DE4307042A1 - Verfahren zum optischen qualitativen und quantitativen Nachweis von Molekülen, Biomolekülen und Mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zum optischen qualitativen und quantitativen Nachweis von Molekülen, Biomolekülen und Mikroorganismen

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Sensor mit einem neuartigen Aufbau für den optischen Nachweis von Molekülen. Es handelt sich um einen Festphasensensor, der mit Hilfe der aus einem Lichtwellenleiter beliebiger Geometrie austretenden evaneszenten Welle Moleküle in der Nähe der Oberfläche nachweist.
Der Nachweis von Molekülen, wie Proteine, Nukleinsäuren, Pestizide, Toxine, pharmazeutische Wirkstoffe, organische und anorganische Substanzen, Mikroorganismen und Ionen (auch Proto­ nen) kann über spezifische Bindungen an ein anderes Molekül, das Rezeptoreigenschaften besitzt, sehr selektiv auch aus einem Gemisch durchgeführt werden. Ein solches Rezeptormolekül kann z. B. ein Antikörpermolekül, oder ein DNS-Molekül, das zumindest teilweise eine zu der nachzuweisen­ den DNS-Sequenz komplementäre Struktur aufweist, sein. Die bisher in der Praxis eingesetzten Nachweisprinzipien sind in der Regel heterogene Mehrschrittverfahren (Methods in Enzymology, 74 (1981), 28-60. So ist in vielen Testsystem-Ausführungen z. B. das Rezeptormolekül an einer Oberfläche immobilisiert, während das nachzuweisende Molekül, das sich im Überstand der Lö­ sung, oder bei gasförmigen Substanzen, das sich im Gasraum über der Oberfläche befindet, an das Rezeptormolekül bindet. Ist die Oberfläche die eines massensensitiven Kristalls, kann die Massen­ zunahme durch die Bindung des Analyten an das Rezeptormolekül direkt i.d.R. über die Abnahme der Resonanzfrequenz detektiert werden (J. Am. Chem. Soc. 108 (1986), 5444-5447). In der Regel werden jedoch Mehrschrittverfahren eingesetzt, die mit Hilfe eines markierten weiteren Moleküls als kompetitiver oder Sandwichtest den Nachweis des Analyten erreichen. Die Markierung ist in der Regel ein Enzym, ein Radionuklid oder ein Fluoreszenzfarbstoff. Die Verwendung von Fluores­ zenzfarbstoff-markierten Molekülen erlaubt nicht nur den Nachweis der markierten Moleküle, son­ dern, wenn der Test kompetitiv oder als Sandwich-Test ausgelegt ist, auch den Nachweis nicht mar­ kierter Analyte. Darüberhinaus kann auch die Wechselwirkung zwischen zwei verschiedenen Fluo­ reszenzfarbstoffen, deren Absorptionsbanden sich überlappen, genutzt werden, wenn diese an einer Oberfläche sich auf wenige Nanometer annähern. Einige dieser bekannten Immunoassay-Metho­ den beinhalten die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff-Molekülen F1, die in der Lage sind, Licht einer Wellenlänge λ1 zu absorbieren und Licht einer zweiten, größeren Wellenlänge λ2 zu emittie­ ren. In Gegenwart eines anderen Fluoreszenzfarbstoffmoleküls F2 erfolgt unter bestimmten Bedin­ gungen nach der Anregung von F1 durch Licht der Wellenlänge λ1 eine strahlungslose Energieü­ bertragung auf F2, der dann seinerseits Licht einer dritten, noch größeren Wellenlänge λ3 emittiert. Dieses Prinzip des Energietransfers ist von Förster in der Theorie beschrieben worden und ist Anre­ gung für vielerlei mögliche Anwendungen gewesen (Annual Reviews in Biochemistry 47 (1978), 819-846).
Der Einsatz der Fluoreszenztechnik ermöglicht einen 1-Schritt-Test, das heißt, es sind keine Wasch­ schritte und mehrfache Inkubationen erforderlich. Besonders die Evaneszenztechnik wurde in der Vergangenheit häufig untersucht, um mit ihr direkt zwischen gebundenen und nicht gebundenen fluoreszenzmarkierten Molekülen zu unterscheiden (Clin. Chem. 30 (1984), 1533-1538). Hier wird das Prinzip ausgenutzt, daß Licht bei der Totalreflexion während der Fortpflanzung in einem Licht­ wellenleiter in das Medium mit niedrigerem Brechungsindex austritt und zwar etwa ¹/₃ der Wellen­ länge des Lichtes. Dieses Licht kann genutzt werden, um Fluoreszenzmoleküle, die sich an der Oberfläche des Lichtwellenleiters befinden, zur Fluoreszenz anzuregen. Das ausgesandte Fluores­ zenzlicht seinerseits wird zum Teil in den Lichtwellenleiter zurückgekoppelt und kann detektiert werden. Sind auf der Lichtwellenleiteroberfläche Rezeptormoleküle adsorbiert oder chemisch ge­ bunden, so führt die spezifische Bindung fluoreszenzmarkierter Analyte zu einer Anreicherung in der Nähe der Oberfläche. Diese Moleküle können durch die evaneszente Welle zur Fluoreszenz an­ geregt werden; andere, nicht gebundene Moleküle, die sich weiter von der Oberfläche entfernt be­ finden, werden dagegen aufgrund der "Kurzsichtigkeit" der evaneszenten Welle nicht zur Fluores­ zenz angeregt und entsprechend nicht erkannt. Es läßt sich also zwischen den Zuständen "gebun­ den" und "nicht gebunden" unterscheiden. Auch können Änderungen des Brechungsindex in der Nähe der Oberfläche, die durch die Anwesenheit von Analytmolekülen auftreten, durch die evanes­ zente Welle detektiert werden.
Die Empfindlichkeit der Detektion von Fluoreszenzlicht kann erhöht werden, wenn man "zeitaufge­ löst" detektiert, das heißt, nach der Anregung mit einem Lichtpuls wartet man mit der Detektion so lange, bis das sehr schnell abklingende Streulicht und evtl. vorhandenes schnell abklingende Hinter­ grundfluoreszenz nahezu verschwunden ist. Erst dann wird das Fluoreszenzlicht der Fluoreszenz­ moleküle mit entsprechend längerer Fluoreszenzabklingzeit detektiert (Analytical Chemistry 62 (1990), 1149A-1157A).
Sind auf der Lichtwellenleiteroberfläche neben Rezeptormolekülen auch Fluoreszenzfarbstoffmo­ leküle F1 z. B. nach z. B. dem in DE 39 38 598 A1 und DE 40 13 713 A1 beschriebenen Verfahren an der Oberfläche immobilisiert, so läßt sich der Fluoreszenzenergietransfer mit Hilfe der Evaneszenz­ technik nachweisen. Werden Moleküle, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff F2 markiert sind, an der Oberfläche gebunden, tritt, wenn der Abstand zwischen F2 und den an der Oberfläche gebundenen Fluoreszenzfarbstoffmolekülen F1 klein genug ist, ein Energietransfer auf, der durch die veränder­ ten Fluoreszenzeigenschaften auf der Oberfläche evaneszent detektiert werden kann.
Nachteile der bisher beschriebenen Evaneszenz-Sensoren entstehen durch die verwendeten Licht­ quellen und die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe. Die Verwendung von Blitzlampen zur Anre­ gung führt zu einer breiten spektralen Anregung, die, trotz Verwendung entsprechender Filter, einen beträchtlichen Anteil Untergrundfluoreszenz verursacht, was die Empfindlichkeit des Sensors ein­ schränkt. In anderen Arbeiten wurden Stickstofflaser eingesetzt, um den Fluoreszenzfarbstoff Fluo­ rescein evaneszent an der Oberfläche des Lichtwellenleiters anzuregen. Darüberhinaus sind Stick­ stofflaser relativ teuer und benötigen reinen Stickstoff für den Betrieb. Dieser kann entweder aus ei­ nem Stickstoffreservoir kontinuierlich durch den Laserresonator fließen, oder aber sich in einem ab­ geschlossenen Resonator befinden, der sich wiederum in einer Kartusche befindet, die von Zeit zu Zeit ausgewechselt werden muß. Dies erhöht die Betriebskosten. Darüberhinaus ist die Apparatur groß und unhandlich und die Empfindlichkeit gegenüber Zerstörung der Lichtquelle groß.
Ein weiterer Nachteil ist die Verwendung von Farbstoffen, die im sichtbaren oder blauen Spektral­ bereich absorbieren und emittieren, da durch die entsprechende Wellenlänge des Anregungslichtes eine Reihe anderer eventuell vorhandener Substanzen (beispielsweise Proteine, Nicotinamiddinu­ kleotid, Flavine) ebenfalls Licht absorbieren und Fluoreszenzlicht emittieren. Dieses "Untergrund­ fluoreszenzlicht" reduziert die Empfindlichkeit des Sensors.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartig aufgebauten Sensor zur Detektion von mit Fluo­ reszenzfarbstoff markierten Molekülen zur Erkennung und zum quantitativen Nachweis dieser Sub­ stanzen oder Analyte. Dabei kann die Schnelligkeit des Tests durch Verwendung eines Lichtwellen­ leiters beliebiger Gestalt und den Einsatz der Evaneszenztechnik genutzt werden, die Hintergrund­ fluoreszenz reduziert und gleichzeitig eine hohe Empfindlichkeit erreicht werden. Darüberhinaus kann die Größe und Empfindlichkeit gegen Stoß des Gerätes verringert und die Kosten reduziert werden.
Die Erfindung betrifft einen optischen Sensor auf der Basis der Evaneszenztechnik, bestehend aus
  • a) einem festen Träger,
  • b) einer auf a) angebrachten ein- oder mehrlagigen Schicht von Rezeptormolekülen,
  • c) einer Laserdiode als Anregungslichtquelle,
  • d) einem oder mehreren Spiegeln und/oder Filtern,
  • e) einem Detektor,
  • f) einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen, die durch das Licht der Laserdiode zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt werden können.
Als Träger kommen alle dem Fachmann bekannten, für die Immobilisierung geeigneten Träger in Frage, wie Glas, Quarz, Kunststoffe.
Auf solche Träger werden adsorptiv, mit Hilfe chemischer Kopplungsmoleküle oder mit Hilfe der Langmuir-Blodgett-Technik, Rezeptormoleküle immobilisiert oder polymere Netzwerke aufge­ bracht, in deren Hohlräume Rezeptormoleküle eingefangen oder kovalent immobilisiert sind oder werden. Darüberhinaus können an der Stelle von oder gemeinsam mit Rezeptormolekülen auch In­ dikatormoleküle immobilisiert oder in Netzwerken auf der Oberfläche aufgebracht sein. Die aufge­ brachten Schichten sollen eine oder wenige Monolagen dick sein, jedoch soll die Schichtdicke nicht die Wellenlänge des Lichtes überschreiten.
Die Immobilisierung funktioneller Moleküle kann auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen: Das funktionelle Molekül kann kovalent, gegebenenfalls unter Verwendung von Spacermolekülen, an die Oberfläche bzw. LB-Schicht geknüpft sein.
Das funktionelle Molekül kann gleichzeitig mit der LB-Schicht als Amphiphil mitgespreitet und so mit "Anker" in die Schicht miteingebaut werden.
Die Anregung erfolgt mit einer Laserdiode, die Licht vorzugsweise im nahen infraroten Wellenlän­ genbereich emittiert. Auch frequenzvervielfachte Laserdioden sind einsetzbar. Weiterhin können zur zeitaufgelösten Fluoreszenzspektroskopie gepulste Laserdioden eingesetzt werden.
Zur Detektion wird eine Photodiode oder ein Photomultiplier eingesetzt.
Der so beschriebene Sensoraufbau kann in dieser Funktion nicht nur einen in Lösung vorhandenen Analyten, der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, nachweisen; der Sensoraufbau kann auch genutzt werden, um in einer kompetitiven Funktionsweise einen nicht fluoreszenzmarkierten Analyten nachzuweisen. Hierzu werden bei der Präparation des Sensors die spezifisch bindenden Stellen der funktionellen Moleküle mit fluoreszenzmarkierten, komplementär bindenden Molekü­ len abgesättigt. Man beobachtet dann bei der Anregung mit Licht eine maximale Fluoreszenzemis­ sion, deren Abnahme über einen zeitlichen Verlauf beobachtet werden kann, wenn bei Kontakt mit der zu untersuchenden Lösung das fluoreszenzmarkierte komplementär bindende Molekül in einer Gleichgewichtsreaktionen durch nicht fluoreszenzmarkierte, komplementär bindende Moleküle des gleichen Typs verdrängt werden. Eine Variation dieses Vorgehens ist die gleichzeitige Zugabe von fluoreszenzmarkierten und nichtfluoreszenzmarkierten Molekülen, so daß die beiden Molekülty­ pen um die Bindungsstellen konkurrieren, jedoch das Gleichgewicht schneller eintritt. Der Aufbau kann natürlich auch eingesetzt werden, um den Nachweis von Molekülen über einen Förster-Ener­ gie-Transfer zu führen.
Als Fluoreszenzfarbstoffe kommen alle Chromophore in Frage, die durch Laserdioden anregbar sind. Hier sind insbesondere zu nennen: Cyanine, Rhodamine, Indocyanine, Oxazine. Diese Aufli­ stung ist nur beispielhaft. Werden frequenzvervielfachte Laserdioden eingesetzt, so werden Fluo­ reszenzfarbstoffe verwendet, die durch die Wellenlänge der frequenzvervielfachten Laserdiode an­ geregt werden können (z. B. Coumarine).
Darüber hinaus kann der Sensor auch eingesetzt werden, um Brechungsindexänderungen, die durch die Anwesenheit von Molekülen in der Nähe der Oberfläche des Lichtwellenleiters auftreten, zu de­ tektieren und so Analyte nachzuweisen.
Anhand eines Ausführungsbeispiels soll die Erfindung erläutert werden:
Der in Fig. 1 beschriebene Aufbau besteht aus einer Laserdiode (1), deren Licht über einen Raman- Holographie-Kantenfilter durch ein Mikroskopobjektiv in einen kommerziell erhältlichen Licht­ wellenleiter eingekoppelt wird. An der Spitze des Lichtwellenleiters wurde der Mantel entfernt, so daß der Kern frei lag. Auf dem Kern wurden über γ-Aminotriethoxysilanmoleküle und Glutardialde­ hyd kovalent anti-Ziege-anti-Hase-IgG-Antikörper gebunden. Zur Detektion der in den Lichtwel­ lenleiter eintretenden Fluoreszenz wurde ein halbdurchlässiger, wellenlängenselektiver Spiegel in den Strahlengang positioniert, und ankommende Fluoreszenzphotonen auf einen Detektor (7) geleitet. Zur Detektion wurde eine PIN-Diode verwendet. Selbstverständlich können auch andere Detekto­ ren, wie z. B. Sekundärelektronenvervielfacher, verwendet werden. Ein zusätzlicher wellenlängen­ selektiver Filter unterdrückt eventuell auftretendes Streulicht. Die Faserspitze (5) wurde nun in eine Lösung getaucht, die einen unmarkierten Ziege-anti-Pferd-Antikörper und einen mit dem Fluores­ zenzfarbstoff "Cy 5" markierten Ziege-anti-Pferd-Antikörper enthält, getaucht. Markierte und nicht markierte Antikörper konkurrieren um die Bindungsstellen der immobilisierten Antikörper. Die Fluoreszenzsignalintensität nimmt mit abnehmender Konzentration an nicht markiertem Antikör­ per zu. Mit der Apparatur lassen sich auch andere Arten von Testkonfigurationen, z. B. kompetitive Tests durchführen und andere Analyte (z. B. Nukleotide, Mikroorganismen, Ionen, Moleküle) nach­ weisen.

Claims (12)

1. Optischer Sensor auf der Basis der Evaneszenztechnik, bestehend aus
  • a) einem festen Träger,
  • b) einer auf a) angebrachten ein- oder mehrlagigen Schicht von Rezeptormolekülen,
  • c) einer Laserdiode als Anregungslichtquelle,
  • d) einem oder mehreren Spiegeln und/oder Filtern,
  • e) einem Detektor,
  • f) einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen, die durch das Licht der Laserdiode zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt werden können.
2. Optischer Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Träger aus Glas, Quarzglas, Kunststoff oder anderen transmittierenden Materialien besteht.
3. Optischer Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial selbst auf ei­ nem weiteren stabilisierenden Festkörper aufgebracht oder eingelagert ist.
3. Optischer Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Rezeptormoleküle auf dem Trä­ ger immobilisiert sind.
4. Optischer Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Moleküle mit Katalysatoreigen­ schaften auf dem Träger gebunden sind.
5. Optischer Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine gepulste Laserdiode zur Anregung eingesetzt wird.
6. Optischer Sensor nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß zeitaufgelöst detektiert wird.
7. Optischer Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß frequenzvervielfachte Laser­ dioden eingesetzt werden.
8. Optischer Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Anregungslicht in den Lichtwellenleiter eingekoppelt wird.
9. Optischer Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzanregung au­ ßerhalb des Lichtwellenleiters durch Bestrahlung der Analytlösung erfolgt.
10. Optischer Sensor nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Auskopplung des Fluoreszenzlichtes an dem Ende des Lichtwellenleiters erfolgt, an dem das Anregungslicht einge­ koppelt wird.
11. Optischer Sensor nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Auskopplung des Fluoreszenzlichtes an einem Ende des Lichtwellenleiters erfolgt, an dem das Anregungslicht nicht eingekoppelt wird.
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