FI76432C - Foerfarande och anordning foer bestaemning av element i loesning med en ljusledare. - Google Patents

Description

! 76432

Menetelmä ja laite liuoksessa olevien elementtien määrittämiseksi valojohdolla Förfarande och anordning för bestämning av element i lösning med en ljusledare

Keksinnön kohteena on valojohdon käyttäminen nesteessä liuoksena olevan elementin (eli analyytin) konsentraation määrittämiseksi mittaamalla nopeus (joka on konsentraatiosta riippuva) , jolla se yhtyy määrättyyn reagoivaan aineeseen eli reagenssiin tai dissosioituu siitä, esim. kompleksointireak-tion konjugaattiosana. Lähemmin määriteltynä keksinnön kohteena on menetelmä liuoksessa olevan analyytin määrittämiseksi, jonka menetelmän mukaan analyytin ja reagenssin reaktiotuotteen kerros muodostetaan valotetun valojohdon pintaan, jossa valojohdossa kulkee moneen kertaan kokonais-heijastunut sähkömagneettinen aaltosignaali, jolloin tämä kerros muuttaa valojohdon optisia ominaisuuksia mainitun signaalin mod ifioimiseksi ja tämä modifikaatio mitataan ja mittaustulosta käytetään mainittua määritystä varten. Keksintö soveltuu täten erilaisiin kemiallisiin ja biologisiin järjestelmiin ja erikoisen hyvin pienenä konsentraationa esiintyvien bioaktiivisten molekyylien määrittämiseksi immunokoetyyppisten reaktioiden avulla, jotka reaktiot toisin sanoen perustuvat kompleksien muodostamiseen siten, että vasta-aine (AB) liitetään antigeenin (AG) molekyyleihin tai päinvastoin.

Tällä alalla on jo olemassa lukuisia menetelmiä edellä mainitun määrityksen suorittamiseksi biokemian tunnettuja keinoja käyttäen. Niinpä voidaan kemiallisia reaktioita käyttää analyytin ilmaisemiseksi monella eri tavoin. Tunnettuihin menetelmiin sisältyy titraus eli reaktio määrätyn reagenssin kanssa, mikä antaa tulokseksi värjääntyneen tuotteen tai sakan. Tämän ilmaisujärjestelmän edellytyksenä on, että reagenssia on läsnä ekvivalenttisin tai ylimäärin, niin että tuote voidaan mitata käyttämällä tavanomaista fotometriaa, nefelometriaa, kolorimetriaa, jne. Mittausjärjestelmä valitaan 2 7 ö 4 3 2 mitattavan signaalin ta^on perusteella. Analyvtin hvvin pienillä konsentraatioii1 a ilmaisu tulee vaikeaksi, nolloin suurempi diskriminaatio voidaan saavuttaa esim. konsentroimalla reaktiotuote paikaliisesti, kuten 1iuotinuuttama1la, sentri f uqo imal 1 a, ine., mikä voi kävdä hankalaksi ia kalliiksi. Edellä mainittua haittaa voitiin kuitenkin huomattavasti vähentää, kun vuonna I960 saatiin kävttöön käyttökelpoinen menetelmä erittäin pieninä konsQntraatioina esiintyvien biokemiallisten analyvttien mittaamiseksi. ^ässä mi kr oanalvvtt i-sessä i är i estel.mä ssä (r ad i o-immunokokeessa) käytettiin hyödyksi molekyylistä tunnistamista varten biologisten "järjestelmien ominaisuuksia (antigeenin ja vasta-aineen reaktioita) ja radioaktiivisten mittausten erittäin suurta herkkyyttä (käyttämällä merkintäradi oakti i visuuden omaavia isotooopej a) . '’(tämän "läpimurron" oi eel i i sena tunnusmerkkinä oli käyttää hyödyksi reagenssin rajoittuneita kokeita ja merkkiaineita mitattavan analyytin reagenssin sitomien ja vapaiden osien välisen jakautumisen mittaamiseksi (kts. esim. julkaisua Review Paper "The theoretical aspects of saturation anaTysis" R.P. EKINB julkaisussa "In vitro procedures with radioisotones in medicine", International Atomic Energy Agency, June 1970). Vaikka immuno-kokeet ensin selitettiin kokeita varten, noissa reagenssia käytettiin rajoitetusti, on myöhemmin selitetty käyttökelpoisia järjestelmiä sei "Taisia menetelmiä varten, joissa reaqens-sia käytetään ylimäärin (kts. julkaisua ΜΤτ,εΕ et ai. Biochem. J. 10R, 611 (196R)).

Nykvään tunnetut menetelmät edellyttävät volumetrisen ja gravimetrisen analyysin lisäksi erittäin herkkiä mittausmenetelmiä, kuten kolorimetrisiä, spektroskoonnis ia ja radioaktiivisia mittauksia. Monet tä1laiset menetelmät ovat kuitenkin nykyään käymässä vanhentuneiksi, koska ne ovat aikaa vieviä, vaativat analvytin suhteellisen suurta määrää, jotta saavutettaisiin täsmällisiä tuloksia, perustuvat vaikeasti valmistettaviin ja vaikeasti varastoitaviin reagensseihin tai edellyttävät kalliita ja tilaa vaativia laitteita ja erittäin ammattitaitoista käyttöhenkilöstöä. t’Mstä syystä on nykvään 7 6 4 3 2 3 n1 trendi kohti tarkempi pn ia her k°mni en menetel mien kehittämistä, jotka vaativat vähemmän r°aqensseia ia iotka kohtuni lisest.i kouliintunut henkilöstö voi toteuttaa turvallisesti, nopeasti ia täsmällisesti. Viime aikoina selitettyiin tällaisten menetelmien loukossa eräät edellyttävät, reaqenssia sisältävien vaioäohtoien käyttöä. Analyysiä varten valoiohto saatetaan kosketukseen liuoksessa olevan anal yvt in kanssa, jolloin tapahtuu reaktio vaioäohdossa olevan reagenssin kanssa, minkä seurauksena valojohdon optiset ominaisuudet muuttuvat. tällaisen muutoksen mittaus antaa sitten tarvittavat tiedot anal vvtin määrittämiseksi. Eräiden viimeaikaisten julkaisujen perusteella fkts. esim. Uä-natentti julkaisua 4 OhO 8 9 8 (Hardv) ^a v0-ju1 kaisua 81 100 012 (Ruckles)) voivat valojohdot koostua (Ruckles) huokoisesta valoa läpäisevästä sydämestä, äoka on kvllästettv reagenssi11 a, johon analyytti diffundoituu reaktion aikana, valojohto voi myös (Ruckles tai Hardy) koostua ei-huokoisesta valoa läpäisevästä sydämestä (esim. lasista), joka on pinnoitettu huokoisella eli läpäisevällä vaipalla, joka on kyllästetty reagenssiila, ia johon analvvtti d i ffundoi tuu . Lisäksi eräässä erikoistapauksessa, ioka soveltuu immunokokeeseen (Hardv, esimerkki 3), tankomai-nen valojohto pinnoitetaan vasta-ai neker r oksel 1 a , joka sidotaan difenvyiidimetoksisiläänillä ia saatetaan reagoimaan polystvreeni1ateksia olevien pienien palloien kanssa, ioita on käsitelty antigeenillä. Antigeenillä käsitellyt pallot kiinnittyvät tällöin vai oiohtoon ia modifioivat tämän valoi ohdon valosignaalin 1'ihtöä, i o Ilo in tätä modifikaatiota käytetään analyyttiseen määrittämiseen.

Edellä mainituilla menetelmillä on etunsa, mutta ne eivät hvvin sovellu eräisiin tyypillisiin analyyseihin, ioihin li.it-tvv reaktion kinetiikkaa. On itse asiassa ennestään tunnettua, että nopeudet voivat antaa oleellisia analyyttisiä tietoja, varsinkin automaattisten koeiärjestelmien yhteydessä. Koska läpäisevissä eli huokoisissa kappaleissa esiintyvät reaktiot edellyttävät analvvtin diffuusiota ennalta tähän kappaleeseen, ja koska diffuusiotaoahtumat yleensä ovat naläon hitaampia 7 6 4 3 2 Λ kuin kemialliset roakt i ot, ei ηϊί^ρη reaktioiden nopeutta voida mitata suoraan, vaan täiιaisessa tapauksessa voidaan saada ainoastaan tasapainotilaan nerustuvia tietona. Ennestään tunnetun tekniikan mukaan vältetään mvös suoritusmuotona, jotka edellyttävät läpinäkyvän sydämen käyttöä, joka sydän on ninnoitettu reanenss’a olevalla vainai1 a, ionka taitekerroin on pienempi kuin sydämen taitekerroin syvstä, että on oletettu tuloksena saatavan pieni herkkyys. Tällaisessa tapauksessa itse asiassa suurin nsa valoiohdon syöttönä .ähän johdetusta vaiosiqnaalista tul»e kulkemaan sydämessä kokonaisheijastumisen seurauksena, i a tässä tapauksessa tulee, kuten on yleisesti oletettu, tämän siqnaalin ja vaipassa, toisin sanoen sydämen ulkopuolella, sijaitsevien reaktiotuotteiden välinen keskinäinen vaikutus olemaan vain vähäinen, aikaisemman tekniikan mukaan on näin ollen pidettv huolta siitä, että vaipan (jossa reaktio tapahtuu) taitekerroin aina on suurempi kuin sydämen taitekerroin in-j_) , niin että sydämen syöt tönöähän äohdettu valo voi taittua vaioassa ia tästä alkaen jatkaa kulkuaan vaioassa suoraan valoiohdon lähtöön. Eräiden aikai-semnien selitysten vastakohtana lähtösiqnaali (resultoiva valo, joka on modifioitunut kulkemalla vaioassa olevan rea-qenssin ja analvvtin reaktiotuotteiden läoi) ei helposti uudelleen tunkeudu sydämeen eikä saavuta sen takaoäätä, ja tästä svvstä (tämä kävttävtvminen aiheutuu myöhemmin selitettävistä optisista a 1 keisoeriaatteista) sekä mittauksia varten on läh-tövalon ilmaisimen sijaittava koesondin välittömässä läheisyydessä, (toisin sanoen vaipan takapäässä). Tällainen järjestelmä ei aina ole rakenteellisesti käytännöllinen, nimittäin tapauksessa, jossa valoiohto (sekä vainoa) uootetaan nesteeseen liuoksessa olevan analvytin mittaamiseksi.

mämä keksintö ooistaa nämä haitat, koska keksinnön mukaan ei käytetä huokoista svdäntä tai vaiopaa eikä mitään diffuusiota ma tri isirakenteen (vaioan tai sydämen) läoi. Keksinnön mukaan ei myöskään valosiqnaalia, ioka kulkee valojohdon sisäouolella kokona i sheiäastumisen seurauksena, välitetä eikä iohdeta rea-qonssin ia analvvtin muodostaman tuotteen läpi, vaan kävtetään

II

5 764 32 sen sijaan hyödyksi ainoastaan syöttösignaalin nopeasti vaimenevaa aaltokomponenttia, toisin sanoen aallon sitä osaa, joka ulottuu sydämen ulkopuolella olevaan alueeseen kokonaisheijastumisen tapauksessa. Koska tämän nopeasti vaimenevan aallon vaikutusalue on ainoastaan aallonpituinen ( / ) murto-osa, on tarvittava tuotemäärä (reagenssi ja analyytti) äärimmäisen pieni ja voidaan saavuttaa erittäin suuri herkkyys (suhteessa analysoitavan elementin kokonaismäärään).

Keksinnön eräänä tarkoituksena on näin ollen aikaansaada menetelmä nesteessä liuoksena olevan kemiallisen elementin tai analyytin konsentraation määrittämiseksi nopeasti ja täsmällisesti valojohdon avulla. Keksinnön eräänä toisena tarkoituksena on aikaansaada analyyttinen menetelmä biologisten ana-lyyttien määrittämiseksi erittäin spesifisesti ja suurella herkkyydellä. Keksinnön tarkoituksena on myös aikaansaada analyyttinen menetelmä, jota kohtuullisesti kouliintunut työvoima voi helposti soveltaa, ja joka vaatii vain pienen määrän analyyttiliuosta. Keksinnön vielä eräänä tarkoituksena on aikaansaada monipuolisesti käyttökelpoiset ja automatoidut mittauskojeet, jotka soveltuvat edellä mainitun menetelmän toteuttamiseksi.

Nämä ja muut tavoitteet selviävät selityksestä ja toteutetaan patenttivaatimusten määrittelemällä tavalla, jolloin keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään valojohtosydäntä, jonka taitekerroin (ηχ) valitaan siten, että se on suurempi kuin mainitun analyyttiliuoksen taitekerroin (n2), ja aikaansaadaan sellainen suhde n^/n2, että valojohdossa kulkevaan valosignaaliin liittyvän sähkömagneettisen kentän tunkeutumissyvyys liuokseen vastaa analyyttiä ja reagenssia olevan kerroksen paksuutta tai ylittää tämän paksuuden. Niinpä tämän menetelmän mukaan saatetaan valotetun (ei-huokoisen), analyyttiin nähden spesifistä reagenssia olevalla ohuella kalvolla pinnoitetun valojohtosydämen eräs osa kosketukseen tämän analyytin liuoksen kanssa siten, että analyytti voi reagoida kalvon mainitun reagenssin kanssa ja muodostaa reagenssin ja analyy- 764 32 6; tin tuotekerroksen, havaitaan aian mittaan tapahtuvat vastaavat optiset muutokset, iotka esiintyvät sydämen läpi kulkevassa valosignaalissa svdämen lähtöpäässä tämän tuotekerroksen muodostumisen tuloksena, ja verrataan saatuna nopeustietoja standardi-nooeustietnihin, iotka on saatu samankaltaisella tavalla mainitun anaivytin kalibrointinävtteistä, jolloin mainitun svdämen taitekerroin (n^l on suurempi kuin mainitun liuoksen taitekerroin (n 2) la mainitun kalvon paksuus on ainoastaan signaalin aallonpituuden murto-osa.

mä<5sä vaiheessa voi olla eduksi antaa jossain määrin yleistä informaatiota, joka koskee valon etenemistä sydämessä ns. kokonaisheijastumisen seurauksena. Tämä voidaan paremmin esittää oheisten piirustusten eräiden kuvioiden perusteella.

Kuvio 1 havainnollistaa kaavi oi 1isesti tulosäteen M kokonaisheijastumista tiheämmän f n g) ja vähemmän tiheän (n2) väliaineen r ai ani nnassa, kun kulma Θ· on suurempi kuin 0C, joka on kokonaisheijastumisen kriittinen kulma. Tässä kuviossa E0 on valon sähkökenttäkomnonentin alkuperäinen suuruus, kun svvvvs vähemmän tiheässä väliaineessa on nolla, 7 on läoitunkeutumis-akselin svvvys ja dD määritellään seuraavassa. R on heijastunut säde.

Kuvio 2 havainnollistaa valon tulokulman funktiona sähkömagneettisen kentän ositettua tunkeutumissvvvyttä vähemmän tiheään massavä1iaineeseen sisäpuolisen kokonaisheijastumisen saavuttamiseksi useiden välipintojen yhteydessä. Läoitunkeutu- m.issvvvvs on äärettömän suuri kriittisellä kulmalla ja on noin aallonpituuden kymmenesosa hyvin vinosti tuleville säteille suhteellisen suuren taitekerto imen omaavien väliaineiden yhteydessä. λ ^ * A/n^ tiheämmässä väliaineessa olevalle aallonpituudelle, (otettu julkaisusta N.Y. HARRICK, Internal Reflection Spectroscopy, Wilev 1967.)

Kuvio 3 havainnollistaa nopeasti vaimenevan aallon ja reaktio-tuotekerroksen välistä keskinäistä vaikutusta.

Il 7 764 32

Perusteel l i semnaa tvs ikaal ista tietoa keskinäisen vaikutuksen mekanismista heiiastavan oinnan luona voidaan saaria tutkimalla asiaa Maxwel1'n yhtälöiden avulla, ^ässä kvsvmvkseen tulevassa taoauksessa, toisin sanoen heijastumisen esiintyessä tiheämmän väliaineen äa vähemmän tiheän väliaineen raianinnan luona, on vastattava seuraavaao kysymykseen: mikä on sähkömaqneettisen kentän iakutuma vähemmän tiheässä väliaineessa heiiastavan väl ininnan takana sisäisen kokonaisheiias turnisen saavuttamiseksi? missä taoauksessa on olemassa vähemmän tiheässä väliaineessa aaltofunktio, ioka etonee yhdensuuntaisena välioinnan kanssa. 'Ien sähkökentän amolitudi pienenee eksponentiaalisesti suhteessa etäisvvteen ninnasta fkts. kuviota 1), ioten sitä sanotaan norjasti vaimenevaksi aalloksi. Ideaa!itaoauksessa, ia i os vähemmän tiheällä väliaineella ei ole mitään omaa absorntio-ominai suutta kysymykseen tulevalla aallonpituudella, ei tanahdu mitään enerqian nettovirtausta ei-absorboivaan vähemmän tiheään väliaineeseen, koska Povntinq'in vektorin selittämän enerqian keskimääräinen aika (kts. esim. iulkaisua M. nORN & F. WOLF, "Princioles of Ootics" Perqamon Press (1959)) on nolla. Sähkökenttä voidaan matemaattisesti kuvata eksDonentiaalifunktiolla:

Z

E * Eq·»”*^

Sisääntunkeuturnissyvyys d0, joka määritellään matkaan, joka tarvitaan sähkökentän amplitudin saattamiseksi nienenemään arvoon e”"'- sen arvosta pinnan luona, saadaan yhtälöstä . Ai nrisin-V-nS-i.)* R 76432 jossa Λ·) = λ/τ\γ on aal 1 onni tuus tiheämmässä väliaineessa ia n2-l = η2/π1 on inka ilmaisee vähemmän tiheän väli aineen taitekerrointa jaettuna tiehämmän väliaineen taite-kertoi mel 1 a . Kuvio 2 havainnollistaa näiden suhteiden tarkoitusta, jolloin tässä kuviossa sisääntunkeutumissvvvvs jaettuna s isääni ankeavan ia heiiastuneen valon aall onpi tuudella λ ^ on niirrettv valon tulokulman Θ funktiona useille väli cinnoille (toisin sanoen eri suhteille r^/n]). On huomattava, että sisääntunkeutumissvvvvs on ainoastaan aal 1 onni tuuäen noin kymmenesosa tarhauksissa, noissa tai teker toimi en ero on suuri, toisin sanoen kun n^/n-j on oieni, mikä on lähellä sivuamis-kulmaa ( Λ= 00°). Tänä sisääntunkeutuminen tulee äärettömän suureksi, kun Λ läh^^tvv aal 1 onoi tuut ta /\ c. Kiinteällä kulmalla on s i. sääntunkeutumi ssyvvvs suuremmi siinä taoauksessa, että kertoimien erot ovat pienet (toisin sanoen kun np/n-| lähestvv arvoa 1). Eisääntunkeutumissyvvvs on siis verrannollinen aal lonoituut°en ja näin ollen suuremoi nitemmillä aallonpituuksilla. Esimerkkinä esitettäköön, että äos tihemoänä väliaineena on lasi (n·^ = 1,5) ia vähemmän tiheänä väliaineena on analvvtin vesi liuos (n? = 1,3), on = 0,R67, mikä aoroksimatiivisesti vastaa kuvion 2 käyrää 11. ^ässä tapauksessa tulisi s i sääntunkeutuminen olemaan noin kolmasosa aallonpituudesta hyvin pienellä tulokulmalla, teoreettisesti äärettömän suuri kriittisellä kulmalla (50°) mutta jo pienempi kuin ], kun kulma on 65°.

Koska E pienenee eksponentiaalisesti, vastaa rajaväl ipinnan takana oleva alue, äossa tuotteen kanssa keskinäisesti vaikuttava enerqiamäärä vhä on merkityksellisen suuri, syvyyttä 7, jossa sähkökentän suuruus on vhä E0:n kohtuullinen murto-osa, esim. sen arvo on vähintään 0,1 E0, ja vieläkin paremmin alue, jossa E on rajoissa E0...E0/3. Optimaalisen tehokkaan keskinäisen vaikutuksen saavuttamiseksi on reaktiotuotekalvon paksuuden aoroksimat i iv isesti vastattava tämän alueen syvyyttä. Tämä on havainnollistettu kuviossa 3, joka esittää tulosädettä (N) ja heijastunutta sädettä (R), nopeasti vaimenevan aallon nol1asvvyvden vektoria E0 ja reaqoivan aineen ja analvvtin (A) 11 76432 q tuotteen muodostamaa kalvoa, ionka oaksuus likimain vastaa sisääntunkeutumi ssyvvvttä dD, iossa F on noin E0/3. Kuviossa 3 ei ohuen kalvon A tai. tekertoimen vaikutusta ole oidettv merki-tvksellisenä, koska tämän kalvon Daksuus ei virta nopeasti vaimenevan aallon sisääntunkeutumissyvyvttä , Itse asiassa on vähemmän tiheän väliaineen taitekertoimen muuttuminen, joka aiheutuu reaktio-alueella olevan analvytin ja reagoivan aineen muodostaman kalvon kasvamisesta, niin oieni, että kriittisen heijastumiskulman arvon vastaava muuttuminen on käytännössä mitättömän oieni, lukuunottamatta heijastavia kohtia, jotka ovat hyvin lähellä tätä heijastuskulmaa. s’ukea tälle näkökohdalle, joka muodostaa keksinnön erään yllätyksellisen edun tunnettuun tekniikkaan verrattuna, voidaan saada esim. em. N.Y. Harrick-viitteen sivulta 51.

Toinen kohta, jota on korostettava vertailuna tunnettuun tekniikkaan, koskee vai osiqnaal. in ja reaktiotuotteen keskinäisen vaikutuksen tehokkuutta. Tunnetuissa soektrometrijärjestel-missä saatetaan valosignaali menemään analyvttiä sisältävän läpinäkyvän säiliön (pikarin tai astian) läpi jolloin näyte absorboi energian erään osan, mikä iohtaa määrättyyn absorptioon, joka mitataan. Tämä menetelmä ei kuitenkaan ole erikoisen tehokas, koska analyyttimäärän on oltava suhteellisen suuri siten, että saadaan merkityksellinen keskinäinen vaikutus valosignaalin kanssa tavanomaisissa olosuhteissa. Tämän vastakohtana on keksinnön mukaan, jossa on kysymys nopeasti vaimenevan aallon ja sellaisen kalvon välisestä keskinäisestä vaikutuksesta, jonka paksuus likimain vastaa tämän aallon si sääntunkeutumissyvyyttä, hyötysuhde huomattavasti suurempi, koska keskinäisen vaikutuksen alueella esiintyy voimakasta valon vahvistumisvaikutusta. Kuten on esitetty esim. em. Harrick-viitteessä, on nopeasti vaimenevan aallon kenttä-voimakkuus alueella, jossa se vaikuttaa analvytin ja reagens-sin muodostamaan kerrokseen, paljon voimakkaampi kuin tulo-signaalin kenttä. Tämä johtuu itse asiassa sekä tulevan että lähtevän säteen kenttäamplitudien samanaikaisesta läsnäolosta.

ιη 76432

Edellä selitetyt optiset perustiedot, jotka helpottavat keksinnön toimintaperiaatteiden ymmärtämistä, liittyvät oolaroi-tumattoman valon käyttöön. Käytännössä on tärkeää muistaa, että sähkökentän alkusuuruus nollasvvvydel1ä (E0) riippuu tulovaloaa1Ion polaroiturnisti1asta. Täten voidaan eräissä tapauksissa edullisesti käyttää keksintöä sovellettaessa pola-roitunutta valoa tavallisen valon asemesta (seuraavassa nähdään, että taoauksessa, jossa siqnaalin muutokset mitataan eli1psometriän avulla, on polaroituneen valon käyttö oleellista), ja tällaisissa tapauksissa voidaan eri ODtiset parametrit säätää ja optimoida maksimaalista toistoa ja herkkyyttä varten. Niinpä voidaan E0:n maksimoimiseksi valita sopiva tul οροίaroitumiskulma (esim. polarisaatio, joka on yhdensuuntainen tulotason kanssa tai kohtisuorassa tätä vastaan).

Edellä esitettvlen selitysten perusteella voidaan täydellisesti ymmärtää keksinnön seuraavat edut tunnettuun tekniikkaan verrattuna. Niinpä koetapauksessa, jossa analyyttia varten käytetään määrättyä spesifistä reaktioainetta, tuotekerroksen paksuus tavallisesti määrätä tuotemolekyy1 ien vastaavan koon perusteella. Niinpä eräässä tvvpillisessä immunokokeessa voi tuotekerros koostua vasta-aineen muodostamasta ensimmäisestä kalvosta ja antigeenin muodostamasta toisesta kalvosta. Tämän kerroksen paksuus voi molekyylin tyvpeistä riippuen olla rajoissa nanometrin useista kymmenesosista useisiin kymmeniin nanometreihin tai enemmän. Ottamalla huomioon kerroksen paksuus voidaan nvt valita sydämen taitekerroin ja eräissä tapauksissa myös aallonpituus siten, että edellä selitetyt parametrit mahdollisimman hyvin sopeutuvat yhteen. Havainnollistavana esimerkkinä esitettäköön, että jos kysymykseen tuleva kerros on suhteellisen ohut, valitaan sydämiä, joilla on suuret taitekertoimet (esim. safiiri n = 1,8, pii n * 3,4), ja mikäli aallonpituudet sopeutuvat kysymykseen tuleviin optisiin prosesseihin (toisen sanoen absorptioon, hajontaan, fluoresenssiin, jne.), voidaan myös valita lyhyempiä aallonpituuksia. Tämän ansiosta voidaan vähentää nopeasti vaimenevan aallon keskinäistä vaikutusta analvytti1iuoksen sellaisten il 764 32 1 1 alueiden kansaa, jotka ovat svvemmät kuin sen tilan paksuus, jossa analyyttinen reaktio tapahtuu, mitä täten vähentää haitallisten ulkopuolisten tekijöiden vaikutusta (taustakohina, liuoksessa läsnä olevat epäpuhtaudet, jne.). Tällaisia mahdollisuuksia ei ilmeisesti ole olemassa minkään tunnetun tekniikan mukaisen menetelmän yhteydessä. Arvosteltaessa tämän keksinnön ja tunnetun tekniikan välistä eroa, jolloin vaipan paksuus ulottuu selvästi nopeasti vaimenevan aallon sisään-tunkeuturnissvvvyden toiselle puolelle (minkä seurauksena vaipan taitekerroin (nj) tulee määrääväksi päinvastoin kuin mitä tapahtuu keksinnön mukaan), jolloin r\2 tehdään suuremmaksi kuin sydämen taitekerroin (n-^), on myös muistettava, että sydämeen aluksi syötetty ja vaippaan heijastunut valosignaali ei helposti tunkeudu uudelleen sydämeen eikä ole läsnä sydämen lähtöpäässä, kuten eräät ilmeisesti luulevat (kts. esim. julkaisua W0 Rl 100 012). Siinä tapauksessa, että valosignaali kulkee vähemmän tiheässä väliaineessa, jota ympäröi tiheämpi väliaine, tapahtuu itse asiassa tämän valosignaalin taittumista vaippaan. Tämän jälkeen tämä taittunut aalto kokonai s-heijastuu takaisin vaipan ul.kos ivur ajasta ja menee takaisin kohti sydäntä. Koska tämän sydämen kerroin n-j on pienempi kuin vaipan kerroin, tulee aallon käyttäytyminen olemaan jommankumman seuraavan vaihtoehdon mukainen: Jos tulokulma on suurempi kuin kriittinen kulma, tulee aalto jälleen heijastumaan ja pysymään lopullisesti vaipassa. Jos tulokulma on pienempi kuin kriittinen kulma, tulee aalto menemään sydämen läpi ja tunkeutumaan toisella sivulla vaippaan jne. Täten ei missään tapauksessa aalto, joka on alkuaan syötetty sydämeen, ja joka on taittunut vaipassa, tule palaamaan yksinomaan sydämeen ja olemaan läsnä svdämen lähtöpäässä, ellei se yhä ole vaipan ympäröimä. Tämä on erinomaisesti näytetty UR-patenttijulkaisun 4 050 895 kuviossa 3R. Minkäänlaista tällaista puutetta ei ole olemassa keksinnön puitteissa, jossa avainvalosignaali ainoastaan kulkee sydämessä eikä reagoivaa ainetta ja analvyttiä sisältävässä ulkopuolisessa kerroksessa.

1 2 764 32

Keksinnön mukaiseen menetelmään liittyvät optiset muutokset voivat liittyä erilaisiin ilmiöihin. Niinoä voivat seuraavat ilmiöt tulla kysymykseen: sydämessä kulkevan valon absorptio, valosignaalin sironta reaktiotuotteen vaikutuksesta, reaktio-tuotteen fluoresenssi sydämessä taoahtuvan herätyksen takia valosignaalin aiheuttamana. Lisäksi voi. sydämessä oleva herätyssignaali olla polaroitunut, ja analyyttinen reaktio voi muuttaa eliiotisiä oolaroitumistekijöitä, joita on valvottava. Jokainen näistä mahdollisuuksista selitetään yksityiskohtaisemmin seuraavassa.

Keksinnön mukaisen menetelmän avulla suoritettavien analyyttisten mittausten tyvpit ovat niin lukuisia, että on käytännöllisesti katsoen mahdotonta luetella ne kaikki. Muutamia esimerkkejä annetaan kuitenkin seuraavassa havainnollistamis-tarkoi tuksessa. Ennen kuin perehdytään syvemmälle tässä suunnassa on eduksi jonkin verran selittää niitä Derustekijöitä , jotka liittyvät keksinnön soveltamiseen kokeissa, joissa käytetään "rajoitettua reagenssimäärää" ja "reagenssin ylimäärää", ja joita edullisesti käytetään biologisessa ja diagnostisessa analyysissä. Tätä selitystä varten sanotaan ana-lvvttiä edullisesti "antigeeniksi" AG ja reagenssia "vasta-aineeksi" AR. Lienee turhaa mainita, että päinvastainen tilanne myös pätee.

"Reagenssin ylimäärä" kokeessa tarkoittaa taoauksia, joissa reagenssia käytetään ylimäärin suhteessa analyyttiin. "Reagenssin rajoitettu määrä" tarkoittaa pääasiallisesti sellaisen järjestelmän käyttämistä, jossa koesubstanssia eli analyvttiä (joka sisältää mitattavaa antigeeniä) käsitellään rajoitetulla määrällä määrättyä reagenssia (vasta-ainetta) analyvtin ja reagenssin muodostaman tuotteen saamiseksi (esim.

AG.AR-kompleksi) ja lisäksi on olemassa jokin määrä jäljellä jäävää analyyttiä. Kun reaktion annetaan sujua päättymiseen asti, jos toisin sanoen koe edistyy tasapainotilaan asti ( " ky1lästvmiskoe") , toisin sanoen rajoitettu konjugaatti-reagenssi (AR) kvllästvv analvvtillä, on välttämätöntä lisätä

II

76432 π kokeiltavaan reaktioseokseen ennen reaktiota (tai peräkkäisissä kokeissa jonakin ajankohtana ennen kuin lopullinen tasapainotila saavutetaan, toisin sanoen ennen mittausta), kiinteä määrä analyvtin merkkimuotoa {AC,*). Kun esimerkiksi antiqeeni on kokeiltava vasta-ainereaqenssil la, on merkityn antiq^eriin (AG*) suhde merkitsemättömään antigeeniin (tuntematon) oltava sama jäännösanalvvtissä kuin se oli alussa. Koska käytetty tunnettu AB-määrä tulee sitomaan tunnetun määrän AG+AG*-seosta, riittää iäännös-AG*:n tai AR:een sitoutuneen AG*: n määrittäminen (sen merkin avulla) näytteessä alkuaan läsnä olevan AG-määrän mittaamiseksi. Yksinkertaistetun esimerkin antamiseksi oletetaan, että nävte sisältää x ekvivalenttia entsyymiä (AG), joka on mitattava käyttämällä tunnettua määrää cj konjuqaatt i entsyymiä (AR) , joka muodostaa AG.AR-komt>leksin (jolloin molempien komponenttien molekvvlisuhde on esim. 1:1). Tämän jälkeen lisätään näytteeseen ennen reaktiota a ekvivalenttia samaa entsvvmiä, joka on mitattava, mutta merkityssä muodossaan (AG*). Täten reaktion kuluessa vasta-aineen q ekvivalenttia kuluttaa erään osan antiqeenin (AG+AG*) cj ekvivalenteista. Sen jälkeen, kun kompleksi on poistettu seoksesta, todetaan jäännös -AG* tavanomaisin keinoin. Jos nyt vähentämällä jäljellä olevan AG*:n mitattu arvo todetaan, että todellisuudessa käytetty määrä oli h ekvivalenttia, on ilmeistä, koska AG ja AG* ovat kemiallisesti identtisiä ja tulevat kulutetuksi samalla nopeudella, että kulutetun AG*:n suhteen kulutettuun AG-määrään, toisin sanoen määrän b/q-b tulisi olla yhtä suuri kuin alkuperäinen suhde a/x, josta voidaan laskea x 3 a(q-b)/b.

Tämäntyyppinen ratkaisu on varsin mielenkiintoinen, vaikka siihen aikaisemman tekniikan mukaisissa sovellutuksissa liittyy eräitä haittoja, joista yksi on yleinen vaatimus, että kompleksi (seos AG*.AB + Ag.AB) on erotettava reaktioväliai-neesta, mikä eräissä tapauksissa on hankalaa ja edustaa erästä mahdollista virhelähdettä, mähän keksintöön sovellettuna tätä haittaa ei ole olemassa, koska muodostuva kompleksi valojoh-doile laskeutuessaan automaattisesti poistaa analyvtin liuok- i4 76432 sesta. Haluttaessa havainnollistaa keksinnön mukaisen menetelmän soveltamista "kyl lästvstyvopisiin kokeisiin", on iälleen aloitettava valojohdosta, esim. optisesta kuidusta, joka on pinnoitettu määrätyllä vasta-aineella AR, joka on upotettu puskuriliuokseen, jossa sen on annettu tasapainottua tähän liuokseen nähden. Tuntematon määrä täydennvsantiqeenia AG, joka on määritettävä, lisätään tämän jälkeen samalla tavoin kuin ennen, mutta samanaikaisesti saman antiqeenin tunnetun oienen määrän kanssa, joka on merkitty molekyylillä, jolla on määrätyt ootiset. ominaisuudet (AG*), esim. optinen absorptio, fluoresenssi, jne), mikä voidaan ilmaista nopeasti vaimenevan aallon keskinäisen vaikutuksen avulla pinnoitetun kuidun pinnassa käyttämällä sopivia optisia järjestelmiä, jotka selitetään tässä hakemuksessa. Koska sekä merkitty että ei-merkittv AG ovat pääasiallisesti reaktiviteetiItään identtisiä AB-pin-noitteeseen kuituoptiikkaan nähden, mutta ainoastaan merkitty elementti voidaan ilmaista sen merkinnän kautta, tulee kuidun avulla ilmaistu optisen ominaisuuden (esim. absorbanssin pieneneminen siinä tapauksessa, että käytetään absorboivaa merkkiä) näennäinen muuttuminen olemaan kääntäen verrannollinen AG: n tuntemattomaan konsentraatioon ja voidaan määrittää vertaamalla tunnettujen standardien sopivaan sarjaan. Tämänkaltainen sovellutus on seuraavassa havainnollistettu eräässä esimerkei stä.

Tässä vaiheessa on eduksi esittää selvä toteamus, joka koskee merkkiä, jota käytetään tapahtuvan reaktion mittaamiseksi. Immunokokeissa ei normaalisti ole mahdollista mitata analyyt-tiä suoraan, koska analyyttien ja reaqenssien konsentraatiot ovat äärimmäisen pieniä. Koska rajoitetusti reaqenssia sisältävissä kokeissa tasapainotilassa oleva seos pääasiallisesti ainoastaan sisältää analyyttiä ylimäärin ja sitoutunutta kompleksia kiinteänä määränä, jolloin edellistä ei voida mitata suoraan ja viimeksi mainittu on kiinteä määrä, ei voida saada analyvtin alkuperäisen konsentraation mitään kvantitatiivista arviota edes senkään jälkeen, kun kompleksi ja antiqeenin ylimäärä on erotettu. Lisätty merkkiaine (hieman merkittyä

II

15 7 6 4 3 2 analvyttiä) on välttämätön mittauksen mahdollistamiseksi merkkiaineen välityksellä sen perusteella, miten se on jakautunut sitoutuneen osan ja vapaan osan kesken.

Jos analyytillä kuitenkin on sille ominainen ominaisuus, joka voidaan mitata, kun analyvtti on paikallisesti konsentroitu (esim. erotettu "in situ" ja konsentroitu "in situ") esim. kuituoptiikkasondin pinnalla, ei merkityn analyytin lisääminen enää ole välttämätöntä. Niinpä tämän keksinnön mukaan voi analvytin ja reaqenssin muodostaman kompleksin konsentroiminen "in situ" mahdollistaa analyvtin ilmaisun ilman, että turvaudutaan merkkiaineeseen. Analvytin ja reaqenssin muodostaman kompleksin paikallinen konsentroiminen (koska reagenssin määrä on kiinteä) ei kuitenkaan mahdollista analvytin alkuperäisen konsentraation kvantitatiivista määritystä, ellei analvytin ja reaqenssin välistä reaktiota mitata kineettisesti, tai ellei analyytin kokonaismäärä ole oienempi kuin ragenssin sidoskoh-tien määrä. Täten voidaan merkkiaineeseen turvautumatta käyttämällä kompleksiin sitoutuneen analyytin erottamista ja konsentroimista "in situ" vhdessä kineettisestä toimivan herkän ilmaisujärjestelmän kanssa, kuten tämän keksinnön mukaan, kvantitatiivisesti ilmaista analvytti reaqenssia rajoitetusti sisältävässä järjestelmässä.

Mitä merkkiainejärjestelmiin tulee, voidaan erottaa toisistaan merkkiainejärjestelmät, joissa analyvtin merkitty versio lisätään tähdemäärin reaktioon, ja merkityt reagenssijärjestelmät, joissa merkkiaine liitetään määrättyyn reaqenssiin. Edellistä merkittyä reaqenssia käytetään normaalisti reaqenssia rajoitetusti sisältävissä kokeissa (esim. standardi-radioimmunoko-keissa), kun taas viimeksi mainittua reaqenssia normaalisti kävtetään reagenssiä ylimäärin sisältävissä kokeissa (esim. standard i tyynni, s i ssä kerrostetuissa kokeissa), ja voidaan käyttää reaqenssin kineettisten kokeiden eräissä muodoissa (esim. UE-oatenttijulkai su 3 931 350 , Kronick ja kumDo.) . Merkityt analyytti- ja merkityt reagenssiiärjestelmät soveltu- 1S 76432 vat käytettäviksi tässä keksinnössä siinä tapauksessa, että käytetty merkkiaine voidaan ilmaista valojohtojärjestelmässä (esim. absorboivat tai fluoresoivat merkkiaineet).

Selityksen seuraavassa osassa viitataan oheisten piirustusten toiseen osaan.

Kuvio 4 havainnollistaa diagrammina ensimmäistä koetyyppiä, jota sanotaan "suoraksi koetvypiksi." .

Kuvio 5 esittää diagrammia, joka havainnollistaa "rajoitettuun reagenssimäärään"-oerustuvaa koetvyopiä.

Kuvio 6 esittää diagrammia, joka havainnollistaa välillistä vertailutvypoistä "rajoitettuun reagenssimäärää n " perustuvaa koetta.

Kuvio 7 esittää diaqrammia, joka havainnollistaa peräkkäistä "kyllästys"-tvypnistä koetta.

Kuvio 8 esittää diaqrammia, joka havainnollistaa "kerrostus"-tyvooistä koetta.

Kuvio 4 näyttää kaavioi!isesti yksinkertaisinta koetaoausta, johon keksintöä voidaan soveltaa. Tätä sanotaan "suoratyyppi-seksi" kokeeksi. Tässä kokeessa valojohdon sydän 1, josta on näytetty ainoastaan eräs osa (ja jonka taittokerroin on n^) , on varustettu vasta-ainetta AB olevalla kalvolla. Tämä sydän upotetaan analyytt i 1 luokseen, jonka taitekerroin on r\2 (n^ > Π2) , ja joka sisältää määritettävää antigeeniä AG?. Antigeeni sitoutuu AB-molekyy!eihin nopeudella, joka on verrannollinen antigeenin (AG?) konsentraatioon (koska sydämellä olevan AB-kalvon määrä on kiinteä kokonaisuus) , ja kun tämä nopeus on määritetty, voidaan sitä verrata standardinopeuksiin, jotka on saatu kalibroivista AG-luoksista ja (AG?) voidaan määrittää. Täten voi kävtettävissä oleva AB-määrä olla "rajoitettu", tai «itä voi olla ylimäärin, jolloin reaktio voi edistyä tasapai- 76432 17 notilaan. AR-AG-komol eksin muodostumisen ilmaisemiseksi sydämessä tapahtuvien entisten muutosten avulla voidaan käyttää erilaisia edellä mainittuna menetelmiä (esim. signaalin sammuttaminen absorptio-, sironta-ja fluoresenssi-ilmiöiden avulla, jne) edellyttäen, että Ab.AGjn muodostuminen aiheuttaa tarvittavat ontiset muutokset. Täten koe soveltuu erikoisen hyvin suurille molekyyleille, jotka kvkenevät sirottamaan valoa, tai noilla on havaittavissa olevia ominaisuuksia määrätyillä aallonni tuuks i1la tai jotka säteilevät fluoresenssia, kun ne herätetään määrätyillä aallonoituuksilla. Jos tällaiset ominaisuudet Duuttuvat, on koe suhteellisen arvoton, joten edulisesti on käytettävä "rajoitettua reaqenssi"-tvyopistä vertailukoetta lisäämällä analyyttiin tietty määrä merkittvä AG:a (AG*). Tämä on havainnollistettu kuviossa 5, jossa käytetyt merkit (kirjaimet ja numerot) ovat samat kuin kuviossa 4. Tässä kokeessa ei AG*-määrän tarvitse olla tunnettu edellyttäen, että se on standardoitu (toisin sanoen aina vakio kalib-rointikäyrien ja -kokeiden ryhmälle), koska analyyttiset reaktionopeudet eri suurilla AG?-määrillä aina tulevat olemaan suorassa suhteessa AG*/AG?-suhteeseen (jolloin luonnollisesti on muistettava, että valojohdossa havaittavissa oleva ootinen muutos ainoastaan johtuu merkitystä reaktiotuotteesta AG*.AB).

"Rajoitettu reagenssi,,-tyyooisen kokeen eräässä toisessa sangen käyttökelpoisessa vaihtoehdossa valojohdon svdän pinnoitetaan tunnetulla tai kiinteällä määrällä samaa antigeeniä (e-dullisesti puhtaana), joka on määritettävä analyyttisessa näytteessä, minkä jälkeen sydän saatetaan kosketukseen näytteen kanssa ia samanaikaisesti lisätään kiinteä määrä vapaasti ilmaistavissa olevaa vasta-ainetta. Tämä on havainnollistettu kuviossa 6, jossa on käytetty samoja merkkejä kuin edellä. Tästä kuviosta nähdään, että vertailumäärä vasta-ainetta AB tulee samanaikaisesti reagoimaan sydämellä olevan vertailu-AG: n kanssa ja mitattavan AG?:n kanssa. Täten havaittu nopeus (joka kuvastuu putkessa tapahtuvien ootisten muutosten muodossa) tulee olemaan suhteessa AB/AG?-moolisuhteeseen, ja halutut tulokset voidaan saada vertaamalla vertailunooeuden standardi- 18 76432 käyriin. Tässä tapauksessa on AR:lla ilmeisesti oltava havaittavissa olevia ominaisuuksia kokeessa kaytettvä optista menetelmää varten, toisin sanoen AR:lla voi olla absorbanssia sopivilla aallonpituuksilla, tai se voi sooia valon sirottami-seen jne. Ellei AB: a suoraan voida havaita valojohdossa, kun se reagoi AG:n kanssa, voi se vaihtoehtoisesti olla merkitty, esim. liitetty fluoresoivaan tai johonkin muuhun optisesti ilmaistavaan merkkiaineeseen.

Vielä eräs toinen järjestelmä perustuu kuvion 7 havainnollistamaan ns. peräkkäistestaukseen. Tässä kokeessa käytetään sydäntä, jolla on kiinteä AR-määrä, joka on suurempi kuin vastaava ekvivalenttinen määrä, joka tarvitaan määritettävän AG?:n sitomiseksi. Ensimmäisessä vaiheessa pinnoitettu sydän tällöin saatetaan kosketukseen näytteen kanssa, minkä seurauksena käytettävissä oleva AG° tulee sitoutumaan ja täten saadaan poistetuksi nävtteestä. Tämän jälkeen sydän saatetaan kosketukseen merkityn AG*:n kanssa, joka täyttää sydämellä olevan vasta-ainekerroksen aukot. Mittaamalla tämän jälkeen tai reaktion aikana ne optiset muutokset, jotka aiheutuvat AG*:n merkistä, saadaan tarvittavat tiedot alkuperäisen AG?-määrän laskemiseksi.

Lopuksi keksintö myös hvvin soveltuu siihen koetapaukseen, jota sanotaan "kerrostus"-kokeeksi, ja joka koskee sellaisten antigeenien määritystä, joissa on useampi kuin yksi sidoskohta vasta-aineita varten, joissa antigeeneissä toisin sanoen on kohdat, jotka on numeroitu (1), (2)...(n), jotka kvkenevät sitoutumaan 1, 2, tai n eri vasta-aineeseen. Tämä on kaaviol-lisesti esitetty kuviossa 8, jossa ensimmäinen vasta-aine on merkitty ABI, toinen vasta-aine on merkitty AB2 ja kaksikoh-tainen antigeeni on merkitty (2)AG(1). Tässä tapauksessa oletetaan, että antigeeni ei sellaisenaan ole optisesti ilmaistavissa, kun taas AB2 voidaan ilmaista sen jälkeen, kun se on reagoinut AG:n sopivan toisen kohdan kanssa. Näin ollen tässä tapauksessa, jossa (2)AG(1)? on määritettävä, käytetään sydäntä, jossa on ensimmäisen vasta-aineen (ABI) muodostama alku-

II

7 6 4 3 2 vertai1uoinnoite, joka saatetaan kosketukseen antigeeni1iuok-sen kanssa. Tämä liuos tulee täten sitoutumaan svdämeen ensimmäisessä sidoskohdassa, minkä jälkeen vertailumäärin lisätään toinen vasta-aine AB2 ja mitataan sen sitoutumisnopeus antigeenin kohtaan 2 niiden optisten muutosten avulla, joita e-siintvy sydämessä tämän sitoutumisen tuloksena, ^ässä mentei-mässä voidaan tietenkin ensimmäisen reaktion ABI + (1)AG(2) antaa edistyä tasapainotilaan, ennen kuin lisätään vertailu-määrä AB2:a, tai vaihtoehtoisesti voidaan suorittaa samanai-kaistyypninen koe, dolla toisin sanoen AB2 voidaan lisätä liuokseen samanaikaisesti kun tämä saatetaan kosketukseen Ahlilla pinnoitetun valojohtosydämen kanssa. Tämä soveltuu erikoisesti siinä tapauksessa, että ABI ja AB2 ovat erilaisia monokloonisia vasta-aineita (ks. esim. julkaisua Uotila et ai. Journal of Immunological Methods 42 (1981) 11 - 15). Edellä selitetyn koejärjestelmän muita vaihtoehtoja voivat tämän alan ammattimiehet sovittaa poikkeamatta keksinnön ajatuksesta, jolloin jokaisen tällaisen vaihtoehdon käyttöoarametrit määritellään vertailemalla analvytin kalibrointiliuosnäytteisiin.

Seuraavassa esitetään oheisten piirustusten seuraavan osan perusteella esimerkkinä kojeita, jotka soveltuvat keksinnön mukaisen menetelmän eri suoritusmuotojen toteuttamiseksi optisen absorption, fluoresenssin ja sironnan aloilla, samoin kuin eliiosometriset mittaukset.

Kuvio 9 esittää kaavioi1isesti laitetta, joka mittaa optisen kuidun läpi kulkevan valosignaalin muutokset "in situ", jotka muutokset aiheutuvat kompleksisen kalvon laskeutumisesta tälle ootiselle kuidulle.

Kuvio 10 esittää kaavioi1isesti liioitellussa mittakaavassa kuvion 9 mukaisessa laitteessa käytettävää optista kuituson-dia. Kuvio 10a esittää oäältä päin tämän sondin erästä osaa, ja kuvio 10b esittää sivulta katsottuna tämän sondin leikkausta kuvion 10a viivan B kohdalta.

20 764 32

Kuvio 11 esittää k a avioliisesti suurennetussa mittakaavassa sondin erästä toista suoritusmuotoa, ioka erikoisesti soveltuu valomuotovaihteluien mittaamiseksi. Kuvio 11a esittää sondia edestä katsottuna ia kuvio 11b sivultan katsottuna.

Kuvio 12 esittää kaavioliisesti diagrammina valosiqnaaleia kuvion 9 kaltaisen laitteen ilmaisimen kohdalla, iota laitetta käytetään fluoresenssimittauksiin. Kuvio 12a koskee tilannetta ennen kuin reaktio on alkanut. Kuvio 12b esittää tilannetta jonain ajankohtana kokeen aikana.

Kuvio 13a esittää kaavio 1 1isesti oäältä näin laitetta, ioka mittaa niitä optisia muutoksia, iotka valon sironta aiheuttaa valoi ohdossa.

Kuvio 13b esittää kuvion 13a mukaista laitetta sivulta katsottuna osakuviona.

Kuvio 14 esittää kaavioll isesti liioitellussa mittakaavassa kuvioiden 13a ja 13b mukaisen suoritusmuodon erästä muunnosta.

Kuvio 15 esittää kaaviollisesti. tämän suoritusmuodon erään toisen muunnoksen osaa.

Kuvio 16 esittää kaaviollisesti laitetta, joka mittaa niitä optisia muutoksia, joita aiheutuu valojohdossa fluoresenssi-ilmiöiden vaikutuksesta.

Kuvio 17 esittää kaaviollisesti paljon liioitellussa mittakaavassa kuvion 16 mukaisen laitteen erästä osaa, ja tarkoituksena on näyttää tulevan ja fluoresoivan valon heijastumiskulmia.

Kuvio 18a esittää kaaviollisesti päältä näin laitetta, joka ellipsometrisesti mittaa optisessa kuidussa esiintyviä optisia muutoksia, jotka aiheutuvat komDleksikalvon muodostumisesta tälle kuidulle.

Il 764 32 21

Kuvio 18b esittää täplän laitteen erästä poikkileikkausta kuvion 18a viivan A-A kohdalta.

Kuvion 8 kaavioitisesti näyttämässä laitteessa on oääasialli-sesti seuraavat komoonentit: a) kuituoptiikka 1, ionka keskeinen osa menee määritettävää nestemäistä analvyttia sisältävän säiliön eli astian 2 läni. Nesteeseen anotetun kuituosan Däällys on ooistettu siten, että tämä osa voidaan oinnoittaa ennen käyttöä ohuella kalvolla määrättyä reaqenssia, joka muodostaa komoleksin nesteeseen liuotetun elementin kanssa, joka on määritettävä. Kuidun 1 ja säiliön 2 yhdistelmä muodostaa laitteen testisondin.

b) moottorin 4 ovörittämä katkoinkiekko 3, jossa on kaksi d iametr aal i.sesti vastakkain ol evaa ikkunaa, joissa on suodattimet 5 ia 8 sekä aukko 7.

c) valon oäälähde 8, koi1imaattori1inssi 8, rengasmainen aukko 10 ja tarkennuslinssi 11 kulman mukaan valitun valonsäteen syöttämiseksi sondin kuitusydämeen. '’’ässä erikoisessa suoritusmuodossa kuitu on monimuoto, ja aukko 10 on sovitettu Tönäisemään määrättyjä muotoja eräiden seuraavassa selitettävien vaatimusten perusteella. Myöhemmin selitettäviä muutoksia käyttäen voidaan tätä laitetta myös käyttää pienemmän muotolu-vun, esim. yksimuotokuitujen yhteydessä. Tarkennuslinssi , joka k a avioi 1 i ses ti on näytetty piirustuksessa, on todellisuudessa otoinen järjestelmä, joka on samankaltainen kuin mikroskoopin objektiivi, mutta jota voidaan asetella, paitsi sen siirtämiseksi pitkin optista rataa myös sivusuunnassa ja ylöspäin ja alaspäin säteen asettamiseksi tarkasti kuidun etuoään eteen.

d) Tämän lisäksi laittessa on valon pää ilmaisin 12, joka muuttaa sydämestä lähtevän valosignaalin sähkösiqnaaliksi, vaihelukittava vahvistin 13 ja näyttölaite 14. Vertai 1 usignaa-li saadaan toisesta lähteestä 15, jonka valo muutetaan pulssimaiseksi saattamalla se menemään katkoimessa olevan aukon 7 läpi, minkä jälkeen valo suunnataan ilmaisimeen 16, joka tämän jälkeen syöttää vastaavia sähköpulsseja vaihelukittavaan vahvistimeen 13.

764 32 22

Kuvio 10 (kuviot 10a + 10b) esittävät keksinnön mukaisessa laitteessa kävtettävän analvyttisen sondin erästä suoritusmuotoa. Kuviossa on näytetty muovia oleva säiliö 2, ionka kahteen vastakkaiseen sivuun on leikattu B-muotoiset urat tai raot 21a ja 21b. Kuituootiikan 1 eräs osa on päällyksineen 22 tvönnetty näihin uriin, jotka oitävät kuidun paikallaan. Kuidun keskiosan päällvs Doistettu esim. syövyttämällä sopivaa liuotinta käyttäen, ja tämän jälkeen pinnoitettu ohuella kalvolla 23 määrättyä konjuqaattiainetta, joka muodostaa kompleksin määritettävän elementin kanssa, joka elementti on kuvattu pienillä neliöillä 24.

Tämä laite toimii seuraavasti: Ensin valitaan suodatin 5 siten, että se läpäisee sydämen läpi aallonpituuden joka muuttuu absorption vaikutuksesta jokaisen sisäisen heijastu-miskohdan luona, koska kalvon 23 ja analysoitavien liuenneiden molekyylien 24 muodostaman kompleksimateriaalin pinnoite absorboi osan nopeasti vaimenevasta aallosta. Havainnollisuuden vuoksi voidaan sanoa, että 23 edustaa vasta-aineen (AB) hyvin ohutta kerrosta ja 24 edustaa määritettävän määrätyn antigeenin (AG) molekyylejä, jolloin koe on kuvion 4 havainnollistamaa "suoraa tyyppiä". Suodatin 6 on valittu siten, että se läpäisee sydämen läpi. aallonpituudella Λ 2 > jota tämä komplek-sioinnoite ei absorboi, ja johon näin ollen ei vaikuta kysymykseen tuleva immunologinen reaktio. Katkoimen 3 pyöriessä molemmat signaalit ja Ä2 syötetään vuorotellen sondin sydämeen, jolloin toinen signaali /) j_ absorboituu progressiivisesti pinnoitteen 23 + 24 kasvaessa ja toinen signaali λ2 toimii vertailusignaalina esim. kalibrointia ja kompensointia varten (kennon tai kuidun korvaus uudella, ine). Sondi valmistetaan valitsemalla sopiva pituus optista kuitua (monimuotoinen kuvion 10 näyttämässä tapauksessa), työntämällä tämä kuitu uriin 21a ja 21b siten, että keskiosa pysyy vaakasuorana säiliössä 2. Tiivistäminen vedeltä tehdään käyttämällä uriin kumimassaa tai 1iimaliuosta, jonka annetaan kuivua. Tämän jälkeen mainitun keskiosan päällys syövytetään pois. Hartsi-päällysteistä kuitua käytettäessä käytetään tämän päällyksen 76432 23 poistamiseksi sopivaa orgaanista liuotinta, ia lasioääl l.vs-teistä kuitua käytettäessä syövytetään laimennetulla fluori-vetvhapolla. Viimeksi mainitussa tapauksessa ei ole välttämätöntä kokonaan syövyttää päällystä pois seuraavassa selitettävistä syistä. Sen iälkeen, kun liuottava tai syövyttävä luos on poistettu ja kenno on puhdistettu perusteellisesti tislatulla vedellä, pinnoitetaan kuidun sydän vasta-ainetta (Ah) olevalla kalvolla soveltamalla tavanomaisia keinoia, esim. täyttämällä kennoon AR-liuost.a niin, että AB laskeutuu sydämelle tasaisena kerroksena. fJos iostain svvstä kuidun pinnalla ei ole riittävää affiniteettia pintaan laskettavaa molekyyliä varten, voidaan pinta ennalta tehdä sitovaksi tämän alan tekniikasta tunnettuna käsittelynä soveltaen, esim. oksastamalla sidoskohtia, sovittamalla reaktiivinen välikerros, jne. Tämän yhteydessä on olemassa runsas kirjallisuus (kuten on selitetty eurooppalaisessa pa t en 11 ihakemus i ulka i. sus sa nro 29.411). Kennon tultua tyhjennetyksi ja huuhdotuksi sovitetaan kenno laitteen nävtettvvn paikkaan linssin 8 ja ilmaisimen väliin, minkä jälkeen kennoon lisätään sopivaa puskuri1iuotin-ta. Tämän iälkeen laite käynnistetään ja katkointa pyöritetään sopivalla nopeudella, esim. 120 k i err/min. signaalit λ ^ ia *2 syötetään sondin sydämeen, ja ilmaisin 12 muuttaa ne likimain sakaramaisiksi sähköpulsseiksi, jotka syötetään vaihelu-kittavaan vahvistimeen 13. Lukitseva vertailusignaali kehitetään myös kerran jokaiselta kierrokselta aukon 7 läpi lähteestä 15, ja ilmaisin 15 saattaa vahvistimen erottamaan (koinsi-denssin vaikutuksesta) aallonpituuksilla λ^ ja λ2 esi i ntvvät pulssit. Käytännössä säätimet edullisesti asetetaan siten, että nämä pulssit ovat suunnilleen yhtä suuret, ennen kuin reaktio käynnistetään. Tämän jälkeen ajankohtana nolla analysoitava näyte (AG-liuos) lisätään sondin säiliöön 2 ja sekoitetaan nopeasti puskuriin (esim. sekoittimella tai kaasun kuplintalaitteella, joita ei ole nävtettv). Aallonpituuden λχ aiheuttama siqnaali alkaa tämän iälkeen progressiivisesti muuttua sondin sydämen lähtöpäässä sen seurauksena, että ana-lyvtin AG molekvyleiä sitoutuu kuidun sydämeen (AB.AG-komolek-sin kasvattamiseksi), ja tämä kompleksi absorboi osan aallon- 764 32 24 pituuden Αχ omaavan nopeasti vaimenevan aallon enerqian erään osan nopeudella, joka on verrannollinen AG:n konsentr aat ioon, jolloin vastaavat vaihtelut syötetään vahvistimeen vastaavina sähköpulsseina ilmaisimesta 12. Täten vaikelukittuvaan vahvistimeen 13 liittyvät laskentapiirit laskevat tiedot, jotka aiheutuvat A-j/ A^-siqnaalin suhteesta ja antavat tulokset nävttöjärjestelmään 1.4 esim. korttiin tallennettuna nopeuskäy-ränä (voidaan tietenkin haluttaessa kävttää mitä tahansa muuta näyttötyyDDiä, esim. digitaalista näyttöä tai oski11oskoop-pia) . Täten saatuja nopeustietoia verrataan sitten standardi-tietoihin, jotka on saatu tunnetun konsentraation omaavista AG-liuoksista, ja tuntematon konsentraatio saadaan interpoloi-malla. tällaiset laskelmat voidaan tehdä käsin tai tehdä automaattisesti mikrotietokoneen avulla, jolloin vertailutiedot on varastoitu tämän tietokoneen muistiin. Valitsemalla soDivia aikajaksoja reaktion ajallisen pituuden kuluessa voidaan valita reaktion halutut nooeustiedot ja erottaa nämä muista nope-ustiedoista, jotka aiheutuvat enemmän tai vähemmän samanaikaisesti mutta eri nopeuksilla edistyvistä interferoivista ja haitallisista reaktioista. Lisäksi tai vaihtoehtoisesti voidaan tasaoaino-olosuhteet johtaa ekstrapoloimalla ja tällä tavalla voidaan suoistaa sitä aikaa, joka kuluu jokaiseen mittaukseen, verrattuna normaaleihin tasaoainomittauksiin. Tämän kysymyksen lisäselvityksiä voidan saada julkaisuista "Kinetic Versus Equilibrium Methods of Analysis" by B.W. Renee et al., in "Centrifugal Analysis in Clinical Chemistry, Price & Spencer; Praeqer (19801 ja Analytical Chemistry 50/02, (1978), 1611-1618.

Tässä vaiheessa on eduksi muistaa, että mittausten herkkyyttä voidaan vaihdella riippuen kuidun tulopäähän syötettyjen valo-muotojen numerosta, toisin sanoen muuttamalla aukon 10 rengasmaista asettelua ja leveyttä. Tämä on helposti ymmärrettävissä, kun muistetaan, että ne absorptioilmiöt, jotka liittyvät sydämen sisäpuolella kokonaisheijastuneeseen säteeseen ja jotka aiheutuvat tämän sydämen ulkosivussa olevasta päällyksestä, ainoastaan vaikuttavat tämän säteen nopeasti vaimene-

II

764 32 vaan aaltokomoonenttiin, toisin sanoen niihin sähköisiin kom-oonentteihin, jotka tunkeutuvat päällykseen. Täten on valittujen valomuotojen kokonaisheijastumiskul mien oltava riittävän laakeita kuidun akseliin nähden kokonaisheijastumisen varmistamiseksi (vaikka vesiliuoksen taitekerroin hiukan muuttuu kuidun svdäntä vmoäröivän pinnoitteen kasvaessa) ia riittävän jyrkiä siten, että saadaan riittävän tiheästi sijaitsevia heijastuskohtia oitkin kuitua (itse asiassa nopeasti vaimeneva aalto ainoastaan näissä kohdissa vaikuttaa komoleksipinnoit-teeseen) . Täten voidaan saada aikaan koeherkkvyden optimoiti säätämällä aukon parametrejä oikealla tavalla, mikä riippuu kulloinkin kävtetvstä sydämestä, testi1iuoksesta ja kompleksin taite kertoimesta . Ammattimiehet voivat määrittää nämä säädöt jokaista eri mi ttaustvvopiä varten ja voivat sitten sisällyttää ne suunnitteluun kenttähenkilöstön tarpeita varten.

On myös mielenkiintoista todeta, että muuttamalla aukon 10 parametrien asettelua voidaan keksinnön mukainen laite saattaa toimimaan eri "luokassa". Niinpä voidaan sopivasti säätämällä tätä aukkoa laite saattaa toimimaan valomuodoilla kysymykseen tulevan kävnnistusjärjestelmän kokonaisheijastumisen kriittisen kulman Qc 1ikiläheisyydessä . Tapauksessa, jossa kokeen aikana eron ^n = n-| - r\2 on pienennyttävä kompleksin muodostue sa, tulee kokonaisheijastuskulma sydämen ja pinnoitteen rajapinnassa muutumaan siten, että eräät valomuodoista (tai kaikki) tulevat äkkiä taittumaan kuidun ulkopuolelle, jolloin tapahtuu signaalin terävä katkeaminen. Tällainen järjestely tulee täten antamaan mitä suurimman herkkyyden analyvttimole-kvylien hyvin pieniä määriä varten. Tämä järjestely soveltuu kuitenkin huonommin kvantitatiivisiin mittauksiin.

Edellä mainittiin, että käytettäessä lasipäällvsteistä kuitu-optiikkaa ei tällaista päällystä tarvitse kokonaan syövyttää pois tätä käyttöä varten. Koska käytön aikana nopeasti vaimeneva aalto tulee itse asiassa tunkeutumaan päällykseen muutamia kymmeniä nanometrejä, on sydämen ympärillä jäljellä oleva lasioäällys, jonka paksuus on pienempi kuin mikä on välttämä- 7(, 76432 töntä nopeasti vaimenevaa aaltoa varten yhämahdollinen, eikä se tule merkityksellisesti vaikuttamaan yhdessä reaktiomateri-aalien kanssa, mikä asettaa vähemmän ankaria valvontaehtoja svövytyskäsittelylle. Paksummat kuidut eivät myöskään ole yhtä helposti rikkoutuvia kuin ohuemmat kuidut.

Kuviot 11a ja llb esittävät kaavioli isesti kuidun erästä oi -dintyyoDiä, joka suurella kertoimella moninkertaistaa kokeen herkkvyden. Tämä oidin koostuu kahdesta kierukkamaisesti uurretusta laipasta, äotka on tehty inertistä muovista (esim. pleksilasista tai polyesteristä), ja joille optinen kuitukao-Dale kelataan ja kiinnitetään kiinnittimillä 33 ja 34. Kuidun etu- ja takaoäät, vast. 35 ja 36, on taivutettu sivuille siten, että niitä voidaan käyttää yhdessä valoa syöttävän linssin 11 ja ilmaisimen 12 kanssa. Kuidun kierrosten 37 keskellä olevat suorat osat ovat paljaat, kun taas urissa lepäävät jäljellä olevat kaarevat osat 38 ovsyttävät alkuperäisen suo-japäällyksensä. Paljaat osat syövytetään siten, että ensin peitetään Ditimen alalaippa sopivan silikonikumiliiman liuoksella, jonka annetaan kuivua. Tämän jälkeen pidin upotetaan syövytyslluokseen vlälaioan alapintaan asti, jolloin kaikki päällyksen välillä olevat osat tulevat poistetuiksi, kun taas alapuolinen kumilla suojattu laippa jää ennalleen. Kokeiden suorittamiseksi ja sen jälkeen, kun kuidun paljas osa on pinnoitettu AGtlla tai ABtlla kuten ennenkin, sijoitetaan pidin oikeaan asentoon kannattimen 39 avulla laitteen optiselle radalle. Tämän jälkeen reaktiovällainetta sisältävä säiliö sovitetaan paikalleen alhaaltapain, reagenssi lisätään ja mittaukset tehdään kuten ennenkin.

On tähdennettävä, että kaikki tähän keksintöön kohdistetut edellä esitetyt selitykset, jotka koskevat vesi- tai orgaanisessa väliaineessa käytettävän kuituoptiikan käyttöä edellyttävät, että taitekerroin on lähellä veden taitekerrointa (toisin sanoen noin 1,3) , kun taas kuidun lasisydämen kerroin n^ sen sijaan on lähempänä arvoa 1,5, ja aktiivisen pinnoitteen kerroin n2 on tällä välillä, toisin sanoen < 1,5 mutta > 1,3.

li 76432 27 Tämä ehto on tässä yhteydessä oleellinen, koska jos r\2 olisi suurempi kuin n-j_, tulisi valo taittumaan päällykseen, sitten takaisin sydämeen, jne. Kuten edellä on mainittu ei tällainen menetelmä ole sellaisenaan mahdoton, kuten on selitetty esim. julkaisussa Nature 2 57 (1975), Hardv ja kuuron., jotka käyttivät 1 asitanko-vaiojohtoa, ja joiden oli käytettävä suhteellisen paksuja nolvmeraattipinnoitteita, jotka sisälsivät upotettuina eräitä määritettäviä reaqensseja. Tämä ei kuitenkaan olisi käyttökelpoista nvt puheena olevassa tapauksessa, koska ympäröivien liuosten taitekertoimet aina ovat pienemmät kuin kuitusvdämen kerroin n-j , ja käytetään ainoastaan hvvin ohuita pinnoitteita (jotka ovat suuruusluokkaa nanometrin sadasosia ...muutamia kymmeniä mikrometrejä). Tämän vastakohtana Hardy ja kurnnp. toimivat ilmassa eivätkä mitanneet reaktioiden nopeuksia .

Eräs toinen tärkeä kohta, josta on keskusteltava, on kysymys yksimuotokuiduista. Kovettamalla tämän alan tekniikassa tunnettuja varsin pieniä muunnoksia, jotka pääasiallisesti koskevat valon syöttöä kuituun, voidaan vksimuotoisia kuituoptiikkoja yhtä hvvin käyttää mvös keksinnön mukaisessa menetelmässä. Näissä kuiduissa on yleensä hvvin ohut sydän (muutamia mikrometrejä), jota ympäröi suhteellisen naksu päällys, ja niiden transmissio riippuu suuresti aallonpituudesta, joten toisin sanoen kuidulla, jonka vaimennus on ainoastaan 5 % metriä kohden aallonpituudella 850 nm, voi olla noin 40 % suuruinen vaimennus 800 ja 900 nanometrillä (ks. julkaisua T.G. Giallorenzi in Proceedings of the IEEE 6j5 (1978), 748). Yksi-muotoisen johtumisen saavuttamiseksi kuidussa aallonpituudella λ on seuraavan lauseen V = 8,9a 1/ ηιΔη/^ arvon on oltava pienempi kuin 2,4 (^n = x\\ - n?) , jolloin a on kuidun säde mikrometreinä. Yli arvon V = 2,4 kuitu ei enää ole vksimuotoi-nen. Kun arvo V on oieni (esim. pienempi kuin 1) tulee ohjattu yksimuoto löysemmin sidotuksi, toisin sanoen kenttä leviää huomattavasti kuidun fysikaalisen sydämen ulkopuolelle (esim. 2 tai 3 kertaa sydämen halkaisija). Täten vksimuotokuitujen transmissio-ominaisuudet ovat erittäin herkkiä päällyksen 28 76432 taitekertoimen vähäisille muutoksille (^n:n muutoksille), toisin sanoen keksinnön mukaisen kokeen aikana muodostuvan orgaanisen pinnoitteen taitekertoimen muutoksille). Tämä taitekerroin on itse asiassa avainvariaabeli, joka esiintyy yksi-muotokuiduilla suoritetussa kokeessa, koska kompleksikerroksen paksuus kasvaa reaktion aikana. Monimuotokuidussa tapahtuvat sisäiset heijastumiset päästävät nopeasti vaimenevan aallon kulkemaan heijastavan rajaoinnan välittömässä läheisyydessä yhdensuuntaisena sydämen kanssa hyvin lyhyen etäisyyden, joka voidaan määrittää Maxwellin yhtälöiden avulla jokaisen heijastumisen yhteydessä, kun taas vksimuotokuitu mahdollistaa tämän nopeasti vaimenevan aaitofraktion kulun yhdensuuntaisena sydämen kanssa pitkin kuidun koko tehollista pituutta. Täten yksi-muotokuitujen käyttäminen keksinnön mukaisessa laitteessa helpottaa herkkyyden suurentamista, verrattuna monimuotokui-t u i h i n.

Yksimuotokuituia voidaan kävttää syövyttämättä täydellisesti alkuperäistä päällystä, koska ohjatut valokentät ulottuvat merkityksellisesti päällykseen ja myös reaktion aikana muodostuneeseen kompleksikerrokseen.

Laitteeseen tehtävät muunnokset yksimuotokuituja käytettäessä ovat pääasiallisesti luonteeltaan optisia ja koskevat toisin sanoen valon syöttöä kuituun ja sinqaalin ilmaisua. Näitä optisia muunnoksia ei selitetä tässä, koska ammattimiehet tuntevat ne, ja ne on hvvin selitetty kirjallisuudessa (ks. esim. edellä mainittua Giallorenzi-kirjoitusta ja siinä olevia viitteitä).

Keksinnön mukaista laitetta voidaan myös käyttää keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseksi käyttämällä fluoresenssi-ilmiöitä absorption tai taitekertoimen muutosten asemesta. Tämän suorittamiseksi on tehtävä laitteeseen seuraavat muunnokset:

II

76432 a) Analyyttiin AG lisätään f 1 uoroivaa merkittyä antigeeniä (AG*), Menetelmä tulee täten toimimaan "rajoitettuun reagens-simäärään" perustuvien immunokokeiden olosuhteissa, kuten edellä on sel.itettv (ks. kuviota 5) .

h) Suodatin 5 valitaan aal1onoituudella Λχ» joka on spesifinen mitattavan fluoresenssin herättämiseksi, ia suodatin 6 valitaan siten, että se sulkee pois aallonpituuden λχ, mutta läoäisee f1uoresenssiemission aiheuttavan aallonpituuden λ 2.

c) Kuidun takaoään ia ilmaisimen 12 väliin sovitetaan lisä-suodatin, nolla on samat optiset ominaisuudet kuin suodattimena 6.

Tämän iälkeen asetetaan paikoilleen sondi ia siinä oleva ous-kuriväliaine ia AR-kalvolla (tavanomaisesti) pinnoitettu kuituoptiikka 1, ia laite säädetään toimintakuntoon, kuten kuviossa 12a on kaavioi!isesti nävtettv. Tässä kuviossa näytetään saria pulsseia ilmaisimesta 12. Pulssit, iotka on merkitty P, ovat vertailupulsseia, ioita kehittvv, kun säde läpäisee suodattimen 6. Pulssit E ovat lähetettviä fluoresenssipulsseia, joita kuidun sydämelle muodostuneet fluoroivan kompleksin AR.AG*-molekvvlit syöttävät kuituun. Täten on käynnistettäessä E-taso (kuvio 12a) noin nolla, koska ei esiinny fluoresenssia tai ainoastaan esiintyy jäännös-taustakohinaa. Tämän iälkeen lisätään analyytti, ioka sisältää määritettävää analvyttiä sekä tunnetun määrän merkittyä fluoroivaa ainetta AG*, jolloin fluoroiva pinnoite vähitellen muodostuu nopeudella, joka on verrannollinen AG : n konsentraatioon, ja kuidussa esiintyy lähetetty fluoresenssisignaali, joka progressiivisesti suurenee ajan mittaan kuten kuviossa 12b on nävtetty. Tämä vaihtelu ilmaistaan, syötetään laitteen vahvistaviin ia laskeviin osiin ja tallennetaan haluttuna nopeusmittana. Tämän iälkeen suoritetaan myöhemmässä vaiheessa tallennettujen tietojen ja standardi-vertailutietojen vertailut silmin tai tietokoneen avul- 30 76432 la, jolloin saadaan halutut analyyttiset tulokset käyttämällä menetelmiä, jotk on selitetty edellä kuvattujen "rajoitettuun reagenssimäärään" oerustuvien kokeiden yhteydessä.

Tässä suoritusmuodossa kuidun sydämen ulkopuolella olevan Dinnoitteen kehittämä fluoresenssi syötetään pääasiallisesti takaisin kuituun ja antaa kokeessa käytetyn siqnaalin. Tämänkaltainen ilmiö on jokin aika sitten selitetty (ks. The Journal of Cell Rioloqv f^9, 141-145 (1981) lasikaopaleen yhteydessä .

Kuituoptiikkaa käytettäessä voidaan etua saavuttaa suuresta herkkyydestä, koska kuidun käyttökelpoinen pituus voidaan tehdä varsin merkitykselliseksi, vaikka tämä pituus on suljettu hyvin pieneen tilaan ja käytetään hyvin pieniä liuostila-vuuksia. On myös mainittava, että pinnoitteiden fluoresenssin mittaus immunokokeissa on jo selitetty (ks. julkaisua M.N. Kronick ja kumpp. Journal of Immunological Methods (1975), 235-240. Tässä tapauksessa fluoresenssi kuitenkin mitattiin vasta-aine)iuoksen avulla, ja käytettiin vhtä ainoata sisäistä heijastumiskohtaa, mikä antoi tulokseksi huonon herkkyyden, koska voitiin käsitellä ainoastaan hyvin rajoitettua osaa koko fluoresenssi-emissiosta. Tapauksessa, jossa käytetään kuitu-optiikkaa, kuten tämän keksinnön mukaan, voidaan mvös mitata sivusuuntaisen fluoresenssin vaikutus esim. käyttämällä litte-äksi kelattua kuitukappaletta ja sijoittamalla ilmaisin aksi-aalisesti kelaan nähden niin, että täten saadaan kerätyksi suurempi osa kuidun lähettämästä fluoresenssivalosta.

Tässä selitetty suoritusmuoto antaa lukuisia etuja verrattuna nykyään tämän alan tekniikassa tunnettuihin koemenetelmiin ja -laitteisiin. Niinoä: a) Koska herkkyys on verrannollinen upoksissa olevan kuitu-osan pituuteen, voidaan valmistaa erittäin herkkiä sondeja, vaikka niiden mitat ovat pienet.

Il 31 7 6 4 3 2 b) Mittauksia voidaan tehdä aallonpituuksien Taalalla alueella, näkyvillä, nv- ia TR-taaiuusalueilla.

c) Voidaan kokeilla mitä erilaisimpia aineita (bioloqisia tai ei-bioloqisiä), ioista mainittakoon lääkkeet, haoteenit, entsyymit, peptidit, proteiinit, hormonit, bakteerit, virukset ja solut. Tävdel.1 i semni luettelo ilmaistavista analvvteistä voidaan saada esim. TJS-patenttijulkaisuista 3 817 837 ja 4 299 916.

Eräs mielenkiintoinen erikoistapaus on verinäytteiden testaus verensiirtoa varten, kun otetaan huomioon vastaanottaiien veressä olevat mahdolliset vasta-aineet. Täten voidaan valmistaa optisia kuitusondeja, joissa on mainitun potilaan veri-komponentteäa sisältävä kalvo, joita komponentteja kokeillaan mahdollisten veren luovuttajien verisoluihin nähden. Poikit-taisr e a k t i v 3 teetin esiintyessä solut tulevat saostumaan kuidulle (koska niiden omat AU-ke skuk set reaqoivat kuidun AB:n kanssa), ja tätä reaktiota voidaan helposti valvoa jollain hemoqlobiinin tyypillisellä absorntiokaistalla (esim. aallonpituudella 588 nm). Eräs toinen mielenkiintoinen erikoistapaus on mahdollisuus käyttää valojohtotunnistintä "in vivo" ana-Ivyttien kvalitatiiviseksi tai kvantitatiiviseksi mittaamiseksi kehossa tai sen eritteissä. Niinpä olisi diaqnoosin yhteydessä mahdollista määrittää kiertävän insuliinin määrä glukoo-s ikuormi tuskokeen seurauksena, ja ruiskutetuilla hormoneilla käsiteltäessä voisi "in vivo" tunnistin ilmaista kiertävän hormonin konsentraation. Mahdollisuus käyttää tunnistimia "in vivo" on Buckles kvllä selittänyt, mutta tällä keksinnöllä on lisäetuina merkkiaineen ouuuttuminen immunokokeessa (jolloin monet merkkiaineet ovat erittäin aktiivisia yhdisteitä, joilla on mahdollisia myrkyllisiä tai karsinogeenisia vaikutuksia), ja lisäksi parantunut valotransmissio, joten ei tarvitse käyttää erikoisia transmissiokuituja signaalin kytkemiseksi tunnistimeen ja pois tästä, kuten Buckles on selittänyt.

32 76432

Kuvioiden 13a ia 13b kaaviollisesti näyttämässä laitteessa on seuraavat avainkomoonentit:

Optinen sondi, iossa on ulokkeiden kannattama (ei näytetty) vinoreunainen valojohtolevv 41 ja vastalevy 42, joka pidetään tarkasti säädetyssä vhdensuuntaisasennossa valoiohtoon 41 nähden. Levy 41 voidaan valmistaa täsmällisesti leikatusta ja korkealaatuisesta kellulasista tai kvartsista. Levynä 42 voi olla mikroskoopin objektinasi. Levvjen 41 ja 42 välinen etäisyys 41a on millimetrin murto-osan suuruusluokkaa, mikä varmistaa, että analyyttiliuos voidaan helposti sijoittaa tähän tilaan, jossa se oysvv kapillaarivoimien vaikutuksesta. Laitteessa on lisäksi valonlähde 43 (tässä erikoisessa suoritusmuodossa on valonlähteenä He-Ne-laser, joka antaa polaroitua valoa), moottorin 45 käyttämä katkoinkiekko 44, jossa on aukko 46 pulssimaisen valosignaalin lähettämiseksi kohti optista sondia optisen järjestelmän läpi, jossa on tarkennuslinssit 47 ja 48, peili 49, oolaroiva levy 50, lieriölinssi 51 ja diafragma 52 hajavalon vähentämiseksi. Syy, miksi valosignaali lähetetään pulsseina, on halu aikaansaada ilmaistun signaalin lopullinen vaiheelle herkkä vahvistus.

Laitteessa on lisäksi fotomonistiniImaisin 53, ja sen suur jännitteinen tehonsyöttölähde 54, jonka lähtö on yhdistetty vaiheeltaan lukittavaan vahvistimeen kaksitiekvtkimen 56 kautta. Fotomonistin on sovitettu keräämään tuotteen sirottamaa valoa, joka tuote muodostuu valojohtolevylle tilassa 41a sen kemiallisen reaktion tuloksena, joka tapahtuu reagoivan aineen ja tilan 41.a täyttämän liuoksen analyytin välillä. Sirontavalo on merkitty nuolilla 57.

Laitteessa on lisäksi ilmaisin 58, joka kokoaa valojohtosydä-men lähdöstä tulevan valon sen jälkeen, kun sydämessä on tapahtunut lukuisia heijastumisia, kuten piirustuksessa on näytetty. Tämän ilmaisimen lähtö voidaan vaihtoehtoisesti syöttää vaiheeltaan lukittavaan vahvistimeen 55 kytkimen 56 kautta. Laitteen vertailusignaalit saadaan ouoliläpinäkvvästä peilistä il 76432 33 59, joka johtaa menen osan ilmaisimessa 60 olevan lähteen valosta, jolloin tämä ilmaisin antaa voimakkuusvertailusignaa-lin, joka syötetään analogiajakolaitteeseen 61, minkä tarkoituksena on kompensoida lähteen mahdolliset vaihtelut mittausten aikana. Pulssimainen lukitseva vertailusiqnaali saadaan peilistä 61 ja ilmaisimesta 62, ja vastaavat sähkösignaalit svötetään vahvistimeen 55. Laitteessa on lopuksi elektroninen yksikkö 62, jossa on näyttöelementti (samalla tavoin kuin edellisissä suoritusmuodoissa) ja tailennin lähtötietojen tallentamiseksi, sekä valinnaisesti mikroprosessori mitattujen tietojen laskemiseksi ja tarvittavien vertailujen suorittamiseksi kaiibrointikokeista saatujen varastoitujen vertailutietojen kanssa.

Käytännössä tämä laite toimii seuraavasti. Ensimmäisenä vaiheena saatetaan optinen sondi kuntoon laskemalla reaktiivista elementtiä oleva kalvo tilan 41a muodostavan valojohdon 41 pintaan. Seuraavassa esitetään yksityiskohtaisesti, miten tämä tehdään. Tämän jälkeen valoiohto 41 ja levy 42 asennetaan laitteeseen, ja optiset ja eTektroniset järjestelmät käynnistetään. Muutaman minuutin lämpenemisen jälkeen säätimet asetetaan nolla-vastausta varten fotomonistimesta 53 (tai vaihtoehtoisesti täyttä transmissiota varten ilmaisimesta 58). Tämän jälkeen analyytti1iuos (muutama yrl) oipetoidaan tilaan 41a, jolloin liuoksessa oleva analyytti alkaa reagoida valojohdol.la 41 olevan reaqenssikai von kanssa. Kun analvytin ja reagenssin tuote muodostaa sirontakohtia (suuria molekyylejä, agqlome-raatteja, jne), saavuttaa sirontasiqnaali fotomonistinoutken 53, joka signaali vahvistetaan, käsitellään ja näytetään ajan funktiona yksikössä 62 olevan näyttölaitteen avulla. Tämän tuloksena saadaan nopeuskäyrä. Kaltevuustiedot tallennetaan ja verrataan standa r d itie toihin, jotka saadaan kaiihrointinävt-teistä, ja jotka on varastoitu elektronisen vksikön 62 muistiin. Tämä laskenta antaa halutut analyyttiset tulokset, esim. analyytti1iuoksessa olevan tuntemattoman elementin konsentraa-tion (tavanomaisin keinoin). Ellei ilmaisimen 58 lähtöä käyte- 34 76432 tä, voidaan valojohdon 41 reuna 41b peittää taustasirontavalon muodostumisen vähentämiseksi. Peittäminen voidaan tehdä esim. mustalla paoerilla tai maalilla.

Kuvio 14 havainnollistaa edellä selitetyn suoritusmuodon erästä oarannusta. Sen sijaan, että käytetään valojohdossa 41 täysin homogeenista tvöointaa, voidaan tätä pintaa ensin käsitellä epäjatkuvuuksien muodostamiseksi siihen. Niinpä voidaan muuntaa pinnan ominaista tartuntakykyä reagenssiin nähden jonkin määrätyn kuvion mukaan (joka voidaan saada esim. soveltamalla tunnettuja fotolitograafisiä menetelmiä). Kuvion 14 näyttämässä tapauksessa on valojohdon 41 ointa 41c hiukan karhennettu merkityillä alueilla 41d, jotka alueet ovat yhdensuuntaisia juovia, joiden leveys on noin yksi aallonpituus ja joiden välillä on samaa suuruusluokkaa oleva etäisyys. Tällainen hilamainen rakenne voidaan saada ensin peittämällä pinta valoherkällä vastuksella, valottamalla tämä vastuskerros valo-kuvausfilmin läoi, jossa on hilan negatiivinen kuva, kehittämällä (siis toisin sanoen liuottamalla valottamattomat alueet sopivalla liuottimena) ja syövyttämällä kevyesti kehittämisen jälkeen paljaat alueet esim. HF:lla. Sen jälkeen, kun vastus on lopuksi poistettu, on levyssä juovien muodostama hilakuvio, jossa on vaihtelevat vyöhykkeet, joilla on suurempi ja pienempi affiniteetti proteiineille (antigeeneille tai vasta-aineille). Kun levy täten saatetaan kosketukseen reagenssin (AB) kanssa, tulee tämä pääasiallisesti kiinnittymään syövytettyi-hin alueisiin, kuten kuviossa 14 on osoitettu kirjaimilla AB. Tässä vaiheessa kuvion paksuus ei ole riittävän suuri sironnan aiheuttamiseksi, mutta antigeenin ollessa läsnä (joka antigeeni on soDivaa luonnetta valon sirottamiseksi) tulee antigeeni sitoutumaan juoviin, joissa on antigeeniä, kuten AG osoittaa piirustuksessa. Tämä epäjatkuva kerrostyyppi tulee antamaan tulokseksi taittuneen sirontavalon selviä suuruusluokkia, oääsuor i tusmuodon ha j as i rontatyvoin vastakohtana, mikä täten parantaa sirontasignaalin suunnattavuutta ja kokoamishyötysuh-detta ( f otomoni st i nputken vaikutuksesta). Kuviossa 14 nuolet 65 osoittavat diffraktion nolla-luokkaa, ja nuolet 66 osoitta-

II

76432 35 vat sen ensimmäistä suuruusluokkaa. Ottamalla talteen määrätty suuruusluokka (esim. ensimmäinen) tulee signaalin kerääntyminen vai omonistusputken 54 vaikutuksesta suuresti vahvistetuksi, ja signaali-kohina-suhde suurenee tässä suoritusmuodossa, verrattuna tapaukseen, jossa kootaan hajasirontavalo, joka on ainoastaan noin 10 % koko sirontavalosta.

Eräässä toisessa kuvion 15 nävttämässä muunnoksessa suihkutettiin valojohdon täysin laakaan ja säännölliseen pintaan 41c vasta-airuen (Ah) mikropisaroita, ja analyysin aikana antigeeni AG liittyv ainoastaan tällaisiin edullisiin alueisiin. Tällainen rakenne muodostaa tilastollisen sirontalaitteen, joka sirottaa valon kartiona, jonka koko ja geometriset oata-metrit riippuvat pisaroiden koosta ja jakautumasta. Niinpä tässäkin tapauksessa on olemassa suuntava ikutus, joka myötävaikuttaa signaalin kokoamishvötysuhteen suurenemiseen, ^oinen etu, joka saavutetaan käyttämällä taipunutta valosignaaiia on, että voidaan vähentää vahingossa esiintyvien sirontalähteiden, kuten pölyhiukkasten tai lasissa olevien suurempikokoisten naarmujen (jotka ovat lähinnä seuraavaa suuruusluokkaa eli noin 10 Λ tai enemmän) merkitystä. Tässä tapauksessa diffrak-tiokulma on pienempi ja koska resultoiva taipunut valo ei saavuta fotomonistinputkea, voidaan sen läsnäolo jättää huomioonottamatta.

Kuvion 16 näyttämä laite on yleisesti samanlainen kuin kuvion 13 perusteella jo selitetty laite, mutta on sovitettu fluore-senssimittauksiin sirontavalomittausten asemesta. Tässä laitteessa on pääasiallisesti lohkon 70 edustama optinen järjestelmä, joka on käytännöllisesti katsoen samanlainen kuin kuvion 13 mukaisessa laitteessa käytetty järjestelmä. Yksinkertaisuuden vuoksi yksityiskohtia ei tästä syystä toisteta. Tässä järjestelmässä 70 on pulssimainen valonlähde ja välineet testi s ignaalin muodostamiseksi, jolla on oikea herätysaal1on-pituus, asianomaisesti suunnattuna valojohtoon 71 ja vertailu-signaalin suuntaamiseksi vertai 1 ui.Imaisimeen 80. Kuten toisessakin suoritusmuodossa on nytkin olemassa levy 72, joka aalto- 76432 36 putken 71 kanssa muodostaa kapean tilan 71a analyyttiliuoksen sijoittamiseksi. Reaqenssikerros on pinnoitettu valojohdon 71 yläpintaan. Laitteessa on myös sivuilmaisin (fotomonistinputki 73 ja sen syöttö 74), sydämen lähdön ilmaisin 78 ja sulkusuo-dattimet 76 ja 77 (nämä komponentit puuttuvat edellisestä suoritusmuodosta). Laitteen elektronisina komponentteina on kaksi inteqraattorivahvistintä 81 ja 82, multiplekseri 83, analoqia-diqitaal imuuttaja 84, mikroprosessori 85 ja näyttö-tallennin 86. Kaikki nämä elementit ovat tavanomaisia ja ammattimiehet tuntevat niiden toiminnat.

Laitteen toiminta sivultaottotavalla on täysin samanlainen kuin on selitetty sirontasuoritusmuodon yhteydessä. Sen jälkeen, kun valojohto 71 on saatettu käyttökuntoon siten, että sen yläpinnassa on reaqenssikerros, ja levy 72 on paikallaan, lisätään analyvtti1iuos fluoresenssireagenssin ja analyytin tuotteen muodostamiseksi. Optinen yksikkö 70 lähettää testi-siqnaalin, jolla on asianomainen aallonpituus fluoresens sin herättämiseksi aallonpituudella ^2· Lähetetty fluoresens-sivalo menee seulan 76 läpi (joka seuloo pois kaikki muut aallonpituudet, mukaanluettuna sirontaherätevalon) ja kohtaa fotomonistinputken 73, jolloin kehittyy signaali, joka on verrannollinen fluoresenssiin (ja reaktion laajuuteen). Tämä signaali syötetään yhdessä ilmaisimesta 80 tulevan vertailu-signaalin kanssa multipleksivahvistimeen 83, joka vuorotellen syöttää ne elektronisten elementtien jäljellä olevaan osaan, jolloin tulee tapahtumaan samanlainen käsittely kuin edellä on selitetty.

Samanaikaisesti tai vaihtoehtoiseti edellä mainitun toiminnan kanssa voidaan myös valvoa signaalia, joka esiintyy sydämen lähdössä ja lankeaa ilmaisimeen 78. Jotta ymmärrettäisiin, miten tämä on mahdollista, viitataan kuvioon 17. Tässä kuviossa on näytetty valojohdon 71 eräs osa, levy 72, välillä oleva tila 71.a ja kaaviollisesti kerros AR. AC!-tuotet ta (tuotetta, joka on reagenssin AR ja analyytin AC! reaktion tulos, jonka reaktion nopeus mitataan kokeessa) . Kuviossa on myös 76432 37 näytetty eri valonsäteet, jotka liittyvät heräte-fluoresenssi-orosessiin, jolloin toisin sanoen N on tulosäde aallonpituulella R on heijastunut säie, jonka aallonpituus on λ-j , ja Rf ovat kehittyneet taaksepäin ja eteenpäin fluoroivat säteet ( A 2>· Θ i on tulokulma ja 6{c on aallonpituuden λ -[ kriittinen kulma. Θfc on aallonpituuden A 2 kriittinen kulma. Kuten on kuvattu kohtaa herätevalo N seinämän sisäpinnan kulmassa joka on suurempi kuin kriittinen kulma öic, ja tulee täten heijastumaan (R). Osa nopeasti vaimenevasta herä-teaallosta absorboituu kuitenkin nyt AR.AG-kerrokseen, ja energiaa lähetetään uudelleen lyhyemmällä aallonpituudella Ao· Vastavuoroisuusperiaatteen ansiosta (jonka on kvantitatiivisesti vahvistaneet C.K. Gorniqlia ja kumoo., J.O.R.A. 62, (4), 1972, 479-496), herätetyt molekyylit lähettävät nopeasti vaimenevia fotoneja, jotka käyttäytyvät tarkasti samalla tavalla kuin nopeasti vaimenevan tuloaallon fotonit. Näin ollen molekyylien lähettämä fluoresenssi lähellä tiiviin ja vähemmän tiiviin aineen väliointaa (AB-AG-kerros) etenee tiiviissä väliaineessa kulmalla, joka on suurempi kuin kriittinen kulma 3tc aallonpituudella λ 2· Huippufluoresenssi havaitaan itse asiassa, kun Qy on lähellä Θja kulmat ovat lähellä 0fc (ks. R.E. Rrenner et ai, Fiber Optics, Advances in R & D, Providence, RI, USA; 19-23 June 1978, NY Plenum Press (1979)). Lähetetyn fluoresenssin maksimivoimakkuus keskittyy täten suhteellisen pienelle kulma-alueelle ja valoiohdon johtamana useissa keskinäisen vaikutuksen kohdissa olevat lähdöt summautuvat siten, että sydämen lähdössä saadaan voimakkaampi signaali. Toinen tärkeä seikka on, että koska taitekertoimet ovat erilaiset eri aal1onmtuuksilla, seuraavat herätyssignaali ja fluoroiva signaali ratoja, joilla on eri heijastumiskulmat valojohdossa ja ne lähtevät myös lähtöoäästä toisistaan eroavissa kulmissa. Täten on olemassa lähetetyn säteen ominainen optinen erottuminen heratyssäteestä sydämen lähdössä, ja ilmaisin 78 voidaan sopivasti sijoittaa fluoresenssisignaalin ( ^2) radalle, ja samalla voidaan välttää jäljellä oleva herä-tvssäde ( Λ]) siinäkin tarhauksessa, että suodatin 77 puuttuu.

3S 76432

Kuvioiden 18a ja 18b näyttämä laite on tarkoitettu niiden optisten muutosten mittaamiseksi, joita esiintyy optisen kuidun muodostamassa valojohdossa, kun tämän kuidun pintaan muodostuu tuote, ja tämä mittaus suoritetaan eliipsometriän avulla. Eliipsometri sen mittauksen sovellutukset biokokeisiin on yksityiskohtaisesti selitetty hakijan tähän hakemukseen liittyvässä EP-patenttihakemusjulkaisussa 81 810 285.0, ia lukija viitataan tähän selitykseen tämän alan yleisten näkökohtien selvittämiseksi. Tämän hakemuksen pääero aikaisempaan selitykseen nähden on optisen kuidun käyttäminen yleisesti tunnettujen laakeiden heijastavien pintojen asemesta. Elliosometria perustuu siihen, että mitataan valon elliptisen polar oitumis-asteen muutokset, jotka aiheutuvat siitä, että heijastaviin pintoihin on laskettu materiaalikalvo. Ootisten kuitujen erikoisluonteen ja muodon huomioonottaen verrattuna laakaointai-seen aaltooutkeen, on eräät 1isätunnusmerkit otettava huomioon. Ensinnäkin on valonsäteen pysyttämiseksi suoraviivaisesti polar oi tuneena kuidussa käytettävä valomuotojen erikoisluok-kaa. Nämä muodot määritellään HE],η-muotoina, joissa m = 1, 2, 3...n (n:n rajana on kysymykseen tulevan kuidun koko ja taitekerroin, ks. julkaisua E. Snitzer and H. Osterberq J. Opt. Soc. Am _5_1, 49P (1061)). Toiseksi on mainittava, että kuidun

Dinnassa tapahtuvan reaktion aiheuttaman polaroitumisen muutoksen mittaamiseksi täydessä laajuudessa on tärkeää, että signaalit missä tahansa nolarointisuunnassa välittyvät yhtä hyvin Ditkin valojohtoa. Tästä syystä on vältettävä geometrista häiriintymistä, joka aiheutuu kuituun vaikuttavasta mekaanisesta rasituksesta, koska tällaisessa taoauksessa jokin määrätty poiaroitumissuunta tulisi olemaan etusijalla. Näin ollen tässä laitteessa optinen sondi (jonka avainkomponenttina on ootinen kuitu), on tehty lyhyeksi ja tarkasti liikkumattomaksi värähtelyn tai muiden mahdollisten häiriöiden haitallisen vaikutuksen vähentämiseksi.

Jotta ensisijassa herätettäisiin HE^m-muodot optisessa kuidussa, on valon säteittäisvoimakkuudella oltava Gaussin jakautuma, toisin sanoen että laserista saatu valo säteilee perusti 3q 76432 muodon mukaan, ja säde on suunnattu aksiaalisesti ja keski-sesti kuidun päähän. Tämä kytkentä voidaan aikaansaada mikroskooppi, obj ekt in avulla. Taustahäir iöiden vähentämiseksi toimitaan edullisesti ainoastaan yhdellä muodolla eikä useilla muodoilla samanaikaisesti. Tässä laitteessa valittiin yksinkertaisuuden vuoksi HE^-muoto (alin yks i ttä i smuoto) . Periaatteessa voidaan monimuotokuituia kävttää vksimuotosignaalei1la. Tämä voidaan tehdä mahdolliseksi (toisin sanoen voidaan valita asianomainen Gaussin iakautuma) antamalla tulosäteen halkaisijan kuidun tulooinnassa olla 0,65 kertaa kuidun sydämen halkaisija. ^ämä ei kuitenkaan itse asiassa ole tyydyttävää, koska muitakin muotoja, joilla on erilaiset polaroitumistilat, myös tulee herätetyiksi jossain määrin ja saadaan sondin lähdössä osittain deoolaroitunut signaali. Näin ollen on varsin edullista käyttää tässä suoritusmuodossa yksimuotokuitua, koska tämä tulee pääasiallisesti välittämään ainoastaan HE^-muotoa, jolloin ei taoahdu muuttumista korkeamman luokan muotoihin eikä näin ollen polaroitumisasteen huononemista. Seurauksena saadaan suurempi signaali-kohinasuhde, verrattuna monimuotokuituäen käyttöön.

Tässä suoritusmuodossa on kuidun pituus edellä mainituista syistä edullisesti 10 cm tai tätä pienempi. Kuituna käytetään edullisesti korkealaatuista yksimuotokuitua deoolaroitumis- ja kahtaislaitteisuusominaisuuksien takia. Edullisesti käytetään kuituja, joita saadaan soveltamalla CVD-menetelmiä, kuten on selitetty julkaisussa H. Aulich et ai, Applied Optics _19, 22, 3735 (1980).

Kuvioiden 18a ja 18b näyttämässä laitteessa on optinen sondi, jossa on osittain syövytetty kappale optista kuitua 101, jossa on sydän 101a ja symmetrisesti poistettu oäällvs 101b. Menetelmä päällyksen poistamiseksi on sama kuin tässä hakemuksessa on selitetty optisen kuidun muille sovellutuksille. Hyvin lyhyen välin (millimetrin murto-osan) päähän kuidun paljaasta sydämestä tämän molemmin puolin on sijoitettu kaksi lasilevyä 102, jotka on jäykästi pysytetty U-muotoisissa pitimissä 103.

40 76432

Valojohdon kuidun Dna 1 Ivstetyt pääteosat on kiinnitetty ei-näytettvjen kiinnittimien avulla, jotka on asennettu ei-näy-tettvvn säädettävään telineeseen, jonka avulla kuidun asento voidaan tarkasti säätää sivusuunnassa ja ylös- ja alasoäin. Kuidun sydämen ja levyjen 102 välinen tila 104 on reaktiokoh-ta, jolloin kokeiltavat nesteet ovsvvät kani 11aarivoimien vaikutuksesta kuidun ja levyjen välissä.

Tässä laitteessa on lisäksi kaksi mikroskoooDiobjektiivia 105 ja 106 tulosäteen kytkemiseksi kuituun ja lähdön elliptisesti polaroituneen signaalin kytkemiseksi iImaisujärjestelmään. Tulosäteen kehittää valonlähde 107 (tässä suoritusmuodossa He-Ne-laser) , jonka lähtövalo menee polaroivan levyn 108 ja moottorin 110 nyörittämän katkoinkiekon 109 läpi, jossa kiekossa on aukko 111 signaalin katkomiseksi. Laitteen ilmaisu-järjestelmänä on neljännesaaltolevy 112, polaroitumisen ana-lyysilaite 113 ja fotoilmaisin 114. Nämä elementit ovat samanlaiset kuin ne vastaavat elementit, jotka on selitetty tähän hakemukseen liittyvässä EP-hakemusjulkaisussa 81 810 255.0, ja ne toimivat samalla tavoin. Lopuksi laitteessa on vaiheeltaan lukittava vahvistin 115 ja siihen liittyvät komponentit, kuten mikrotietokone 116 ja tallennin 117. Näiden elektronisten komponenttien toiminnat ovat pääasiallisesti samat kuin tässä selityksessä aikaisemmin jo selitettyjen vastaavien elementtien toiminnat. On edelleen huomattava, että vertailutarkoituk-seen käytetty katkottu vertai1 usignaali on piirustuksessa kuvattu katkoinmoottorista 110 lähtevänä ja vahvistimeen 115 johtoa 119 myöten välittyvänä.

Laitteen toiminta on pääasiallisesti hyvin samanlainen kuin edellisissä suoritusmuodoissa on selitetty, yhdistettynä tähän hakemukseen liittyvässä EP-hakemusjulkaisussa 81 810 255,0 selitettyyn laitteeseen. Niinpä kokeen suorittamiseksi kuidun paljas osa ensin pinnoitetaan reagenssilla (esim. vasta-aineella) , kuten piirustuksen numerolla 120 on näytetty, jolloin tila täytetään asianomaisella liuoksella, kuten piirustuksessa on näytetty katkokuvioin. Tavanomaisten huuhtelu- ja kuivaus-

II

41 76432 vaiheiden jälkeen nollataan koje tyhjän puskurin ollessa läsnä asianmukaisesti vuorotellen kiertämällä oolaroivia elementtejä 112 ja 113 (ks. EP-hakemusjulkaisun 81 810 255.0 selitystä), minkä jälkeen tvhjä liuos poistetaan, ja kokeiltava liuos sijoitetaan paikalleen antigeenianalvvtin ja vasta-aineoin-noitteen välisen reaktion käynnistämiseksi, mikä johtaa rea-genssin ja analyvtin muodostaman kerroksen kasvuun valojohdon sydämellä ja näin ollen elliotisesti polaroituneen lähdön muuttumiseen. Valoilmaisimesta 114 saatu vastaava muutos vahvistetaan ja valvotaan siihen liittyvissä elektronisissa komponenteissa 116 ja 117, jolloin saadaan halutut tiedot täsmällisesti samalla tavoin kuin aikaisemmista suoritusmuodoista.

Vasta-ainetta olevan kalvon kiinnittämiseksi valojohdon sydämeen (tai tietenkin antigeenin kiinnittämiseksi, jossa vasta-aine on määritettävä) voidaan käyttää useita tämän alan tekniikassa tunnettuja menetelmiä, kuten edellä jo mainittiin. Keksintöä sovellettaessa immunokoetestauksen yhteydessä on yleensä edullista käyttää eduksi sitä seikkaa, että useimmat lasityypit adsorboivat voimakkaasti proteiineja niiden hydrofobisten tai hvdrofiilisten alueiden välityksellä. Tällaisessa tapauksessa syövytetty kuitu ensin puhdistetaan pesuaineen vesiliuoksessa (esim. pesuaineen 2-prosenttisessa vesiluokses-sa) . Tämän jälkeen kuitu huuhdotaan juoksevassa vedessä ja upotetaan yli yön konsentroituun rikkihappoon. Tämän jälkeen se huuhdotaan tislatulla vedellä ja kuivataan lämpimässä ilmassa. Tällöin se helposti sitoo proteiineja liuoksista, esim. puskureissa olevaa ihmisen IgG:a.

Erään toisen edullisena pidetyn mentelmän mukaan valojohto, sen jälkeen kun se on puhdistettu rikkihapolla ja huuhdottu edellä selitetyllä tavalla, upotetaan TiCl^n 15-prosenttiseen (paino/tilavuus) liuokseen vedettömässä orgaanisessa liuotti-messa, kuten asetonissa tai etanolissa. Tämän jälkeen se pestään tislatulla vedellä ja 0,1 M fosfaattipuskurilla (pH = 7) ja saatetaan sitten kosketukseen ihmisen IgG-1iuoksen kanssa (2 g/1 0,9-prosenttisessa NaCl-1iuoksessa tai 0,1 M fosfaatti- 42 76432 puskurissa, pH = 7). Kuitu (tai pikemminkin sondi), joka täten on tehty valmiiksi Aqm testausta varten, varastoidaan märkänä sopivassa puskurissa (tai myös kuivana lyhyehköjä ajanjaksoja) .

Reuraavat esimerkit havainnollistavat keksinnön käytännöllisiä näkökohtia.

Esimerkki 1

Optinen sondi, jossa on kuvioiden 13a ja 13b perusteella selitettyä tyyppiä oleva valojohto ja lasia oleva vastalevy, saatettiin kuntoon immunokemiallisten kokeiden suorittamiseksi seuraavalla tavalla: Lasielementit, jotka oli tehty seuraavas-ta lasityyoistä (n = 1,523): "Farbloses Rrillenrohglass B-260, DESAG", pestiin ensin lämpimällä pesuaineluoksella, huuhdottiin tislatussa vedessä ja kuivattiin ilmassa. Tämän jälkeen ne upotettiin 5 minuutin ajaksi konsentroituun rikkihappoon 95 °C:ssa, huuhdottiin tislatulla vedellä ja kuivattiin puhtaalla kankaalla. Seuraavat käsittelyt suoritettiin noudattamalla mitä suurinta huolellisuutta, puhtaisiin lasipintoihin ei koskettu, ja sondia käsiteltiin sen reunoista. Levyt sovitettiin kuvioiden 13a ja 13b näyttämään laitteeseen siten, että niiden väliin jäi 0,3 mm tila. Pinnoittamista varten valmistettiin aproksimatiivisesti (mutta tarkasti punnittu) 1 g/1 antiqeeniliuos liuottamalla tarvittava määrä kiinteää ihmisen immunoglobuliinia (Serva Riocehmicals, Heidelberg, Länsi-Saksa) 0,9-prosenttiseen NaCl-1luokseen. Noin 0,2 ml tätä liuosta pantiin sondin lasielementtien 41 ja 42 väliin ruiskun avulla ja annettiin olla oaikallaan 2 tuntia huoneenlämmössä. Tämän ajan kuluessa aoroksimatiivisesti 1...10 % näyteessä olevasta AG:sta liittyi valojohdon pintaan (noin 2...20 yg). Tämän jälkeen kenno tyhjennettiin absorboimalla neste absorboivalla materiaalilla, ja kenno huuhdottiin tislatulla vedellä, ja huuhteluvedet poistettiin kuten aikaisemminkin. Tämän jälkeen kennoon pantiin 0,1 M fosfaattipuskuria (pH = 7), josa oli 2 g/1 naudan seerumivalkuaista ja 0,5 ml/1 nestemäistä oesuai-

II

76432 43 netta (Tween 20) , ja annettiin puskurin olla kennossa tunnin ajan. Seerumivalkuaineen tulisi täyttää lasiin jääneet tyhjät "aukot" antigeenillä suoritetun pinnoittamisen jälkeen (koska antiqeeni ei normaalisti liity lasin kaikkiin käytettävissä oleviin alueisiin, ia koska kokeiltavalla vasta-aineella myös on affiniteettia paljaaseen lasiin, voisi pinnoittamattornien alueiden, valojohdossa olevien "aukkojen" läsnäolo myöhemmin aiheuttaa mittausvirheitä). Koska vasta-aineella ei ole affiniteettia naudan seerumivalkuaineeseen tämä käsittelv tulisi yksinkertaisesti tekemään lasin käyttämättömät paljaat osat toimettomiksi. Pesuaine itse asiassa täydentää tätä vaikutusta.

Sen jälkeen, kun jälleen oli pesty ja huuhdottu, annettiin kennon kuivua puhtaassa lämpimässä ilmavirrassa. Tämän iälkeen se oli valmis kokeita varten. Kaikki analyysit tehtiin huoneenlämmössä. Fri optiset ja elektroniset komponentit, foto-moni st inputkea lukuunottamatta, käynnistettiin ja niiden annettiin tasapainottua, ja vasta-aineliuoksen näyte (2 ml) pantiin kennoon samalla laitteella. Valittu vasta-aine oli kaniinista saatua ihmisen immunoglobuliinin vasta-ainetta, valmistaja Oako Immunochemicals, Kööpenhamina, Tanska, 0,9-prosentt i sessa NaCl-1iuoksessa. Saatu alkuperäinen liuos oli 10 g/1 proteiiniliuos, jonka tiitteri oli 900/ml, toisin sanoen tämä luku (jonka valmistaja antaa) tarkoittaa, että vasta-aineliuoksen jokainen ml todellisuudessa neutraloi 900 yrg antigeeniä (neutralointi tarkoittaa tässä, että kun tällaiset toisiaan vastaavat määrät molempia komponentteja ovat reagoineet, ei liuoksessa enää ole mitään sanottavaa määrää AG:a tai AR:a). Kaiibrointitarkoituksia varten käytettiin näin ollen sopivasti laimennettuja tunnettuja vasta-aineliuoksia kokeen suorittamiseksi (ks. taulukkoa I). Heti, kun kenno oli täytetty kaiibrointi1iuoksella (n = aoproksimatiivisesti 1,3), huone pimennettiin valomonistinputken kyllästymisen välttämiseksi, ja putki kytkettiin käyttöön. Fotomonistimen vastaanottamasta sirontavalosignaalista kehittyvä nopeuskäyrä alkoi kehittyä muutamien sekuntien tasapainottumisen jälkeen (mikä 44 76432 todennäköisesti johtui ajasta, joka kului pinnoitteen proteiinien asianmukaiseksi kostuttamiseksi). Reaktion annettiin jatkua noin 2...5 minuuttia, ja melkein suoraviivaisen nopeus-käyrän keskimääräinen kaltevuus laskettiin tältä ajalta.

Tulokset on vhtenvetona esitetty seuraavassa taulukossa I, josta saadaan antiseeruminäytteiden laimentumisarvot ja vastaavat lasketut tiitteriarvot samoin kuin vastaavien nopeus-käyrien kaltevuudet, jotka mitattiin käytetvllä laitteella.

Taulukko I

Antiseerumin lai- Antiseerumin Nopeuskäyrän mennus (1 ml + ml vasta-aineen kaltevuus 0,9 NaCl) tiitteri (mV/min) 1+20 42,9 22,0 1 + 100 8,9 12,6 1 + 200 4,5 6,1 1 + 1000 0,89 0,8

Tuntemattoman näytteen analysoimiseksi sovellettiin samaa menetelmää, nopeustiedot tallennettiin ja niitä verrattiin jälkeenoäin taulukon I standard itietoihin. Halutut analyyttiset tiedot saatiin piirtämällä saadut analyyttiset nopeusarvot vastaavan tiitterin funktiona, joka saatiin taulukon I tiedoista.

Esimerkki 2

Esimerkissä 1 selitetyn kokeen käänteisesimerkki suoritettiin samalla laitteella ja samoissa olosuhteissa. Tässä tapauksessa optisen sondin valojohto pinnoitettiin vasta-ainekalvolla (kaniinista saadulla ihmisen immunoglobuliinin vasta-aineella) käyttämällä 0,2 ml alkuperäistä liuosta, jonka tiitteri ol.i 900/ml (ks. esimerkkiä 1). Kaikki muut käsittelyt olivat samat kuin esimerkissä 1 on selitetty. Kaiibrointinäytteet valmis- il 45 764 32 tettiin antigeeni1iuoksen tunnetuista laimennuksista, jotka on esitetty taulukossa II, jossa myös yhteenvetona on esitetty tallennettujen nopeuskäyrien kaltevuudet.

Taulukko II

Antigeeni!iuokset Nooeuskävrän kaltevuus (ml/1) (mV/min) 0,42 4,8 1,63 11,3 5,32 10,0 10,16 21,7

Tuntemattomien AG-nävtte iden analvsoimiseksi sovellettiin esimerkissä 1 selitettyä menetelmää, toisin sanoen mitattiin kokeiltavan vastaavan nopeuskäyrän kaltevuus ja verrattiin saatua arvoa vastaavaan antigeenin konsentraatioon vertailemalla käyrään, joka laadittiin taulukossa II yhteenvetona esitetyistä arvoista.

Esimerkki 3 Tässä esimerkissä käytettiin nopeuskäyrän kehittämiseksi signaalia, joka saatiin valosta, joka lähti valoiohdon takaoäästä ja lankesi ilmaisimeen 58. Outinen sondi oli pääasiallisesti sama kuin esimerkissä 2 käytetty (AB-pinnoite, kaniinista saatu ihmisen immunoglobuliinin vasta-aine). Antigeeniliu-osten näytteitä (kuten esimerkissä 2) käytettiin konsentraati-oina, jotka on esitetty seuraavassa taulukossa III. Muut käsittelyt suoritettiin tarkasti kuten esimerkeissä 1 ja 2 on selitetty, sillä erolla, että ei käytetty fotomonistintä 53, ja että signaali itse asiassa pieneni reaktion jatkuessa (koska sen valon osuus, joka ei saavuta valojohdon lähtöoäätä, suurenee reaktion edistyessä). Taulukossa III on esitetty nopeuskäyrien kaltevuus, joka on merkitty näytteissä läsnä olevan AG-määrän funktiona.

Taulukko III

46 76432

Antigeeniliuos Nopeuskäyrän kaltevuus (ml/1) (mV/min) 1.0 -0.42 0.32 -0.35 0.10 -0.31 0.03 ei heloosti mitattavissa

Esimerkki 4

Eeuraava esimerkki havainnollistaa vertailuna koemenetelmää, joka on kuvion 5 yhteydessä selitettyä tyvopiä. Tätä varten käytettiin kuvion 16 mukaista tyyooiä olevaa fluoresenssin mittauslaitetta. Ootinen sondi saatettiin käyttökuntoon pinnoittamalla vastaava valojohto 71 kalvolla ihmisen immunoglo-buliinia (AG) soveltamalla esimerkissä 1 selitettyä menetelmää. Käytetty vasta-aine AR* merkittiin fluoreseiini-iso-tiosyanaatill a (EI^G) , -joka on spesifinen kokeiltavaan antigeeniin nähden (saatiin toiminimeltä Dako Immunoglobulins, Kööpenhamina). Vastaava merkitsemätön vasta-aine AR saatiin myös samalta toimittajalta. Reuraavassa kokeessa valojohdon lähtöpinta 71b peitettiin mustalla maalilla tulevan sironta-valon vähentämiseksi.

Jokaisessa kokeessa lisättiin kiinteä määrä merkki-vasta-ai-netta AB*. Tämä määrä oli 100 1 Dako-tuotetta, joka laimen nettiin suhteessa 1:200 käyttämällä 0,1 M fosfaattipuskuria, pH = 7, ja sekoitettiin 100 Iraan merkitsemättömän AB: n koe-liuosta taulukon IV esittäminä laimennuksina. Käsittely suoritettiin kuten edellisissä esimerkeissä, ja sekoitetut 100 l:n erät ruiskutettiin levyjen 71 ja 72 väliin. Tulokset on ilmaistu vastaavien nopeuskäyrien kaltevuuksina taulukossa IV.

Il

Taulukko IV

47 7 6 4 3 2

Vasta-aineen Vasta-aineen Nopeuskäyrän laimennus tiitteri kaltevuus (1 ml + ml puskuria) (mV/min) 1+20 42.9 11.6 1 + 100 8.9 57.7 1 + 200 4.5 90.3 1 + 1000 0.89 95.5

Vasta-aineen tuntemattomien liuosten mittaamiseksi käytettiin samaa menetelmää (lisättiin 100 1 merkittyä vasta-ainetta) ja tulokset saatiin vertaamalla edellä oleviin standardi-tietoihin.

Esimerkki 6

Edellinen esimerkki toistettiin, mutta tällä kertaa valvottiin valojohdon takaoäässä olevan ilmaisimen 78 lähtöä. Käyttämällä samoja test i konsentraatioita kuin taulukossa IV on esitetty, saatiin vastaavat nopeustulokset (suurenevassa järjestyksessä): 2,9, 4,8, 6,1 ja 6,6 (mV/min).

Esimerkki 6 8ondikenno saatettiin käyttökuntoon ottamalla kaopale muovilla oäällystettvä oiidioksidikuitua toiminimeltä "Quartz & Silice SA”, type PC9 Fibrosil WSF-UV series (halkaisija 380 m, sydän 200 m, häviöt 0,14 db/m aallonpituudella 350 nm, transmissio 97 %) ja työntämällä tämä kaopale päistään kuvioiden 10a ja 10b näyttämän PVC-kennon uriin. Liimaukseen käytettiin siliko-nikumiliimaa asetonissa. Päällys syövytettiin oois täyttämällä kenno konsentroidulla rikkihapolla ja antamalla hapon olla kennossa tunnin ajan (Däällystämättömän osan pituus noin 10 cm), minkä jälkeen kuitu tehtiin aktiiviseksi soveltamalla ensimmäistä edullisena pidettyä menetelmää, joka on selitetty viimeisissä kaopal.eissa ennen esimerkkejä.

48 76432

Kalvo ihmisen immunoglohuliinia G (IgG), joka oli ostettu toiminimeltä "Herva Riochemicals, Heidelberg, Länsi-8aksa, laskettiin sitten kuidulle seuraavalla tavalla: Kennossa oleva fosfaattipuskuri poistettiin ja korvattiin IgG:n (10 ml) 2 g/1 liuoksella 0,9-orosenttisessa NaCl-iiuoksessa. Vasta-aineliuos poistettiin 2 tunnin kuluttua, ja kuitu huuhdottiin puskuriliuoksella, minkä jälkeen kennoon pantiin naudan seerumivalku-aisen 2 g/1 liuosta, jossa oli 0,5 ml tuotetta "Tween 20" (pesuainetta) 0,1 M fosfaattipuskurissa, ja annettiin liuoksen olla kennossa tunnin ajan. Tämän jälkeen kenno jälleen huudot-tiin puskurilla ja tävtettiin tuoreella puskurilla (10 ml). Kenno asennettiin kuvion 9 mukaisen laitteen optiseen rataan, suodatin 5 valittiin aallonpituudelle = 280 nm (proteiinin absorptio) ja suodatin 6 läoäisi aallonpituuden /j 2 = 340 nm (ei mitään proteiinin absorptiota), minkä jälkeen säädöt tehtiin säteen keskiöimiseksi elektronisten yksiköiden asianomaisen toiminnan aikaansaamiseksi, ja järjestelmä saatettiin tasapainotilaan siten, että kohina oli mahdollisimman pieni. Tämän jälkeen lisättiin 50 jjl antiseerumin eri laimennuksia (kaniineissa kehitetty anti-IgG, ostettu toiminimeltä Dako Immunochemicals, Kööpenhamina) ja sekoitettiin perusteellisesti kuplimalla ilmaa kennon läoi. Tämän jälkeen tallennin käynnistettiin ajankohtana nolla, ja valvottiin absorption vaihteluja aallonpituudella = 280 nm noin 10 min. Tämän absorptiosignaalin muuttumisen keskinopeus piirrettiin, ja kaltevuus merkittiin mielivaltaisina yksikköinä. Tulokset on taulukossa V esitettv AG-konsentraation funktiona.

Taulukko V

AG:n (anti-TgG:n) konsentraatio Nopeuskäyrän kaltevuus (Mg/ml) (mv/min) 4.5 2.23 2.3 1.02 1.5 0.78 0.76 ei helposti mitattavissa

II

Esimerkki 7 76432 49

Menetelmä oli pääasiallisesti sama kuin edellisessä esimerkissä selitetty, mutta kaniinin IgG korvattiin vastaavalla merkityllä anti-seerumi 11a. Merkkivhdisteenä oli fluoreseiini-iso-tiosyanaatti ( "I somer-1" (FITC) . Tämä merkitty antiseerumi saatiin toiminimeltä "Dako". Tämä materiaali absorboi voimakkaasti aallonpituudella 492 nm (tässä aallonpituus on myös se aallonpituus, joka herättää fluoreseiinin). Kokeessa suodatin 5 valittiin aallonpituudelle = 492 nm, ja suodatin 6 aal lonpituudelle /\ 2 ~ 600 nm, jolla mitään absortiota ei tapahdu. Kokeet suoritettiin kuten edellä jo on selitetty käyttämällä FITC-merkitvn TgG:n eri konsentraatioita, ja käyttämällä toisessa mittaussarjassa aktiivisen kuidun kappaleita, joiden pituus oli vain 5 cm. Tulokset on esitetty taulukossa vi.

Taulukko VI

Merkityn IgG:n konsentraatio Nopeuskäyrän kaltevuus koeastiassa ( g/ml) (mV/min) kuidun pituuksille 5 ja 10 cm 5 10 0.827 10.2 22.6 0.568 6.8 14.3 0.350 4.1 8.9 0.178 2.1 4.3 0.090 0.98 2.1 0.045 0.43 0.94

Esimerkki 8

Edellisessä esimerkissä nähtiin, että voidaan käyttää merkitsemistä f luoresei inijohdannaisei la proteiinin absorptio-spektrin modifioimiseksi ja näin ollen keksinnön mukaisen kokeen herkkyyden suurentamiseksi verrattuna merkitsemättömään elementtiin. Tätä järjestelmää voidaan tietenkin myös käyttää ihmisen merkitsemättömän IgG:n tuntemattoman konsentraat ion 50 76432 mittaamiseksi (vertailutyyppiset mittaukset) käyttämällä lisäksi merkityn AB:n vakiokonsentraatiota, jonka suhde merkittyyn elementtiin tällöin tulee olemaan nopeuden determinantti kuvion 6 näyttämän kaavan mukaan. Kokeissa, joiden tulokset on esitetty taulukossa VII, oli merkityn lgG:n vakiokonsentraatio 1 jt/g/ml . Ensimmäisessä sarakkeessa mainitut arvot koskevat merkitsemätöntä IgG:ta.

Taulukko VII

Merkitsemättömän IgG:n Nopeuskäyrien kaltevuus konsentraatio ( q/ml) (mielivaltaisina yksikköinä) 0 toisin sanoen 1 g/ml merkittyä IgG:a 24.3 0.09 19.7 0.83 10.2 4.14 2.4 0.2 0.84

Esimerkki 9

Kuvion 9 mukaista laitetta käytettiin fluoresenssimittauksen olosuhteissa, toisin sanoen herätysvalon suodatin 5 oli aallonpituudelle Λι = 492 nm, ja suodattimen 6 ja kuidun taka-oään jälkeen sijaitseva herätysvaloa sulkeva lisäsuodatin oli aallonpituudelle A 2 = 518 nm.

Koe suoritettiin itse asiassa tarkasti samalla tavoin kuin esimerkissä 8, mutta mitattiin signaalin (lähetetyn fluoresenssin) suureneminen sen pienenemisen asemesta, kuten absorp-tioilmiön yhteydessä. Samalla tavoin kuin esimerkissä 8 oli analyytissä 1 pq/v\l fluresoivaa IgG:a sekä ihmisen merkitsemätöntä IgG:a eri konsentraatioina, kuten taulukon vasemmassa sarakkeessa on näytetty.

Il si 76432

Taulukko VIII

Merkitsemättömän TqG:n Nopeuskäyrien kaltevuus konsentraatio ( q/ml) (mielivaltaisina yksikköinä) 0 17.9 0.09 13.0 0.83 5.3 4.14 1.4 9.20 0.42

Lukijalle on oltava selvää, että esimerkeissä 1 ia 9 selitettyjä tuloksia on käytetty standardeina vartailutarkoituksiin samanlaisten näytteiden tuntemattomia konsentraatioita varten. Vertailut ja laskennat voidaan tehdä kuten tavanomaisesti visuaalisesti tai suorittamalla elektroninen käsittely selitettyyn laitteeseen liitettävällä mikrotietokoneella.

Claims (20)

52 76432

1. Menetelmä liuoksessa olevan analyytin määrittämiseksi, jonka menetelmän mukaan kerros analyytin ja reagenssin muodostamaa tuotetta kerääntyy valotetun valojohdon sydämen pinnalle, jossa kulkee moninkertaisesti kokonaisheijastunut valo-aaltosignaali, joka muodostunut kerros muuttaa valojohdon optisia ominaisuuksia ja täten muuttaa mainitun aaltosignaa-lin, ja mainittu muutos mitataan ja sitä käytetään mainittuun määrittämiseen, jolloin valojohtona käytetään sydäntä, jonka taitekerroin (n^) on suurempi kuin mainitun analyyttiliuoksen taitekerroin (n2) , tunnettu siitä, että suhteen r\i/r\2 arvo on sellainen, että sydämessä kulkevaan aaltosignaaliin liittyvän valokomponentin sisääntunkeutumissyvyys käytännöllisesti katsoen sovittuu analyytin ja reagenssin mainitun tuotteen paksuuteen tai ylittää tämän paksuuden.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analyytille spesifisen reagenssin ohuella kalvolla pinnoitetun valotetun ei-huokoisen valojohdon sydämen osa saatetaan kosketukseen mainitun analyytin liuoksen kanssa ja täten saatetaan tämä analyytti reagoimaan mainitun kalvon mainitun reagenssin kanssa ja muodostamaan kerroksen reagenssin ja analyytin tuotetta, tarkkaillaan niitä vastaavia optisia muutoksia, joita ajan mittaan esiintyy sydämen läpi kulkevassa valoaaltosignaalissa mainitun sydämen lähdössä mainitun tuotekerroksen muodostumisen seurauksena ja verrataan täten saatuja nopeustietoja vastaaviin standardi-vertailunopeustie-toihin, jotka on samankaltaisella tavalla saatu mainitun analyytin kalibrointinäytteistä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valojohdon ei-huokoisen sydämen osa pinnoitetaan vertailumäärällä määritettävää analyyttiä, syötetään valoaal-tosignaali mainitun osan tuloon, saatetaan mainittu valotettu osa kosketukseen analyyttiliuoksen kanssa ja lisätään ennalta 53 764 3 2 tai samanaikaisesti siihen vertailumäärä reagenssia tämän saattamiseksi kilpailevasti reagoimaan liuoksessa olevan ana-lyytin kanssa ja sydämellä olevan mainitun vertailumäärän kanssa, tarkkaillaan vastaavia optisia muutoksia, jotka ajan mittaan tapahtuvat mainitussa aaltosignaalissa mainitun sydämen osan lähdössä reagenssin ja mainitun vertailumäärän välisen reaktion tuloksena ja verrataan täten saatuja nopeustieto-ja standardivertailunopeustietoihin, jotka on samalla tavoin saatu mainitun analyytin liuosten kalibrointinäytteistä.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analyyttiliuokseen lisätään merkintämäärin puhdasta merkittyä analyyttiä, jolloin mainitun merkin läsnäolo reagenssin ja analyytin tuotekerroksessa valojohdon sydämellä aiheuttaa sydämen läpi kulkevan valoaaltosignaalin mainitut optiset muutokset, ja näiden muutosten suuruus on suorassa suhteessa merkityn analyytin ja liuoksessa olevan analyytin suhteeseen.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään sydäntä, jossa pinnoitteena on reagenssia yli sen stökiömetrisen määrän, joka tarvitaan liuoksessa olevan määritettävän analyytin sitomiseksi, saatetaan mainittu pinnoitettu sydän kosketukseen analyyttiliuoksen kanssa mainitun määritettävän analyytin sitomiseksi kokonaan, lisätään analyyttiliuokseen vertailumäärä puhtaassa merkityssä muodossa olevaa analyyttiä sen saattamiseksi reagoimaan reagenssin yhä käyttämättömän osan kanssa, jolloin mainitun merkkiaineen läsnäolo reagenssin ja analyytin tuotteessa saattaa mainitut optiset muutokset tapahtumaan aaltosignaalissa ja näiden muutosten suuruus on suorassa suhteessa merkityn analyytin ja liuoksessa olevan analyytin suhteeseen.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, kun analyytissä on useampi kuin yksi sidoskohta, joka spesifisesti sitoo useamman kuin yhden reagenssilajin, tunnettu siitä, että ensimmäisellä reagenssilla pinnoitettu mainittu sydän saate- 76432 taan kosketukseen mainitun analyyttiliuoksen kanssa, lisätään vertailumäärä toista reagenssia mainitun toisen reagenssin saattamiseksi sitoutumaan mainitun analyytin toiseen sidoskoh-taan, jolloin mainittu optinen muutos aiheutuu analyytin mainitussa toisessa sidoskohdassa olevan toisen reagenssin sitoutumisesta, joka analyytti on sitoutunut ensimmäisessä sidos-kohdassa sydämen mainittuun ensimmäiseen reagenssiin.

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut nopeustiedot tulkitaan niiden nopeuskäy-rien kaltevuuksina, jotka koskevat kokeiltavaa reaktiota, tai nopeustiedot ekstrapoloidaan tasapaino-olosuhteiden määrittämiseksi.

8. Patenttivaatimuksen 1...7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valojohdon sydämen optisten ominaisuuksien mainittu muutos on suhteessa aaltosignaalin absorptioon, joka muutos johtaa mainitun sydämen lähdössä mitatun valo-signaalin pienenemiseen ajan mittaan.

9. Patenttivaatimuksen 1...6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valojohdon sydämen optisten ominaisuuksien muutos koskee fluoresenssivalosignaalin kehittymistä, joka signaali ajan mittaan suurenee mitattuna mainitun sydämen lähdössä tai sivusuunnassa siitä.

10. Patenttivaatimuksen 1...6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valojohdon sydämen optisten ominaisuuk- ien mainittu muutos koskee mainitun valoaaltosignaalin sirontaa, jonka sironnan määrä ajan mittaan suurenee ja on mitattavissa osittain sivusuunnassa sironta-alueesta ja osittain sydämen lähdössä.

11. Patenttivaatimuksen 1...6 mukainen menetelmä, tungettu siitä, että käytetään polaroitua valosignaalia, ja ’ttä valojohdon optisten ominaisuuksien muutos koskee mainitun signaalin elliptisiä polarisaatioparametrejä, jotka mitataan mainitun sydämen lähdössä. 55 7 6432

12. Patenttivaatimuksen 1...10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sydän on valittu valoa läpäisevien levy-, tanko- tai kuitumaisten kappaleiden joukosta, joiden taitekerroin on vähintään 1,4.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sydän on yksimuotoisen tai monimuotoisen optisen kuidun sydän.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetään monimuotokuitua, jossa on muotoja, jotka ovat riittävän tylppiä kuidun akseliin nähden kokonaisheijastumisen aikaansaamiseksi, ja riittävän jyrkkiä valosignaalin ja pinnoitteen välisten vaikutuskohtien suuren lineaarisen tiheyden aikaansaamiseksi.

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sydän on monimuotokuitu, jossa muodot on valittu siten, että alkuheijastumiskulma on lähellä kriittistä kulmaa niin, että reaktion aikana vähemmän tiheän väliaineen taitekertoimen r\2 pieni muuttuminen, joka aiheutuu analyytin ja reagenssin tuotteen kasvusta, johtaa valon osittais- tai kokonaistaittumiseen sydämen ulkopuolelle.

16. Laite kineettisten parametrien mittaamiseksi analyytin ja siihen nähden spesifisen reagenssin reaktiossa, joka reaktio esiintyy valojohdon (1) pinnalla ja aiheuttaa valojohdon optisten ominaisuuksien ilmaistavissa olevia muutoksia, jolloin laitteessa on valonlähde (8) , välineet (9, 10, 11) signaalin syöttämiseksi tästä lähteestä valojohdon (1) tuloon, ilmaisin-välineet (12) valosignaalin ilmaisemiseksi, joka on muuttunut kulkiessaan laitteen läpi ja lähtiessään siitä, ja sen muuttamiseksi sähkösignaaliksi, ja välineet (13) mainitun signaalin käsittelemiseksi mainittua reaktiota koskeviksi käyttökelpoisiksi tiedoiksi, ja valojohto (1) on materiaalia, jonka tai- 76432 tekerroin (ni) on suurempi kuin reaktioväliaineen taitekerroin (n2) , tunnettu siitä, että suhteen ni/n2 arvo on sellainen, että sydämessä kulkevaan aaltosignaaliin liittyvän valokomponentin sisääntunkeutumissyvyys käytännöllisesti katsoen sovittuu analyytin ja reagenssin mainitun tuotteen paksuuteen tai ylittää tämän paksuuden.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen laite, tunnettu siitä, että valojohto (1) on muodoltaan levy tai kuitu, jonka taitekerroin on rajoissa noin 1,4...noin 3,5 ja joka on muotoiltu siten, että valosignaali välittyy valojohdon läpi moninkertaisen kokonaisheijastumisen seurauksena.

18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen laite, tunnettu siitä, että muunnettu valosignaali lähtee sirotettuna, fluoresoivana tai osittain absorboituneena valosignaalina.

19. Patenttivaatimuksen 16 mukainen laite, tunnettu siitä, että valojohto (1) on muodoltaan kierukkamaisesti kelattu optinen kuitu.

20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen laite, tunnettu siitä, että siinä on vastalevy (42) , joka on sovitettu ei-kos-kettavaan läheiseen rinnakkaissuhteeseen valojohtolevyyn (41) nähden, jolloin reaktio tapahtuu näiden levyjen välissä olevassa tilassa, ja reaktioväliaine pysyy paikallaan kapillaarivoimien vaikutuksesta. ?atentkrav