WO1999015543A2 - Verfahren zum sequenzieren eines einzelnen dna-moleküls - Google Patents

Verfahren zum sequenzieren eines einzelnen dna-moleküls Download PDF

Info

Publication number
WO1999015543A2
WO1999015543A2 PCT/EP1998/005061 EP9805061W WO9915543A2 WO 1999015543 A2 WO1999015543 A2 WO 1999015543A2 EP 9805061 W EP9805061 W EP 9805061W WO 9915543 A2 WO9915543 A2 WO 9915543A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fiber tip
light
fiber
fluorescent
molecules
Prior art date
Application number
PCT/EP1998/005061
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO1999015543A3 (de
Inventor
Jürgen WOLFRUM
Original Assignee
Wolfrum Juergen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wolfrum Juergen filed Critical Wolfrum Juergen
Priority to EP98946308A priority Critical patent/EP1017708A2/de
Priority to US09/509,579 priority patent/US6225068B1/en
Publication of WO1999015543A2 publication Critical patent/WO1999015543A2/de
Publication of WO1999015543A3 publication Critical patent/WO1999015543A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805—Optical property

Definitions

  • the invention relates to methods for sequencing individual macromolecules, in particular individual DNA and RNA molecules.
  • the sequencing of a single DNA strand comprises the following steps: (a) Starting from the DNA molecule to be sequenced, the so-called template, which is present in large numbers, DNA molecules are synthesized as complementary copies, in which at least one part of nucleotide dye molecules are coupled. These DNA molecules are often referred to as labeled DNA. The synthesis takes place with the help of a polymerase. The result is marked double strands or, if necessary, marked single strands after denaturation.
  • the carrier is transferred to a detection apparatus;
  • the individual, partially labeled nucleotides are gradually degraded by an exonuclease, i.e. cleaved from the DNA strand.
  • the cleaved and labeled mononucleotides are detected and identified in the detection apparatus. This can be done with the aid of spectrally or temporally resolved fluorescence spectroscopy or other nucleotide-specific methods, such as, for example, mass spectrometry.
  • Step (b) has hitherto been carried out in such a way that microspheres with a diameter between 0.5 and 5 ⁇ m are coated with avidin or streptavidin.
  • To the 5'- Biotin is coupled at the end of the DNA strand.
  • the coated microspheres are immersed in a solution which contains the biotinylated DNA strands, the DNA strands bind to the microspheres. If the concentration of the DNA strands in the solution is very small, only 0, 1, 2 or more DNA strands bind to the beads in a statistical manner, but on average only between none and one DNA strand.
  • An optical tweezer is then used to search for a microsphere which, owing to the bound DNA strand, shows a fluorescence signal. In this way, there is a certain probability of finding a microsphere to which exactly one strand of DNA is bound.
  • the DNA strand In order for the fluorescence of the DNA strand bound to the microsphere to be seen despite the Brownian movement of the microsphere, the DNA strand must be irradiated with a high-power excitation light. This can lead to the destruction of those dyes with which the DNA strand is stained. In addition, the dye molecules in a highly labeled DNA strand fluoresce only poorly due to various fluorescence quenching processes. The cleavage and detection of the mononucleotides in step (d) often takes place in flow systems (J. Biomolecular Struc. & Dynamics, Volume 7 (1989) p. 301). The marked and cleaved mononucleotides flow past a detection apparatus by suitably forming a flow system.
  • the object of the invention is to improve the method for sequencing a single DNA molecule.
  • a method for extracting a single fluorescent material is used for step (b) of single-strand sequencing mentioned at the beginning.
  • Cromolecule specified from a fluid which is characterized in that an area of a tip of a fiber having a diameter of at most a few micrometers is coated with molecules, the molecules being selected such that they are made with the material of the fiber tip and the fluorescent macromolecule can enter into a bond; that the coated fiber tip is immersed in the fluid containing the fluorescent macromolecule, the area of the fiber tip being irradiated with light of the excitation wavelength of the fluorescent macromolecule; that the fluorescent light from the surroundings of the fiber tip is detected; and that the fiber tip is removed from the fluid as soon as the detected fluorescent light exceeds a predetermined intensity.
  • the concentration of the fluorescent macromolecules in the fluid is chosen such that it only binds to the fiber tip at larger time intervals, the probability that two fluorescent macromolecules bind to the fiber tip at the same time is very small. As a result, if the fluorescent light exceeds a predetermined intensity, the probability is very high that only a single fluorescent macromolecule has bound to the fiber tip.
  • the fluorescent macromolecule bound to a fiber tip can be removed from the fluid with the aid of the fiber tip and transported to any other apparatus.
  • the specified method for extracting a single fluorescent macromolecule from a fluid is not limited to DNA molecules. In general, it can be used for any fluorescent macromolecule, provided that a bond between the macromolecule and the fiber tip can be mediated. The process can also be used both in gases and in liquids.
  • the coating of the fiber tip with molecules is achieved in that the surface of the fiber tip is coated with photobiotin molecules; that a spatially restricted area of the surface of the fiber tip is exposed to light in the wavelength range from approximately 300 to 360 nm in such a way that the photobiotin molecules are bound to the fiber tip in the exposed area; that the unbound photobiotin molecules are then washed off the tip of the fiber become; and that the fiber tip is then brought into contact with a solution containing avidin or streptavidin.
  • a coating of the fiber tip with these molecules is appropriate due to the strong bond between biotin and avidin or streptavidin.
  • This method represents a particularly elegant way of achieving a coating with avidin or streptavidin in the smallest possible area of the fiber tip.
  • the coating of the fiber tip can be achieved by using focused light in an area limited to fractions of a ⁇ m 2 .
  • a fiber tip made of glass or PMMA is pretreated in a known manner for coating with photobiotin.
  • a dye-labeled double-stranded DNA molecule is extracted from an aqueous solution, intercalation dye molecules having an excitation wavelength in a wavelength range other than the excitation wavelength of the dye molecules are added to the aqueous solution.
  • Light of the excitation wavelength of the intercalation dye molecules is coupled into the fiber and directed to the fiber tip in such a way that it has a small depth of penetration into the aqueous solution.
  • the intercalation dye molecules are excited to fluoresce by the coupled light.
  • the fluorescent light from the vicinity of the fiber tip is detected.
  • the fiber tip is removed from the fluid as soon as the detected fluorescent light exceeds a predetermined intensity. It is no longer the double-stranded
  • a method for detecting a single fluorescent molecule in a fluid in which a fluid is passed through a microcapillary which has an outlet opening at one end with an internal diameter between approximately 300 and 700 nm and a wall thickness less than one Has a quarter of the excitation wavelength of the fluorescent molecule, the fluorescent molecule emerging at the exit opening; a light beam of the excitation wavelength of the fluorescent molecule is focused on an area immediately at the outlet opening of the microcapillary; the fluorescent light is detected with high collection efficiency; and the passage of the molecule through the focus is assumed as soon as the detected fluorescent light exceeds a predetermined intensity.
  • the cleaved nucleotide leaving the capillary through the exit opening generates fluorescent light when it enters the light beam just before, at or just behind the exit opening.
  • the stated method for detecting a single fluorescent molecule is in no way limited to DNA molecules, but is applicable to any fluorescent molecules, e.g. for fluorescent or fluorescence-labeled proteins or amino acids. Because the relatively small outlet opening of the extended microcapillary is completely irradiated with light, no molecule can flow past or diffuse past the focus of the light source.
  • the wall thickness of the extended microcapillary in the observed area is less than one A quarter of the wavelength, preferably less than an eighth of the wavelength of the light used for excitation. This leads to a strongly weakened reflection of the excitation light. This in turn leads to a significant reduction in the disturbing background signal in the single-molecule detection.
  • a further weakening of the reflection can be achieved by comparing the refractive index of the solvent filling the capillary tip and of the surrounding solvent with that of the glass material.
  • Charged fluorescent molecules e.g. Labeled DNA molecules, nucleotides, amino acids, peptides, proteins etc. can still be separated electrophoretically before leaving the microcapillary.
  • the microcapillary is immersed in a solution that is electrically coupled to an electrode.
  • the solution forms an electrical current path to a counter electrode.
  • An electrical voltage difference is set between the electrode and the counterelectrode such that the charged, fluorescent molecules move out of the microcapillary through the end.
  • the object on which the invention is based is also achieved by a method for sequencing a single DNA molecule, in which (a) a multiplicity of essentially identical DNA molecules are synthesized in a solution in which dye molecules are present on at least some of the nucleotides are coupled (labeled nucleotides);
  • the fiber tip is inserted into a microcapillary which has an inner diameter between approximately 300 and 700 nm at one end;
  • the microcapillary is filled with a solution which brings about successive cleavage of individual nucleotides of the DNA molecule;
  • the binding of the DNA molecule to a fiber tip enables it to be easily extracted from the solution.
  • the bound DNA molecule can be inserted into a microcapillary at the tip of the fiber. This is designed so that it enables detection and identification of the labeled mononucleotides.
  • 1A shows a perspective view of a fiber tip
  • 1B is a sectional view of a fiber tip
  • FIG. 2A shows a schematic representation of a fiber tip coated with avidin
  • FIG. 2B shows a schematic representation of the binding of biotinylated and dye-labeled DNA to the coated fiber tip according to FIG. 2A;
  • FIG. 3 shows a sectional view of an arrangement of a fiber tip with a DNA molecule bound to it in an extended microcapillary; and
  • FIG. 4 shows a schematic illustration of the arrangement according to the invention.
  • the template will be present in relatively large numbers, for example in micromolar concentration in solution. Accordingly, many colored copies of the template are created. For single-strand sequencing, a single colored DNA molecule must be extracted from the solution in the next step.
  • a fiber made of glass or PMMA is used, the tip of which has a diameter of less than 1 ⁇ m.
  • Such a fiber tip is shown schematically in FIG. 1.
  • the aim is to bind only a single colored strand of DNA to the tip of the fiber, biotin being bound at the 5 'end of the colored strand of DNA. It would therefore be desirable to bind avidin or streptavidin, the biotin, in the smallest possible area of the very small fiber tip can bind to itself and thus enable a connection of the DNA strand to the fiber.
  • the glass or PMMA fiber is first prepared in a known manner for the binding of photobiotin.
  • the fiber is then immersed in a solution containing photobiotin.
  • the fiber is irradiated with light of 300 to 360 nm wavelength from a laser beam focused on the smallest possible area of the fiber tip.
  • Light with a wavelength between 300 and 360 nm is coupled into this from the end facing away from the tip. It only emerges at the tip of the fiber. Only then is the photobiotin exposed.
  • the photobiotin By exposure of the photobiotin to light of the specified wavelengths, a bond is established between the photobiotin and the surface of the glass or PMMA fiber prepared in a known manner. After exposure, the unbound photobiotin is removed from the fiber in a washing step.
  • the fiber tip is then immersed in a solution containing avidin or streptavidin.
  • Avidin or streptavidin has four binding sites for biotin. It therefore binds to the biotin immobilized on the fiber. Its other three binding sites remain free and can bind to the biotin coupled to the DNA strands.
  • 2A shows schematically the fiber tip 1 occupied by avidin molecules 2. The result is a fiber tip to which avidin or streptavidin is bound in a very small range of a few 100 nm in diameter.
  • the fiber 1 thus prepared is immersed in the solution 3, which contains the biotinylated and colored DNA strands 4, as shown in FIG. 2B.
  • the aim is to connect an individual or the 1

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

Eine ausgezogene Faserspitze (1) wird mit Photobiotin belegt und mit UV-Licht bestrahlt. Dadurch geht das Photobiotin mit der Faserspitze in Bindung. Die Faserspitze wird anschließend mit Streptavidin in Kontakt gebracht und in eine Lösung getaucht, die gefärbte Kopien des zu sequenzierenden DNA-Moleküls enthält. Am 5'-Ende der gefärbten DNA-Moleküle (4A) ist ebenfalls Biotin gebunden. Das an die einzelnen DNA-Moleküle gekoppelte Biotin bindet an das Streptavidin an der Faserspitze. Zum Nachweis dieser Bindung wird Licht in die Faser eingekoppelt. Das evaneszente Feld dieses Lichts regt ein gefärbtes DNA-Molekül zur Fluoreszenz an, sobald es an die Faserspitze bindet. Wird eine Bindung festgestellt, wird die Faser sofort aus der Lösung entfernt. Die Faserspitze wird sodann in eine Mikrokapillare (5) eingeführt. Die Mikrokapillare wird mit einer Pufferlösung gefüllt, die Exonukleasen enthält, die das DNA-Molekül Base für Base abbauen. Der Ausgang (6) der Kapillare befindet sich im Beobachtungsbereich einer Einzelmolekül-Detekionsapparatur. Um das Signal-Rauschen-Verhältnis für die Einzel-molekül-Detektion zu verbessern, ist die Wandstärke der Mikrokapillare im Bereich der Austrittsöffnung deutlich kleiner als 1/4 der Wellenlänge des Anregungslichts.

Description

Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA-Moleküls
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren beim Sequenzieren einzelner Makromoleküle, insbesondere einzelner DNA- und RNA-Moleküle.
Seit einigen Jahren wird weltweit versucht, einzelne DNA-Moleküle bzw. -Stränge zu sequenzieren. Die Sequenzierung eines DNA-Einzelstrangs umfaßt dabei die folgenden Schritte : (a) Ausgehend von dem zu sequenzierenden DNA-Molekül, dem sog. Template, welches in großer Anzahl vorliegt, werden DNA-Moleküle als komplementäre Kopien synthetisiert, bei denen an wenigstens einem Teil der Nukleotide Farbstoff- Moleküle gekoppelt sind. Diese DNA-Moleküle werden häu- fig als markierte DNA bezeichnet. Die Synthese geschieht mit Hilfe einer Polymerase . Im Ergebnis erhält man markierte Doppelstränge oder, bei Bedarf, nach Denaturierung markierte Einzelstränge.
(b) Aus den markierten DNA-Strängen wird ein einzelner an einen Träger gebunden.
(c) Der Träger wird in eine Detektionsapparatur überführt; in der Detektionsapparatur werden die einzelnen, teilweise markierten Nukleotide durch eine Exonuklease sukzessiv abgebaut, d.h. vom DNA-Strang abgespalten. (d) Die abgespaltenen und markierten Mononukleotide werden in der Detektionsapparatur detektiert und identifiziert. Dies kann mit Hilfe von spektral oder zeitlich aufgelöster Fluoreszenzspektroskopie oder anderen Nukleotid- spezifischen Verfahren, wie beispielsweise Massenspek- trometrie, erfolgen.
Schritt (b) wird bisher in der Weise durchgeführt, daß Mikrokügelchen mit einem Durchmesser zwischen 0,5 und 5 μm mit Avidin oder Streptavidin beschichtet werden. An das 5'- Ende des DNA-Strangs wird Biotin gekoppelt. Taucht man die beschichteten Mikrokügelchen in eine Lösung, die die bio- tinylierten DNA-Stränge enthält, so binden die DNA-Stränge an die Mikrokügelchen. Ist die Konzentration der DNA-Stränge in der Lösung sehr klein, so binden in statistischer Weise lediglich 0, 1, 2 oder mehr DNA-Stränge an die Kügelchen, im Mittel jedoch nur zwischen keinem und einem DNA-Strang. Mit Hilfe einer optischen Pinzette wird daraufhin ein Mikrokügelchen gesucht, welches aufgrund des gebundenen DNA- Strangs ein Fluoreszenzsignal zeigt. Auf diese Weise findet man mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit ein Mikrokügelchen, an das genau ein DNA-Strang gebunden ist.
Damit die Fluoreszenz des an das Mikrokügelchen gebundenen DNA-Strangs trotz der Brownschen Bewegung des Mikrokü- gelchens gesehen werden kann, muß der DNA-Strang mit einem Anregungslicht hoher Leistung bestrahlt werden. Dies kann zu einer Zerstörung derjenigen Farbstoffe führen, mit denen der DNA-Strang gefärbt ist. Hinzu kommt, daß die Farbstoff-Moleküle in einem hochmarkierten DNA-Strang aufgrund verschie- dener Fluoreszenz-Löschprozesse nur schlecht fluoreszieren. Die Abspaltung und Detektion der Mononukleotide in Schritt (d) geschieht häufig in Flußsystemen (J. Biomolecu- lar Struc. & Dynamics, Band 7 (1989) S. 301) . Durch ein geeignetes Ausbilden eines Strömungssystems fließen die mar- kierten und abgespaltenen Mononukleotide an einer Detektionsapparatur vorbei . Diese arbeitet mit einem relativ großen Detektionsvolumen im Bereich von Pikolitern. Entsprechend groß ist das Hintergrundsignal durch Verunreinigungen und Raman-Streuung. Ferner bedingt das Flußsystem einen relativ großen Abstand der Sammeloptik vom Detektionsvolumen, wodurch die Sammeleffizienz sinkt.
Aufgabe der Erfindung ist es, das Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA-Moleküls zu verbessern.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird für den eingangs genann- ten Schritt (b) der Einzelstrang-Sequenzierung ein Verfahren zum Extrahieren eines einzelnen fluoreszenzfähigem Ma- kromoleküls aus einem Fluid angegeben, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein einen Durchmesser von höchstens wenigen Mikrometern aufweisender Bereich einer Spitze einer Faser mit Mole- külen beschichtet wird, wobei die Moleküle so ausgewählt werden, daß sie mit dem Material der Faserspitze und dem fluoreszenzfähigen Makromolekül eine Bindung eingehen können; daß die beschichtete Faserspitze in das das fluoreszenz- fähige Makromolekül enthaltende Fluid eingetaucht wird, wobei der Bereich der Faserspitze mit Licht der Anregungswellenlänge des fluoreszenzfähigen Makromoleküls bestrahlt wird; daß das Fluoreszenzlicht aus der Umgebung der Faser- spitze detektiert wird; und daß die Faserspitze aus dem Fluid entfernt wird, sobald das detektierte Fluoreszenzlicht eine vorgegeben Intensität überschreitet .
Dadurch, daß eine Faser mit einer äußerst kleinen Spitze verwendet wird, und auch nur ein Bereich dieser Spitze mit Molekülen beschichtet wird, die eine Bindung zwischen der Faserspitze und dem fluoreszenzfähigen Makromolekül herstellen können, besteht nur eine sehr kleine Oberfläche, an die das fluoreszenzfähige Makromolekül anbinden kann. Da- durch, daß die Oberfläche so klein ist, wird die Wahrscheinlichkeit wesentlich erhöht, daß nur ein einziges Molekül an die Faserspitze bindet.
Außerdem wird eine online-Überwachung der Bindung eines fluoreszenzfähigen Makromoleküls an die Faserspitze er- reicht. Sobald eine vorgegebene Erhöhung der Intensität des detektierten Lichts festgestellt wird, kann mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit von einer Bindung eines fluoreszenzfähigen Makromoleküls an die Faserspitze ausgegangen werden. Die Faserspitze wird anschließend sofort aus dem Fluid entfernt. Bei der Online-Überwachung steht für die Fluoreszenzde- tektion des an die Faserspitze gebundenen fluoreszenzfähigen Makromolekül, das nicht mehr diffundieren kann, eine verhältnismäßig lange Zeit zur Verfügung. Deshalb kann die Anregungsintensität entsprechend klein gewählt werden. Dadurch wiederum sinkt die Wahrscheinlichkeit einer photochemischen Zerstörung der Fluoreszenzfähigkeit des Makromoleküls.
Wird die Konzentration der fluoreszenzfähigen Makromoleküle im Fluid derart gewählt, daß es nur in größeren zeitlichen Abständen zu einer Bindung an die Faserspitze kommt, so ist die Wahrscheinlichkeit, daß zwei fluoreszenzfähige Makromoleküle gleichzeitig an die Faserspitze binden, sehr klein. Demzufolge ist wenn das Fluoreszenzlicht eine vorgegebene Intensität überschreitet, die Wahrscheinlichkeit sehr groß, daß nur ein einziges fluoreszenzfähiges Makromolekül an die Faserspitze gebunden hat. Das an eine Faserspitze gebundene fluoreszenzfähige Makromolekül kann mit Hilfe der Faserspitze aus dem Fluid entfernt und zu beliebigen anderen Apparaturen transportiert werden.
Das angegebene Verfahren zum Extrahieren eines einzelnen fluoreszenzfähigen Makromoleküls aus einem Fluid ist dabei nicht auf DNA-Moleküle beschränkt. Es kann ganz allgemein für beliebige fluoreszenzfähige Makromoleküle eingesetzt werden, sofern eine Bindung zwischen den Makromolekülen und der Faserspitze vermittelt werden kann. Auch kann das Ver- fahren sowohl in Gasen als auch in Flüssigkeiten eingesetzt werden .
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird die Beschichtung der Faserspitze mit Molekülen dadurch erreicht, daß die Oberfläche der Faserspitze mit Photobiotin- Molekülen beschichtet wird; daß ein räumlich eingegrenzter Bereich der Oberfläche der Faserspitze mit Licht im Wellenlängenbereich von ca. 300 bis 360 nm derart belichtet wird, daß die Photobiotin-Moleküle im belichteten Bereich an die Faserspitze gebunden werden; daß die nicht gebundenen Pho- tobiotin-Moleküle danach von der Faserspitze abgewaschen werden; und daß die Faserspitze danach mit einer Avidin oder Streptavidin enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird.
Ist Biotin am fluoreszenzfähigen Makromolekül gebunden, so bietet sich aufgrund der starken Bindung zwischen Biotin und Avidin oder Streptavidin eine Beschichtung der Faserspitze mit diesen Molekülen an. Dieses Verfahren stellt eine besonders elegante Möglichkeit dar, eine Beschichtung mit Avidin oder Streptavidin in einem möglichst kleinen Bereich der Faserspitze zu erreichen. Die Beschichtung der Faser- spitze kann durch den Einsatz von fokussiertem Licht in einem flächenmäßig auf Bruchteile eines μm2 beschränkten Bereich erreicht werden. Eine aus Glas oder PMMA gefertigte Faserspitze wird für die Beschichtung mit Photobiotin in bekannter Weise vorbehandelt. Bei einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird ein farbstoff-markiertes doppelsträngiges DNA-Molekül aus einer wäßrigen Lösung extrahiert, wobei der wäßrigen Lösung Interkalationsfarbstoff-Moleküle zugesetzt werden, deren Anregungswellenlänge in einem anderem Wellenlängenbereich als die Anregungswellenlänge der Farbstoff-Moleküle liegt. Licht der Anregungswellenlänge der Interkalationsf rbstoff- Moleküle wird in die Faser eingekoppelt und zur Faserspitze derart geleitet, daß es eine geringe Eindringtiefe in die wäßrige Lösung hat. Die Interkalationsfarbstoff-Moleküle werden durch das eingekoppelte Licht zur Fluoreszenz angeregt. Das Fluoreszenzlicht aus der Umgebung der Faserspitze wird detektiert. Die Faserspitze wird aus dem Fluid entfernt, sobald das detektierte Fluoreszenzlicht eine vorgegebene Intensität überschreitet. Es werden somit nicht mehr die an das doppelsträngige
DNA-Molekül gekoppelten Farbstoff-Moleküle angeregt, sondern die Interkalationsfarbstoff-Moleküle. Die an die DNA gekoppelten Farbstoff-Moleküle werden somit geschont. Sie sind entscheidend für ein späteres Detektieren und Identifizieren der einzelnen Nukleotide des DNA-Moleküls. Ein weiterer entscheidender Aspekt für ein Gelingen einer Einzelstrang-DNA-Sequenzierung besteht darin, daß möglichst kein markiertes und abgespaltenes Nukleotid undetek- tiert bleibt. Erfindungsgemäß wird dazu ein Verfahren zum Detektieren eines einzelnen fluoreszenzfähigen Moleküls in einem Fluid angegeben, bei dem ein Fluid durch eine Mikrokapillare geleitet wird, die an einem Ende eine Austrittsöffnung mit einem Innendurch- messer zwischen ca. 300 und 700 nm und einer Wandstärke kleiner als ein Viertel der Anregungswellenlänge des fluoreszenzfähigen Moleküls hat, wobei das fluoreszenzfähige Molekül an der Austrittsöffnung austritt; ein Lichtstrahl der Anregungswellenlänge des fluores- zenzfähigen Moleküls auf einen Bereich unmittelbar an der Austrittsöffnung der Mikrokapillare fokussiert wird; das Fluoreszenzlicht mit hoher Sammeleffizienz detek- tiert wird; und der Durchtritt des Moleküls durch den Fokus angenommen wird, sobald das detektierte Fluoreszenzlicht eine vorgegeben Intensität überschreitet.
Das abgespaltene, die Kapillare durch die Austrittsöffnung verlassende Nukleotid erzeugt ein Fluoreszenzlicht, wenn es in den Lichtstrahl kurz vor, an oder kurz hinter der Austrittsöffnung gelangt.
Das angegebene Verfahren zum Detektieren eines einzelnen fluoreszenzfähigen Moleküls ist keineswegs auf DNA-Moleküle beschränkt, sondern auf beliebige fluoreszenzfähige Moleküle anwendbar, z.B. auf fluoreszierende oder fluoreszenzmarkier- te Proteine bzw. Aminosäuren. Dadurch, daß die relativ kleine Austrittsöffnung der ausgezogenen Mikrokapillare vollständig mit Licht bestrahlt wird, kann kein Molekül am Fokus der Lichtquelle vorbeifließen oder -diffundieren.
Ganz entscheidend für eine Verbesserung des Signal - Rausch-Verhältnisses ist es, daß die Wandstärke der ausgezogenen Mikrokapillare im beobachteten Bereich kleiner als ein Viertel der Wellenlänge, vorzugsweise kleiner als ein Achtel der Wellenlänge des zur Anregung verwendeten Lichts ist . Dadurch kommt es zu einer stark abgeschwächten Reflexion des Anregungslichts . Dies wiederum führt zu einer deutlichen Verringerung des störenden Hintergrundsignals bei der Einzelmolekül-Detektion .
Eine weitere Abschwächung der Reflexion läßt sich dadurch erzielen, daß der Brechungsindex des die Kapillarspitze ausfüllenden und des umgebenden Lösungsmittels mit dem des Glasmaterials abgeglichen wird.
Geladene fluoreszenzfähige Moleküle, z.B. markierte DNA- Moleküle, Nucleotide, Aminosäuren, Peptide, Proteine etc., können vor Verlassen der Mikrokapillare noch elektrophore- tisch getrennt werden. Dazu wird die Mikrokapillare in eine Lösung getaucht, die elektrisch mit einer Elektrode gekoppelt ist . Innerhalb der Mikrokapillare wird durch die Lösung ein elektrischer Strompfad zu einer Gegenelektrode gebildet. Zwischen der Elektrode und der Gegenelektrode wird eine elektrische Spannungsdifferenz derart eingestellt, daß sich die geladenen, fluoreszenzfähigen Moleküle durch das Ende aus der Mikrokapillare herausbewegen.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird ferner durch ein Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA- Moleküls gelöst, bei dem (a) eine Vielzahl von im wesentlichen identischen DNA- Molekülen in einer Lösung synthetisiert werden, bei denen an wenigstens einen Teil der Nukleotide Farbstoff-Moleküle gekoppelt sind (markierte Nukleotide) ;
(b) eines der synthetisierten DNA-Moleküle durch Binden an eine Faserspitze mit einem Durchmesser von höchstens wenigen Mikrometern aus der Lösung extrahiert wird;
(cl) die Faserspitze in eine Mikrokapillare eingeführt wird, die an einem Ende einen Innendurchmesser zwischen ca. 300 und 700 nm hat; (c2) die Mikrokapillare mit einer Lösung befüllt wird, die ein sukzessives Abspalten einzelner Nukleotide des DNA- Moleküls bewirkt; und
(d) danach die einzelnen abgespaltenen und markierten Nukleotide am Ende der Mikrokapillare detektiert und identifiziert werden.
Die Bindung des DNA-Moleküls an eine Faserspitze ermöglicht dessen einfaches Extrahieren aus der Lösung. So kann das gebundene DNA-Molekül an der Faserspitze in eine Mikro- kapillare eingeführt werden. Diese ist so ausgebildet, daß sie ein Detektieren und Identifizieren der markierten Mononukleotide ermöglicht.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in Unteransprüchen gekennzeichnet. Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungs- beispielen näher erläutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche Elemente. Im einzelnen zeigt: Fig. 1A eine perspektivische Ansicht einer Faserspitze; Fig. 1B eine Schnittansicht einer Faserspitze;
Fig. 2A eine schematische Darstellung einer mit Avidin beschichteten Faserspitze; Fig. 2B eine schematische Darstellung der Bindung von biotinylierter und farbstoff-markierter DNA an die beschichtete Faserspitze gemäß Fig. 2A;
Fig. 3 eine Schnittansicht einer Anordnung einer Faserspitze mit einem daran gebundenen DNA-Molekül in einer ausgezogenen Mikrokapillare; und Fig. 4 eine schematische Darstellung der erfindungsge- mäßen Anordnung .
Herstellung gefärbter DNA-Molekülkopien
Will man die Basenfolge oder Nukleotid-Folge eines DNA- Moleküls an einem DNA-Einzelstrang entschlüsseln (Sequenzieren) , so muß zunächst von dem zu sequenzierenden DNA-Strang eine mit Farbstoff-Molekülen gefärbte komplementäre Kopie (Gegenstrang) synthetisiert werden.
Dies wird dadurch erreicht, daß an das 3 ' -Ende des zu sequenzierenden DNA-Moleküls (Template) eine kurze komple- mentäre DNA-Sequenz, der sog. Primer, anhybridisiert wird. An das 5 ' -Ende des Primers ist D-Biotin gekoppelt. Der Lösung, in der die Reaktion zum Aufbauen eines komplementären Strangs ausgeführt wird, werden Nukleosid-Triphosphate zugesetzt. An diese Mononukleotide sind Farbstoff-Moleküle ge- koppelt.
Bis heute ist es nicht möglich, einen Gegenstrang zu synthetisieren, bei dem sämtliche Nukleotide gefärbt sind. Eine Synthese läßt sich bisher nur mit jeweils zwei gefärbten der vier Basen realisieren. Es werden somit nur für zwei der vier Basen der DNA gefärbte Nukleosid-Triphosphate der Lösung zugegeben. Für die beiden übrigen Basen werden nicht- gefärbte Nukleosid-Triphosphate der Lösung zugesetzt. Die eigentliche Kopie des Templates wird dann mit Hilfe einer Polymerase erstellt.
Extrahieren eines einzelnen DNA-Moleküls In der Regel wird das Template in relativ großer Zahl vorliegen, beispielsweise in mikromolarer Konzentration in Lösung. Entsprechend werden viele gefärbte Kopien des Tem- plates erstellt. Für eine Einzelstrang-Sequenzierung muß im nächsten Schritt ein einzelnes gefärbtes DNA-Molekül aus der Lösung extrahiert werden.
Dazu wird eine Faser aus Glas oder PMMA verwendet, deren Spitze einen Durchmesser von weniger als 1 μm hat. Eine sol- ehe Faserspitze ist schematisch in Fig. 1 dargestellt. Ziel ist es, möglichst nur einen einzigen gefärbten DNA-Strang an die Faserspitze zu binden, wobei am 5 ' -Ende der gefärbten DNA-Stränge Biotin gebunden ist. Daher wäre es wünschenswert, auf einer möglichst kleinen Fläche der sehr kleinen Faserspitze Avidin oder Streptavidin zu binden, die Biotin an sich binden können und damit ein Anbinden des DNA-Strangs an die Faser ermöglichen.
Um die Faser derart vorzubereiten, wird zunächst die Glas- oder PMMA-Faser in bekannter Weise für die Bindung von Photobiotin vorbereitet. Anschließend wird die Faser in eine Photobiotin enthaltende Lösung getaucht. Nach dem Herausziehen wird die Faser mit Licht von 300 bis 360 nm Wellenlänge aus einem auf einen möglichst kleinen Bereich der Faserspitze fokussierten Laserstrahl bestrahlt. Alternativ zuur Fokussierung eines Lichtstrahls auf die Spitze kann als Faserspitze eine SNOM-Spitze verwendet werden (SNOM = Scanning Nearfield Optical Microscopy) . In diese wird von dem der Spitze abgewandten Ende Licht mit einer Wellenlänge zwischen 300 und 360 nm eingekoppelt. Es tritt ausschließlich an der Faserspitze aus. Nur dort wird dann das Photobiotin belichtet.
Durch Belichtung des Photobiotins mit Licht der angegebenen Wellenlängen wird eine Bindung zwischen dem Photobiotin und der in bekannter Weise vorbereiteten Oberfläche der Glas- oder PMMA-Faser hergestellt. Nach der Belichtung wird das nicht -gebundene Photobiotin von der Faser in einem Waschschritt entfernt .
Die Faserspitze wird dann in eine Avidin oder Streptavidin enthaltende Lösung getaucht. Avidin bzw. Streptavidin hat vier Bindungsstellen für Biotin. Es bindet somit an das auf der Faser immobilisierte Biotin. Seine anderen drei Bindungsstellen bleiben frei und können an das an den DNA- Strängen gekoppelte Biotin binden. Fig. 2A zeigt schematisch die mit Avidin-Molekülen 2 besetzte Faserspitze 1. Im Ergebnis erhält man somit eine Faserspitze, an der in einem sehr kleinen Bereich von wenigen 100 nm Durchmesser Avidin bzw. Streptavidin gebunden ist.
Im nächsten Schritt wird die so vorbereitete Faser 1 in die Lösung 3 getaucht, in der die biotinylierten und gefärb- ten DNA-Stränge 4 enthalten sind, wie es in Fig. 2B gezeigt ist. Ziel ist es, die Anbindung eines einzelnen bzw. des 1
, ß ß
XI ε φ =ör 3 rö -H
Φ rö T! ß υ ß φ SH ß =3 X < Φ rö Φ
Φ • ß fr ß φ a SH Φ 3 CQ a < Φ Φ X ß φ
3 ε 0 3 ß SH 0 a a Öl fr Xi Di Xl ß J ß Ti =0 TJ Φ ß ß p ü Φ SH υ O
.
l
Figure imgf000013_0001
4J
SH SH , N ß Φ , Φ ß CQ Di 0
Φ •H Φ Φ rö rH φ 4 Φ ß -H ß X! rH ß Φ ß £ 4-> X!
SH CQ
N a ß ß CQ Φ a. Φ 4J 4-J ω N ß ß
H CQ pq H υ Φ c- SH • Φ
0 Dl 4-1
3 ß rH rH 3 Φ fr Di a
=3 a ß 4H 0 φ SH X
T! Φ Φ ß > Dl φ ß
X! SH -H
Φ 3 Φ
Dl N
CQ SH
3 4J Φ rö -H CQ φ rö ß 1X1 fr
Φ ß φ Φ
X! SH -H
-H Φ TS
Dl ß ß ß o =rö -H
> rH
Φ
SH > -H
Φ -H Ti
TS 4J rö ß ß rH ß
0 φ rö
-H SH X
4J
X Φ φ ß Φ
4-) -H Dl
Φ Φ ß
P -H
Di SH φ ß Φ
-H 3 Dl
Ti rH
XI Ti
. rö ß
O X SH Φ
> X!
TJ CJ
Figure imgf000014_0001
ε Φ SH 3 ß Φ
3 4H Φ rö 4J Φ ß ß -H ß
© • Φ SH 4H TJ i < X xi -H -H Φ Ti 3 o rö ß Dl CQ Φ 0
00 υ
Os c -H φ
H X υ 0. •
X
•
Ti
CQ
SH
Φ
CQ rö
H ß
Φ
T!
0
-H
P
CQ ro ι 'Ö φ
Di ß
=rö rH ß
Φ rH rH
Φ
£
SH
Φ
TJ
-H
Φ
X!
IΛ ß
*- Φ
Di as φ
O Di rö
TJ
Figure imgf000015_0001
ß Φ ε φ 4-)
\© Φ l ß =0 φ ß 1 rö ß -H CQ S SH Φ rH
© 1 Di ß rö 0 1 rH öi Φ ß MD W -H Φ -H Φ 4-1 3 SH
Φ
P
4J
SH
Φ
-H
CQ
CQ
3
X
0
4H xi υ
-H φ
SH φ
CQ ß
Φ
CQ φ
-H
TJ
4H
3 rö
4-)
CQ
-H
C0
CQ
SH
Φ
CQ rö r-i ß
Φ
T!
0
-H
P ß φ
4-1
CQ
Figure imgf000016_0001
Φ Φ CQ φ N _. ß φ 4-J 4H -H 0 CQ -H rö -H -H SH ß ß 4-J Φ .
© SH ε
IΛ) Dl 4H CQ 3 rö fr Φ TJ ß Φ Ti 3 ß φ φ rö X! ß ß
© Φ =rö =0 ε rö fr SH SH -H X! X Φ SH rH TJ xi SH xi Φ rH Φ
00 ß SH CQ rö SH σs ß χι 4J CQ Φ α, -H Φ 4J -P W -H
X -H X 4J
H SH H υ X U Φ Φ 4-) •H Φ
EL, P TJ CQ P 4-) ß 3 φ
• PQ φ TJ ε -H
3. ß SH P 3
Φ Φ N
H ß TJ
Φ 4J Φ
CQ Di X rH TJ rH 0 υ X -H rö N -H rö -P
Φ Φ SH 0
SH Di SH 4-) Φ
Φ CQ Φ CQ r-i
Di 3 CQ φ X
-H rö Xi 3 ß Φ ß
Φ ε -P SH 0
5 rö ε Φ ß cö CQ 0 m CQ φ CQ rö £ rö SH Φ P
5 rö Di ß
4-1 rH ε Φ
Φ rH SH 0 ß
-H Φ > Φ
4J a TJ 4-J
Öl rö Φ rH
=rö X Ti SH rö
0 SH rö a
4-) SH -H rH CQ φ X 5 rH φ
X! -H -H Öl
£ 4-) a X!
H -H rö rö
Φ SH ε X
CQ φ 0 0 T!
CQ TJ co SH ß
Φ X 3 ε SH . -H
XI Φ ε £ ß ro υ Q ß Φ
SH CQ SH 4J m
V) 3 φ o Φ SH
TJ ε o TJ Φ
CQ ,ß in -H
3 υ Dl X
X SH . ß SH
0 3 rö 3 rö fr P J ß ε
Figure imgf000017_0001
__, ε Φ ß rö Φ
H xi S
© P Φ P ß ß S rH υ ß Φ P -H -H 4H Φ φ ß
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000018_0003
Figure imgf000018_0001

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Extrahieren eines einzelnen fluoreszenzfähigen Makromoleküls aus einem Fluid, dadurch gekennzeichnet, daß ein einen Durchmesser von höchstens wenigen Mikrometern aufweisender Bereich einer Spitze einer Faser mit Molekülen beschichtet wird, wobei die Moleküle so ausgewählt werden, daß sie mit dem Material der Faserspitze und dem fluoreszenzfähigen Makromolekül eine Bindung eingehen können; daß die beschichtete Faserspitze in das das fluoreszenzfähige Makromolekül enthaltende Fluid eingetaucht wird, wobei der Bereich der Faserspitze mit Licht der Anregungswel - lenlänge des fluoreszenzfähigen Makromoleküls bestrahlt wird; daß das Fluoreszenzlicht aus der Umgebung der Faserspitze detektiert wird; und daß die Faserspitze aus dem Fluid entfernt wird, sobald das detektierte Fluoreszenzlicht eine vorgegeben Intensität überschreitet .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Bereich der Faserspitze mit Licht der Anregungswel - lenlänge des fluoreszenzfähigen Makromoleküls bestrahlt wird, indem das Licht in die Faser eingekoppelt und zur Faserspitze derart geleitet wird, daß es eine geringe Eindringtiefe in das Fluid hat.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Licht derart zur Faserspitze geleitet wird, daß an dem Bereich ein evaneszentes Feld erzeugt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Bereich der Faserspitze mit Licht der Anregungswel- lenlänge des fluoreszenzfähigen Makromoleküls bestrahlt wird, indem die Faserpitze in den Fokusbereich eines Fluoreszenzmikroskops gebracht und mittels Fluoreszenzmikroskopie überprüft wird, ob ein fluoreszenzfähiges Makromolekül an die Faserspitze gebunden ist .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Faser aus PMMA oder Glas verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Faser mit einem Durchmesser der Spitze von weniger als 1 μm verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Faserspitze eine für die Nahfeldmikroskopie geeignete Faserspitze verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung der Faserspitze mit Molekülen auf einer Fläche von maximal einigen μm durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Eintauchen der Faserspitze Biotin an das fluoreszenzfähige Makromolekül gekoppelt wird; und daß als Moleküle für die Beschichtung der Faserspitze Avidin oder Streptavidin verwendet werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß der Bereich der Faserspitze mit Avidin oder Streptavidin beschichtet wird, indem die Oberfläche der Faserspitze mit Photobiotin-Molekülen beschichtet wird; daß der Bereich der Oberfläche der Faserspitze mit Licht im Wellenlängenbereich von ca. 300 bis 360 nm derart belichtet wird, daß die Photobiotin-Moleküle im belichteten Bereich an die Faserspitze gebunden werden; daß die nicht gebundenen Photobiotin-Moleküle danach von der Faserspitze abgewaschen werden; und daß die Faserspitze in eine Avidin oder Streptavidin enthaltende Lösung getaucht wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Licht zur Belichtung des Bereichs der Oberfläche in die Faser eingekoppelt und durch die Faser zur Faserspitze geleitet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Bereich der Oberfläche der Faserspitze mit einem von außen auf die Faserspitze fokussierten Lichtstrahl belichtet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als fluoreszenzfähiges Makromolekül ein DNA- oder RNA-Molekül verwendet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß Biotin an das 5 ' -Ende des DNA- oder RNA-Moleküls gekoppelt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Eintauchen der Faserspitze am 3 ' -Ende des DNA- oder RNA-Moleküls ein zusätzliches Marker-Molekül angekoppelt wird, dessen Anregungswellenlänge in einem anderem Wellenlängenbereich als die Anregungswellenlänge eines die Nukleotide der DNA- oder RNA-Moleküle markierenden Farb- Stoffs liegt; daß Licht der Anregungswellenlänge des Marker-Moleküls in die Faser eingekoppelt und zur Faserspitze geleitet wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als Marker-Molekül B-Phycoerythrin oder ein mit Farbstoff-Molekülen angefärbtes Mikrokügelchen verwendet werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzlicht aus der Umgebung der Faserspitze dadurch detektiert wird, daß von dem fluoreszenzfähigen Molekül emittiertes Fluoreszenzlicht von der Faserspitze aus durch die Faser geleitet und an einem der Faserspitze entgegengesetzten Faserende detektiert wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzlicht aus der Umgebung der Faserspitze dadurch detektiert wird, daß ein Fluoreszenzmikroskop auf die in das Fluid eingetauchte Faserspitze fokussiert wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei ein farbstoff-markiertes doppelsträngiges DNA-Molekül aus einer wäßrigen Lösung extrahiert wird; dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Eintauchen der Faserspitze der wäßrigen Lösung Interkalationsfarbstoff-Moleküle zugesetzt werden, deren Anregungswellenlänge in einem anderem Wellenlängenbereich als die Anregungswellenlänge des das DNA-Molekül markierenden Farbstoffs liegt; daß Licht der Anregungswellenlänge der Interkalations- farbstoff -Moleküle in die Faser eingekoppelt und zur Faserspitze geleitet wird; und daß nach dem Eintauchen das Licht in der Faser derart geleitet wird, daß es eine geringe Eindringtiefe in die wäß- rige Lösung hat.
20. Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA-Moleküls, wobei
(a) eine Vielzahl von im wesentlichen identischen DNA- Molekülen in einer Lösung synthetisiert werden, bei denen an wenigstens einen Teil der Nukleotide Farbstoff-Moleküle gekoppelt sind (markierte Nukleotide) ;
(b) eines der synthetisierten DNA-Moleküle durch Binden an eine Faserspitze gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 extrahiert wird; (c) die Nukleotide des extrahierten DNA-Moleküls in einer Detektionsapparatur sukzessive einzeln abgespalten werden; und wobei
(d) die einzeln abgespaltenen Nukleotide in der Detektionsapparatur detektiert und identifiziert werden.
21. Verfahren zum Detektieren eines einzelnen fluoreszenzfähigen Moleküls in einem Fluid, wobei das Fluid durch eine Mikrokapillare geleitet wird, die an einem Ende eine Austrittsöffnung mit einem Innendurchmes- ser zwischen ca. 300 und 700 nm und einer Wandstärke kleiner als ein Viertel der Anregungswellenlänge des fluoreszenzfähigen Moleküls hat, wobei das fluoreszenzfähige Molekül an der Austrittsöffnung austritt; ein Lichtstrahl der Anregungswellenlänge des fluores- zenzfähigen Moleküls auf einen Bereich unmittelbar an der Austrittsöffnung der Mikrokapillare fokussiert wird; das Fluoreszenzlicht mit hoher Sammeleffizienz detektiert wird; und wobei der Durchtritt des Moleküls durch den Fokus angenommen wird, sobald das detektierte Fluoreszenzlicht eine vorgegeben Intensität überschreitet.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtstrahl derart an der Austrittsöffnung fokus- siert wird, daß der gesamte Querschnitt der Mikrokapillare bestrahlt wird.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei ein Molekül mit einer Anregungswellenlänge im roten Spektralbereich detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtstrahl von einem Diodenlaser im roten Spektralbereich erzeugt wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtstrahl von einem gepulsten Laser erzeugt wird, und daß das Fluoreszenzlicht zeitaufgelöst detektiert wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei im Fluid elektrisch geladene, fluoreszenzfähige Moleküle de- tektiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapillare in eine Lösung getaucht wird, die elektrisch mit einer Elektrode gekoppelt ist; daß innerhalb der Mikrokapillare durch die Lösung ein elektrischer Strompfad zu einer Gegenelektrode gebildet wird; und daß zwischen der Elektrode und der Gegenelektrode eine elektrische Spannungsdifferenz derart eingestellt wird, daß sich die geladenen, fluoreszenzfähigen Moleküle durch das Ende aus der Mikrokapillare heraus bewegen.
26. Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA-Moleküls, wobei
(a) eine Vielzahl von im wesentlichen identischen DNA- Molekülen in einer Lösung synthetisiert werden, bei denen an wenigstens einen Teil der Nukleotide Farbstoff -Moleküle gekoppelt sind (markierte Nukleotide) ;
(b) eines der synthetisierten DNA-Moleküle durch Binden an eine Faserspitze mit einem Durchmesser von höchstens wenigen Mikrometern aus der Lösung extrahiert wird; (cl) die Faserspitze in eine Mikrokapillare eingeführt wird, die an einem Ende einen Innendurchmesser zwischen ca. 300 und 700 nm hat;
(c2) die Mikrokapillare mit einer Lösung befüllt wird, die ein sukzessives Abspalten einzelner Nukleotide des DNA- Moleküls bewirkt; und wobei
(d) danach die einzelnen abgespaltenen und markierten Nukleotide am Ende der Mikrokapillare detektiert und identifiziert werden.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (b) das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 20 extrahiert wird.
28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Faserspitze in Schritt (cl) wenige Mikrometer vor dem Austrittsende in der Mikrokapillare positioniert wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen markierten Nukleotide nach einem der Ansprüche 21 bis 24 detektiert werden.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 29, da- durch gekennzeichnet, daß unterschiedliche Arten von Nukleotiden jeweils mit Farbstoffen mit unterschiedlichen Fluoreszenzlebensdauern markiert werden; daß in Schritt (d) die markierten Nukleotide mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie detektiert und anhand der Fluoreszenzlebensdauer der an sie gekoppelten Farbstoffe identifiziert werden.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, da- durch gekennzeichnet daß vor Schritt (d) die Schritte nach
Anspruch 25 durchgeführt werden.
32. Anordnung zum Durchführen des Verfahrens nach Anspruch 21, mit einer Lichtquelle einer vorgegebenen Wellenlänge; einer Mikrokapillare mit einer Austrittsöffnung mit einem Innendurchmesser zwischen ca. 300 und 700 nm und mit einer Wandstärke kleiner als ein Viertel der vorgegebenen Wellenlänge, wobei die Lichtquelle so auf das Ende der Mikrokapillare ausgerichtet ist, daß ihr Licht auf einen im Bereich der Austrittsöffnung gebildeten Probenraum fokus- siert ist, der den gesamten Querschnitt der Austrittsöffnung umfaßt ; und einer auf den Probenraum gerichteten Einrichtung zum Detektieren von einzelnen Photonen aus dem Probenraum.
33. Anordnung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle ein gepulster Diodenlaser ist; und daß die Einrichtung zum Detektieren einen Detektor zum zeitaufgelösten Erfassen von einzelnen Photonen enthält .
34. Anordnung nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle Licht im roten Spektralbereich emittiert .
PCT/EP1998/005061 1997-09-25 1998-08-10 Verfahren zum sequenzieren eines einzelnen dna-moleküls WO1999015543A2 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98946308A EP1017708A2 (de) 1997-09-25 1998-08-10 Verfahren zum sequenzieren eines einzelnen dna-moleküls
US09/509,579 US6225068B1 (en) 1997-09-25 1998-08-10 Process for sequencing an individual DNA molecule

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19742227.6 1997-09-25
DE19742227A DE19742227A1 (de) 1997-09-25 1997-09-25 Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA-Moleküls

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO1999015543A2 true WO1999015543A2 (de) 1999-04-01
WO1999015543A3 WO1999015543A3 (de) 1999-05-20

Family

ID=7843525

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1998/005061 WO1999015543A2 (de) 1997-09-25 1998-08-10 Verfahren zum sequenzieren eines einzelnen dna-moleküls

Country Status (4)

Country Link
US (1) US6225068B1 (de)
EP (1) EP1017708A2 (de)
DE (1) DE19742227A1 (de)
WO (1) WO1999015543A2 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6365349B1 (en) 1997-07-22 2002-04-02 Qiagen Genomics, Inc. Apparatus and methods for arraying solution onto a solid support

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9814604A (pt) * 1997-12-31 2000-10-17 Qiagen Genomics Inc "ponteiras em fase sólida e seus usos"
US6767731B2 (en) * 2001-08-27 2004-07-27 Intel Corporation Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing
US6982165B2 (en) * 2001-09-24 2006-01-03 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of molecular deconstruction
US7238477B2 (en) * 2001-09-24 2007-07-03 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by Raman scattering
US6972173B2 (en) * 2002-03-14 2005-12-06 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by raman scattering
US6852492B2 (en) * 2001-09-24 2005-02-08 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of uptake of precursors during molecular replication
DE10162536A1 (de) * 2001-12-19 2003-07-17 Gnothis Holding Sa Ecublens Evaneszenz-basierendes Multiplex-Sequenzierungsverfahren
US20040110208A1 (en) * 2002-03-26 2004-06-10 Selena Chan Methods and device for DNA sequencing using surface enhanced Raman scattering (SERS)
US7476501B2 (en) 2002-03-26 2009-01-13 Intel Corporation Methods and device for DNA sequencing using surface enhanced raman scattering (SERS)
CN1682237B (zh) * 2002-09-20 2010-05-26 英特尔公司 用于通过使用编码探针检测生物分子的方法和仪器
US7361821B2 (en) * 2002-09-20 2008-04-22 Intel Corporation Controlled alignment of nanobarcodes encoding specific information for scanning probe microscopy (SPM) reading
US7606403B2 (en) * 2002-10-17 2009-10-20 Intel Corporation Model-based fusion of scanning probe microscopic images for detection and identification of molecular structures
US20050147976A1 (en) * 2003-12-29 2005-07-07 Xing Su Methods for determining nucleotide sequence information
US20050147979A1 (en) * 2003-12-30 2005-07-07 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by Raman monitoring of uptake of nucleotides during molecular replication
US20050147980A1 (en) * 2003-12-30 2005-07-07 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by Raman monitoring of uptake of nucleotides during molecular replication
EP1607737A1 (de) * 2004-06-17 2005-12-21 Patrick Hunziker Gerät und Methode zur Detektion und Messung von Nukleinsäuresträngen in Lösung
US20060057585A1 (en) * 2004-09-10 2006-03-16 Mcallister William H Nanostepper/sensor systems and methods of use thereof
US7736818B2 (en) 2004-12-27 2010-06-15 Inphase Technologies, Inc. Holographic recording medium and method of making it
DE102011008788B3 (de) * 2011-01-14 2012-05-03 Institut Für Photonische Technologien E.V. Anordnung zur Durchführung einer Einzelprobenanalyse und -manipulation für die Raman-Mikrospektroskopie
JP6886965B2 (ja) * 2015-08-11 2021-06-16 ステム アーツ プロジェクツ， エルエルシー 携帯型核酸抽出器具及びその使用方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0103426A2 (de) * 1982-08-23 1984-03-21 Block, Myron J. Vorrichtung und Verfahren für Immunbestimmungen
DE3807975A1 (de) * 1988-03-10 1989-09-28 Greulich Karl Otto Verfahren zur optischen charakterisierung von nukleinsaeuren und oligonukleotiden
EP0563998A1 (de) * 1992-04-02 1993-10-06 Markus Sauer Verfahren zur Erfassung von Biomolekülen, toxischen Substanzen, Polymeren und pharmazeutischen Wirkstoffen mittels zeitaufgelöster Laserspektroskopie
DE4307042A1 (de) * 1993-03-05 1994-09-08 S & L Ges Fuer Wissenschaftlic Verfahren zum optischen qualitativen und quantitativen Nachweis von Molekülen, Biomolekülen und Mikroorganismen
US5401469A (en) * 1989-04-19 1995-03-28 Ibiden Co., Ltd. Plastic optical biomaterials assay device
US5494798A (en) * 1993-12-09 1996-02-27 Gerdt; David W. Fiber optic evanscent wave sensor for immunoassay

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4844869A (en) * 1985-09-09 1989-07-04 Ord, Inc. Immunoassay apparatus
US4745285A (en) * 1986-08-21 1988-05-17 Becton Dickinson And Company Multi-color fluorescence analysis with single wavelength excitation
JPH07104349B2 (ja) * 1987-04-11 1995-11-13 株式会社日立製作所 細胞測定法
US5079169A (en) * 1990-05-22 1992-01-07 The Regents Of The Stanford Leland Junior University Method for optically manipulating polymer filaments
JP3123249B2 (ja) * 1991-09-10 2001-01-09 株式会社日立製作所 Ｄｎａ分子の長さ計測方法および計測装置
US5501225A (en) * 1991-09-20 1996-03-26 Wilson; David F. Imaging of tissue oxygen using needle phosphorimeter
WO1993021530A1 (de) * 1992-04-10 1993-10-28 Messerschmitt-Bölkow-Blohm Gmbh Verfahren und vorrichtung zur empfindlichkeits- und selektivitätssteigerung bei immuno-assays, molekül-rezeptor-, dna-komplementär-dna- und gast-wirtsmolekül-wechselwirkungs-assays
DE4233686A1 (de) * 1992-10-02 1994-04-07 Ism Ingenieurbuero Fuer Spezia Verfahren zur selektiven optischen Darstellung bzw. Markierung vorbestimmter Atome, Moleküle oder Molekülgruppen
JP2575270B2 (ja) * 1992-11-10 1997-01-22 浜松ホトニクス株式会社 核酸の塩基配列決定方法、単一分子検出方法、その装置及び試料の作成方法
DE19508366C2 (de) * 1995-03-10 1998-01-29 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum direkten Nachweisen weniger Nucleinsäurestränge
AT403961B (de) * 1995-03-17 1998-07-27 Avl Verbrennungskraft Messtech Optochemisches messsystem mit einem fluoreszenzsensor
DE19619790C2 (de) * 1996-05-15 1998-10-29 Lwg Lausitzer Wasser Gmbh & Co Verfahren zur beschleunigten Anreicherung von Analyten während der Festphasenmikroextraktion

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0103426A2 (de) * 1982-08-23 1984-03-21 Block, Myron J. Vorrichtung und Verfahren für Immunbestimmungen
DE3807975A1 (de) * 1988-03-10 1989-09-28 Greulich Karl Otto Verfahren zur optischen charakterisierung von nukleinsaeuren und oligonukleotiden
US5401469A (en) * 1989-04-19 1995-03-28 Ibiden Co., Ltd. Plastic optical biomaterials assay device
EP0563998A1 (de) * 1992-04-02 1993-10-06 Markus Sauer Verfahren zur Erfassung von Biomolekülen, toxischen Substanzen, Polymeren und pharmazeutischen Wirkstoffen mittels zeitaufgelöster Laserspektroskopie
DE4307042A1 (de) * 1993-03-05 1994-09-08 S & L Ges Fuer Wissenschaftlic Verfahren zum optischen qualitativen und quantitativen Nachweis von Molekülen, Biomolekülen und Mikroorganismen
US5494798A (en) * 1993-12-09 1996-02-27 Gerdt; David W. Fiber optic evanscent wave sensor for immunoassay

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M. SAUER ET AL.: "Diode laser based detection of single molecules in solutions." CHEMICAL PHYSICS LETTERS, Bd. 254, 24. Mai 1996, Seiten 223-228, XP002074125 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6365349B1 (en) 1997-07-22 2002-04-02 Qiagen Genomics, Inc. Apparatus and methods for arraying solution onto a solid support

Also Published As

Publication number Publication date
US6225068B1 (en) 2001-05-01
WO1999015543A3 (de) 1999-05-20
EP1017708A2 (de) 2000-07-12
DE19742227A1 (de) 1999-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1999015543A2 (de) Verfahren zum sequenzieren eines einzelnen dna-moleküls
DE69618790T2 (de) Chemisch, biochemisch und biologisch verarbeitung bei dünner schichten
EP0731173B1 (de) Verfahren zum direkten Nachweisen weniger Nukleinsäurestränge
DE4230355A1 (de) Verfahren und geraet zum messen der laenge einer dns
WO1998009154A1 (de) System zur unterscheidung fluoreszierender molekülgruppen durch zeitaufgelöste fluoreszenzmessung
WO2002038806A2 (de) Nachweis von nukleinsäure-polymorphismen
EP1373875A2 (de) Optische struktur zur multi-photonen-anregung und deren verwendung
WO2002097406A1 (de) Verwendung von optischen diffraktionselementen in nachweisverfahren
DE10023423B4 (de) Direkter Nachweis von Einzelmolekülen
EP1458892B1 (de) Evaneszenz-basierendes multiplex-sequenzierungsverfahren
DE102004038359A1 (de) Paralleles Hochdurchsatz-Einzelmolekül-Sequenzierungsverfahren
EP1349649A2 (de) Einzelmolekül-sequenzierungsverfahren
EP1281969A2 (de) Verfahren und Vorrichtung zum Bestimmen von Proteinen auf einem Reaktionsträger
DE10210737A1 (de) Einkanal-Mehrfarben-Korrelationsanalyse
EP1280939B1 (de) Verfahren zum nachweis von polynukleotiden
WO2003021240A1 (de) Einkanal-mehrfarben-korrelationsanalyse
EP1311829B1 (de) Verfahren und vorrichtung zum messen chemischer und/oder biologischer proben
DE19947616C2 (de) Verfahren zur Bestimmung von Substanzen, wie z.B. DNA-Sequenzen, in einer Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
EP1448798A1 (de) Nanostruktur insbesondere zur analyse von einzelmolekülen
WO2003076656A2 (de) Verwendung von abfangsonden beim nachweis von nukleinsäuren
DE69219857T2 (de) Vorrichtung zur optischen Unterscheidung von Basenarten
EP1218727A1 (de) Verfahren und einrichtung zur bestimmung von substanzen, wie z.b. dna-sequenzen, in einer probe
WO2003076655A2 (de) Verfahren zur bestimmung eines nukleinsäureanalyten
DE102007010860A1 (de) Partikel mit zwei oder mehr monodispers eingebetteten Fluorophoren, dazugehöriges Herstellungsverfahren und Identifikationsverfahren solcher Partikel in einer Probe
EP1068360B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur quantifizierung von dna und rna

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): CN JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): CN JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998946308

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09509579

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998946308

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1998946308

Country of ref document: EP