 15 hver type målinger og kan derpå design-inkorporeres til feltoperatorers hensigt.

Det er også interessant at notere, at ved at ændre indstillingen af parametrene for hullet 10 kan det omhandlede apparat bringes til at operere med en anden "klasse".

20 F.eks. ved passende indstilling af et sådant hul kan ap- paratet bringes til at operere med lysbølgetyper i nærheden af den kritiske vinkel for totalreflektering for det betragtede udgangssystem. I dette tilfælde, når i løbet af forsøget forskellen Δη = n^-n^ skal falde 25 med kompleksdannelse, så vil vinklen for den totale re fleksion ved grænsen kerne-overtræk ændres, så at nogle af bølgetyperne (eller alle) pludselig vil brydes uden for fiberen, og der vil forekomme skarp afskæring af signalet. Et sådant arrangement vil derfor give den 30 yderste følsomhed for meget små mængder analytmolekyler.

Det er imidlertid mindre velegnet til kvantitative målinger .

Det har været nævnt i det foregående, at når man anvender en glasbeklædt fiberoptik, behøver en sådan beklædning 35 ikke ætses helt væk til den omhandlede anvendelse. Da

DK 166639 B

29 den kortvarige bølge under drift faktisk vil penetrere beklædningen nogle få tiendedele nm, er en resterende glasbeklædning rundt om kernen med en tykkelse under den, der er nødvendig for den kortvarige bølge.for i betyde-5 lig grad at virke sammen med reaktionsmaterialet, stadig mulig, hvilket, giver mindre strenge kontrolbetingelser for ætsningsoperationen. Endvidere er tykkere fibre mindre skøre end tyndere.

En type fiberholder, der vil mangedoble følsomheden for 10 prøven, er afbildet skematisk på fig. 11a og 11b. Denne holder består af to flanger med heliske kanaler eller noter dannet af inert plast (f.eks. plexiglas eller polyester), på hvilke et stykke optisk fiber er vundet og sat fast med klemmer 33 og 34. For- og bagenderne af 15 fiberen, henholdsvis 35 og 36, bøjes til siden, så de kan anvendes med den lysindkastende linse 11 og detektoren 12. De strakte mellemdele af vindingerne 37 af fiberen er bare, medens de resterende kurvede sektioner 38, der hviler i kanalerne, beholder deres oprindelige 20 beskyttelsesbeklædning. Ætsningen af de bare dele ud føres ved først at dække den nedre flange af holderen med en egnet siliconegummicementopløsning og lade den tørre. Derefter neddykkes holderen i en ætsende opløsning ned til den nedre overflade af den øvre flange, 25 hvorved alle mellemsektionerne af beklædningen vil blive fjernet, idet den nedre gummibeskyttede flange forbliver urørt. Til udførelse af forsøgene og efter overtrækning af den bare del fiberen med AG eller AB som før anbringes holderen korrekt ved hjælp af en krog 39 i apparatets 30 optiske vej. Så bringes en cuvette med reaktionsmediet ind nedefra, reagenset tilsættes, og målingerne udføres som før.

Det skal bemærkes, at alle de i det foregående anførte diskussioner vedrørende den foreliggende opfindelse an-35 gående anvendelsen af fiberoptik, der kan anvendes i

DK 166639 B

30 vandigt eller organisk medium med brydningsindex nær indexet for vand (dvs. ca. 1,3), hvorimod indexet n^ for glaskernen i fiberen snarere er nær 1,5, og indexet n2 for det aktive overtræk ligger derimellem, dvs. er 5 mindre end 1,5, men større end 1,3. Denne tilstand er væsentlig, for hvis n^ var større end n^, ville lyset brydes i beklædningen, dernæst tilbage i kernen osv. Som vi har set før, er en sådan metode ikke umulig som sådan, og den er f.eks. omhandlet i Nature 257 (1975) af Hardy 10 et al., som arbejdede med glasstavs-bølgeledere og måtte anvende forholdsvis tykke polymere overtræk indeholdende, indlejret, nogle reagenser, der skulle bestemmes, men det ville ikke være praktisk i det foreliggende tilfælde, da de omgivende opløsninger altid har brydningsindices 15 mindre end fiberkernen n^, og kun meget tynde overtræk (af størrelsesordenen nogle få Angstrom til nogle få tiendedele nm) involveres. I modsætning hertil opererede Hardy et al. i luft og målte ikke reaktionshastigheder.

Et andet vigtigt punkt, der skal diskuteres, er spørgs-20 målet om mono-bølgetypefibre. Med meget mindre modifika tioner kendt i teknikken og hovedsageligt gældende for lysinjektion i fiberen kan enkelt-bølgetypefiberoptik anvendes også ved den foreliggende fremgangsmåde. Sådanne fibre har generelt en meget tynd kerne (nogle få ^urn) 25 omgivet af en forholdsvis tyk beklædning, og deres trans mission er stærkt bølgelængdeafhængig, f..eks. kan en fiber med kun 5%'s svækkelse pr. meter ved 850 nm have en svækkelse på 40¾ ved 800 og 900. nm (se T.G. Giallorenzi i Proceedings of the IEEE 6jS (1978), 748). For mono-bølge-30 typeledning i en fiber ved bølgelængde λ må følgende ud tryk V = 8,9aVnjAn/A nu have en værdi under 2,4 (Δ^ = Π1-π2’ °9 8 er f i- berradi us i ^um). Over V = 2,4 er fiberen ikke længere en enkelt-bølgetype. Når værdien U er lille (f.eks. under 1), bliver den ledede enkelt-bølge-35 type mere løst bundet, dvs. feltet spredes betragteligt ud over den fysiske fiberkerne (f.eks. to eller tre gange

DK 166639 B

31 kernediameteren). Transmissionsegenskaberne for enkelt-bølgetypefibre er således meget følsomme for små ændringer (Ån~ændringer) i brydningsindex for beklædningen, dvs. for det organiske overtræk, som dannes under 5 prøven ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Dette brydningsindex er faktisk den nøglevariable, der er involveret i det omhandlede forsøg, der udføres med enkelt-bølgetypefibre, da tykkelsen af det komplekse lag vokser under reaktionen. Hvorimod indledende refleksioner i en 10 multi-bølgetypefiber tillader den kortvarige bølge i den umiddelbare nærhed af refleksionsgrænsen at passere parallelt med kernen et meget kort stykke (som kan defineres ved-hjælp af Maxwell's ligninger) ved hver refleksion, tillader mono-bølgetypefiberen passage af denne kort-15 varige bølgefraktion parallelt med kernen langs hele den effektive længde af fiberen. Anvendelsen af enkelt-bølge-typefibre i det omhandlede apparat letter således en forøgelse i følsomhed sammenlignet med multi-bølgetype-fibre.

20 Enkelt-bølgetypefibre kan anvendes uden fuldstændig ætsning af den oprindelige beklædning, da de ledte lysfelter strækker sig betydeligt ind i beklædningen og også ind i det komplekse lag, der dannes under reaktionen.

De modifikationer, der må foretages på apparatet, når 25 man anvender enkelt-bølgetypefibre er i alt væsentligt af optisk natur, dvs. indkastning af lyset i fiberen og detektering af signalet. Sådanne optiske variationer er ikke beskrevet her, da de kendes af fagfolk på området og er godt beskrevet i litteraturen (se f.eks. oven-30 nævnte artikel af Giallorenzi og referencerne deri).

Det omhandlede apparat kan også anvendes til at udføre fremgangsmåden ifølge opfindelsen, når man anvender fluorescensvirkninger i stedet for absorption eller brydningsindexændringer. Dertil skal følgende modifi-

DK 166639 B

32 kationer foretages: a) Et fluorescensmærket antigen (AG*) vil blive sat til analytten AG. Fremgangsmåden vil således blive udført under tilstande med "begrænset reagens" immunoforsøg som 5 diskuteret i det foregående (se fig. 5).

b) Filter 5 vil være valgt for en ^-værdi, der er specifik for anslåningen af den fluorescens, der skal måles, og filter 6 vil være valgt til at blokere A^, men at lade fluorescensemissionsbølgelængden ^2 Passere* 10 c) Et yderligere filter med optiske egenskaber identiske med egenskaberne for filter 6 vil blive indsat mellem fiber-bagenden og detektoren 12.

Derpå vil proben med puffermedium og sin fiberoptik 1 overtrukket (som sædvanligt) med en AB-film blive instal-15 leret, og apparatet vil blive indstillet for respons som vist skematisk på fig. 12a. På denne figur vises en række impulser fra detektoren 12; de med R mærkede impulser er referenceimpulser, der dannes, når filteret 6 er i strålen; impulserne E er de emitterede fluorescensimpulser kastet 20 ind i fiberen af de fluorescerende komplekse AB-AG*-mole- kyler, der dannes på fiberkernen. Ued starten er størrelsen af E (fig. 12a) således omkring 0 fra ingen fluorescens eller kun resterende baggrundsstøj. Derpå tilsættes analytten indeholdende antigenet, der skal bestemmes, plus 25 en kendt mængde fluorescensmærket AG*; der dannes gradvis et fluorescerende overtræk med en hastighed, der er proportional med AG-koncentrationen, og der forekommer et emissionsfluorescenssignal i fiberen, og det forøges progressivt med tiden som vist på fig. 12b. Denne variation 30 detekteres, føres til forstærknings- og beregningssektioner i apparatet og optegnes som den ønskede hastighedsmåling. Dernæst foretages der visuelle eller beregnede sammenligninger af de optegnede data og de standardiserede refe-

DK 166639 B

33 rencedata, hvorfra de ønskede analytiske resultater opnås under anvendelse af den teknik, der er specifik for "begrænset reagens" prøver som diskuteret i det foregående.

I den omhandlede udførelsesform genindsendes den fluor-5 escens, der dannes af overtrækket uden på fiberkernen, i alt væsentligt ind i fiberen og giver det signal, der anvendes til prøven. Et dermed beslægtet fænomen er for nylig blevet beskrevet (se The Jounal of Cell Biology 89, 141-145 (1981)) med hensyn til en glasblok.

10 Når der anvendes en fiberoptik, kan der også opnås fordel i form af stor følsomhed, da den nyttige længde af fiberen kan gøres ret betydelig skønt afgrænset på et meget lille sted og med anvendelse af meget små opløsnings voluminer . Det skal også nævnes, at målet af fluor-15 escensen for overtræk i immunoforsøg allerede er rappor teret (se M.N. Kronick et al., Journal of Immunological Methods (1975), 235-240). I et sådant tilfælde blev fluorescensen imidlertid målt gennem antistofopløsningen, og der blev kun anvendt ét indre reflektionssted, hvilket 20 gav dårlig følsomhed, da der kun kunne behandles en meget begrænset del af den totale fluorescensemission. I tilfælde med anvendelse af fiberoptik som i den foreliggende opfindelse kan også måles fluorescensoptagelse til siden, f.eks. ved anvendelse af et fladspolet stykke fiber og 25 anbringe detektoren aksialt i forhold til spolen, hvorved man samler en større del af det fluorescerende lys udsendt af fiberen.

Den foreliggende udførelsesform giver mange fordele frem for de i teknikken kendte metoder og apparater. F.eks.

30 a) Da følsomheden er proportional med længden af den ned dykkede fiberdel, kan der fremstilles meget følsomme probér omend med små dimensioner.

34 b) Målinger kan foretages over et stort område af bølgelængder, i de synlige, ultraviolette og infrarøde bånd.

c) En lang række stoffer (biologiske og ikke-biologiske) 5 kan afprøves, blandt hvilke man kan nævne lægemidler, haptener, enzymer, peptider, proteiner, hormoner, bakterier, vira og celler. En mere komplet liste af detek-terbare analytter findes f.eks. i US patentskrifterne nr. 3 817 837 og 4 299 916.

10 Et specielt interessant tilfælde er afprøvning af blod prøver til transfusion med henblik på mulige antistoffer i recipienternes blod. Der kan således fremstilles optiske fiberprober med en fiim bestående af patientens b1odbestandde1e, og de kan afprøves mod blodcel-15 lerne fra potentielle donorer. I tilfælde af krydsreak tivitet vil cellerne udfælde på fiberen (på grund af reaktionen af deres egne AG-centre med AB i fiberen), og denne reaktion kan ]et vises ved et af de typiske absorptionsbånd for hæmoglobin (f.eks. 555 nm). Et andet særligt 20 interessant tilfælde er muligheden for at anvende en bøl- geledersensor in vivo til at foretage kvalitative eller kvantitative målinger af analytter inde i eller sekreteret fra legemet. Ved diagnose ville det f.eks. være muligt at prøve for mængden af cirkulerende insulin i respons til 25 en glucosebelastningsprøve, og ved behandling med injice rede hormoner ville in vivo sensoren detektere den cirkulerende hormonkoncentration. Muligheden for at anvende in vivo sensorer er nu beskrevet af Buckles, men den foreliggende opfindelse har tilføjet fordelene ved at undgå et 30 mærke i immunoprøvemåden (hvor mange mærker er yderst ak tive forbindelser med mulighed for toxiske eller carci-nogene virkninger) og forbedret lystransmission, hvilket gør det muligt at undgå behovet for specielle transmissions-fibre til at koble signalet ind og ud af sensoren som be-35 skrevet af Buckles.

DK 166639 B

35

Det på fig. 13a og 13b skematisk viste apparat har følgende nøglekomponenter:

En optisk probe sammensat af en bølgelederplade 41 med 5 skrå kant holdt af støtter (ikke vist) og en modplade 42 holdt nøjagtigt parallelt mod bølgelederen 41. Pladen 41 kan være lavet af nøjagtigt udskåret float-glas af høj kvalitet eller af kvarts. Pladen 42 kan være et mikro-skop-objektglas. Mellemrummet 41a mellem pladerne 41 og 10 42 er af størrelsesordenen en brøkdel af millimeter; det te sikrer, at en analytopløsning let kan indføres i mellemrummet, hvor den vil blive holdt af kapillære kræfter. Apparatet omfatter yderligere en lyskilde 43 (i denne særlige udførelsesform er lyskilden en He-Ne-laser, der 15 giver polariseret lys), en chopperskive 44, der påvirkes af en motor 45 og er forsynet med et hul 46 til tilvejebringelse af et pulserende lyssignal, der skal sendes mod den optiske probe gennem et optisk system omfattende fokuserende linser 47 og 48, et spejl 49, en polarisator-20 plade 50, en cylindrisk linse 51 og et diafragma 52 til at minimere spredt lys. Grunden til, at lyssignalet pulseres, er at man derved opnår en endelig fasefølsom forstærkning af det detekterede signal.

25 Apparatet omfatter yderligere en fotomultiplicerende detektor 53 med højspændingskraftkilde 54, hvis udgang er forbundet til en indelukningsforstærker 55 gennem en tovej skontakt 56. Fotomultiplieren er anbragt til at opsamle det lys, der spredes af produktet, der dannes på bøl-30 gelederpladen i mellemrummet 41a som følge af en kemisk reaktion foregående mellem en reaktant og en analyt i opløsningen, der fylder rummet 41a. Det spredte lys er indikeret ved pile 57. Samlingen er ikke nødvendig eller til kalibrering.

Apparatet omfatter yderligere en detektor 58 til opsamling af det lys, der kommer ud ved output’et fra bølgeleder- 35

DK 166639 B

36 kernen efter flere reflektioner deri som vist på tegningen. Output'et fra denne detektor kan alternativt føres til indelukningsforstærkeren 55 ved hjælp af kontakten 56. Referencesignalerne for apparatet frembringes af et 5 halvtransparent spejl 59, som afleder en lille del af lyset fra kilden på en detektor 60, hvilken sidstnævnte giver et intensitetsreferencesignal ført til en analog deler 61, hvilket kompenserer for mulige variationer for kilden under målingerne. Et pulserende holdereferencesig-10 nal tilvejebringes af et spejl 61 og en detektor 62, idet det tilsvarende elektriske signal føres til forstærkeren 55. Endelig omfatter apparatet en elektronisk enhed 62, som omfatter et displayelement (som i de tidligere udførelsesformer) og en optager for outputdata og eventuelt 15 en mikroprocessor til beregning af de målte data og til at foretage de nødvendige sammenligninger med de opbevarede referencedata fra kalibreringsforsøg.

I praksis bruges det omhandlede apparat som følger. Det første trin er at fremstille den optiske probe ved at 20 aflejre en film af et reaktivt stof på overfladen af bølgelederen 41, som definerer mellemrummet 41a. Detaljer om, hvordan man skal gøre dette, gives i det følgende. Derpå anbringes lederen 41 og pladen 42 i apparatet, og de optiske og elektroniske systemer startes op. Efter nogle 25 få minutters opvarmning indstilles kontrollerne til nul- respons fra fotomultiplieren 53 (eller også fuld transmission fra detektoren 58). Derpå pipetteres analytopløs-ningen (nogle få ^uliter) ind i mellemrummet 41a, hvorved analytten i opløsning begynder at reagere med reaktant-30 filmen på lederen 41. Når analyt-reaktantproduktet tilveje- bringer spredningssteder (store molekyler, agglomerater, etc.) når et spredt signal fotomultiplierrøret 53, som forstærkes, behandles og vises i forhold til tiden af det display, der er indeholdt i enheden 62. Dette resulterer 35 i en hastighedskurvej hældningsdata optegnes og beregnes

LMV ΙΟ0009 D

37 mod standarddata opnået fra kalibreringsprøver og opbevares i hukommelsen i den elektriske enhed 62. Denne beregning kan give analytiske resultater (f.eks. koncentrationen af det ukendte stof i analytopløsningen) på sædvan-5 lig måde.

En forbedring af den i det foregående beskrevne udførelsesform er vist på fig. 14. I stedet for at anvende en perfekt homogen arbejdsoverflade for bølgelederen 41 behandler man først denne overflade til tilvejebringelse 10 af diskontinuiteter derpå. Man kan f.eks. modificere den iboende vedhængen af overfladen over for reaktanten efter et vist mønster (der f.eks. kan opnås ved den kendte foto-litografiske teknik). I det på fig. 14 viste tilfælde er overfladen 41c af lederen 41 blevet gjort let ru i områ-15 der indikeret ved 41d, idet sådanne områder er som pa rallelle striber med en bredde på omkring en bølgelængde og adskilt med en afstand af samme størrelsesorden. Et sådant ridselignende mønster kan opnås ved først at dække overfladen med en lysmodstand, eksponere dette modstands-20 lag gennem en fotografisk film med det negative billede af ridsningen, udvikle (dvs. opløse de ueksponerede områder i et egnet opløsningsmiddel) og ætse de bare arealer let efter udvikling, f.eks. med HF. Efter endelig fjernelse af modstanden har pladen et ridsemønster af striber 25 med skiftende zoner med højere og lavere affinitet for proteiner (antigener eller antistoffer). Når således pladen bringes i kontakt med et reagens (AB), vil sidstnævnte hovedsageligt hænge ved de ætsede områder som vist på fig.

14 ved bogstaverne AB. På dette stadium er tykkelsen af møn-20 steret ikke tilstrækkeligt til at give spredninq, men i nær værelse af antigenet (hv.is beskaffenhed er egnet til at sprede lys) vil sidstnævnte bindes til striberne, hvorpå der er et

DK 166639 B

38 antigen, dvs. som vist ved AG på tegningen. Denne diskontinuerlige lagtype vil give bestemt · orden for brudt, spredt lys i modsætning til den tilfældige spredningsmåde for hovedudførelses formen, hvilket således forbed-5 rer retningen og samlingseffektiviteten (med fotomul- tiplierrøret) for det spredte signal. I fig. 14 indikerer pilene 65 nulte ordensdiffraktion, og pilene 66 indikerer førsteordensdiffraktion.

I en anden modifikation, se fig. 15, blev en perfekt flad 10 og regulær overflade 41c af en bølgeleder sprøjtet med mikrodråber af antistof (AB),og under analyse knytter antigenet AG sig kun til sådanne foretrukne områder. En sådan struktur udgør en statistisk spreder, som spreder lys i form af en konus, hvis størrelse og geometriske pa-15 rametre afhænger af størrelsen og fordelingen af smådrå- berne. Her er der således en retningsbestemt virkning, der bidrager til at forøge effektiviteten af signalopsamlingen.

En anden fordel ved at tilvejebringe et brudt lyssignal er at minimere betydningen af tilfældige spredere, såsom 20 støvpartikler eller ridser i glasset af større størrelses orden (af næste højere størrelsesorden, dvs. ca. 10 λ eller mere).

Det på fig. 16 viste apparat er generelt svarende til det allerede beskrevne med henvisning til fig. 13, men det er 25 tilpasset til fluorescensmålinger i stedet for målinger med spredt lys. Dette apparat omfatter i alt væsentligt et optisk system repræsenteret ved blok 70, som er prak- 39 tisk taget identisk med det system, der er anvendt i apparatet i fig. 13. Detaljerne gentages derfor ikke for simpelheds skyld. Dette system 70 indeholder en pulserende lyskilde og midler til tilvejebringelse af et 5 prøvesignal med den korrekte anslåningsbølgelængde passende rettet mod en bølgeleder 71 og et reference-signal til en referencedetektor 80. Som i den anden udførelsesform er der en plade 72, der sammen med lederen 71 bestemmer et tyndt mellemrum 71a til indføring af 10 analytopløsningen, hvilket reaktantlag er overtrukket på den øvre overflade af lederen. Apparatet omfatter også en sidedetektor (fotomultiplierrøret 73 og dets forsyner 74), en kerneoutputdetektor 78 og blokeringsfiltre 76 og 77 (disse ting mangler i den foregående udførelsesform). De 13 elektriske komponenter i apparatet omfatter to integrator- forstærkere 81 og 82, en multipleksor 83, en analog til digital omformer 84, en mikroprocessor 85 og en display-recorder 86. Alle disse elementer er konventionelle, og deres drift er velkendt for fagmanden på området.

20 Brugen af apparatet ved sideopsamlingsmåden er helt sva rende til den, der blev beskrevet for spredningsudførelsesformen. Efter præparering af bølgelederen 71 med et lag af reaktant på dens øvre overflade og pladen 72 indføres analytopløsningen således til tilvejebringelse af 25 et fluorescerende reaktant-analytprodukt. Den optiske en hed 70 sender et signal af den passende bølgelængde til frembringelse af fluorescensen ved bølgelængde λ£· Det udsendte fluorescerende lys går tværs over skærmen 76 (som frasigter alle andre bølgelængder, herunder spredt anslået 30 lys) og rammer fotomultipl ierrøret 73, hvorved der dannes et signal proportionalt med fluorescensen (og til reaktionens udstrækning). Dette signal føres sammen med referencesignalet fra detektoren 80 til multipleks-forstærkeren 83, som alternativt fører dem til resten af de elektro-35 niske elementer, hvorved der vil forekomme en behandling

DK 166639 B

40 svarende til den tidligere beskrevne.

Samtidigt eller alternativt med førnævnte operation kan det signal, der forekommer ved kerneudgangen og falder på detektoren 78, også vises. Til forståelse af, hvor-5 ledes dette er muligt, henvises til fig. 17. På denne figur er der vist en del af lederen 71, pladen 72 og derimellem mellemrummet 71a og, skematisk, et lag af AB-AG-produkt (det produkt, som er resultatet af reaktionen mellem reaktanten AB og analytten AG, hvis hastig-10 hed måles i forsøget). Figuren viser også de forskellige lysstråler, der er involveret i frembringelse af fluorescensprocessen, dvs. N er den indfaldende stråle vedy^r R er den reflekterede stråle ved bølgelængde A^, og er de dannede bagud og fremad fluorescerende stråler .

15 Θ. er indfaldsvinklen, oq Θ. er den kritiske vinkel for

Aj_ · Øfc er den kritiske vinkel forA^. Nu rammer det anslående lys N som vist den indre overflade af væggen med en vinkel Θ. større end den kritiske vinkel Θ. , og det reflekteres således (R). Imidlertid absorberes den del af 20 den kortvarige anslåningsbølge af AB-AG-laget, og energien genudsendes med en kortere bølgelængde . Ved hjælp af det reciprokke princip (bekræftet kvantitativt af C.K. Corniglia et al. i J.O.S.A. 62_, (4), 1972, 479-486), udsender de anslåede molekyler kortvarige photoner, der opfører sig nøj-25 agtigt som de omhandlede kortbølgephotoner. Den fluorescens, der udsendes af molekyler nær ved grænsen mellem tæt og tyndt medium (AB-AG-laget) propagerer således i det tætte medium ved vinkler større end den kritiske vinkel B_ for fc ^2 · Spidsfluorescens observeres, når er nær ved og 30 ved vinkler nær ved 0*. (se R.E. Brenner et al., Fiber r c

Optics, Advances in R & D, Providence, RI, USA; 19-23 juni 1978, NY Plenum Press (1979)).

41 Q g n imitterede f 1 uo rescensmaks i mum.i n t ens i te t koncentreres således inden for et forholdsvis lille vinkelområde, og når det ledes af bølgelederen, adderes output'et fra flere interaktionssteder til tilvejebringelse af et h ø j e -5 re intensitetssignal ved kernens output. Et andet punkt af betydning er, at fordi brydningsindices er forskellige for forskellige bølgelængder, følger det anslående signal og det fluorescerende signal baner med forskellige reflektionsvinkler i lederen, og de vil komme ud fra 10 output med ligeledes indbyrdes forskellige vinkler. Der er derfor en iboende optisk adskillelse af den udsendte stråle fra den anslående stråle ved output af kernen, og detektor 78 kan hensigtsmæssigt anbringes, så den er i vejen for det fluorescerende signal (λ £) > idet man undgår 15 den resterende anslående stråle selv i fravær af filter 77.

Det på fig. 18a og 18b viste apparat er beregnet til måling af optiske ændringer forekommende i en optisk fiber-bølgeleder tilvejebragt ved dannelsen af et produkt på 20 overfladen af fiberen, hvilken måling udføres ved hjælp af ellipsometri. Ellipsometrisk måling anvendt i bioforsøg er beskrevet detaljeret i ansøgernes europæiske ansøgning EP 81 810 255.0, hvortil der henvises for almindelige betragtninger på dette område. Hovedforskellen 25 mellem den foreliggende opfindelse og den kendte teknik er anvendelsen af en optisk fiber i stedet for de alment kendte flade reflekterende overflader. Ellipsometri er baseret på målingen af ændringer i graden af elliptisk polarisation af lys forårsaget af tilstedeværelsen af 30 en film aflejret på de reflekterende overflader. Med hen blik på den særlige natur og geometri for optiske fibre sammenlignet med bølgeledere med flad overflade må yderligere træk betragtes. For at holde en lysstråle lineært polariseret i fiberen må man for det første anvende en 35 speciel familie af lysbølgetyper. Disse bølgetyper er de-

DK 166639 B

42 fineret som HE^-bølgetyperne, hvor m = 1, 2, 3 ..... n (hvor n er begrænset af størrelsen og brydningsindex for den fiber, der betragtes, se E. Snitzer og H. Osterberg J. Opt. Soc. Am. 5_1, 499 (1961)). For at være i stand til 5 at måle den fulde udstrækning af enhver polarisationsmo difikation forårsaget af en reaktion foregående på overfladen af fiberen er det for det andet vigtigt, at signaler med en vilkårlig polarisationsretning transmitteres lige godt langs bølgelederen. Geometrisk uro, såsom den, 10 der er forårsaget af mekanisk spænding på fiberen, skal således undgås, fordi i et sådant tilfælde kunne en særlig polarisationsretninq blive favoriseret. Følqeliq qø-res den optiske probe (hvis nøglekomponent er den optiske fiber) i det omhandlede apparat kort og stift ubevæge-15 lig for at minimere den uønskede vibrationsvirkning eller anden mulig uro.

For på foretrukken vis at anslå HEj^-bølgetyperne i en optisk fiber må den radiale lysintensitet have en Gauss-fordeling, f.eks. som opnået fra en laserudstråling af den 20 fundamentale bølgetype, og strålen skal være rettet ak- sialt og centralt på fiberenden. Denne kobling kan opnås ved hjælp af et mikroskopisk objektiv. Til minimering af baggrundsuro er det nu foretrukkent at operere med kun en bølgetype fremfor flere bølgetyper samtidig. I det om-25 handlede apparatur blev HE-^-bølgetypen (den laveste enk le bølgetype) valgt for nemheds skyld. I princippet kan multi-bølgetypefibre anvendes med enkelt-bølgetypesig-naler. Dette kan muliggøres (f.eks. kan den rene Gauss-fordeling vælges) ved at lade den indfaldende stråledia-30 meter ved fiberinputfladen være 0,65 x diameteren for fiberkernen. Dette er imidlertid ikke rigtig tilfredsstillende, fordi andre bølgetyper med forskellige polarisationsstadier også anslås i noqen qrad, oq der opnås et delvist depo1ari seret siqnal ved probeoutput. Det er 35 således yderst foretrukkent at anvende en enkel t-bøl getypef i- 43

DK 166639 B

ber i denne udførelsesform, da det vil være væsentligt kun at transmittere HE^-bølgetypen, hvorved der ikke vil forekomme nogen overføring i højereordensbølgetyper og således ingen opløsning i polarisationsgraden. Følgelig 5 opnås et højere forhold signal/støj sammenlignet med an vendelse af multi-bølgetypefibre.

I den foreliggende udførelsesform er fiberlængden foretruk-kent 10 cm eller mindre af de førnævnte grunde. Det er foretrukkent en enkelt-bølgetypefiber af høj kvalitet 10 med hensyn til polarisation og dobbeltbrydningsegenska ber. Fibre opnået ved CVD-teknik, såsom den omhandlet i H. .Aulich et al., Applied Optics 1^, 22, 3735 (1980), foretrækkes.

Det på fig. 18a og 18b viste apparat omfatter en optisk 15 probe omfattende et delvist ætset stykke optisk fiber 101 med en kerne 101a og en symmetrisk fjernet beklædning 101b. Teknikken til fjernelse af beklædningen er den samme som beskrevet for andre optiske fiberanvendelser i den foreliggende opfindelse. I meget kort afstand fra den ba-20 re fiberkerne (en brøkdel af en mm) på begge sider deraf er anbragt to glasplader 102 holdt stift på U-formede klemmer 103. De beklædte endedele af fiber-bølgelederen er holdt fast ved hjælp af ikke viste klemmer anbragt på et ikke vist justerbart stativ, hvilket gør det muligt at 25 kontrollere fiberens stilling til siden og op og ned.

Mellemrummet 104 mellem fiberkernen og pladerne 102 er reaktionsstedet, idet de væsker, der skal afprøves, holdes tilbage af kapillære kræfter mellem fiberen og pladerne.

30 Det omhandlede apparat omfatter yderligere to mikroskop- / objektiver 105 og 106 til kobling af input indfaldsstrålen med fiberen og det elliptisk polariserede outputsignal med detekteringssystemet. Den indfaldende stråle

DK 166639B

44 dannes af en lyskilde 107 (i denne udførelses form en He-Ne-laser), hvis udgangslys går tværs over en polariserings-plade 108 og en roterende chopper-skive 109, der drives af en motor 110 og har et hul 111 til afskæring eller de-5 ling af signalet. Derpå omfatter apparatets detekterings- system en kvartbølgeplade 112, en polariseringsanalysator 113 og en fotodetektor 114, hvilke elementer svarer til de tilsvarende elementer beskrevet i EP ansøgning nr.

81 810 255.0 og drives på tilsvarende måde. Endelig om-10 fatter apparatet en lock-in forstærker 115 og dermed forbundne komponenter, nemlig en mikrocomputer 116 og en recorder 117, idet funktionerne af disse elektroniske -komponenter er i alt væsentligt de samme som for de tilsvarende elementer, der allerede er beskrevet tidlige-15 re i beskrivelsen. Det skal yderligere bemærkes, at det afskårne eller delte referencesignal, der anvendes til referenceformål, er vist på tegningen som stammende fra choppermotoren 110 og transmitteret til forstærkeren 115 ved en linie 118.

20 Driften af apparatet er meget lig driften af de allerede beskrevne udførelsesformer kombineret med driften af det i EP ansøgning 81 810 255.0 beskrevne apparat. Til udøvelse af et forsøg overtrækkes den bare del af fiberen først med en reaktant .(f.eks. antistoffet) som vist ved tallet 25 120 på tegningen ved at fylde mellemrummet med den rene opløsning som vist på tegningen med stiplede linier. Efter den sædvanlige skylning og tørring, nulstilling af instrumentet i nærværelse af en kontrolpuffer ved passende alternativ rotering af polariseringselementerne 112 og 30 113 (se beskrivelse i ansøgning nr. EP 81 810 255.0) og fjernelse af kontrolopløsningen indføres den opløsning, der skal afprøves, for at starte reaktionen med antigen-analytten og antistofovertrækket, hvilket resulterer i vækst af reaktant-analytlaget på bølgelederkernen og der-35 af følgende modifikation af det elliptisk polariserede 45 output. Den tilsvarende ændring fra fotodetektoren 114 forstærkes og vises i de elektroniske komponenter, der er tilknyttet, 116 og 117, og giver de ønskede data nøjagtigt som i de tidligere beskrevne udførelsesformer.

5 Til immobilisering af en film af antistof på en bølgele- derkerne (eller selvsagt af antigen, hvis dette er antistoffet, der må bestemmes) kendes der i teknikken mange metoder, der kan anvendes, som allerede nævnt i det foregående. Ved udøvelse af den foreliggende opfindelse 10 til immunoafprøvning foretrækkes det almindeligvis at drage fordel af den kendsgerning, at de fleste glastyper· i høj grad adsorberer proteiner via deres hydrofobe eller hydrofile områder. I sådan tilfælde renses den ætsede fiber således først i en vandig detergent (f.eks. 15 en 2%'s vandig detergentopløsning). Derpå skylles den un der rindende vand og neddykkes natten over i koncentreret b^SO^. Dernæst skylles den med destilleret vand og tørres i varm luft. Den binder derefter let proteiner fra opløsninger, f.eks. human IgG i puffere.

20 I en anden foretrukken metode er den aktive del af lede ren efter rensning med H^SO^ og skylning som i det foregående neddykket i 1 time i 15¾ (vægt/volumen) TiCl^ i et vandfrit organisk opløsningsmiddel som acetone eller ethanol. Derpå vaskes den med destilleret vand og 0,1 M 25 phosphatpuffer (pH 7), og derefter bringes den i kontakt med human IgG-opløsning (2 g/liter i 0,9¾ NaCl-opløs-ning eller 0,1 M phosphatpuffer, pH 7). Den således til afprøvning mod AG klargjorte fiber (eller snarere probe) opbevares vådt i en egnet puffer (eller endog tørt i kor-50 tere tidsrum).

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

EKSEMPEL 1 46

DK 166639 B

En optisk prøve indeholdende en bølgeleder af den med henvisning til fig. 13a og 13b beskrevne type og en glas-modplade blev fremstillet til foretagelse af immunoke-5 miske prøver som følger: Glasdelene blev fremstillet af følgende type glas (n = 1,323): "Farbioses Brillenroh-glass B-260, Desag", blev først vasket med en varm detergentopløsning, skyllet i destilleret vand og lufttørret.

Derpå blev de neddykket i koncentreret l-^SO^ ved 95 °C 10 i 5 minutter, skyllet med destilleret vand og tørret i ren serviet. De påfølgende manipulationer blev derpå ud-før.t med yderste omhu for, at de rene glasoverflader ikke blev berørt og proben håndteret ved kanterne. Pladerne blev anbragt i apparatet som vist på fig. 13a og 13b, 15 hvilket efterlod et mellemrum på 0,3 mm derimellem. Til overtræksformål blev der fremstillet en antigenopløsning med ca. 1 g/liter'(men nøjagtigt afvejet) ved opløsning af den påkrævede mængde fast human immunoglobolin (Serva Biochemicals, Heidelberg, Tyskland) i 0,9?ό NaCl-opløsning.

20 Ca. 0,2 ml af denne opløsning blev anbragt mellem glas- elementerne 41 og 42 i proben ved hjælp af en sprøjte og fik lov at blive der i 2 timer ved stuetemperatur. I løbet af denne tid blev ca. 1 - 10?ά af den tilgængelige mængde AG i prøven knyttet til overfladen af bølgelede-25 ren (ca. 2 - 20^ug). Derpå blev cellen tømt ved absorbe ring af væsken med et absorberende materiale, og cellen blev skyllet med destilleret vand, skyllevandet blev fjernet som før. Derpå blev 0,1 M phosphatpuffer (pH 7) indeholdende 2 g/liter bovinserumalbumin og 0,5 ml pr.

30 liter væskeformig detergent (Tween 20) anbragt i cellen og efterladt der i 1 time. Serumalbuminen udfylder de "huller", der er efterladt tomme på glasset efter overtrækning med antigenet (da antigenet normalt ikke knytter sig til alle tilgængelige områder på glasset, og da det 35 antistof, der skal afprøves, også har affinitet for det 47 DK b bare glas, kan tilstedeværelsen af uovertrukne områder, "hullerne1' på bølgelederen derefter indføre fejl i målingerne). Da antistoffet ikke har nogen affinitet for bovinserumalbumin, ville denne behandling der ganske en-5 kelt sætte de ubrugte bare dele af glasset ud af funk tion. Detergenten supplerer faktisk denne virkning.

Efter vask og skylning igen fik cellen lov at tørre i en strøm af ren varm luft. Den var derpå parat til forsøg. Al analyse blev foretaget ved stuetemperatur. De 10 forskellige optiske og elektroniske komponenter, undtagen fotomultiplierrøret, 'blev tilsluttet og fik lov at'ind-stille sig til ligevægt, og en prøve af antistofopløsning (2 ml) blev indført i cellen på sammen måde. Det valgte antistof var antihumant kaninimmunoglobolin fra 15 Dako Immunochemicals/ København, Danmark i 0,9% NaCl.

Begyndelsesopløsningen som modtaget var en 10 g/liter proteinopløsning med en titer på 900 pr. ml, dvs. dette tal (opgivet af producenten) betyder, at hver ml af antistofopløsningen faktisk neutraliserer 900^,ug af anti-20 genet (neutralisering betyder her, at når sådanne reci prokke mængder af begge bestanddele har reageret, indeholder opløsningen ikke længere AG eller AB af betydning).

Til kalibreringsformål blev således anvendt kendte antistofopløsninger hensigtsmæssigt fortyndet til udførelse 25 af forsøget (se tabel I). Så snart cellen var fyldt med kaliberingsopløsningen (n = ca. 1,33) blev rummet mørke-lagt for at undgå mætning af fotomultiplierrøret, og sidstnævnte blev slået til. Den fra det spredte lyssignal, der blev optaget fra fotomultiplieren, dannede has-30 tighedskurve begyndte at udvikles efter nogle sekunders ligevægt (sandsynligvis på grund af den tid, der er nødvendig til passende befugtning af proteinerne på overtrækket. Reaktionen fik lov at skride frem i ca. 2-5 minutter, og hældningskoefficienten for hastighedskurven (næs-35 ten lineær) blev bestemt som gennemsnit over perioden.

DK 166639 B

48

Resultaterne er summariseret i tabel I i det følgende, hvilken tabel giver værdierne for fortynding af prøverne af antiserum og de tilsvarende beregnede titerværdi-er såvel som hældningskoefficienterne for de tilsvaren-5 de hastighedskurver som målt med det anvendte apparat.

TABEL I

Fortynding af anti- Hældningskoefficient serum Antistoftiter for hastigheds- (1 ml + ml 0,9 NaCl) for antiserum kurve (mV/min)_ 10 1+20 42,9 22,0 1 + 100 8,9 12,6 1+200 4,5 6,1 1 + 1000 0,89 0,8

Til analysen af en ukendt prøve blev samme procedure 15 fulgt, idet hastighedsdata blev optegnet, og derefter sammenlignes med standarddata fra tabel I. De ønskede analytiske data blev opnået ved afbilding af d^n analytiske hastighedsværdi som opnået mod den tilsvarende titer som givet ved de i tabel I anførte data.

EKSEMPEL 2 49

UK D

Det omvendte af forsøget som beskrevet i eksempel 1 blev foretaget med samme apparatur og under samme betingelser. I dette tilfælde blev bølgelederen i den 5 optiske probe overtrukket med en film af antistof (antihuman kanin-immunoglobulin) ved hjælp af 0,2 ml af begyndelsesopløsningen med titer 900 pr. ml (se eksempel 1). Alle andre operationer var de samme som beskrevet i eksmepel 1. Kalibreringsprøverne blev 10 fremstillet ud fra kendte opløsninger af antigenopløsningen som angivet i tabel 2, som også summariserer hældningskoefficienterne for de optegnede hastigheds-kurver .

TABEL II

Antigenopløsningen Hældningskoefficient for hastighedskurve (ml/liter) _(mV/min.)_ 0,42 4,9 1,63 11,3 5,32 19,0 10,16 21,7

Til analysering af ukendte prøver af AG blev den alle-15 rede i eksempel 1 beskrevne procedure anvendt, dvs.

hældningskoefficienten af den tilsvarende hastigheds-kurve under forsøget blev målt, og den opnåede værdi blev korreleret med den tilsvarende antigenkoncentration ved sammenligning med den kurve, der blev frem-20 stillet ud fra værdier som summariseret i tabel II.

EKSEMPEL 3 I dette eksempel blev det signal, der blev opnået fra lyset udgående fra bagenden af bølgelederen og falden-

DK 166639 B

50 de på detektor 58 anvendt til dannelse af hastighedskurven. Den optiske probe var i alt væsentligt den samme som den i eksempel 2 anvendte (med et overtræk af AB, antihuman kaninimmunoglobulin). Prøver på 5 antigenopløsninger (som i eksempel 2) blev anvendt, hvis koncentrationer er vist i tabel III i det følgende. De resterende operationer blev udført nøjagtigt som forklaret i eksempel 1 og 2 med den forskel, at multiplieren 53 ikke blev anvendt, og at signalet 10 faktisk faldt, efterhånden som reaktionen skred frem (dette skyldes, at den del af lyset, der ikke når output .for bølgelederen, forøges efterhånden som reaktionen skrider frem). Hældningskoefficienten for hastighedskurverne optegnet som funktion af mængden af AG til 15 stede i prøverne er angivet i tabel III.

TABEL III

Hældningskoefficient

Antigenopløsningen for hastighedskurve (ml/liter) _(mV/min.)_ 1,0 -0,42 0,32 -0,35 0,10 -0,31 0,03 vanskeligt målelig EKSEMPEL 4

Dette eksempel viser en konkurrerende prøvemetode af den type, der er diskuteret under henvisning til fig.

5. Dertil blev der anvendt et apparat af fluorescens-20 målingstypen af den slags, der er omhandlet under henvisning til fig. 16. Den optiske probe blev fremstillet ved at overtrække den tilsvarende bølgeleder 71 med en film af human immunoglobulin (AG) ved samme procedure som beskrevet i eksempel 1. Antistoffet AB*, der 25 blev anvendt, blev mærket med fluorescin-isothiocyanat (FITC) og var specifikt for det afprøvede antigen (det 51 UK Ibbbdy b blev opnået fra Dako Immunoglobulins, København). Det umærkede tilsvarende antistof AB blev også opnået fra samme kilde. I det følgende forsøg blev output-fladen 71b af bølgelederen overtrukket med sort maling for 5 at minimere spredt indfaldende lys.

I hvert forsøg blev en fast mængde sporstof-antistof AB* tilsat. Denne mængde var 100 pi af DAKO-produktet fortyndet 1/200 i 0,1 M phosphatpuffer ved pH 7, og det blev blandet med 100 pi af prøveopløsningen af u-10 mærket AB i de i tabel IV angivne fortyndinger. Driften blev foretaget som i de foregående eksempler, idet de blandede 200 pi portioner blev sprøjtet ind mellem plader 71 og 72. Resultaterne er angivet i form af hældningskoefficienter for tilsvarende hastighedskur-15 ver i tabel IV.

TABEL IV

Fortynding af antistof Antistoftiter Hældningskoefficient (1 ml + ml puffer) for hastighedskurve _ _ _(mV/min.)__ 1+20 42,9 11,6 1 + 100 8,9 57,7 1 + 200 4,5 90,3 1 + 1000 0,89 95,5

Til måling af ukendte opløsninger af antistof blev samme teknik anvendt (tilsætning af 100 pi af det mærkede antistof), og resultaterne blev opnået ved hjælp af de i det foregående angivne standarddata.

20 EKSEMPEL 5

Det tidligere eksempel blev gentaget, men denne gang blev output fra detektoren 78 ved bagenden af bølgelederen vist. Under anvendelse af samme prøvekoncentra-

DK 166639 B

52 tioner som givet i tabel IV opnåedes tilsvarende hastighedsresultater (i stigende rækkefølge) (mV/min.): 2,9, 4,8, 6,1 og 6,6.

EKSEMPEL 6 5 En probecelle blev fremstillet ved at tage et stykke plastbeklædt siliciumoxidfiber fra "Quartz & Silice SA", type PCS Fibrosil WSF-UV rækken (diameter 380 /jm, kerne 200 /jm, tab 0,14 db/m ved 350 nm, 97%'s transmission) og indsætte det med dets ender i kanalerne i en BVC-10 celle som vist på fig. 10a og 10b. Til stemning blev der anvendt en opløsning af siliconegummicement i acetone. Beklædningen blev ætset væk ved at fylde cellen med koncentreret H^SO^ og lade den blive der i en time (ubeklædt del ca. 10 cm lang), hvorpå fiberen blev gjort 15 aktiv ved den første foretrukne metode, der er beskrevet i de sidste afsnit før eksemplerne.

En film af human immunoglobulin G (IgG) fra "Serva Biochemicals", Heidelberg, Tyskland blev anbragt på fiberen som følger: phosphatpufferen i cellen blev 20 fjernet og erstattet med en 2 g/liter opløsning af IgG (10 ml) i en 0,9Si's NaCl-opløsning. Efter 2 timers forløb blev antistofopløsningen fjernet, og fiberen blev skyllet med en pufferopløsning, hvorefter en 2 g/liter opløsning af bovinalbumin indeholdende 0,5 ml "Tween 20" 25 (en detergent) i 0,1 M phosphatpuffer blev indført og efterladt der i 1 time. Derpå blev cellen igen skyllet med puffer og fyldt med frisk puffer (10 ml). Cellen blev anbragt på en optisk bænk i apparatet ifølge fig.

9, hvor filter 5 blev valgt for λ^ = 280 nm (protein-30 absorption) og filter 6 f or\ 2 = 340 nm (ingen protein-absorption), hvorpå indstillinger blev foretaget for at centrere strålen, for’at få passende respons fra de elektroniske enheder og muliggøre ligevægtsindstil- 53

DK Ί66639 B

ling af systemet med minimal støj. Derpå blev 50 ^1 af forskellige opløsninger af antiserum (anti-IgG dannet i kaniner leveret af "Dako Immunochemicals, København) tilsat og omhyggeligt blandet ved 5 gennembobling af luft. Rekorderen eller skriveren blev derpå startet på tidspunktet nul, og absorptionsændringerne ved^ = 280 nm blev vist i ca. 10 minutter. Gennemsnitshastigheden for ændring i dette absorptionssignal blev afbildet, og hældningskoeffi-10 cienten blev vist i arbitrære enheder. Resultaterne fremgår af tabel V som funktion af AG koncentrationen.

TABEL V

AG (anti IgG) koncentration Hældningskoefficient for hastighedskurve _(jjq/ml)_ (mV/min.)_ 4.5 ' 2,23 2,3 1,02 1.5 0,78 0,76 vanskeligt målelig EKSEMPEL 7

Fremgangsmåden var i alt væsentligt som beskrevet i de foregående eksmepler, men kanin-IgG blev erstattet 15 med en tilsvarende mærket antiserum. Den mærkede forbindelse var fluorescin-isothiocyanat "isomer-1" (FITC), og det mærkede antiserum blev opnået fra "Dako". Dette materiale absorberer stærkt ved 492 nm (denne bølgelængde er faktisk også den, som anslår fluorescin).

20 I dette forsøg blev filter 5 valgt for λ ^ = 492 nm, filter 6 for λ 2 = 600 nm, hvor der ikke forekommer nogen absorption. Forsøgene blev udført som allerede beskrevet med forskellige koncentrationer af FITC-mærket IgG og også , i et andet sæt målinger, anvendelse af 25 aktive fibersektioner på kun 5 cm. Resultaterne fremgår af tabel VI.

DK 166639B

TABEL VI

54

Koncentration af mærket IgG Hældningskoefficient prøvecuvette (ug/ml) for hastighedskurve ____ for fiberlænqder 5 og 10 cm 5 7 0,827 10,2 22,6 0,568 6,8 14,3 9,330 4,1 8,9 0,178 2,1 4,3 0,090 0,98 2,1 0,045 0,43 0,94 EKSEMPEL 8

Det fremgår af det foregående eksempel, at mærkning med et fluorescinderivat kunne anvendes til at modificere absorptionsspektret for et protein og følgelig forøgelse af følsomheden for det omhandlede forsøg med hen-5 syn til de umærkede stoffer. Dette system kan selvsagt også anvendes til måling af ukendt koncentration af umærket human IgG (konkurrerende type måling) ved foruden at anvende en fast koncentration af mærket AB, hvoraf mængden i forhold til mærkede stoffer så vil 10 være hastighedsbestemmende efter det i fig. 6 viste skema. I forsøgene, hvoraf resultaterne er rapporteret i tabel VII, var den faste koncentration af mærket IgG 1 /jg/ml. De rapporterede værdier i første søjle er for umærket IgG.

TABEL VII

Umærket IgG koncentration Hældningskoefficient (^jg/ml) for hastighedskurver _ (arbitrære enheder) 0 (dvs. 1 /jg/ml 24,3 mærket IgG) 0,09 19,7 0,83 10,2 4,14 2,4 9,2 0,84

DK T66639 D

EKSEMPEL 9 55

Apparatet ifølge fig. 9 blev anvendt under fluorescensmålingsbetingelser , dvs. filteret 5 for anslåningsly-set var for7\j = 492 nm, og værdien for filter 6 og for 5 det yderligere anslåningslys-blokeringsfilter efter fiberbagenden var for^2 = 518 nm.

Forsøget blev faktisk udført nøjagtigt som i eksempel 8, men i stedet for at måle en forøgelse af signalet (emitteret fluorescens) blev der målt en nedgang i 10 absorptionsfænomenet. Som i eksempel 8 indeholdt ana-lytten 1 jug/ml fluorescerende IgG + forskellige koncentrationer af umærket human IgG som vist i den venstre søjle i tabellen.

TABEL VIII

Umærket IgG koncentration Hældningskoefficient (jjg/ml) for hastighedskurver _ (arbitrære enheder) 0 17,9 0,09 13,0 0,83 5,3 4,14 1,4 9,20 0,42

Det skulle være klart for læseren, at de i eksemplerne 15 1-9 angivne resultater er blevet anvendt som standard for sammenligningsformål med lignende prøver af ukendte koncentrationer. Sammenligninger og beregninger kan foretages som sædvanligt visuelt eller ved elektronisk behandling i de mikrokomputere, der kan tilknyttes de 20 omhandlede apparater.

Claims (19)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af en analyt i en opløs-5 ning, i hvilken fremgangsmåde - opløsningen bringes i kontakt med en reaktant, der er specifik over for analytten, til dannelse af et lag af et reaktionsprodukt mellem analytten og reaktanten på over- 10 fladen af en bølgelederkerne udsat for opløsningen og med et brydningsindex n^ højere end brydningsindexet n^ for opløsningen, - lys med bølgelængde λ propageres gennem bølgelederkernen 15 ved intern multitotalreflektion ved en reflektionsvinkel e, - reaktionsproduktlagets virkning på lyset bestemmes ved måling af modifikationen af en parameter for lyset, 20 - analytten bestemmes ud fra denne modifikation, kendetegnet ved, at 25. forholdet n^/n^ og e vælges således, at dybden Z, hvor til det elektriske felt af de forsvindende bølger, der forekommer uden for bølgelederkernen på grund af den totale reflektion af det inden i ledte lys, penetrerer ud i bøl-gelederkernens omgivelser, svarer til eller overskrider 30 tykkelsen af reaktionsproduktlaget.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at penetrationsdybden er således, at det elektriske felt E ved denne dybde Z er mindst 0,1 Eo og fortrinsvis

35 Eo/3, hvor Eo er det elektriske felt ved dybde 0. DK 166639 B

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man kontakter en sektion af bølgelederkernen overtrukket med en tynd hinde af den reaktant, der er specifik over for analytten, med en opløsning af analytten, hvorved 5 man gør det muligt for analytten at reagere med hindens reaktant og danne reaktionsproduktlaget, at man som en funktion af tiden iagttager den tilsvarende modifikation af parameteren for det lys, der går gennem kernen ved udgangen af kernen som følge af dannelsen af reaktionspro-10 duktlaget og korrelerer de således opnåede hastighedsdata med tilsvarende standardreferencedata opnået på lignende måde ud fra kalibreringsprøverne fra analytten, idet den anvendte bølgelederkerne er ikke-porøs.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man overtrækker en sektion af bølgelederkernen med en referencemængde af den analyt, der skal bestemmes, indfører lys i en indgang i sektionen, kontakter den oplyste sektion med analytopløsningen, mens der forud eller samti-20 dig tilsættes en referencemængde af reaktanten for at få sidstnævnte til kompetitivt at reagere med analytten i opløsningen, og referencemængden på sektionen, idet man som funktion af tiden iagttager den tilsvarende lysparametermodifikation ved en udgang fra sektionen som følge af re-25 aktionen mellem reaktanten og referencemængden og sammenligner de således opnåede hastighedsdata med standardrefe-rencehastighedsdata opnået på lignende måde ud fra kalibreringsprøver eller opløsninger af analytten, idet den anvendte bølgelederkerne er ikke-porøs. 30

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der til opløsningen sættes en sporstofmængde af ren analyt på mærket form, idet tilstedeværelsen af mærket i reaktionsproduktlaget på bølgelederkernen forårsager 35 lysparametermodifikationen, hvor størrelsen af modifikationen står i direkte relation til forholdet mellem mærket analyt og analyt i opløsningen. DK 166639 B

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at man anvender en bølgelederkerne med et overtræk af reaktanten i overskud i forhold til den støkiometriske mængde, der behøves til at binde analytten i opløsningen, 5 der skal bestemmes, kontakter den overtrukne bølgelederkerne med opløsningen til total binding af en analyt i opløsningen, at man til opløsningen sætter en referencemængde af analyt på ren mærket form til at reagere med det stadig uanvendte overskud af reaktant, idet tilstedeværel-10 sen af mærket i reaktionsproduktet forårsager modifikationen, hvor størrelsen af modifikationen står i direkte forhold til forholdet mellem mærket analyt og oprindeligt tilstedeværende analyt i opløsningen.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at analytten i opløsningen har mere end et bindingssted for specifik binding af mindst to slags reaktanter, og at man bringer bølgelederkernen, der er overtrukket med en første reaktant, i kontakt med opløsningen, tilsætter 20 en referencemængde af den anden reaktant for at få denne anden reaktant til at binde til et andet bindingssted i analytten, hvor lysparametermodifikationen er resultatet af bindingen af den anden reaktant til det andet bindingssted i den analyt, der er bundet ved sit første bindings-25 sted til den første reaktant på bølgelederkernen.

8. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at modifikationen af lysparameteren refererer til absorptionen af lyset, hvil- 30 ken modifikation fører til en nedgang med tiden i den lys-intensitet, der måles ved en udgang fra bølgelederkernen.

9. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-7, kendetegnet ved, at modifikationen af lyspara- 35 meteren angår dannelsen af et fluorescerende lyssignal, hvilket signal forøges med tiden som målt ved en udgang fra bølgelederkernen eller ved siden af denne. DK IbbtjJ» b

10. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-7, kendetegnet ved, at man anvender polariseret lys, og at modifikationen af lysparameteren angår signalets elliptiske polarisationsparametre, hvilke parametre 5 måles ved en udgang fra bølgelederkernen.

11. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-9, kendetegnet ved, at bølgelederkernen er valgt blandt lystransparent plade, stang eller fiberlignende 10 genstande med et brydningsindex på mindst 1,4.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved,- at bølgelederkernen er en enkelt-bølgetype eller mul-ti-bølgetype optisk fiberkerne. 15

13. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at der anvendes en multi-bølgetype fiber, og at den omfatter anvendelse af bølgetyper, der er tilstrækkeligt flade med hensyn til fiberaksen til at sikre en høj lineær 20 tæthed for det lyssignal, der overtrækker interaktionsste-der.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at bølgelederkernen er en multi-bølgetype fiber, og 25 at bølgetyperne er valgt med en begyndelsesreflektionsvinkel nær ved den kritiske vinkel, hvorved under reaktionsforløbet en lille ændring af brydningsindexet der forekommer på grund af væksten af reaktionsproduktlaget, vil resultere i delvis eller total brydning af lyset uden for 30 kernen.

15. Apparat til brug ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 1, hvilket apparat omfatter 35. en lyskilde (8; 43; 70; 107), DK 166639 B - en optisk bølgeleder (1; 41; 71; 101), der har en kernesektion, som kan udsættes for en opløsning indeholdende en analyt, der skal måles, hvilken kernesektion har et bryd-ningsindex n^ højere end brydningsindexet ^ for opløsnin- 5 gen og bærer et overtræk af en reaktant, der er specifikt over for analytten, - optiske elementer (9-11? 47-52; 70; 105) arrangeret til at sende lys fra lyskilden ind i bølgelederen for således 10 at muliggøre propagering af det indsendte lys gennem kernesektionen ved indre multi- totalreflektion ved en re-flektionsvinkel e, - lysdetekterende midler (12; 58; 78; 124) arrangeret til 15 at modtage lys, der kommer ud fra bølgelederen, og at konvertere det til et elektrisk signal, der reflekterer en modifikation, som en parameter af det indsendte lys kan have undergået i response til penetrationen af det propagerende lys ind i et reaktionsproduktlag, der dannes på 20 overfladen af kernesektionen som følge af en reaktion mellem reaktanten og analytten, - kredsløbsmidler (13; 14; 55; 61; 62; 81-86; 115-117) til ud fra det elektriske signal at bestemme data representa- 25 tive for reaktionen, kendetegnet ved, at - de optiske elementer (9-11; 47-52; 70; 105) er anbragt 30 til at sende lys ind i bølgelederen (1; 41; 71; 101) ved en forside deraf, som strækker sig på tværs af lyspropageringsretningen inde i bølgelederen, - lysdetekteringsmidler (12; 58; 78; 114) er arrangeret 35 til at opfange det lys, der kommer ind fra bølgelederen på en bagside deraf, der også strækker sig på tværs af lyspropageringsretningen, og LMV I 00009 d - forholdet n^/r^ og e er valgt således, at dybden z, hvortil det elektriske felt af de forsvindende bølger, der forekommer uden for kernesektionen på grund af den totale reflektion af det inden i ledte lys, penetrerer ud i ker-5 nesektionens omgivelser, svarer til eller overskrider tykkelsen af reaktionsproduktlaget.

16. Apparat ifølge krav 15, kendetegnet ved, at bølgelederen har form af en plade (41; 71) eller en fiber 10 (1; 101) med et brydningsindex i området ca. 1,4 til ca. 3,5. 17. -Apparat ifølge krav 15, kendetegnet ved, at det modificerede lys kommer ud som fluorescerende eller 15 delvist absorberet lys.

18. Apparat ifølge krav 15, kendetegnet ved, at bølgelederen er en optisk fiber på spiralform.

19. Apparat ifølge krav 16, kendetegnet ved, at det omfatter en modplade (42; 72) arrangeret uden berøring, men tæt ved og parallelt med bølgelederpladen (41; 71), idet reaktionen finder sted i det mellemrum, der dannes mellem pladerne, og reaktionsmediet holdes på plads 25 af kapillære kræfter. 30 35