CN110133269A - 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法及检测卡 - Google Patents
一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法及检测卡 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及丙肝病毒检测领域,公开了一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法及检测卡,采用双抗体与双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒抗原抗体,将待测样本与样本稀释液混合,样本中的HCV抗体与HCV核心抗原分别跟生物素标记抗原和生物素标记抗体反应,再取混合后的样本一次性加入试纸卡中,以此实现对HCV抗原抗体的联合检测。本发明不仅避免了HCV抗原抗体之间的相互干扰,一次性检测HCV抗原抗体,而且能区分HCV抗原阳性、HCV抗体阳性,或二者同为阳性,提高了HCV病毒检测的准确度和灵敏度,可用于HCV的早期筛查与临床的辅助诊断,以弥补HCV抗体诊断试剂盒在感染“窗口期”的漏检,达到HCV抗体检测与HCV抗原检测的互补效果,既提高了工作效率,又节约了成本。
Description
技术领域
本发明涉及丙肝病毒检测领域,更具体地说,特别涉及一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法及检测卡。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)是1989年发现的非甲非乙肝炎病毒。主要通过输血、静脉注射等途径传播,危害大、病死率较高。由于市场暂无疫苗预防,因此研制HCV的快速且能广泛应用的检测方法具有重要意义。
目前,丙型肝炎病毒抗体检测是使用最广泛的检测方法,但其缺点是存在较长的“窗口期”,HCV感染后至HCV抗体产生之前还有一段约40-70天的较长时期(平均66天),此时献血员已被感染并具有传染性,应用目前的第三代和四代EIA检测试剂都不能检出,称为感染后血清阳转前的“窗口期”(preseroconversion window phase,PWP)。PWP的存在,是输血安全的重要威胁之一,使受血者依然有输入抗HCV筛选阴性的血液而感染HCV的危险。
HCV核心抗原是HCV感染的早期标志,在HCV RNA出现后的1-2天内即出现HCV核心抗原,且与HCV RNA的水平相平行,可以作为HCV复制的标志。有研究表明,HCV核心抗原检测与抗体检测相比,HCV核心抗原的检测可使检测的“窗口期”平均提前49天,缩短“窗口期”感染的风险。将两者功能结合起来的HCV抗原抗体联合检测试剂盒既可以缩短检测的“窗口期”,用于HCV的早期筛查,也可以作为HCV临床的辅助诊断,同时也可以提高工作效率、节约成本。
在现有技术中,HCV抗原抗体联合检测试剂盒基本是酶联免疫法、化学发光法和时间分辨荧光分析法,其方法均有一定的局限性。近年来,量子点正慢慢取代分子荧光团而成为最有前景的一类纳米荧光探针材料,相对于传统的有机荧光染料,量子点具有许多优异的光学性质:第一,量子点具有宽激发和窄发射波长范围,荧光发射峰窄而对称,并且连续分布,重叠小。而传统的有机荧光染料的激发光波长范围较窄,发射峰宽且拖尾严重,难用于多组分的同时分析检测。第二,量子点的荧光发射波长可以通过控制其粒径大小和组成材料来调节,从而可以获得多种可分辨的颜色。使用同一种激发光同时激发多种量子点,发射出不同波长的荧光,因而可用于多种标记物的同时检测,极大地促进了荧光标记在生物医学中的应用。第三,量子点荧光量子产率高,而且抗光漂白能力强,荧光稳定性好且荧光寿命长。而不像传统的有机荧光染料那样容易发生荧光猝灭,这也为研究细胞中生物分子之间长期相互作用提供了有力的工具。第四,量子点具有良好的生物相容性。这些优异的光学性质使量子点成为一种理想的荧光探针,其具有独特的光学、电学和表面可修饰性等特点,已被广泛应用于物理、化学、电学和生物学领域,尤其是作为荧光标记物在生物学领域的应用最为广泛。
公开号为CN102928595A的中国发明专利“丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法”所述运用三个独立包装的酶工作液,即HCV抗原抗体联合检测酶工作液、HCV抗原酶工作液和HCV抗体酶工作液可实现区分所检测样本为HCV抗原阳性、HCV抗体阳性,或是二者同为阳性,虽然解决了一问题,但不能通过一次加样在同一实验中完成,又增加了检测成本。其次,专利中只考虑了对人抗鼠IgG的封闭,同时也未提到使用灵敏度更高的生物素-链霉亲和素放大检测系统。
公开号为CN104237520A的中国发明专利“一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法”所述运用辣根过氧化物酶标记HCV嵌合抗原,碱性磷酸酶标记HCV单克隆抗体通过两种发光底物来实现HCV抗原与抗体的检测,但加入第2种底物比第1种底物多一步洗板步骤,这样多次洗涤对第2种底物催化灵敏度造成一定影响。其次,专利所述未提到试剂盒的稳定性和如何避免异常IgG的非特异性反应。
公开号为CN104914244A的中国发明专利“一种化学发光法联合检测丙肝病毒抗原-抗体的试剂盒”所述使用化学发光法联合检测HCV抗原和抗体,不能区分检测样本是HCV抗原阳性、HCV抗体阳性、或是二者同为阳性,且操作步骤繁琐。其次,专利所述未提到试剂盒的稳定性和如何避免异常IgG的非特异性反应。
以上专利均未提到检测全血样本。本发明利用量子点的稳定性好、激发普宽、发射谱窄,以及生物相溶性良好与荧光寿命长的特点,制备一种快速、简单、灵敏度高、重复性好的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测荧光免疫层析试纸。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法及检测卡,本发明采用双抗体与双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒抗原抗体,将待测样本与样本稀释液混合,样本中的HCV抗体与HCV核心抗原分别跟生物素标记抗原和生物素标记抗体反应,再取混合后的样本一次性加入试纸卡中,样本中含有生物素的结合物与样本垫上的量子点偶联结合物反应,经层析作用,与NC膜上固相的HCV核心抗原单克隆抗体和HCV嵌合抗原反应,形成生物素抗体—抗原—抗体复合物和生物素嵌合抗原—抗体—抗原复合物,通过量子点荧光强弱判断待测样本中HCV核心抗原和HCV抗体是否为阳性,以此实现对HCV抗原抗体的联合检测。质控C线采用鸡IgY和兔抗鸡IgY之间的反应来判断检测试纸是否有效,与HCV检测系统不发生任何干扰反应。本发明不仅避免了HCV抗原抗体之间的相互干扰,一次性检测HCV抗原抗体,而且能区分HCV抗原阳性、HCV抗体阳性,或二者同为阳性,提高了HCV病毒检测的准确度和灵敏度,可用于HCV的早期筛查与临床的辅助诊断,以弥补HCV抗体诊断试剂盒在感染“窗口期”的漏检,达到HCV抗体检测与HCV抗原检测的互补效果,既提高了工作效率,又节约了成本。其次,本发明除检测血清和血浆外,还能检测全血。
为了达到上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法,包括:S1、使用生物素标记HCV嵌合抗原;S2、使用生物素标记HCV核心抗原单克隆抗体;S3、使用量子点偶联链霉亲和素;S4、使用量子点偶联兔抗鸡IgY;S5、制备样品垫处理液并用该样品垫处理液对样品垫进行处理;S6、将步骤S3制得的量子点偶联的链霉亲和素、步骤S4制得的量子点偶联的兔抗鸡IgY分别按一定的浓度稀释至同一缓冲液中并混匀,将该混合液体喷制在步骤S5所得的样品垫上,真空干燥;S7、将NC膜贴至PVC板上,再将HCV核心抗原单克隆抗体、HCV嵌合抗原与鸡IgY按一定浓度分别包被NC膜,依次作为检测T1线、T2线和质控C线;S8、对步骤S6制得的样品垫进行裁剪并与吸水纸贴至步骤S7所得的PCV板上。
进一步地,所述步骤S1包括:S100、将HCV嵌合抗原置于PH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中充分浸泡,并将所得混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h;S101、取适量生物素并与预冷的超纯水配制成浓度为5mg/ml的生物素溶液;S102、按生物素与HCV嵌合抗原为固定摩尔比添加步骤S101制得的生物素溶液与步骤S100制得的HCV嵌合抗原制得混合液体,并将该混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h,所述摩尔比为50:1;S103、将步骤S102透析制得的生物素标记的抗原结合物取出并加入等体积的甘油,并置于-20℃的环境下保存备用。
进一步地,所述步骤S2包括:S200、将HCV核心抗原单克隆抗体置于PH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中充分浸泡,并将所得混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h;S201、取适量生物素并与预冷的超纯水配制成浓度为5mg/ml的生物素溶液;S202、按生物素与HCV核心抗原单克隆抗体为固定摩尔比添加步骤S201制得的生物素溶液与步骤S200制得的HCV核心抗原单克隆抗体制得混合液体,并将该混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h,所述摩尔比为50:1;S203、将步骤S202透析制得的生物素标记的抗原结合物取出并加入等体积的甘油,并置于-20℃的环境下保存备用。
进一步地,所述步骤S3包括:S300、将NHS与EDC分别以0.5mg/mg与0.2mg/mg的质量比与量子点混合,室温反应10~30min;S301、将步骤S300所得混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加pH为7.5~8.5的碱性缓冲液进行溶解,混匀后冰浴超声3~5min;S302、将链霉亲和素以0.1~1mg/mg的质量比与量子点混合,室温旋转反应2h;S303、加入终浓度为1%的牛血清白蛋白,室温反应20~30min;S304、将步骤S303所得的混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加含1%牛血清白蛋白与0.1%吐温20进行溶解,置于2~8℃下保存备用。
进一步地,所述步骤S4包括:S400、将NHS与EDC分别以0.5mg/mg与0.2mg/mg的质量比与量子点混合,室温反应10~30min;S401、将步骤S400所得混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加pH为7.5~8.5的碱性缓冲液进行溶解,混匀后冰浴超声3~5min;S402、将兔抗鸡IgY以0.1~1mg/mg的质量比与量子点混合,室温旋转反应2h;S403、加入终浓度为1%的牛血清白蛋白,室温反应20~30min;S404、将步骤S403所得的混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加含1%牛血清白蛋白与0.1%吐温20进行溶解,置于2~8℃下保存备用。
进一步地,所述步骤步骤S5中的样品垫为玻璃纤维素膜,其处理过程包括:S500、使用样品垫处理液对样品垫进行浸泡处理;S501、取出步骤S500中浸泡过的样品垫并将其置于37℃干燥12~24h;S502、将步骤S502所得的样品垫置于37℃干燥12~24h。
本发明还提供一种检测卡,包括卡壳上盖和卡壳下盖,所述卡壳上盖上开设有加样孔和检测观察孔,所述卡壳上盖和卡壳下盖之间设有试纸条,所述试纸条包括PVC底板、样品垫、吸水纸和NC膜,所述样品垫、吸水纸和NC膜安装在PVC底板的上表面,且NC膜位于样品垫和吸水纸之间,所述NC膜上设有质控线C线、检测T1线和检测T2线,所述质控线C线、检测T1线和检测T2线使用上述任意一项方法所制得的处理后的HCV核心抗原单克隆抗体、HCV嵌合抗原与鸡IgY进行包被处理。
进一步地,所述卡壳下盖上设有用于对试纸条进行限位的一对限位槽,所述限位凹槽内设有凸点,可以增加样品垫放置时的稳定性。
进一步地,所述卡壳上盖和卡壳下盖通过固定栓连接。
进一步地,所述卡壳上盖和检测观察孔之间设有截流板。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
本发明采用双抗体与双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒抗原抗体,将待测样本与样本稀释液混合,样本中的HCV抗体与HCV核心抗原分别跟生物素标记抗原和生物素标记抗体反应,再取混合后的样本一次性加入试纸卡中,样本中含有生物素的结合物与样本垫上的量子点偶联结合物反应后,经层析作用,与NC膜上固相的HCV核心抗原单克隆抗体和HCV嵌合抗原反应,形成生物素抗体—抗原—抗体复合物和生物素嵌合抗原—抗体—抗原复合物,通过量子点荧光强弱判断待测样本中HCV核心抗原和HCV抗体是否为阳性,以此实现对HCV抗原抗体的联合检测。质控C线采用鸡IgY和兔抗鸡IgY之间的反应来判断检测试纸是否有效,与HCV检测系统不发生任何干扰反应。本发明不仅避免了HCV抗原抗体之间的相互干扰,一次性检测HCV抗原抗体,而且能区分HCV抗原阳性、HCV抗体阳性,或二者同为阳性,提高了HCV病毒检测的准确度和灵敏度,可用于HCV的早期筛查与临床的辅助诊断,以弥补HCV抗体诊断试剂盒在感染“窗口期”的漏检,达到HCV抗体检测与HCV抗原检测的互补效果,既提高了工作效率,又节约了成本。其次,本发明除检测血清和血浆外,还能检测全血。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图说明
图1是本发明中方法流程图;
图2是本发明中使用生物素标记HCV嵌合抗原的方法流程图;
图3是本发明中使用生物素标记HCV核心抗原单克隆抗体的方法流程图;
图4是本发明中使用量子点偶联链霉亲和素的方法流程图;
图5是本发明中使用量子点偶联兔抗鸡IgY的方法流程图;
图6是本发明中样品垫处理过程的方法流程图;
图7是本发明中卡壳上盖的结构示意图;
图8是本发明中卡壳下盖的结构示意图;
图9是本发明中样品垫处的结构示意图。
附图标记:1、卡壳上盖;2、加样孔;3、固定栓;4、截流板;5、检测观察孔;6、卡壳下盖;7、限位槽;8、PVC底板;9、样品垫;10、吸水纸;11、NC膜;12、质控线C线;13、检测T1线;14、检测T2线、15凸点。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细阐述,以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解,从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
请参阅图1所示,本发明提供一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法,包括:S1、使用生物素标记HCV嵌合抗原;S2、使用生物素标记HCV核心抗原单克隆抗体;S3、使用量子点偶联链霉亲和素;S4、使用量子点偶联兔抗鸡IgY;S5、制备样品垫处理液并用该样品垫处理液对样品垫进行处理;S6、将步骤S3制得的量子点偶联的链霉亲和素、步骤S4制得的量子点偶联的兔抗鸡IgY分别按一定的浓度稀释至同一缓冲液中并混匀,将该混合液体喷制在步骤S5所得的样品垫上,真空干燥;S7、将NC膜贴至PVC板上,再将HCV核心抗原单克隆抗体、HCV嵌合抗原与鸡IgY按一定浓度分别包被NC膜,依次作为检测T1线、T2线和质控C线;S8、对步骤S6制得的样品垫进行裁剪并与吸水纸贴至步骤S7所得的PCV板上。
请参阅图图2所示,所述步骤S1包括:S100、将HCV嵌合抗原置于PH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中充分浸泡,并将所得混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h;S101、取适量生物素并与预冷的超纯水配制成浓度为5mg/ml的生物素溶液;S102、按生物素与HCV嵌合抗原为固定摩尔比添加步骤S101制得的生物素溶液与步骤S100制得的HCV嵌合抗原制得混合液体,并将该混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h,所述摩尔比为50:1;S103、将步骤S102透析制得的生物素标记的抗原结合物取出并加入等体积的甘油,并置于-20℃的环境下保存备用。
请参阅图3所示,所述步骤S2包括:S200、将HCV核心抗原单克隆抗体置于PH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中充分浸泡,并将所得混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h;S201、取适量生物素并与预冷的超纯水配制成浓度为5mg/ml的生物素溶液;S202、按生物素与HCV核心抗原单克隆抗体为固定摩尔比添加步骤S201制得的生物素溶液与步骤S200制得的HCV核心抗原单克隆抗体制得混合液体,并将该混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h,所述摩尔比为50:1;S203、将步骤S202透析制得的生物素标记的抗原结合物取出并加入等体积的甘油,并置于-20℃的环境下保存备用。
请参阅图4所示,所述步骤S3包括:S300、将N-羟基琥珀酰亚胺NHS与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC分别以0.5mg/mg与0.2mg/mg的质量比与量子点混合,室温反应10~30min;S301、将步骤S300所得混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加pH为7.5~8.5的碱性缓冲液进行溶解,混匀后冰浴超声3~5min;S302、将链霉亲和素以0.1~1mg/mg的质量比与量子点混合,室温旋转反应2h;S303、加入终浓度为1%的牛血清白蛋白,室温反应20~30min;S304、将步骤S303所得的混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加含1%牛血清白蛋白与0.1%吐温20进行溶解,置于2~8℃下保存备用。
请参阅图5所示,所述步骤S4包括:S400、将NHS与EDC分别以0.5mg/mg与0.2mg/mg的质量比与量子点混合,室温反应10~30min;S401、将步骤S400所得混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加pH为7.5~8.5的碱性缓冲液进行溶解,混匀后冰浴超声3~5min;S402、将兔抗鸡IgY以0.1~1mg/mg的质量比与量子点混合,室温旋转反应2h;S403、加入终浓度为1%的牛血清白蛋白,室温反应20~30min;S404、将步骤S403所得的混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加含1%牛血清白蛋白与0.1%吐温20进行溶解,置于2~8℃下保存备用。
请参阅图6所示,所述步骤S5中制备样品垫处理液并用该样品垫处理液对样品垫进行处理的具体过程包括以下。
样本稀释液制备:样本稀释液所采用的缓冲液为磷酸盐缓冲液PH6.0-8.0,包含1-5mM的EDTA·2Na,2-10%海藻糖,0.1-2%的牛血清白蛋白,0.01-1%的表面活性剂吐温20或TritonX-100,0.01-0.05%的SDS,0.02-1%TCEP·HCl,0.01-1%防腐剂。其工作液将生物素标记的HCV嵌合抗原与生物素标记的HCV核心抗原单克抗体按一定浓度加入配制。
样品垫处理液制备:样品垫处理液所采用的缓冲液为碱性缓冲液PH7.2-10.0,如硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-cl缓冲液等,包含有0.1-2%牛血清白蛋白,2-10%的海藻糖,0.01-1%的表面活性剂吐温20或TritonX-100,0.01-2%小鼠血清、0.01-2%羊血清、0.01-2%的鼠抗人红细胞腹水。
量子点结合物稀释液制备:样品垫处理液所采用的缓冲液为碱性缓冲液PH7.2-10.0,如硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-cl缓冲液等,包含有0.1-2%牛血清白蛋白,2-10%的海藻糖,0.01-1%的表面活性剂吐温20或TritonX-100,0.1-1%聚乙二醇、0.1-1%聚乙烯吡咯烷酮。
NC膜包被液制备:样品垫处理液所采用的缓冲液为碱性缓冲液PH7.2-10.0,如硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-cl缓冲液等,包含有包含有包含有0.1-2%牛血清白蛋白,2-10%的海藻糖。
样品垫处理:样品垫为玻璃纤维素膜,其处理过程包括:S500、使用样品垫处理液对样品垫进行浸泡处理;S501、取出步骤S500中浸泡过的样品垫并将其置于37℃干燥12~24h;S502、将步骤S502所得的样品垫置于37℃干燥12~24h。
本方案还提供一种应用了上述方法的检测卡,包括卡壳上盖1和卡壳下盖6,所述卡壳上盖1和卡壳下盖6通过固定栓3连接,所述卡壳上盖1上开设有加样孔2和检测观察孔5,所述卡壳上盖1和检测观察孔5之间设有截流板4,所述卡壳上盖1和卡壳下盖6之间设有试纸条垫板,试纸条垫板上用于放置样品垫9。
本实施例中,所述卡壳下盖6上设有用于对试纸条进行限位的一对限位槽7,所述限位凹槽7内设有凸点15,可以增加样品垫放置时的稳定性。
本实施例中,所述试纸条包括PVC底板8、样品垫9、吸水纸10和NC膜11,所述样品垫9、吸水纸10和NC膜11安装在PVC底板8的上表面,且NC膜11位于样品垫9和吸水纸10之间。
本实施例中,所述NC膜11上设有质控线C线12、检测T1线13和检测T2线14,所述质控线C线12、检测T线13和检测T线14使用制得的处理后的HCV核心抗原单克隆抗体、HCV嵌合抗原与鸡IgY进行包被处理。
通过试纸的检测方法如下:取100微升待测样本与100微升样本稀释液混匀,再取100微升混匀的样本加入试纸卡的加样孔中,反应15分钟后,用量子点荧光免疫分析仪分析荧光信号强弱,此时荧光信号的强弱反应患者体内HCV抗原和HCV抗体的浓度。
结果判断:
采用不少于200例正常人样本进行检测,量子点荧光免疫分析仪检测得到结果T1、T2和C值,取T1、T2和C值的平均值,计算T1平均值/C平均值和T2平均值/C平均值,此时所测的比值分别为HCV核心抗原与HCV抗体检测的临界值。如待测样本荧光值大于或等于T1平均值/C平均值为HCV抗原阳性,大于或等于T2平均值/C平均值为HCV抗体阳性,反之,均为阴性。
经200例正常人样本进行检测,根据HCV核心抗原与HCV抗体的检测结果分别进行计算其平均值与标准偏差(SD),采用SD作为本试剂的临界值。
性能检测:
1、三种不同样品处理液对20例临床样本进行检测,对检测结果不一致采用湖南康润药生产的HCV核心抗原检测试剂盒(ELISA)与HCV抗体诊断试剂盒(ELISA)进行检测确认。
1)样品处理液Ⅰ:含小鼠血清和羊血清
2)样品处理液Ⅱ:只含小鼠血清
3)样品处理液Ⅲ:不含小鼠血清和羊血清
通过以上结果,样品处理液中同时含有小鼠血清和羊血清时,其特异性最好,且对阳性样本的检测结果无影响。
2、稳定性检测
将试剂盒放置37℃0天、14天、28天进行比较,检测上述20例临床样本,其结果如下:
根据以上结果,本试剂盒37℃放置28天,对其结果无影响。
3、灵敏度检测
1)采用HCV抗原阳性且HCV抗体阴性的临床血清样本,用正常人血清按1:2、1:4、1:16、1:32、1:64进行稀释,与上市主流HCV核心抗原检测试剂盒(酶联免疫法)进行比较。
2)采用HCV抗体阳性且HCV抗原阴性的临床血清样本,用正常人血清按1:10、1:100、、1:500、1:1000、1:10000进行稀释,与上市主流第三代HCV抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)进行比较。
根据以上结果,本试剂盒HCV抗原检测灵敏度不低于上市主流HCV核心抗原检测试剂盒灵敏度;HCV抗体检测灵敏度高于上市主流第三代HCV抗体诊断试剂盒灵敏度。
虽然结合附图描述了本发明的实施方式,但是专利所有者可以在所附权利要求的范围之内做出各种变形或修改,只要不超过本发明的权利要求所描述的保护范围,都应当在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法,其特征在于,包括:
S1、使用生物素标记HCV嵌合抗原;
S2、使用生物素标记HCV核心抗原单克隆抗体;
S3、使用量子点偶联链霉亲和素;
S4、使用量子点偶联兔抗鸡IgY;
S5、制备样品垫处理液并用该样品垫处理液对样品垫进行处理;
S6、将步骤S3制得的量子点偶联的链霉亲和素、步骤S4制得的量子点偶联的兔抗鸡IgY分别按一定的浓度稀释至同一缓冲液中并混匀,将该混合液体喷制在步骤S5所得的样品垫上,真空干燥;
S7、将NC膜贴至PVC板上,再将HCV核心抗原单克隆抗体、HCV嵌合抗原与鸡IgY按一定浓度分别包被NC膜,依次作为检测T1线、T2线和质控C线;
S8、对步骤S6制得的样品垫进行裁剪并与吸水纸贴至步骤S7所得的PCV板上。
2.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法,其特征在于,所述步骤S1包括:
S100、将HCV嵌合抗原置于PH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中充分浸泡,并将所得混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h;
S101、取适量生物素并与预冷的超纯水配制成浓度为5mg/ml的生物素溶液;
S102、按生物素与HCV嵌合抗原为固定摩尔比添加步骤S101制得的生物素溶液与步骤S100制得的HCV嵌合抗原制得混合液体,并将该混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h,所述摩尔比为50:1;
S103、将步骤S102透析制得的生物素标记的抗原结合物取出并加入等体积的甘油,并置于-20℃的环境下保存备用。
3.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法,其特征在于,所述步骤S2包括:
S200、将HCV核心抗原单克隆抗体置于PH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中充分浸泡,并将所得混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h;
S201、取适量生物素并与预冷的超纯水配制成浓度为5mg/ml的生物素溶液;
S202、按生物素与HCV核心抗原单克隆抗体为固定摩尔比添加步骤S201制得的生物素溶液与步骤S200制得的HCV核心抗原单克隆抗体制得混合液体,并将该混合液体置于温度为2~8℃的环境下透析2~4h,所述摩尔比为50:1;
S203、将步骤S202透析制得的生物素标记的抗原结合物取出并加入等体积的甘油,并置于-20℃的环境下保存备用。
4.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法,其特征在于,所述步骤S3包括:
S300、将NHS与EDC分别以0.5mg/mg与0.2mg/mg的质量比与量子点混合,室温反应10~30min;
S301、将步骤S300所得混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加pH为7.5~8.5的碱性缓冲液进行溶解,混匀后冰浴超声3~5min;
S302、将链霉亲和素以0.1~1mg/mg的质量比与量子点混合,室温旋转反应2h;
S303、加入终浓度为1%的牛血清白蛋白,室温反应20~30min;
S304、将步骤S303所得的混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加含1%牛血清白蛋白与0.1%吐温20进行溶解,置于2~8℃下保存备用。
5.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法,其特征在于,所述步骤S4包括:
S400、将NHS与EDC分别以0.5mg/mg与0.2mg/mg的质量比与量子点混合,室温反应10~30min;
S401、将步骤S400所得混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加pH为7.5~8.5的碱性缓冲液进行溶解,混匀后冰浴超声3~5min;
S402、将兔抗鸡IgY以0.1~1mg/mg的质量比与量子点混合,室温旋转反应2h;
S403、加入终浓度为1%的牛血清白蛋白,室温反应20~30min;
S404、将步骤S403所得的混合液体置于10000~15000prm环境下离心10~20min,弃去上清液并向下层沉淀添加含1%牛血清白蛋白与0.1%吐温20进行溶解,置于2~8℃下保存备用。
6.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂的制备方法,其特征在于,所述步骤步骤S5中的样品垫为玻璃纤维素膜,其处理过程包括:
S500、使用样品垫处理液对样品垫进行浸泡处理;
S501、取出步骤S500中浸泡过的样品垫并将其置于37℃干燥12~24h;
S502、将步骤S502所得的样品垫置于37℃干燥12~24h。
7.一种检测卡,包括卡壳上盖(1)和卡壳下盖(6),所述卡壳上盖(1)上开设有加样孔(2)和检测观察孔(5),所述卡壳上盖(1)和卡壳下盖(6)之间设有试纸条,其特征在于:所述试纸条包括PVC底板(8)、样品垫(9)、吸水纸(10)和NC膜(11),所述样品垫(9)、吸水纸(10)和NC膜(11)安装在PVC底板(8)的上表面,且NC膜(11)位于样品垫(9)和吸水纸(10)之间,所述NC膜(11)上设有质控线C线(12)、检测T1线(13)和检测T2线(14),所述质控线C线(12)、检测T1线(13)和检测T2线(14)使用权利要求1至6任意一项权利要求所制得的处理后的HCV核心抗原单克隆抗体、HCV嵌合抗原与鸡IgY进行包被处理。
8.根据权利要求7所述的检测卡,其特征在于:所述卡壳下盖(6)上设有用于对试纸条进行限位的一对限位槽(7),所述限位凹槽(7)内设有凸点(15)。
9.根据权利要求7所述的检测卡,其特征在于:所述卡壳上盖(1)和卡壳下盖(6)通过固定栓(3)连接。
10.根据权利要求7所述的检测卡,其特征在于:所述卡壳上盖(1)和检测观察孔(5)之间设有截流板(4)。
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