DE4104014A1 - Verfahren zur bestimmung von calciumionenkonzentration in zellen - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von calciumionenkonzentration in zellenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Bestimmung intrazellulärer Ca2+-
Konzentrationen. Calcium nimmt eine zentrale Stellung bei der
biochemischen Signalübertragung auf zellulärer Ebene ein; es
steuert die Aktivierung von Transmittern, Enzymen oder Hormonen
ausgehend von Potentialänderungen oder Rezeptoren in tierischen
und pflanzlichen Zellen. Die Messung von Ca2+-Konzentrationen im
Zellinneren ist deshalb von herausragender Bedeutung in der
experimentellen Zellbiologie und Neurobiologie.
Es sind verschiedene Verfahren zur Bestimmung von intrazellulären
Ca2+-Konzentrationen bekannt, die auf dem Einsatz von Ca2+-
empfindlichen Mikroelektroden, Biolumineszenz von Biopolymeren
und Fluoreszenzindikatoren beruhen.
Die letztgenannte Methode wird wegen ihrer hohen Empfindlichkeit
und ihres Verzichts auf mechanische Eingriffe in den letzten
Jahren in wachsendem Maße breit eingesetzt. Sie beruht auf der
Verwendung von speziellen Sondenfarbstoffen, die eine hohe
Affinität und Selektivität für die Bindung von Ca2+ sowie eine
möglichst effiziente Fluoreszenz mit starker Änderung von
Fluoreszenzparametern bei Ca2+-Anlagerung aufweisen. Die
Fluoreszenzregistrierung wird mit mikroskopischen oder
durchflußzytometrischen Verfahren kombiniert. Dabei ist das
Verfolgen von Aktivierungsprozessen im Echtzeitbetrieb zusammen
mit räumlicher Darstellung ("optical recording") von besonderem
Interesse. Es wurden spezielle Mikroskopphotometer entwickelt,
mit denen für solche Indikatorfarbstoffe, die eine deutliche
spektrale Änderung bei Ca2+-Bindung aufweisen, aus der
Fluoreszenzmessung bei zwei verschiedenen Anregungs- bzw.
Fluoreszenzwellenlängen mittels eines Quotientenverfahrens auf
die Ca2+-Konzentration geschlossen wird (DE 36 04 815; Nature
318 [1985], 558-561).
Der Einsatz der Laserrastermikroskopie ist vor allem im
Zusammenhang mit der Möglichkeit der 3D-Auflösung und
Tiefendiskriminierung attraktiv.
Einige wenige Indikatorfarbstoffe haben sich in der breiten
Anwendung durchgesetzt (J. Biol. Chem., 260 [1985], 3440-3450;
Biochem. J., 248 [1987], 313-328; Trans. in Neurosci., 11 [1988],
419-424). Bei den Farbstoffen "fura-2" und "indo-1" ändert sich
im wesentlichen das Absorptions- bzw. Fluoreszenzspektrum bei
Ca2+-Anlagerung, bei "quin-2" und "fluo-3" die Fluoreszenzquantenausbeute.
Während die übrigen Farbstoffe im UV-Bereich
angeregt werden müssen, bietet "fluo-3" den entscheidenden
Vorzug, im sichtbaren Wellenlängenbereich um 500 nm anregbar zu
sein. Das ist einerseits hinsichtlich der Verfügbarkeit von
Lichtquellen (Argonlaser) sowie optischen Bauelementen günstig.
Andererseits entfällt weitestgehend die bei Anregung im nahen UV-
Bereich störend in Erscheinung tretende Eigenfluoreszenz von
Zellen. Zudem wird der parallele Einsatz von UV-Strahlung, z. B.
zur photostimulierten Ca2+-Freisetzung, möglich.
Die Absolutbestimmung der Ca2+-Konzentration mittels solcher
Farbstoffe, die keine wesentliche Spektrenverschiebung bei Ca2+-
Anlagerung aufweisen, ist jedoch mit einer außerordentlich
komplizierten, zeitaufwendigen und zellschädigenden Eichprozedur
verbunden.
Es ist eine absolute Intensitätsmessung nötig, die durch lokale
oder zeitliche Änderungen
- - der Farbstoffkonzentration,
- - der optischen Weglänge in der Zelle,
- - der Anregungsintensität,
- - der Detektorempfindlichkeit
beeinträchtigt wird. Unter Erhaltung dieser Bedingungen ist für
jedes konkrete Objekt in situ die Bestimmung der
Fluoreszenzintensitäten für praktisch verschwindende und sehr
hohe Ca2+-Konzentration erforderlich. Die von "Mol. Probes Inc."
dafür angegebene Eichprozedur beinhaltet einen z. B. durch
dosierte Zugabe von Ionomycin ausgelösten Ca2+-Einstrom aus dem
umgebenden Medium bis in den Sättigungsbereich; anschließend wird
durch Mn2+-Zugabe die Fluoreszenz gelöscht, um einen Bezug zu dem
Wert ohne Ca2+ zu erhalten.
Ziel der Erfindung ist die Senkung des Aufwandes für
Eichprozeduren und Herabsetzung der damit verbundenen Belastung
des Zellmaterials bei der absoluten Ca2+-Konzentrationsbestimmung
mittels Fluoreszenzindikatoren.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
anzugeben, mit dem die absolute Bestimmung der Ca2+-Konzentration
in biologischen Materialien mit Hilfe solcher Indikaktorfarbstoffe,
die auf eine Veränderung der Ca2+-Konzentration mit einer
Veränderung der Fluoreszenzquantenausbeute reagieren, unter
Vermeidung sonst üblicher aufwendiger Eichprozeduren gelingt.
Die Lösung gelingt erfindungsgemäß dadurch, daß die Zellen mit
einem solchen Indikatorfarbstoff, der auf eine Veränderung der
Ca2+-Konzentration mit einer Veränderung der Fluoreszenzquantenausbeute
reagiert, eingefärbt und dann mit kurzen Lichtimpulsen
zur Fluoreszenz angeregt werden, das Fluoreszenzlicht mit
zeitlicher Auflösung registriert wird und durch Auswertung des
Abklingverhaltens das Verhältnis der Anteile der beiden Fluoreszenzkomponenten,
die dem freien Farbstoff einerseits und dem
Farbstoff-Ca2+-Komplex andererseits entsprechen, und daraus die
Ca2+-Konzentration ermittelt wird.
In der flüssigen Lösung, deren Ca2+-Gehalt zu bestimmen ist
(Cytosol der Zellen), liegen nach Zugabe des Indikatorfarbstoffes
freie Farbstoffanionen (FS; Index 1) und Farbstoff-Ca2+-Komplexe
(FSCa; Index 2) im chemischen Gleichgewicht vor. Ihr Konzentrationsverhältnis
hängt in bekannter Weise gemäß dem Massenwirkungsgesetz
mit der Ca2+-Konzentration über die Dissoziationskonstante
KD zusammen
[Ca2+] = KD · c₂/c₁, (1)
hierbei ist 1 : 1-Stöchiometrie des Komplexes vorausgesetzt.
Die Messung hat die Aufgabe, das Verhältnis c₂/c₁ zu ermitteln;
erfindungsgemäß wird dazu die zeitaufgelöste Registrierung des
Abklingens der Fluoreszenz herangezogen.
Ursache für eine bei Ca2+-Bindung eintretende Änderung der
Quantenausbeute bzw. Intensität der Fluoreszenz des Indikatorfarbstoffes
sind Veränderungen der Raten verschiedener Relaxationsprozesse
aus dem angeregten Zustand der Farbstoffmoleküle.
Diese bestimmen andererseits die Lebensdauer des angeregten
Zustandes, die insbesondere als Abklingzeit der Fluoreszenz nach
Impulsanregung der Beobachtung zugänglich ist. Deshalb sind für
solche Indikatorfarbstoffe, von denen bekannt ist, daß sie auf
Ca2+-Bindung mit einer erheblichen Veränderung der Fluoreszenzquantenausbeute
reagieren (insbesondere quin-2 und fluo-3), auch
deutliche Unterschiede der Fluoreszenzabklingzeiten für FS und
FSCa zu erwarten.
Die Fluoreszenzintensität bei gleichzeitigem Vorliegen von FS und
FSCa hat unter der Voraussetzung, daß nur diese beiden Spezies
fluoreszieren und jeweils einfach-exponentielles Abklingverhalten
aufweisen, einen zeitlichen Verlauf der Form
IF(t) = a (c₁ · kF1 · exp {- t/γ₁} + c₂ · kF2 · exp {- t/γ₂}), (2)
wenn die Anregung mit einem im Vergleich zu den Abklingzeiten
γ1,2 kurzen Lichtimpuls erfolgt. Der Faktor a hängt mit der
absorbierten Anregungsenergie sowie der Effektivität des
Fluoreszenznachweises zusammen. kF 1,2 sind die Raten der
strahlenden Desaktivierung des angeregten Zustandes für die
beiden Farbstoffspezies. Im weiteren wird angenommen, daß
kF1=kF2 gilt; anderenfalls sind Eichmesungen z. B. an Lösungen
bekannter Ca2+-Konzentration heranzuziehen. Die lineare
Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration ist
an ausreichend schwache Absorption und nicht zu starke Anregung
gebunden.
Die zeitaufgelöste Messung der Fluoreszenzintensität liefert
IF(t) = A₁ exp {- t/γ₁) + A₂ exp {- t/γ₂}. (3)
Aus den Amplituden A1,2, die in bekannter Weise durch
Kurvenanpassung aus der gemessenen Abklingkurve erhalten werden
können, ist gemäß (2) und für den Fall kF1=kF2
A₂/A₁ = c₂/c₁, (4)
woraus sich nach (1) mit
[Ca2+] = KD · A₂/A₁ (5)
unmittelbar die Ca2+-Konzentration ergibt.
Das Wesen der Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel näher
erläutert werden. Eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens geeignete Anordnung ist in Fig. 1 schematisch
dargestellt.
Das biologische Objekt 1, dessen Ca2+-Konzentration zu bestimmen
ist, wird gemäß üblicher Vorschrift mit dem Indikatorfarbstoff
quin-2 oder fluo-3 eingefärbt. Die Anregung der Fluoreszenz
erfolgt durch einen mittels des Mikroskopobjektivs 2 fokussierten
Laserstrahl 3, der in einem modensynchronisierten kontinuierlichen
Laser 4 erzeugt wird und demzufolge aus einem Zug von
Picosekundenimpulsen besteht. Das Strahlablenksystem 5 dient der
Positionierung des Laserfokus auf dem Objekt 1. Die vom Objekt 1
ausgehende Fluoreszenzstrahlung wird in Rückwärtsrichtung vom
Mikroskopobjekt 2 erfaßt, am Teilerspiegel 6 reflektiert und
gelangt auf den Sekundärelektronenvervielfacher 7. Dieser liefert
Einzelphotonenimpulse, die in einem Meßsystem für zeitkorrelierte
Einzelphotonenzählung 8 registriert werden. Die Fluoreszenzabklingkurve,
die den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzintensität
nach Impulsanregung repräsentiert und von der Ca2+-Konzentration
abhängt (vgl. Fig. 2), wird in dem angeschlossenen Computer 9
ausgewertet, so daß das Verhältnis der Amplituden der beiden
Fluoreszenzkomponenten, die von Farbstoff-Ca2+-Komplexen bzw.
freien Farbstoffanionen herrühren, erhalten wird. Daraus wird mit
der bekannten Dissoziationskonstante unmittelbar die Ca2+-Konzentration
berechnet. Sie kann nach Messung an vielen Punkten des
Objektes 1 in Abhängigkeit von der mit der Kontrolleinrichtung 10
ermittelten Position des Laserstrahls als Rasterbild dargestellt
werden.
Fig. 2 zeigt als Beispiel das Fluoreszenzabklingen für quin-2-
Lösungen definierten Ca2+-Gehaltes (a: 10-6 mol/l, b: 10-7 mol/l)
bei festem pH-Wert 6,72 (Pufferlösung 10-2 mol/l MOPS) und einer
Wellenlänge 490 nm. Die Kurve c repräsentiert den Anregungsimpuls
(Wellenlänge 350 nm).
Claims (1)
- Verfahren zur rastermikroskopischen Bestimmung von intrazellulären Ca2+-Konzentrationen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit einem solchen Indikatorfarbstoff, der auf eine Veränderung der Ca2+-Konzentration mit einer Veränderung der Fluoreszenzquantenausbeute reagiert, eingefärbt und dann mit kurzen Lichtimpulsen zur Fluoreszenz angeregt werden, das Fluoreszenzlicht mit zeitlicher Auflösung registriert wird und durch Auswertung des Abklingverhaltens das Verhältnis der Anteile der beiden Fluoreszenzkomponenten, die dem freien Farbstoff einerseits und dem Farbstoff-Ca2+-Komplex andererseits entsprechen, und daraus die Ca2+-Konzentration ermittelt werden.
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