JP5238171B2 - 光導波路型抗体チップ - Google Patents

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Description

本発明は、光導波路型抗体チップおよびこのチップを用いた抗原測定方法に関する。
従来から、抗原と抗体の特異的な反応を利用した微量成分の測定方法として、酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法という）が臨床検査分野等で実用化されている。
ＥＬＩＳＡ法には、通常マイクロプレートと呼ばれる９６個のくぼみ（ウエル）が設けられた樹脂製の板が用いられる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の場合、各ウエルには目的に応じた一次抗体が固定されている。まず検体溶液をウエルに分注し、プレート上に固定された抗体と検体溶液中の測定対象物質とを反応（以下、一次反応という）させた後、洗浄して未反応の検体溶液を取り除く。その後、酵素標識された二次抗体の溶液を洗浄後のプレートに分注し、一次抗体と反応した測定対象物質と特異的に反応（以下、二次反応という）させる。洗浄して未反応の二次抗体溶液を除去した後、発色試薬溶液を分注して酵素反応させ酵素反応産物を発色させ、マイクロプレートリーダーを用いてウエルの透過光量から吸光度を求め、検量線により測定対象物質の濃度を求めている。
例えばインスリンは、膵臓のβ細胞から分泌されるホルモンで、血糖降下作用をもつものとして知られている。そこで、糖尿病の診断や病態の把握のために、インスリンの血中濃度を測定する必要がある。ＥＬＩＳＡ法でインスリンを測定する場合、マイクロプレートのウエルには抗インスリン抗体が固定化されており、このウエルに検体溶液を分注して、抗インスリン抗体と検体溶液中のインスリンとを反応させ、以下、上記と同様にしてインスリン濃度を求めている。
マイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡ法では、測定試料として数１０μＬ〜１００μＬ程度の量の試料を必要とし、特別に少ない場合でも５μＬ以上必要であり、これ以下の量では測定感度は数１０００ｐｇ／ｍＬ程度に過ぎないという問題点があった。
一方、特許文献１には抗原抗体反応を利用するセンサプレートが開示されている。この光導波路型のセンサプレートは、ガラス等の基板上にシリコン窒化膜等からなる光導波路層が形成され、その両端に一対の入射側グレーティング（回折格子）および出射側グレーティング、またはプリズムが形成され、光導波路層上に抗体固定化層が形成されて構成されている。
このような構成のセンサプレートにおいて、抗体固定化層に抗原を含む検体溶液を接触させると抗原抗体反応が起こる。ここに蛍光色素標識されている抗体溶液を添加すると、抗体／抗原／蛍光色素標識抗体からなる免疫複合体が基板上に形成される。この状態でレーザ光を入射側グレーティングを通して光導波路層に入射させ、エバネッセント波を発生させて、光導波路層上の抗体固定化層において蛍光色素をエバネッセント波で励起し、蛍光色素から放射される蛍光量を受光素子により検出して、検体溶液中の抗原量を分析する。
エバネッセント波とは光が光導波路層と外層との界面で全反射するとき、その界面に発生する界面近傍だけに局在する電磁波のことである。エバネッセント波を用いる測定方法としては、上記した蛍光色素で標識する方法以外にも、検体中の色素標識化物質（例えば色素標識された２次抗体）におけるエバネッセント波の吸収による反射光の物理量の変化を検出する方法が知られている（特許文献２参照）。
しかしながら、前記センサプレートを用いて例えばモデルラット（例えばＺｕｃｋｅｒ）の血漿中のインスリンを測定すると、検出値が実測値より相当下回る、つまり検出再現性が低い問題がある。
特開平８−２８５８５１号公報 特公平３−７２７０号公報
本発明は、検体溶液中の抗原量を実測値（ＥＬＩＳＡ法による測定値）に近似もしくは等しい値として検出することが可能な光導波路型抗体チップおよびこのチップを用いた抗原測定方法を提供することを目的とする。
本発明によると、透光性を有する基板と、
前記基板の主面に互いに距離をあけて配置された入射側光学要素および出射側光学要素と、
前記光学要素間に形成された光導波路層を含む基板の主面に前記光導波路層の一部が露出するよう開口して反応ホールを形成するように被覆された撥水性樹脂膜と、
前記光導波路層上に前記反応ホールを取り囲むように固定され、前記反応ホールと共に検体溶液の注入、排出が可能なセルを形成する枠状のセル壁と、
前記反応ホールの底に形成され、表面に１００ｍＭトリスおよび１００ｍＭ ＮａＣｌを少なくとも含む膜を有する抗体固定化層と
を備えることを特徴とする光導波路型抗体チップが提供される。
また本発明によると、透光性を有する基板と、この基板の主面に互いに距離をあけて配置され、光導波路層を形成するための入射側光学要素および出射側光学要素と、これらの光学要素間に形成された光導波路層を含む基板の主面に前記光導波路層の一部が露出するよう開口して反応ホールを形成するように被覆された撥水性樹脂膜と、前記光導波路層上に前記反応ホールを取り囲むように固定され、前記反応ホールと共に検体溶液の注入、排出が可能なセルを形成する枠状のセル壁と、前記反応ホールの底に形成され、表面に１００ｍＭトリスおよび１００ｍＭ ＮａＣｌを少なくとも含む膜を有する抗体固定化層を備える光導波路型抗体チップを用いて抗原測定を行う方法であって、
前記セル内の抗体固定化層上に検体溶液を滴下し、一次抗体−抗原複合体を形成する工程と、
前記抗体固定化層上に酵素標識された二次抗体を滴下し、一次抗体−抗原−二次抗体複合体を形成する工程と、
前記抗体固定化層上に発色試薬を滴下して前記標識酵素と反応させ、発色する酵素反応物を生成する工程と、
発色試薬の滴下前後の基板に対し、光を前記入射側光学要素から前記基板の光導波路層を通して前記抗体固定化層に照射し、光導波路層を通して前記出射側光学要素から出射された光を受光して発色試薬の滴下前後の光の強度を測定し、これらの光強度の差に基づいて前記検体溶液中の抗原濃度を算出する工程と
を含むことを特徴とする抗原測定方法が提供される。
本発明によれば、例えば全血のような検体溶液中の抗原量を従来のＥＬＩＳＡ法の５μＬに対して１μＬでも測定可能な比較的少ない検体量で、実測値（ＥＬＩＳＡ法による測定値）に近似もしくは等しい値として再現性よく検出することが可能な光導波路型抗体チップおよびこのチップを用いた抗原測定方法を提供できる。
以下、本発明の実施形態に係る光導波路型抗体チップおよびこのチップを用いた抗原測定方法を図面を参照して詳細に説明する。
図１は、実施形態に係る光導波路型抗体チップを示す平面図、図２は図１のII−II線に沿う断面図である。
透光性を有する例えばホウケイ酸ガラスからなる基板１の主面の両端部には、入射側光学要素である入射側グレーティング２ａおよび出射側光学要素である出射側グレーティング２ｂが設けられている。撥水性樹脂膜３は、グレーティング２ａ，２ｂ間の基板１に形成された光導波路層上に被覆されている。撥水性樹脂膜３には、光導波路層の一部が露出するよう開口して反応ホール４を形成している。枠状のセル壁５は、基板１の光導波路層上に反応ホール４を囲むように撥水性樹脂膜３を貫通して設けられている。枠状のセル壁５は、反応ホール４と共に検体溶液の注入、排出が可能なセル６を形成する。表面に緩衝剤および塩を少なくとも含む膜を有する抗体固定化層７は、反応ホール４の底に形成されている。
このような光導波路型抗体チップは、入射側グレーティング２ａに光を入射させるレーザ発振器および出射側グレーティング２ｂから出射される光を受光する光電変換素子等と組み合わせて使用される。
入射側グレーティング２ａおよび出射側グレーティング２ｂは、例えば酸化チタン（ＴｉＯ2）、酸化錫（ＳｎＯ2）、酸化亜鉛、ニオブ酸リチウム、ガリウム砒素（ＧａＡｓ）、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）、ポリイミド等で形成することが好ましい。
グレーティング２ａ，２ｂは、光導波路型抗体チップにレーザ光を導入し、また出射させるための光学的機能を有しているが、他の部材を用いて同様の機能を実現できるならば、特に備える必要はない。また、同様の機能を実現できるものであればプリズム等の他の光学要素が配置されていてもよい。
実施形態に係る光導波路型抗体チップは、反応ホール４内で酵素反応を行い、発色し、沈殿する酵素反応物を生成するため、ここに注入される検体溶液は１μＬ程度あれば十分に測定できる。
前記枠状のセル壁５を基板１上に設けることによって光導波路型抗体チップ上での薬液操作において各種の薬液による侵食を防止することが可能となる。枠状のセル壁５は、使用される薬品と反応しない構成であれば、その大きさや高さ、開口の形状、材質等は使い勝手に応じて自由に決定してよい。枠状のセル壁５の材質は、特に黒等の有色樹脂で形成することが好ましい。この有色樹脂材料は、試薬、溶媒等との反応性、相溶性がなく、成形性が良いものであれば特に制限はなく、例えばアクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂等を使用することができる。
枠状のセル壁５は、光導波路層を形成する基板１の全反射面を構成する主面に開口する反応ホール４を塞ぐように例えばＵＶ硬化性接着剤によって直接接着されている。枠状のセル壁５は、反応ホール４内に投入される試薬・検体溶液・洗浄液等の薬液が外部に漏出しないように囲うものである。したがって、枠状のセル壁端部によって規定される基板表面からの高さ（厚さ）は、撥水性樹脂膜３の高さよりも高く形成されている。
撥水性樹脂膜３は、基板１の全反射面を構成する主面のうち、抗体固定化層７の少なくとも一部、および枠状のセル壁５が設けられる領域以外を覆うように配設される。撥水性樹脂膜３には、基板１下方から入射される光を外部に漏らさないように、遮光性がある黒等の有色樹脂を用いるのが好ましい。撥水性樹脂は、特にフッ素樹脂が好適である。
抗体固定化層７は、例えば抗体を架橋高分子で固定化した構造を有する。抗体固定化層７で用いられる架橋高分子は、基板表面にシランカップリング剤によりアミノ基等の官能基を導入し、グルタルアルデヒド等の架橋剤により基板に導入したアミノ基と抗体のアミノ基を架橋する。なお、架橋に利用する官能基はアミノ基に限定されない。
例えば光架橋性ポリビニルアルコールのような水素結合性の官能基を含む高分子を挙げることができる。抗体は一般的に親水性であるので、抗体固定化層も親水性を有しているものが好ましい。
抗体固定化層７の厚さ（光導波路層表面から抗体固定化層の表面までの距離）は、３０ｎｍ〜５００ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍ以下、最も好ましくは８０ｎｍ以下であることが望ましい。
抗体固定化層は、緩衝剤および塩を少なくとも含む膜を有する。緩衝剤および塩の組合せとしては、例えばＴＢＳ［トリス（Ｔｒｉｓ）バッファー＋ＮａＣｌ］を挙げることができる。特に、ＴＢＳの中で１００ｍＭトリス＋１００ｍＭ ＮａＣｌは、抗体固定化層に塗布、乾燥し、窒素雰囲気の封入した状態で例えば４日間保存した後において、ＮａＣｌの結晶が生成せず、良好に分散した均一な表面状態を維持でき、保存耐久性も期待できるために好ましい。
また、前記ＴＢＳにキャリアタンパクとなる物質、例えばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、を加えることが保存時の安定性の向上の上で好ましい。なお、ＢＳＡは検体反応時に非特異結合を防ぐ効果も期待できる。界面活性剤としては、イオン性、非イオン性、両性、それぞれが利用可能で、米国Atlas powder社の商品名、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０として市販されているものを使用することができる。これらの添加成分の中で、ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ２０が好ましく、特に前記１００ｍＭ−トリス＋１００ｍＭ−ＮａＣｌの組成割合のＴＢＳにＢＳＡおよびＴｗｅｅｎ２０をそれぞれ０．１％、０．０１％加えた、すなわち１００ｍＭトリス＋１００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、組成を持つ膜を抗体固定化層に形成した光導波路型抗体チップは、検体溶液中の抗原(例えば血漿中のインスリン）の測定においてＥＬＩＳＡによる測定濃度値との相関性が最も高い特性を有するために好ましい。
次に、実施形態に係る光導波路型抗体チップの製造工程の一例を図３および図４を参照して説明する。
図３の（Ａ）に示すようにまず、例えばホウケイ酸ガラスからなる基板１の表面に、例えば酸化チタンをスパッタ又はスピン塗布し、酸化チタン薄膜２を形成する。
次いで、図３の（Ｂ）に示すように酸化チタン薄膜２をフォトエッチング技術で選択エッチングしてパターニングすることにより、両端部表面上に入射側グレーティング２ａおよび出射側グレーティング２ｂを形成する。これによって、厚さが１μｍ程度でグレーティングを有する光導波路層が形成される。
次いで、図３の（Ｃ）に示すように入射側グレーティング２aおよび出射側グレーティング２ｂを含む基板１表面の反応ホール４およびこの反応ホール４に例えば同心円状に配置されたリング状のセル壁形成領域８を除く部分に撥水性樹脂、例えば遮光性有色フッ素樹脂を印刷することにより撥水性樹脂３を形成する。
次いで、図４の（Ｄ）に示すように撥水性樹脂３のリング状のセル壁形成領域８に例えば黒色ＡＢＳ樹脂等からなる枠状(例えばリング状）のセル壁５を紫外線硬化性接着剤を介して嵌合させ、この接着剤を紫外線照射で硬化させることによって前記枠状のセル壁５を基板１表面に接着し、セル６を形成する。
次いで、図４の（Ｅ）に示すように反応ホール４内に抗体固定化層７を形成する。
前記抗体固定化層７は、具体的には以下の手法で作製する。
（１）シランカップリング剤であるアミノプロピルトリメトキシシランを用いて、反応ホール４から露出する基板１表面部分にシランカップリング処理を施し、基板１表面をアミノ基で修飾する。
（２）次に、グルタルアルデヒド処理を施し、架橋による抗体を基板１に固定化する。
（３）洗浄等を施した後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等によってブロッキングして反応ホール４から露出する基板１表面に抗体固定化層７を形成する。
このような抗体固定化層７の形成後にこの抗体固定化層７表面に少なくとも緩衝剤および塩を含む溶液でマスキング、例えば滴下、乾燥することにより光導波路型抗体チップを製造する。
次に、前述した図１および図２の光導波路型抗体チップを用いて実施形態に係る抗原測定方法を説明する。
まず、セル６内の抗体固定化層７に検体溶液を滴下して抗原抗体反応させることにより一次抗体−抗原複合体を形成する、すなわち検体溶液の抗原を抗体固定化層７に固定化する。抗体固定化層上に酵素標識された二次抗体を滴下し、一次抗体−抗原−二次抗体複合体を形成した後、発色試薬溶液を滴下して前記標識酵素と反応させ、発色する酵素反応物を生成する。
次いで、発色試薬溶液の滴下前後の光導波路型抗体チップの基板１裏面から光(例えばレーザ光）を入射し、入射側グレーティング２ａから前記基板１の光導波路層を通して前記抗体固定化層７に照射、つまり光導波路層と抗体固定化層７との界面で全反射させ、光導波路層を通して出射側グレーティング２ｂから出射された光を受光して光の物理量を測定し、測定された光の物理量に基づいて前記検体溶液中の抗原の濃度を算出する。すなわち、光導波路層内を伝播する全反射光のエバネッセント波は前記酵素反応物が存在する抗体固定化層７において全反射する際、この酵素反応物との相互作用により、酵素反応物の量に相応する光の物理量、例えば光強度の減衰作用を受ける。発色試薬溶液の滴下前の酵素反応物が存在しない場合と発色試薬溶液の滴下後の酵素反応物が存在する場合とにおける全反射させた光の強度変化（光の強度差）を求め、この光強度差を予め作成した検量線、すなわち既知の抗原濃度と既知の抗原を光導波路型抗体チップを用いて測定した前記光強度の差の関係を持つ検量線、に照合させることによって、検体溶液中の測定対象となる抗原の濃度を算出して、検体溶液中の測定対象物質の濃度測定を行うことが可能になる。
前記標識酵素に用いる酸化還元酵素には特に制限はなく、例えば、西洋ワサビ、牛乳、白血球等から抽出したペルオキシダーゼ、カタラーゼ等の活性酵素が挙げられる。これらの中では、西洋ワサビ、ペルオキシダーゼが特に好ましい。
前記発色試薬の好ましい態様は、発色基質がベンジジン系発色剤であり、標識酵素の基質が過酸化物である。ベンジジン系発色剤としては、例えば４−クロロ−１−ナフトール、３，３’−ジアミノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等が挙げられる。これらの中では、測定感度の観点から、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（以下、ＴＭＢＺという）又はその塩酸塩（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン・２ＨＣｌ・２Ｈ２Ｏ）が好ましい。過酸化物としては、例えば過酸化水素等を用いることができる。
次に、前記光導波路型抗体チップを用いた抗原濃度の測定方法をより具体的に説明する。
光導波路型抗体チップの反応ホール４内の基板１の表面には、タンパク質、ＤＮＡ等の測定対象となる抗原(例えばインスリン)を特異的に認識する一次抗体からなる抗体固定化層７が形成されている。この反応ホール４内の抗体固定化層７上に抗原を含む検体溶液を例えば１．０〜５μＬ滴下すると、抗原が一次抗体と結合し、一次抗体／抗原の免疫複合体を形成する。
次いで、一次抗体に結合した抗原以外の検体溶液の洗浄効果を高めるために界面活性剤を添加したトリス緩衝液（ＴＢＳ）等の洗浄液によって洗浄する。
次いで、酵素標識されている二次抗体溶液を滴下する。酵素標識されている二次抗体溶液を滴下すると、二次抗体は一次抗体とは別の部位で抗原にさらに結合する。その結果、一次抗体／抗原／二次抗体からなる免疫複合体が形成される。なお、二次抗体に標識されている標識酵素として、例えば酸化還元酵素としてペルオキシダーゼ等を用いることができる。
次いで、免疫複合体を形成しなかった二次抗体を含む二次抗体溶液を前記ＴＢＳ緩衝液等の洗浄液によって再洗浄する。
次いで、洗浄に使用した界面活性剤を取り除き、安定化させるためにリン酸緩衝液のみを注入する。
次いで、光導波路型抗体チップの入射側グレーティング２ａに向けて発光素子からレーザ光等を照射して、レーザ光等を光導波路層内に伝播させる。光導波路層の表面からエバネッセント波が生じる。この伝播光を出射側グレーティング２ｂからの反射光として受光素子で受光し、基準反射光強度として測定する。
次いで、抗体チップの抗体固定化層７を含むセル６に発色試薬溶液を滴下する。発色試薬溶液としては、例えばｐＨ＝４．９の緩衝液中に、酢酸、ＴＭＢＺ、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ジメチルスルホキシド等の少量の有機溶媒を含む溶液を使用することが好ましい。発色試薬溶液の滴下によりペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）等の標識酵素と、標識酵素（ＰＯＤ）の基質であるＨ2Ｏ2との酸化還元酵素反応によりラジカル酸素原子（Ｏ＊）が生成される。この酵素反応により生成されるラジカル酸素原子（Ｏ＊）により発色試薬が酸化され、例えばＴＭＢＺの−ＮＨ2基が＝ＮＨ基に酸化され、青緑色に発色し、さらに不溶化し、抗体固定化層７内（基板１表面）に沈澱する。
次いで、基準反射光強度を測定したのと同様に光導波路型抗体チップの基板１にレーザ光を入射させる。すなわち、光導波路型抗体チップの入射側グレーティング２ａに向けて発光素子からレーザ光等を照射すると、入射したレーザ光が入射側グレーティング２ａを介して光導波路層である基板１内を全反射で伝播する。レーザ光が全反射するとき、光導波路層表面にエバネッセント波が生じる。このエバネッセント波は沈澱した酵素反応物に吸収される。この作用に基づき光導波路層を伝播する光に極微な変化を与える。出射側グレーティング２ｂからの反射光を受光素子で受光し、発色後の反射光強度を測定する。
次いで、既に測定した基準反射光強度と発色後の反射光強度との光強度の差を予め作成した検量線、すなわち既知の抗原濃度と既知の抗原濃度を有する検体溶液を光導波路型抗体チップを用いて測定した基準反射光強度と発色後の反射光強度との光強度の差の関係を持つ検量線、に照合させることによって、検体溶液中の抗原（例えばインスリン、タンパク質）の濃度を算出することができる。
このような抗原濃度の測定において、検体溶液中の不純物(例えば血漿中の脂質）が抗体固定化層の抗体と検体溶液中の抗原との間の抗原抗体反応を阻害する物質として作用するため、基準反射光強度と発色後の反射光強度との光強度の差は抗原抗体反応が阻害されない場合に比べて小さくなる。その結果、前記検量線との照合で求めた抗原の濃度は実際の検体溶液中の抗原濃度に比べて低い値として算出される。また、この抗原の濃度の低下度合も検体溶液中の不純物量等により影響されてばらつく。
そこで、実施形態に係る光導波路型抗体チップの抗体固定化層に少なくとも緩衝剤および塩を含む膜を形成することによって、抗体固定化層の抗体と検体溶液中の抗原との間の抗原抗体反応を阻害する物質の影響を抑制することができる。その結果、濃度測定において、基準反射光強度と発色後の反射光強度との光強度の差を予め作成した検量線に照合させて求めた抗原の濃度は、実際の検体溶液中の抗原濃度に近似した値として算出することが可能になる。すなわち、検体溶液中の抗原濃度を高精度で測定することが可能になり、例えば検体溶液中の抗原濃度をＥＬＩＳＡによる測定濃度値と高い相関性をもって測定することが可能になる。
前記検体溶液は、例えば全血、血清、血漿のいずれかを用いることができる。実施形態に係る光導波路型抗体チップは基板表面の光導波路層の一部に位置する反応ホール内の抗体固定化層で一次反応、二次反応、酵素反応をさせた後、抗体固定化層の情報を光導波路層を伝播するエバネッセント波を利用して検出するため、測定に供する検体溶液の量はある一定量以上であればよく、測定に供する検体溶液の量が不正確でもインスリンのような抗原濃度を測定することが可能になる。
また、実施形態の抗原測定方法は従来法のようにマイクロプレートを用い、ウエルの透過光量のみを測定するのでなく、抗体固定化層で全反射する際に生じるエバネッセント波の吸収による反射光の光強度変化を観測するため、測定に必要な面積が縮小化でき、５μＬ以下、通常１．０〜５μＬ、好適条件では１．０〜２μＬの検体溶液の量でも測定が可能となる。
全反射させた光の強度測定においては、一般的に全反射させた光の０次光を用いるが、これに限らず、回折光、すなわち１次光、２次光、など全反射させた光の高次の光、その他の適宜な現象・方法を用いて観測しても構わない。
以下、本発明の実施例を説明する。
（実施例１）
前述した実施形態の方法で説明した図１および図２に示す光導波路型抗体チップを用いてラットのインスリン濃度の測定を行った。なお、基板１の光導波路層上の反応ホール４内の抗体固定化層７（直径２ｍｍの円形範囲）に抗インスリン抗体を固定化した。さらに、この抗体固定化層７に１００ｍＭトリス＋１００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（Atlas Powder社商品名）の溶液１．５μＬを滴下、乾燥した。
＜検量線の作成＞
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のラット（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのラットのインスリン溶液１．５μＬを光導波路型抗体チップのセル６内の抗体固定化層７に滴下し、３７℃で１０分間、一次反応させた後、ＴＢＳ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含有）で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで酵素標識された二次抗体溶液を滴下し、３７℃で１０分間二次反応させた。二次反応後、前記ＴＢＳ緩衝液で洗浄、さらに緩衝溶液で洗浄した。
次いで、光導波路型抗体チップの入射側グレーティング２ａに向けて発光素子からレーザ光を照射して光導波路層内を伝播させた。このとき、レーザ光は抗体固定化層７の裏面で全反射した。反射光は、出射側グレーティング２ｂにより基板１の外部に放射され、受光素子（フォトダイオード）で受光し、基準反射光強度として測定した。全反射が行われる際に抗体固定化層７のセンシングエリアに入射するエバネッセント波の吸収と反射に応じて、全反射後の光束の強度に変化が生じる。
次いで、基準反射光強度の測定後、発色試薬溶液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン１．１ｍｍｏｌ／Ｌ、過酸化水素１．９ｍｍｏｌ／Ｌ、ジメチルスルホキシド１容量％、酢酸緩衝液８０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．９）をセル６内の反応ホール４に滴下し、この直後から１０分間に亘って光導波路型抗体チップの入射側グレーティング２ａに向けて発光素子からレーザ光を照射し、光導波路層内を伝播させた。このとき、レーザ光は抗体固定化層７の裏面で全反射した。反射光は、出射側グレーティング２ｂにより基板１の外部に放射され、受光素子（フォトダイオード）で受光し、発色後の反射光強度として測定した。すなわち、発色試薬溶液の滴下直後から１０分間に亘って発色後の反射光強度の変化を測定した。
このような操作で測定した基準反射強度と発色後の反射光強度の差を求め、これらの反射光強度差とインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
＜ラットのインスリン濃度の実測＞
希釈倍率の異なる４種のラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに基準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前述した方法で作成した検量線に照合してラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１）のインスリン濃度を算出した。
算出した各ラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各ラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１）のインスリン濃度の測定値との関係を図５に示す。
(実施例２)
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のラット（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、実施例１と同様な構成の光導波路型抗体チップを用い、同様な方法により基準反射強度と発色後の反射光強度の差とラットのインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
希釈倍率の異なる４種のラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃２）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃２）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前記検量線に照合してラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃２）のインスリン濃度を算出した。
算出した各ラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃２）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各ラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃２）のインスリン濃度の測定値との関係を図５に示す。
(実施例３)
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のマウス（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、実施例１と同様な構成の光導波路型抗体チップを用い、同様な方法により基準反射強度と発色後の反射光強度の差とマウスのインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
希釈倍率の異なる４種のマウス（ｄｂ／ｄｂ＃３）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのマウス（ｄｂ／ｄｂ＃３）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前記検量線に照合してマウス（ｄｂ／ｄｂ＃３）のインスリン濃度を算出した。
算出した各マウス（ｄｂ／ｄｂ＃３）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各ラット（ｄｂ／ｄｂ＃３）のインスリン濃度の測定値との関係を図５に示す。
(実施例４)
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のマウス（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、実施例１と同様な構成の光導波路型抗体チップを用い、同様な方法により基準反射強度と発色後の反射光強度の差とマウスのインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
希釈倍率の異なる４種のマウス（ｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのマウス（ｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前記検量線に照合してマウス（ｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン濃度を算出した。
算出した各マウス（ｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各マウス（ｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン濃度の測定値との関係を図５に示す。
(比較例１)
基板の光導波路層上の反応ホール内の抗体固定化層（直径２ｍｍの円形範囲）に抗インスリン抗体を固定化した光導波路型抗体チップを用いてラットのインスリン濃度の測定を行った。すなわち、実施例１〜４のように１００ｍＭトリス＋１００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（Atlas Powder社商品名）の溶液の滴下、乾燥の処理を施さない抗体固定化層を備えた以外、前述した図１および図２と同様な構造の光導波路型抗体チップを用いた。
＜検量線の作成＞
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のラット（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのラットのインスリン溶液１．５μＬを光導波路型抗体チップのセル内の抗体固定化層に滴下し、３７℃で１０分間、一次反応させた後、ＴＢＳ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含有）で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで酵素標識された二次抗体溶液を滴下し、３７℃で１０分間二次反応させた。二次反応後、前記ＴＢＳ緩衝液で洗浄、さらに緩衝溶液で洗浄した。
次いで、光導波路型抗体チップの入射側グレーティングに向けて発光素子からレーザ光を照射して光導波路層内を伝播させた。このとき、レーザ光は抗体固定化層の裏面で全反射した。反射光は、出射側グレーティングにより基板の外部に放射され、受光素子（フォトダイオード）で受光し、基準反射光強度として測定した。全反射が行われる際に抗体固定化層７のセンシングエリアに入射するエバネッセント波の吸収と反射に応じて、全反射後の光束の強度に変化が生じる。
次いで、基準反射光強度の測定後、発色試薬溶液（テトラメチルベンジジン １．１ｍｍｏｌ／Ｌ、過酸化水素１．９ｍｍｏｌ／Ｌ、ジメチルスルホキシド１容量％、酢酸緩衝液８０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．９）をセル内の反応ホールに滴下し、この直後から１０分間に亘って光導波路型抗体チップの入射側グレーティングに向けて発光素子からレーザ光を照射して光導波路層内を伝播させた。このとき、レーザ光は抗体固定化層の裏面で全反射した。反射光は、出射側グレーティングにより基板の外部に放射され、受光素子（フォトダイオード）で受光し、発色後の反射光強度として測定した。すなわち、発色試薬溶液の滴下直後から１０分間に亘って発色後の反射光強度の変化を測定した。
このような操作で測定した基準反射強度と発色後の反射光強度の差を求め、これらの反射光強度差とインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
＜ラットのインスリン濃度の実測＞
希釈倍率の異なる４種のラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに基準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前述した方法で作成した検量線に照合してラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１）のインスリン濃度を算出した。
算出した各ラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各ラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１）のインスリン濃度の測定値との関係を図６に示す。
(比較例２)
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のラット（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、比較例１と同様な構成の光導波路型抗体チップを用い、同様な方法により基準反射強度と発色後の反射光強度の差とラットのインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
希釈倍率の異なる４種のラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃２）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃２）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前記検量線に照合してラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃２）のインスリン濃度を算出した。
算出した各ラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃２）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各ラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃２）のインスリン濃度の測定値との関係を図６に示す。
(比較例３)
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のマウス（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、比較例１と同様な構成の光導波路型抗体チップを用い、同様な方法により基準反射強度と発色後の反射光強度の差とマウスのインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
希釈倍率の異なる４種のマウス（ｄｂ／ｄｂ＃３）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのマウス（ｄｂ／ｄｂ＃３）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前記検量線に照合してマウス（ｄｂ／ｄｂ＃３）のインスリン濃度を算出した。
算出した各マウス（ｄｂ／ｄｂ＃３）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各マウス（ｄｂ／ｄｂ＃３）のインスリン濃度の測定値との関係を図６に示す。
(比較例４)
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のマウス（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、比較例１と同様な構成の光導波路型抗体チップを用い、同様な方法により基準反射強度と発色後の反射光強度の差とマウスのインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
希釈倍率の異なる４種のマウス（ｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのマウス（ｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前記検量線に照合してマウス（ｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン濃度を算出した。
算出した各マウス（ｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各マウス（ｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン濃度の測定値との関係を図６に示す。
図５から明らかなように実施例１〜４により算出した各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｙ）とＥＬＩＳＡ法による各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｘ）の関係は、ｙ＝１．０６８２ｘの一次関数として表され、かつ相関係数（Ｒ2）は０．９６１６であり、ＥＬＩＳＡ法による各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値に対して非常に高い相関を示し、高精度のインスリン濃度測定が可能であることがわかる。
これに対し、比較例１〜４により算出した各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｙ）とＥＬＩＳＡ法による各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｘ）の関係は図６から明らかなようにｙ＝０．４７８４ｘの一次関数として表され、かつ相関係数（Ｒ2）は０．６８４であり、ＥＬＩＳＡ法による各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値に対する相関性が低く、インスリン濃度測定の精度が低いことがわかる。
(実施例５)
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のマウス（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、実施例１と同様な構成の光導波路型抗体チップを用い、同様な方法により基準反射強度と発色後の反射光強度の差とマウスのインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
希釈倍率の異なるマウス（ｏｂ／ｏｂ＃Ａ）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのマウス（ｏｂ／ｏｂ＃Ａ）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前記検量線に照合してマウス（ｏｂ／ｏｂ＃Ａ）のインスリン濃度を算出した。
算出した各ラット（ｏｂ／ｏｂ＃Ａ）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各ラット（ｏｂ／ｏｂ＃Ａ）のインスリン濃度の測定値との関係を図７に示す。
(実施例６)
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のマウス（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、実施例１と同様な構成の光導波路型抗体チップを用い、同様な方法により基準反射強度と発色後の反射光強度の差とマウスのインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
希釈倍率の異なるマウス（ｏｂ／ｏｂ＃Ｂ）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのマウス（ｏｂ／ｏｂ＃Ｂ）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前記検量線に照合してマウス（ｏｂ／ｏｂ＃Ｂ）のインスリン濃度を算出した。
算出した各マウス（ｏｂ／ｏｂ＃Ｂ）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各マウス（ｏｂ／ｏｂ＃Ｂ）のインスリン濃度の測定値との関係を図７に示す。
(実施例７)
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のラット（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、実施例１と同様な構成の光導波路型抗体チップを用い、同様な方法により基準反射強度と発色後の反射光強度の差とラットのインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
希釈倍率の異なるラット（ＷＢＮ）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのラット（ＷＢＮ）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前記検量線に照合してラット（ＷＢＮ）のインスリン濃度を算出した。
算出した各ラット（ＷＢＮ）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各ラット（ＷＢＮ）のインスリン濃度の測定値との関係を図７に示す。
(実施例８)
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のラット（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、実施例１と同様な構成の光導波路型抗体チップを用い、同様な方法により基準反射強度と発色後の反射光強度の差とラットのインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
希釈倍率の異なるラット（ＳＨＲ）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのラット（ＳＨＲ）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前記検量線に照合してラット（ＳＨＲ）のインスリン濃度を算出した。
算出した各ラット（ＳＨＲ）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各ラット（ＳＨＲ）のインスリン濃度の測定値との関係を図７に示す。
(実施例９)
検体溶液として３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬ濃度のラット（スタンダード）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、実施例１と同様な構成の光導波路型抗体チップを用い、同様な方法により基準反射強度と発色後の反射光強度の差とラットのインスリン濃度３．２ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬとをプロットして検量線(横軸；反射光強度差、縦軸；インスリン濃度）を作成した。
希釈倍率の異なるラット（Ｗｉｓｔａｒ＃１）のインスリン溶液１．５μＬを用意し、これらのラット（Ｗｉｓｔａｒ＃１）のインスリン溶液を前記検量線の作成と同様な操作で基準反射光強度および発色後の反射光強度を測定し、さらに準反射光強度および発色後の反射光強度の差を求めた。これらの反射強度差を前記検量線に照合してラット（Ｗｉｓｔａｒ＃１）のインスリン濃度を算出した。
算出した各ラット（Ｗｉｓｔａｒ＃１）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各ラット（Ｗｉｓｔａｒ＃１）のインスリン濃度の測定値との関係を図７に示す。
なお、図７には前述した実施例１〜４により算出された各種ラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１，Ｚｕｃｋｅｒ＃２）と各種マウス（ｄｂ／ｄｂ＃３およびｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン濃度の測定値とＥＬＩＳＡ法による各種ラット（Ｚｕｃｋｅｒ＃１，Ｚｕｃｋｅｒ＃２）と各種マウス（ｄｂ／ｄｂ＃３およびｄｂ／ｄｂ＃５）のインスリン濃度の測定値との関係を併記する。
図７から明らかなように実施例１〜９により算出した各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｙ）とＥＬＩＳＡ法による各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｘ）の関係は、ｙ＝１．１０５４ｘの一次関数として表され、かつ相関係数（Ｒ2）は０．９３５５であり、ＥＬＩＳＡ法による各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値に対して非常に高い相関を示し、高精度のインスリン濃度測定が可能であることがわかる。
本発明の実施形態に係る光導波路型抗体チップの一例を示す平面図。 図１のII−II線に沿う断面図。 本発明の実施形態に係る光導波路型抗体チップの製造工程を示す断面図。 本発明の実施形態に係る光導波路型抗体チップの製造工程を示す断面図。 実施例１〜４により算出した各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｙ）とＥＬＩＳＡ法による各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｘ）の関係を示す図。 比較例１〜４により算出した各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｙ）とＥＬＩＳＡ法による各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｘ）の関係を示す図。 実施例１〜９により算出した各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｙ）とＥＬＩＳＡ法による各種ラット、各種マウスのインスリン濃度の測定値（ｘ）の関係を示す図。
符号の説明
１…基板、２ａ，２ｂ…グレーティング、４…反応ホール、５…セル壁、７…抗体固定化層。

Claims (6)

  1. 透光性を有する基板と、
    前記基板の主面に互いに距離をあけて配置された入射側光学要素および出射側光学要素と、
    前記光学要素間に形成された光導波路層を含む基板の主面に前記光導波路層の一部が露出するよう開口して反応ホールを形成するように被覆された撥水性樹脂膜と、
    前記光導波路層上に前記反応ホールを取り囲むように固定され、前記反応ホールと共に検体溶液の注入、排出が可能なセルを形成する枠状のセル壁と、
    前記反応ホールの底に形成され、表面に１００ｍＭトリスおよび１００ｍＭ ＮａＣｌを少なくとも含む膜を有する抗体固定化層と
    を備えることを特徴とする光導波路型抗体チップ。
  2. 前記抗体固定化層表面の膜は、さらにキャリアタンパクおよび界面活性剤から選ばれる少なくとも１つの物質を含むことを特徴とする請求項１記載の光導波路型抗体チップ。
  3. 透光性を有する基板と、この基板の主面に互いに距離をあけて配置され、光導波路層を形成するための入射側光学要素および出射側光学要素と、これらの光学要素間に形成された光導波路層を含む基板の主面に前記光導波路層の一部が露出するよう開口して反応ホールを形成するように被覆された撥水性樹脂膜と、前記光導波路層上に前記反応ホールを取り囲むように固定され、前記反応ホールと共に検体溶液の注入、排出が可能なセルを形成する枠状のセル壁と、前記反応ホールの底に形成され、表面に１００ｍＭトリスおよび１００ｍＭ ＮａＣｌを少なくとも含む膜を有する抗体固定化層を備える光導波路型抗体チップを用いて抗原測定を行う方法であって、
    前記セル内の抗体固定化層上に検体溶液を滴下し、一次抗体−抗原複合体を形成する工程と、
    前記抗体固定化層上に酵素標識された二次抗体を滴下し、一次抗体−抗原−二次抗体複合体を形成する工程と、
    前記抗体固定化層上に発色試薬を滴下して前記標識酵素と反応させ、発色する酵素反応物を生成する工程と、
    発色試薬の滴下前後の基板に対し、光を前記入射側光学要素から前記基板の光導波路層を通して前記抗体固定化層に照射し、光導波路層を通して前記出射側光学要素から出射された光を受光して発色試薬の滴下前後の光の強度を測定し、これらの光強度の差に基づいて前記検体溶液中の抗原濃度を算出する工程と
    を含むことを特徴とする抗原測定方法。
  4. 前記検体溶液は、全血、血清、血漿のいずれかであることを特徴とする請求項３記載の抗原測定方法。
  5. 表面に緩衝剤および塩を少なくとも１つ含む膜を有する前記抗体固定化層は、前記基板の反応ホールの底に抗体を固定化した後、その抗体固定化層表面を１００ｍＭトリスおよび１００ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液で処理し、乾燥することにより形成されることを特徴とする請求項３記載の抗原測定方法。
  6. 前記検体溶液中の抗原濃度の算出は、前記光強度の差を既知の抗原濃度と既知の抗原濃度を有する検体溶液を前記光導波路型抗体チップを用いて測定した発色試薬の滴下前後の光の強度の差の関係を持つ検量線に照合させることによりなされることを特徴とする請求項３記載の抗原測定方法。
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