DE102012107719B4

DE102012107719B4 - Standard auf DNA-Origami-Basis

Info

Publication number: DE102012107719B4
Application number: DE102012107719.3A
Authority: DE
Inventors: Philip Tinnefeld; Jürgen Schmied; Phil Holzmeister
Original assignee: Technische Universitaet Braunschweig
Current assignee: TECHNISCHE UNIVERSITAET BRAUNSCHWEIG, DE
Priority date: 2012-08-22
Filing date: 2012-08-22
Publication date: 2017-09-21
Anticipated expiration: 2032-08-23
Also published as: US20140057805A1; DE102012107719A1

Abstract

Anordnung zur Kalibrierung einer Messeinrichtung, insbesondere eines Mikroskops, mit Hilfe von Markermolekülen, mit einer Kalibrierungsprobe mit einer ersten Struktur auf Basis eines DNA-Origami und gegebenenfalls mindestens einer zweiten Struktur auf Basis eines DNA-Origami, wobei die DNA-Origami durch kurze DNA-Abschnitte in eine vorbestimmte Struktur geformt werden und gegebenenfalls diese DNA-Origami auf einem Träger angeordnet sind, und dass eine vorbestimmte Anzahl der kurzen DNA-Abschnitte eine vorbestimmte Anzahl eines Markermoleküls aufweist, wobei eine zweite DNA-Origami-Struktur als Kalibrierungsprobe vorliegt, die kein Markermolekül umfasst, und/oder wobei mindestens zwei unterschiedliche Strukturen auf Basis von DNA-Origami vorliegen und diese mindestens zwei DNA-Origami eine vorbestimmte, voneinander unterschiedliche Zahl von Markermolekülen aufweisen.

Description

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Standards geeignet zur Kalibrierung von Messeinrichtungen, insbesondere von Mikroskopen. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung Anordnungen zur Kalibrierung einer Messeinrichtung mit Hilfe von Markermolekülen, wobei diese Anordnung als Kalibrierprobe eine erste Struktur auf Basis eines DNA-Origami aufweist und wobei das DNA-Origami durch kurze DNA-Abschnitte in eine vorbestimmte Struktur geformt wird und ggf. auf einem Träger angeordnet vorliegt, wobei eine vorbestimmte Anzahl der kurzen DNA-Abschnitte, die die vorbestimmte Struktur der DNA-Origami ausbilden können, eine vorbestimmte Anzahl eines Markermoleküls aufweist, wie in den Ansprüchen definiert die Anordnung kann mindestens eine zweite von der ersten Struktur unterschiedliche Struktur auf Basis eines DNA-Origami als Kalibrierprobe aufweisen. Die Anordnung zur Kalibrierung der Messeinrichtung ist dazu geeignet Messsignale zu quantifizieren, insbesondere erlaubt es auf Basis der Anzahl von Photonen pro Zeiteinheit eine Quantifizierung der Markermoleküle. In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf ein Verfahren zur Kalibrierung einer Messeinrichtung, wie einem Mikroskop, mit Hilfe der erfindungsgemäßen Kalibrierprobe sowie ein Kit zum Kalibrieren einer Messeinrichtung und entsprechende Computerprogramme mit Programmcodemitteln, die auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert sind eingerichtet zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn das Computerprogramm auf einer Recheneinheit durchgeführt wird.
Stand der Technik
Eine quantitative Analyse von Proben und einzelnen Bestandteilen dieser Proben erfordert eine vorherige Kalibrierung der Messeinrichtung. Eine Möglichkeit zur Kenntlichmachung der zu analysierenden Bestandteile umfasst eine Markierung dieser Bestandteile mit geeigneten Markermolekülen. Solche Markermoleküle umfassen sowohl solche, die optisch erkannt werden können als auch solche, die mit anderen physikalischen Messverfahren bestimmt werden können, z.B. radioaktiv etc. Die Fluoreszenzmessung ist eine der Techniken, die sich gerade im Mikroskopiebereich sowohl im medizinischen als auch in biologischen Wissenschaften immer mehr in den Vordergrund schiebt. Dieses beruht unter anderem auf der Weiterentwicklung der Auflösung z.B. durch superauflösende fluoreszenzmikroskopische Verfahren. Mit diesen superauflösenden Mikroskopietechniken ist eine Auflösung im Nanometerbereich möglich. Beispiele für solche Verfahren sind STED, (d)STORM, (F)PALM, PAINT, GSDIM und Blink Mikroskopie. Neben der hohen Auflösung erlauben solche Fluoreszenzmikroskope aber auch andere Parameter zu bestimmen, um Informationen über die entsprechende Probe bereitzustellen. Solche Informationen schließen die Fluoreszenzintensität, die Fluoreszenzlebenszeit, die Fluoreszenzpolarisierung, die Farbe sowie den Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) ein.
Eine quantitative Analyse mit Hilfe solcher Mikroskopietechniken ist aber dadurch begrenzt, dass es nur wenige Verfahren gibt, die eine Kalibrierung dieser Messeinrichtungen, wie Mikroskopen erlauben. Insbesondere die Bereitstellung von standardisierten Proben ist begrenzt, vor allem in Submikrometerbereichen bis hin zu den Bereichen der superauflösenden Bildgebung und FRET. Top-Down lithographische Ansätze können die notwendigen Größendimensionen erreichen, lassen sich aber nur schwierig mit den Anforderungen auf dem molekularen Bereich verbinden. Weiterhin sind solche Ansätze meist nicht biokompatibel oder optisch kompatibel und beeinflussen insbesondere auch die Eigenschaften der Markermoleküle, wie der im Fluoreszenzmikroskopiebereich eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe.
Chemische und makromolekulare Ansätze, wie sie im Bottom-Up Ansätzen eingesetzt werden, können reguläre Strukturen in der notwendigen Größe ausbilden, allerdings besteht dann ein Problem in der strukturellen und stöchiometrischen Bestimmung in den für die Mikroskopie relevanten Bereichen, da nicht individuelle Nanoobjekte wie Fluoreszenzfarbstoffe in den relevanten Abständen platziert werden können.
Vor kurzem wurde mit der DNA-Origami-Technik ein Werkzeug bereitgestellt, das diese oben beschriebenen Probleme der Top-Down und Bottom-Up Ansätze beeinflussen kann. Gefaltete DNA-Origami sind eine einfache und effiziente Möglichkeit zwei- und dreidimensionale vorbestimmte Strukturen zu schaffen. Üblicherweise werden hier durch Hybridisierung von kurzen einzelsträngigen DNA-Abschnitten, den sogenannten „staple strands“ an einen langen einzelsträngigen Gerüst-DNA-Strang (scaffold DNA) die gewünschten Strukturen durch Ausbildung und Festigung des Gerüsts geschaffen. Dadurch ist es möglich, vorbestimmte Strukturen nach einfacher Hybridisierung dieser kurzen DNA-Abschnitte an die Gerüst-DNA zu erhalten. Vorteil dieser Strukturen ist deren große Festigkeit und genaue und vorbestimmte Dimensionierung.
Durch diesen Ansatz ist es möglich verschiedene einzigartige Eigenschaften der DNA auszunutzen: Die DNA ist ein supramolekulares Polymer und erlaubt eine orthogonale isoenergetische Erkennung für spezifische Interaktionen basierend auf der Watson-Crick Basenpaarung. Diese Watson-Crick Basenpaarung ist die Basis für die Ausbildung der DNA-Origami-Struktur und erlaubt eine einfache Integration von (bio)chemischen Funktionalitäten mit Subnanometergenauigkeit. Die DNA-Origami-Technik wurde bereits in verschiedenen Ansätzen für die Lichtmikroskopie und insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt: So wird sie zur Einzelmoleküluntersuchung von per DNA angeordneten plasmonischen Strukturen und z.B. in FRET und Farbstoffpartikel-Linealen (sogenannte Nanometerlineale) eingesetzt. Sie dienen weiterhin, dazu die superauflösenden Eigenschaften der Mikroskopie darzulegen. Aus der Veröffentlichung von Forthmann C. et. al., Laborpraxis, September 2011, Seite 70 bis 72 und Steinauer c., et al., 2009, Angew Chem Int Ed Engl 48, 8870–8873 sind sogenannte Nanometerlineale als Strukturen bekannt, die in genau definierten Abständen einzelne Farbstoffe tragen. Diese dort beschriebenen Nanometerlineale werden dazu genutzt, das Auflösungsvermögen des Mikroskops experimentell zu bestimmen. Entsprechende Nanometerlineale werden durch DNA-Nanostrukturen, den DNA-Origami, hergestellt. Dabei sind Nanometerlineale beschrieben, die aus einfachem DNA-Origami, üblicherweise einfachen Rechtecken, bestehen. Auf diesen werden einzelne Farbstoffe in einem vorbestimmten Abstand angeordnet um so das Auflösungsvermögen des Mikroskops zu ermitteln.
Für quantitative Messungen im Bereich der Fluoreszenzmikroskopie ist es von entscheidender Bedeutung alle Parameter des Mikroskops zu kennen, insbesondere für Experimente, bei denen die Bestimmung der absoluten Helligkeit (Anzahl der Photonen) der mit Markermolekülen markierten Proben, insbesondere solche wo die Markermoleküle wie Farbstoffe, wie Fluoreszenzfarbstoffe sind, erfolgt, muss zuvor eine Kalibrierung mit einer definierten Kalibrierprobe durchgeführt werden. Diese Kalibrierprobe muss bei gegebener Anregungsleistung durch die Lichtquelle eine verlässliche Anzahl von Photonen pro Sekunde emittieren, um anschließend eine quantitative Messung der zu analysierenden Probe durchführen zu können. Bei sequenziellen Messungen innerhalb einer Versuchsreihe muss gewährleistet werden, dass die zu untersuchende Probe stets mit der gleichen oder zumindest einer definierten Anregungsleistung beleuchtet wird. Entsprechend ist es hilfreich, bei jeder Messung die Kalibrierprobe vorliegen zu haben.
Bisher wurde versucht die Messung der Anregungsleistung durch einen lichtempfindlichen Detektor zu bestimmen. Dieser ist im Strahlenverlauf des Anregungslichtes angeordnet. Allerdings besteht hier der Nachteil, dass nicht die tatsächlich in der Probe ankommende Intensität des Anregungslichtes gemessen wird. In manchen Fällen ist eine solche Messung durch spezifische Eigenarten der Methode auch gar nicht möglich, z.B. bei der TIRF-Anregung. Außerdem wird mit Hilfe des lichtempfindlichen Detektors die integrale Intensität gemessen, allerdings unterliegt die Intensität des Anregungslichts einer starken Heterogenität, die nicht berücksichtigt wird. Alternativ werden bisher sogenannte „Beads“ eingesetzt. Ein Nachteil hiervon ist allerdings, dass in den Beads meist keine definierte Anzahl von Farbstoffen vorliegt. Die Anzahl der Farbstoffe ist selbst für perfekte Beads durch die Poisson-Verteilung bestimmt, d.h. es wird eine breitere Streuung bei der Verteilung der Anzahl von Farbstoffen erhalten. Außerdem liegen die Farbstoffmoleküle in den Beads ungeordnet vor, so dass Interaktionen zwischen den einzelnen Farbstoffmolekülen auftreten. Dieses führt bei Messungen, bei denen einzelne Farbstoffmoleküle einen detektierbaren Unterschied in der gemessenen Helligkeit der Probe erzeugen sollen, dazu, dass das Signal nicht mehr proportional zur Anzahl der Farbstoffe ist. Die Empfindlichkeit eines Mikroskops kann aufgrund der größeren Signalheterogenität nicht genau bestimmt werden. Auch kann die Empfindlichkeit nicht mehr auf die Anzahl der detektierbaren Farbstoffe kalibriert werden, da nicht alle Farbstoffe gleich hell sind. Ähnlich kann nicht exakt auf eine an einem Ort herrschende Anregungsleistung zurückgeschlossen werden.
Die WO 2012/058638 A2 beschreibt Nukleinsäure Nanostrukturen, die als Barcodeproben nutzbar sind.
Aufgabe ist daher die Bereitstellung von Kalibrierproben und Anordnungen, um eine entsprechende Einstellung der relevanten Parameter der Messeinrichtung, wie eines Mikroskops, zu erlauben. Außerdem können die Kalibrierproben als Vergleichsproben mit einer genau definierten Anzahl an Farbstoffen dienen, mit denen die Empfindlichkeit (Helligkeit) des Mikroskops abgeschätzt werden kann. Ferner können durch Intensitätsvergleiche mit Proben oder Bereichen in Proben mit unbekannter Farbstoffanzahl Konzentrationen oder sogar quantitative Molekülanzahlen (in absoluten Farbstoffanzahlen) bestimmbar werden.
Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Anordnung zur Kalibrierung einer Messeinrichtung, insbesondere eines Mikroskops, mit Hilfe von Markermolekülen, mit einer Kalibrierprobe mit einer ersten Struktur auf Basis eines DNA-Origami und ggf. mindestens einer zweiten Struktur auf Basis eines DNA-Origami wobei die DNA-Origami durch kurze DNA-Abschnitte in eine vorbestimmte Struktur geformt werden und gegebenenfalls diese DNA-Origami auf einem Träger angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, dass eine vorbestimmte Anzahl der kurzen DNA-Abschnitte eine vorbestimmte Anzahl eines Markermoleküls aufweist und sich die Anzahl der Markermoleküle der ersten Struktur auf Basis eines DNA-Origami unterscheidet von der Anzahl der Markermoleküle der ggf. mindestens zweiten Struktur auf Basis eines DNA-Origami, wie in Anspruch 1 definiert.
Unter einer „Struktur auf Basis eines DNA-Origami“ wird vorliegend ein DNA-Origami verstanden, gebildet aus einem Gerüst-DNA-Strang und kurzen DNA-Abschnitten, die eine vorbestimmte Struktur des Gerüst-DNA-Strangs ausbilden. Die Struktur auf Basis eines DNA-Strangs kann weitere Komponenten umfassen wie Farbstoffe, plasmonische Strukturen, biologische Moleküle wie Proteine, Enzyme, Nanoteilchen, und kleine Moleküle wie Biotin. Alternativ kann die Struktur auf Basis eines DNA-Origami auch lediglich aus kurzen DNA-Abschnitten aufgebaut sein, wie kürzlich von Wie B., et. al., Nature, 485, 623–626, 2012 beschrieben
Mit einer „ersten“ und „mindestens einer zweiten“ Struktur ist vorliegend gemeint, dass die Strukturen eine unterschiedliche Anzahl von Markermolekülen aufweisen, wobei n für die Anzahl von Markermolekülen steht und n gleich null die Negativkontrolle sein kann. Gegebenenfalls können die Strukturen auch miteinander verknüpft, z.B. über entsprechende Linker einschließlich DNA-Strängen, vorliegen.
Vorliegend wurde überraschend festgestellt, dass die mit der Messeinrichtung, wie dem Fluoreszenzmikroskop, bestimmbaren Eigenschaften der Markermoleküle, die Fluoreszenzintensität von Fluorophoren, die als Markermoleküle eingesetzt werden, direkt proportional zu der Anzahl der Markermoleküle ist, insbesondere der Anzahl der Fluorophore, die in dem DNA-Origami vorliegen. Dadurch ist es möglich, einen idealen und sehr stabilen Helligkeitsstandard selbst für Markermoleküle hoher Intensität bereitzustellen. Es zeigte sich überraschend, dass die Fluoreszenz der Fluorophore nicht durch benachbarte Fluorophore gestört bzw. negativ beeinflusst wird. D.h. die grundlegende Idee der vorliegenden Anmeldung ist es, an DNA-Origami Nanostrukturen eine definierte Anzahl und Art von Markermolekülen, insbesondere von Fluoreszenzfarbstoffen, anzuordnen, so dass diese Strukturen als Kalibrierungsproben und entsprechende Anordnung zur Kalibrierung der Messeinrichtung, insbesondere eines Mikroskop, dient. Der große Vorteil der verwendeten DNA-Origami als Basis dieser Kalibrierprobe ist die definierte und vorbestimmte Struktur, die besonders robust ist. Dadurch ist es möglich an vorbestimmten Positionen eine vorbestimmte Anzahl von Markermolekülen anzuordnen. Entsprechend kann dann mit geeigneten Verfahren die Intensität, insbesondere die Anzahl an Photonen über die Zahl dieser Moleküle bestimmt werden, um so eine Kalibrierung des Systems im Bezug auf die Fluoreszenzintensität zu erreichen. Dadurch ist es möglich, diese Messeinrichtung zur weiteren quantitativen Messung der Fluoreszenz zu kalibrieren.
Mit Hilfe der DNA-Origami-Technik ist es möglich, eine definierte Anzahl an Farbstoff innerhalb eines beugungsbegrenzten Punktes anzubringen. Die bisher dazu genutzten Beads erlauben eine solche vorbestimmte Positionierung dieser Markermoleküle in einem weitaus geringeren Maße, so dass die Eignung zur Kalibrierung der Messeinrichtung durch die Beads nicht gegeben ist. Die erfindungsgemäße Anordnung bzw. die erfindungsgemäßen Kalibrierproben eignen sich insbesondere als Standards für die Fluoreszenzmikroskopie. Im Gegensatz zu den bisher im Stand der Technik beschriebenen Beads weisen die erfindungsgemäßen Anordnungen und Kalibrierproben eine größere Homogenität auf. Weiter ist die Lebensdauer dieser Standards im Vergleich zu Beads mit identischen Markermolekülen erhöht. Die erfindungsgemäßen Kalibrierproben bzw. Anordnungen geeignet als Standards für Messeinrichtungen können auch als solche für andere spektroskopische Parameter, wie die Fluoreszenzlebensdauer, eingesetzt werden. Durch die DNA-Origami-Technik ist es möglich, einen hohen Grad an Skalierbarkeit sowohl im Bezug auf die Menge der hergestellten Proben als auch die Flexibilität im Bezug auf die Anzahl und Art der verwendeten Farbstoffe, bereitzustellen. Die erfindungsgemäßen Kalibrierproben bzw. Anordnungen zur Kalibrierung der Messeinrichtung sind insbesondere als solche für die Mikroskopie, insbesondere die Fluoreszenzmikroskopie, geeignet. Mit entsprechenden Markermolekülen sind diese Kalibrierproben bzw. Anordnungen aber auch in anderen Messbereichen einsetzbar, z.B. im Bereich der Absorptionsmessung oder im Bereich der Raman-Spektroskopie, der Nanophotonik oder der Plasmonik.
Die erfindungsgemäßen Anordnungen erlauben weiterhin die Sensitivität des Messverfahrens zu bestimmen.
Vorliegend wird unter dem Ausdruck „Markermolekül“ eine Komponente verstanden, die auf dem DNA Origami angebracht ist und das zu messende Signal erzeugt, wie zum Beispiel ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Nanopartikel, Halbleiter Nanokristall, oder Enzym.
Unter dem Ausdruck „kurze DNA-Abschnitte“ wird vorliegend die als „staple strands“ bezeichneten Nukleotidmoleküle verstanden, die eine Sequenz komplementär zu einer Sequenz des Gerüst-DNA-Strangs oder eines anderen kurzen DNA-Abschnitts aufweisen. Diese kurzen DNA-Abschnitte können weiterhin dazu dienen, dem langen DNA-Strang die vorbestimmte Struktur zu verleihen. Alternativ kann es sich bei den kurzen DNA-Abschnitten um solche handeln, die in vorbestimmten Bereichen mit dem DNA-Gerüst-Strang des DNA-Origami hybridisieren.
Unter dem Ausdruck „DNA“, wie er vorliegend verwendet wird, werden nicht nur Stränge von Desoxynukleinsäure verstanden, sondern auch analoge Strukturen, wie Stränge von Ribonukleinsäuren, PNA, usw.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Markermolekülen um ein Fluorophor, das in einer vorbestimmten Anzahl auf den DNA-Origami angeordnet ist. Die Positionierung findet mit Hilfe der kurzen DNA-Abschnitte statt. Dadurch ist es möglich dass eine vorbestimmte Anzahl n an Markermolekülen auf einen DNA-Origami vorliegen. n ist dabei bevorzugt eine ganze Zahl von 0 bis 600, z.B. 1 bis 400 oder bis 300, wie 1 bis 200, 2 bis 100, insbesondere 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 usw. oder 10 und ein Vielfaches von 10. Insbesondere ist es bevorzugt, dass in der Anordnung mindestens eine zweite DNA-Origami-Struktur als Kalibrierprobe vorliegt, die kein Markermolekül umfasst. Alternativ kann eine mindestens zweite DNA-Origami-Struktur vorliegen und diese mindestens zweite DNA-Origami weist eine vorbestimmte, von der ersten DNA-Origami verschiedene Zahl von Markermolekülen auf. So ist es bevorzugt, dass diese Anordnung im DNA-Origami mit z.B. 12, 24, 36 usw. Markermoleküle aufweist, um eine entsprechende Kalibrierung der Messeinrichtung zu erlauben. Eine entsprechende Kalibrierung erfolgt dabei indem die Fluoreszenzintensität der entsprechenden DNA-Origami mit der vorbestimmten Anzahl an Markermolekülen gemessen wird und durch entsprechende Analyse der Photonenanzahl über die Fläche bzw. pro DNA-Origami die Kalibrierung erfolgt.
Unter dem Ausdruck „Kalibrierung“ wird dabei vorliegend verstanden, eine Messgröße anhand einer oder mehrerer Referenzproben zu quantifizieren oder die Eigenschaften wie die Sensitivität einer Apparatur zu bestimmen.
Die erfindungsgemäße Anordnung ist dabei bevorzugt eine bei der die kurzen DNA-Abschnitte in vorbestimmter Anzahl eine vorbestimmte Anzahl eines Markermoleküls aufweisen, wobei diese kurzen DNA-Abschnitte unterschiedliche Markermoleküle vorbestimmter Anzahl aufweisen können. D.h., im Falle von Fluorophoren weisen diese Markermoleküle unterschiedliche Emissionsspektren auf. Dieses erlaubt ein Kalibrieren der Messeinrichtung, insbesondere des Fluoreszenzmikroskops, nicht nur für einen Farbstoff sondern für Farbstoffe unterschiedlicher Emissionsspektren.
Die Anordnung kann dabei eine sein, die auf einem Träger, insbesondere auf einem transparenten Träger (wie Glas) angeordnet ist. Dem Fachmann sind entsprechend geeignete Methoden zur Fixierung der DNA-Origami auf dem Träger bekannt. Diese Verfahren beinhalten die Verwendung von Biotin/Avidin-Systemen, usw.
Es ist weiter bevorzugt, dass z.B. bei Aufbringen der DNA-Origami als Kalibrierproben auf einem Träger diese auf dem Träger eingebettet sind, z.B. in einem Material umfassend Polyvinylalkohol und Glycerin.
Alternativ kann diese Anordnung auch als interne Kalibrierprobe zu einer zu analysierenden Probe hinzugefügt werden. D.h., die erfindungsgemäßen Kalibrierproben und erfindungsgemäßen Anordnungen können einerseits zu Beginn, am Ende und/oder zwischendurch zur Kalibrierung der Messeinrichtung eingesetzt werden und die zu analysierenden Proben werden getrennt davon gemessen. Alternativ kann gleichzeitig mit der zu analysierenden Probe die erfindungsgemäße Kalibrierprobe oder Anordnung gemessen werden und somit eine Quantifizierung insbesondere der Fluoreszenzintensität mit hoher Genauigkeit erreicht werden.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung bzw. einer erfindungsgemäßen Kalibrierprobe zur Kalibrierung der Messeinrichtung zur Quantifizierung von Messsignalen, insbesondere der Anzahl von Photonen pro Zeiteinheit, gemessen mit einem Sensor und/oder zur Kalibrierung der Auflösung der Messeinrichtung.
Überraschenderweise konnte dargestellt werden, dass eine direkte Proportionalität zwischen der Zahl an Fluorophoren und der Fluoreszenzintensität der Fluorophore angeordnet auf dem DNA-Origami besteht. Im Gegensatz zu Fluorophoren, die in bekannten Beads eingesetzt werden, findet keine Wechselwirkung zwischen den auf dem DNA-Origami an vorbestimmten Positionen angeordneten Fluorophoren statt. Es findet also keine Selbstlöschung der Fluorophore statt. Weiterhin ist die Lebenszeit der Markermoleküle, insbesondere der Fluorophore, sehr homogen und eine Wechselwirkung zwischen den Fluorophoren und eine dadurch begründete Veränderung der emittierten Photonen sind nicht zu beobachten. Dieses gilt insbesondere dann, wenn die Markermoleküle, die Fluorophore auf dem DNA-Origami mit einem Abstand von mindestens 6 Nanometer voneinander beabstandet sind. Dadurch werden direkte Markermolekülwechselwirkungen und ein self-quenching (Selbstlöschen) vermieden und die beschriebene direkte Proportionalität zwischen der Zahl der Markermoleküle und Fluoreszenzintensität erreicht. Es können in einer Anordnung mindestens 2 verschiedenartige DNA-Origami, wie 3, 4, 5 oder mehr vorliegen. Unter „verschiedenartige DNA-Origami“ werden DNA-Origami verstanden, die eine unterschiedliche Anzahl an Markermolekülen aufweisen. Aufgrund dieser unterschiedlichen DNA-Origami ist es möglich eine entsprechende Kalibrierungskurve mit Hilfe einer einzigen Anordnung zu erzielen und somit eine genaue und robuste Quantifizierung der Fluoreszenzintensität zu ermöglichen. Durch die Quantifizierung ist es möglich, sehr genau die Anzahl an Markermolekülen in einer Probe und somit ggf. die Anzahl an markierten Komponenten, wie markierten Molekülen in der Probe zu bestimmen, wobei insbesondere eine ortsaufgelöste Quantifizierung möglich ist.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein Verfahren zur Helligkeitskalibrierung einer Messeinrichtung gemäß den Ansprüchen umfassend die Schritte:

– Bereitstellung mindestens einer Kalibrierprobe mit einer vorbestimmten Anzahl von Markermolekülen, insbesondere einer erfindungsgemäßen Anordnung mit Kalibrierprobe;
– Messen dieser mindestens einen Kalibrierprobe unter gegebener Anregungsleistung, mit einem geeigneten Sensor;
– Kalibrieren der Messeinrichtung auf Basis der Messung der emittierten Photonen pro Zeiteinheit mit einem Sensor, bevorzugt mit Hilfe einer Rechnereinheit.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Kalibrierung von Mikroskopen, insbesondere von Fluoreszenzmikroskopen. Die Messeinrichtung ist eine zur Messung der Fluoreszenz. Dabei ist diese Messeinrichtung insbesondere eine, die eine superauflösende, d.h. im Nanometerbereich liegende, optische Auflösung erlaubt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Messung bei gegebener Anregungsleistung durch eine Lichtquelle die Anzahl an Photonen emittiert von Fluorophoren als Markermolekülen pro Zeit mit einem Sensor misst und mit Hilfe des gemessenen Wertes eine vorgegebenen Standardkurve die Kalibrierung durchgeführt wird und/oder mit Hilfe von mindestens zwei Messwerten erhalten von mindestens zwei Kalibrierproben eine Kalibrierung durch Berechnung einer Standardkurve durchgeführt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Kalibrierung von Messeinrichtungen, insbesondere solchen zur Messung der Fluoreszenz wie Fluoreszenzmikroskope zur quantitativen Messung dieser Fluoreszenz geeignet. In einer Ausführungsform liegen dabei mindestens zwei unterschiedliche Markermoleküle, insbesondere zwei unterschiedliche Fluorophore mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen vor, auf die die Messeinrichtung dann kalibriert werden kann.
Aufgrund der vorliegend gefundenen direkten Proportionalität zwischen der Anzahl der Fluorophore der mit der DNA-Origami-Struktur vorliegenden Markermoleküle zur Fluoreszenzintensität dieses DNA-Origami ist es möglich, Kalibrierproben als Standards zur quantitativen Bestimmung der Anzahl an Farbstoffen bereitzustellen. Insbesondere eignen sich diese Standards für die Anwendungen im superauflösenden Mikroskopiebereich, z.B. für die STED-Mikroskopie. Es konnte gezeigt werden, dass zwei Intensitätspunkte, die in einem Abstand von z.B. 6 bis 94 nm auseinander lagen, aufgelöst und in ihrer Intensität differenziert werden konnten, um eine quantitative Bestimmung der Intensität zu erlauben. Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Kalibrierproben sowie dessen Anordnung auf einem Träger erlaubt weiterhin die Sensitivität der Messverfahren zu bestimmen. D.h., durch eine einfache Anordnung mit DNA-Origami mit unterschiedlicher Anzahl an Markermolekülen ist es möglich die Sensitivität des Messverfahrens also die notwendige Anzahl von Markermolekülen pro Messpunkt zu bestimmen.
Schließlich wird ein Kit zum Kalibrieren einer Messeinrichtung, insbesondere einer Messeinrichtung zur Messung von Fluoreszenzen wie ein Fluoreszenzmikroskop bereitgestellt. Dieses Kit umfasst eine erfindungsgemäße Anordnung mit Kalibrierprobe.
Die erfindungsgemäße Anordnung mit Kalibrierprobe kann, wie oben ausgeführt, auf einem Träger ggf. eingebettet in ein geeignetes Einbettmedium bereitgestellt werden. Alternativ kann die Anordnung mit Kalibrierprobe auch direkt in die zu analysierende Probe hinzugefügt werden. Dabei kann in einer Ausführungsform das Markermolekül der Kalibrierprobe unterschiedlich zu dem Markermolekül der zu analysierenden Probe sein. In einer anderen Ausführungsform sind die Markermoleküle identisch.
Schließlich stellt die vorliegende Anmeldung ein Computerprogramm mit Programmcodemitteln, insbesondere auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert bereit, dieses ist eingerichtet zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn das Computerprogramm auf einer Recheneinheit durchgeführt wird.
Die Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele näher erläutert, ohne dass sie auf diese beschränkt ist.
DNA-Origami-Strukturen als Fluoreszenzstandards
Es wurden zwei unterschiedliche DNA-Origami-Strukturen eingesetzt: Rechteckige DNA-Origami und ein Sechs-Helix-Bündel. Die nicht modifizierten und modifizierten kurzen DNA-Abschnitte (staple strands) wurden von MWG (München, Deutschland) oder IBA (Göttingen, Deutschland) in Konzentration von 100 µM erhalten und wurden ohne weitere Aufreinigung verwendet. Die DNA-Origamis wurden ausgebildet unter Verwendung eines nmol-Verhältnis von 1:30 zwischen viraler DNA und nicht modifizierten kurzen DNA-Abschnitten und in einem Verhältnis von 1:100 zwischen viraler DNA und modifizierten kurzen DNA-Abschnitten. Zur Herstellung der Gerüst-Stränge aus viraler DNA wurden E. coli Stamm K91 mit den entsprechenden M13MP18 Phagen infiziert und nach Amplifikation wurden die Phagen-Partikel abgetrennt, aufgereinigt und die Einzel-Strang-DNA extrahiert, wie beschrieben in Castro, C. E., et. al., Nature Methods: 2011, (3), 221–229. Die Konzentration wurde entsprechend auf 100 nmol eingestellt. Die Sechs-Helix-Bündel wurden mittels Gelelektrophorese aufgereinigt. Das rechteckige DNA-Origami wurde basierend auf der Veröffentlichung (Rothemund, Nature (2006) 440, 7082, 297–302) nach dem thermischen Annealen in einem Thermocycler unter Verwendung von Amicon-Zentrifugen-Filtereinrichtungen (100.000 MWCO 300 × G 10 Minuten) aufgereinigt.
Zur Stabilisierung der Strukturen, zur Lagerung und zur Verbesserung der Portabilität der DNA-Origami auf den Trägern wurde fakultativ ein Polymer verwendet, hergestellt unter Verwendung von 10 g „Mowiol 488“ (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland), 25 g Glycerin und 100 ml 0,1 Tris (pH 7,2 gepuffert). Als Träger wurden Mikroskop-Objektträger und Deckgläser verwendet: Als Markermoleküle wurden verwendet: Fluoreszenzfarbstoffe ATTO647N oder Alexa488. Die Bindung der Markermoleküle an die entsprechenden kurzen DNA-Abschnitte erfolgte gemäß bekannten Verfahren.
DNA-Origami Immobilisierung
Zur Immobilisierung der DNA-origami wurden verschiedene Verfahren eingesetzt. Eine chemische Immobilisierung erfolgte mittels BSA-Biotin/BSA Neutravidin Oberflächen, wie in Piestert, Sauer, Nano Letters, (2003) 3, 7, 979-982 beschrieben. Alternativ erfolgte eine Elektrostatische Immobilisierung entweder durch Beschichtung der Oberfläche mit PLL (Biochrom, Berlin, Deutschland) oder durch Zugabe von MgCl₂ zu der Lösung.
Messung der Helligkeit
Die Messung der Helligkeit wurde mit einem konfokalen Mikroskop basierend auf einem inversen Mikroskop (IX-71, Olympus) durchgeführt. Zur Anregung des Farbstoffs ATTO647N (ATTO-TEC) wurde ein 80 MHz gepulster Diodenlaser (LDH-D-C-640) mit 640 nm Wellenlänge verwendet, der mithilfe eines dichroitischen Strahlteilers (z532/633, Chroma) in das Objektiv (UPlanSApo60XO / 1.35 NA, Olympus) eingekoppelt wurde. Die emittierte Fluoreszenz wurde mit passenden Filtern (ET 700/75m, Chroma; RazorEdge LP 647, Semrock) vom Anregungslicht getrennt und auf eine APD (τ-SPAD-100, Picoquant) fokussiert. Das detektierte Signal wurde mit einer PC-Karte weiter verarbeitet (SPC-830, Becker&Hickl) und mit selbstgeschriebener LabVIEW software (LabVIEW2009, National Instruments) ausgewertet.
STED-Mikroskopie
Die STED-Messungen wurden mit einem kommerziellen Leica TCS-STED Mikroskop und einem kommerziellen Leica TCS-STED CW Mikroskop durchgeführt. Für die TCS-STED Messung betrug die Anregung 642 Nanometer und der STED-Beam hatte eine Wellenlänge von 750 Nanometer (80 Megahertz Wiederholungsfrequenz, 100× Ölobjektiv mit einer NA von 1,4, effektive Pixelgröße 10,8 nm. Für CW-STED waren die Werte: 492 Nanometer für die Anregungswellenlänge und 592 Nanometer für den STED-Beam. (100× Ölobjektiv mit einer NA von 1,4, effektive Pixelgröße 10,8 nm.
Superauflösende Bildgebung in mehreren Farben
Die superauflösende Mehrfarbenmikroskopie wurde auf einem inversen Olympus IX-71 Stativ durchgeführt mit TIRF (Total internal reflection) Anregung. Als Objektiv wurde ein UPlanSApo 100× NA = 1,4 von Olympus verwendet. Zur Anregung wurden drei verschiedene Laser verwendet: Sapphire 488 (λ = 488 nm, Coherent, Dieburg, Deutschland), Sapphire 568 (λ = 568 nm, Coherent) and ibeam smart (λ = 639nm, Toptica Photonics, München, Deutschland). Die Lasernlinien wurden über einen triple-band Strahlenteiler (Chroma z476-488/568/647, AHF Analysentechnik) für blaue und rote Anregung und über einen single-band Strahlenteiler (Semrock, Laser BS z561, AHF) eingekoppelt. Abhängig von der Anregungswellenlänge wurde die Fluoreszenz mit einem der folgenden Filtern gefiltert: Semrock BrightLine Exciter 531/40 (blau), Semrock BrightLine HC 609/54 (gelb), Semrock RazorEdge LP 488 RS, Semrock RazorEdge LP 647 RS (beide rot, alle AHF Analysentechnik). Die Fluoreszenz wurde mit einer EMCCD Kamera (Ixon DU-897, Andor Technology, Belfast, Nordirland) mit einer Integrationszeit von 8.6 ms aufgzeichnet. Die effektive Pixelgröße betrug 100 nm. Die Messungen wurden auf einer BSA-Biotin-neutravidin Oberfläche und einem Umgebungspuffer bestehend aus 50 mM TRIS pH 8.0, 10 mMNaCl, 12,5 mM MgCl2, 1% w/w Glukose, 10 % v/v enzymatisches Sauerstoffentzugssystem und 140 mM 2-mercaptoethanol.
Standards für die Ultrahochauflösungsbildgebung
Die ultrahochauflösende Mikroskopie wurde durch schrittweises Fotobleichen und Rekonstruktion der Punktspreizfunktionen der jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe durchgeführt. Dazu wurde der rote Kanal des Versuchsaufbaus wie im Abschnitt „Superflösende Bildgebung in mehreren Farben“ verwendet. Die Integrationszeit der Kamera betrug hier 50 ms. Der verwendete Farbstoff war Atto647N in 1 × PBS, darin enthalten 12,5 mM MgCl2, 1 % w/w Glukose, 10 % enzymatisches Sauerstoffentzugssystem, 2 mM Methylviologen und 2 mM Ascorbinsäure.
Beispiel 1 Helligkeitsstandards auf Basis von DNA-Origami
Die mit ATTO647N markierten kurzen DNA-Abschnitte wurden bei dem Selbstzusammenbau (self assembly) der DNA-Origami eingesetzt. In der 1a ist eine entsprechende Darstellung von einem rechteckigen DNA-Origami mit 36 Fluorophorpositionen dargestellt. In der 1b ist die Analyse der ortsintegrierten Photonenzahl bezogen auf die Zahl an Markermolekülen dargestellt. Deutlich ist die lineare direkte Abhängigkeit der Anzahl der Photonen als Maß der Helligkeit von der Anzahl der eingebauten Fluorophore zu erkennen. Hierzu wurden DNA-Origami mit 12, 24 und 36 ATTO647N Moleküle eingesetzt. Deutlich wird, dass kein self-quenching, das zu einer Reduktion der Photonen pro Spot führt, erkennbar ist. Im Gegensatz dazu zeigen Versuche mit kommerziell erhältlichen Beads in denen die statistisch Fluorophore verteilt sind, dass ein self-quenching auftritt (1c). Weiterhin ist die Lebenszeit der Fluoreszenz bei der DNA-Origami-Probe sehr homogen im Gegensatz zu den kommerziell eingesetzten Beads (1d und e).
Dieser Versuch zeigt, dass keine Fluorophorinteraktionen bei den DNA-Origami auftreten. Die Fluorophore sind bei den DNA-Origami in einem Abstand von ca. 6 Nanometer angeordnet. Im Gegensatz dazu treten bei kommerziell erhältlichen Beads mit einer ungeordneten Verteilung der Fluorophore Interaktionen zwischen den einzelnen Fluorophoren auf, die zu einem self-quenching-Effekt führen.
Beispiel 2: Standards für Sted-Mikroskopie
STED (stimulated emission depletion) war die erste superauflösende Mikroskopietechnik, die die Beugungsgrenze durchbrach. Vorliegend wurden DNA-Origami-Lineale für sowohl gepulste als auch kontinuierliche STED hergestellt. Dazu wurden entsprechende rechteckige Origami mit einer Distanz von 71 Nanometer zwischen den beiden Linien aus jeweils 12 ATTO647N Molekülen hergestellt (siehe 2a). Diese DNA-Origami wurden auf Polylysin beschichteten Deckgläschen immobilisiert und mit einer Polymerschicht abgedeckt. Mit Hilfe der STED-Technologie konnte der Abstand zwischen den beiden Linien aus jeweils 12 Molekülen aufgelöst werden und die Distanz zwischen den beiden Linien konnte mittels STED-Mikroskopie auf 71 ± 3 nm bestimmt werden, wie in der 2b dargestellt. Mit Hilfe von STED mit gepulster Anregung konnten auch Linien mit einem Abstand von 44 Nanometer aufgelöst werden. Ähnliche Ergebnisse konnten mit Alexa 488 Fluorophore erzielt werden (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 3: Standards für Ultrahochauflösende Bildgebung
Die Auflösung der superauflösenden Mikroskopie unterhalb der Beugungsgrenze wird normalerweise begrenzt durch (i) Fotobleichen, (ii) der gemessenen Photonenzahlen in einem „An-Zustand“ und dem An/Aus-Zyklus oder einfach aufgrund der Stabilität des Aufbaus. Vorliegend wurden in DNA-Origami Rechtecke mit zwei ATTO647N Molekülen in Abständen von 6, 12 bzw. 18 nm entworfen (s. 3a). Diese DNA-Origami wurden mit 5 Biotin markierten Strängen immobilisiert. Um eine Limitierung durch die Zahl der Photonen zu vermeiden, wurde die Fluoreszenz der Farbstoffe bis zum Photobleichen aufgenommen. Nachträglich wurden die Positionen der einzelnen Farbstoffe bestimmt, indem die Punktabbildungsfunktion des längerlebigen Farbstoffs von der Punktabbildungsfunktion vor dem ersten Photobleichschritt abgezogen wurde. Die individuellen Moleküle wurden in umgekehrter Reihenfolge des Fotobleichens lokalisiert und die Intensitätsverteilung des zweiten Moleküls wurde subtrahiert von dem ersten Teil des Übergangs. Es konnte beispielhaft ein Abstand von 5,7 nm bestimmt werden, der gut mit dem erwarteten Abstand übereinstimmen, siehe 3b. Die experimentell bestimmten Werte über viele Messungen für die drei Abstände waren d1 = 5,8 ± 2,9 nm, d2 = 10,7 ± 1,8 nm und d3 18,3 ± 5,7 nm, liegen also somit sehr dicht an den erwarteten Werten.
Beispiel 4 Superflösende Bildgebung in mehreren Farben
Eine Möglichkeit der superauflösenden Bildgebung stellt die aufeinanderfolgende Lokalisierung einzelner, stochastisch blinkender oder fotoaktivierbarer Moleküle dar. Bei diesen Experimenten wird ein Großteil der Moleküle stochastisch in einen nichtfluoreszierenden Auszustand gebracht so dass die verbleibenden Moleküle welche sich noch in einem Anzustand befinden aufgezeichnet und lokalisiert werden können. Es konnte gezeigt werden, das DNA origami benutzt werden können um zwei Farbstoffmoleküle im Abstand von ~90 nm aufzulösen. Die DNA Origamis wurden über fünf Biotinmoleküle auf einer BSA-Biotinneutravidin Oberfläche immobilisiert Für die Farbstoffe Alexa488 und Alexa 568 wurde reduktionsinduziertes Radikalblinken verwendet. Für Alexa647 wurde thiol induziertes Blinken verwendet.
Beispiel 5 Stabilität der Standards
Zur Verbesserung der Stabilität und der Lagerfähigkeit der erfindungsgemäßen Standards wurden diese mit einer Schicht von Polyvinylalkohol und Glycerin bedeckt. Es zeigte sich, dass diese Proben auch nach Lagerung von bis zu 12 Monaten bei –20°C keinen wesentlichen Verlust in der Darstellungsqualität aufzeigen. Bei manchen Standards kann ein Zusatz von 1% β-Mercaptoethanol vorteilhaft sein.

Claims

Anordnung zur Kalibrierung einer Messeinrichtung, insbesondere eines Mikroskops, mit Hilfe von Markermolekülen, mit einer Kalibrierungsprobe mit einer ersten Struktur auf Basis eines DNA-Origami und gegebenenfalls mindestens einer zweiten Struktur auf Basis eines DNA-Origami, wobei die DNA-Origami durch kurze DNA-Abschnitte in eine vorbestimmte Struktur geformt werden und gegebenenfalls diese DNA-Origami auf einem Träger angeordnet sind, und dass eine vorbestimmte Anzahl der kurzen DNA-Abschnitte eine vorbestimmte Anzahl eines Markermoleküls aufweist, wobei eine zweite DNA-Origami-Struktur als Kalibrierungsprobe vorliegt, die kein Markermolekül umfasst, und/oder wobei mindestens zwei unterschiedliche Strukturen auf Basis von DNA-Origami vorliegen und diese mindestens zwei DNA-Origami eine vorbestimmte, voneinander unterschiedliche Zahl von Markermolekülen aufweisen.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Markermolekül ein Fluorophor ist.
Anordnung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Abstand zwischen den Markermolekülen mindestens 6 nm beträgt.
Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die kurzen DNA-Abschnitte in vorbestimmter Anzahl eine vorbestimmte Anzahl eines Markermoleküls aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass die kurzen DNA-Abschnitte unterschiedliche Markermoleküle in vorbestimmter Anzahl aufweisen.
Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein transparentes Material, insbesondere ein Glas ist.
Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Origami auf dem Träger eingebettet sind, bevorzugt in einem Material aus Polyvinylalkohol.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass diese als interne Kalibrierungsprobe zu einer zu analysierenden Probe hinzugefügt sind.
Verwendung einer Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche zur Kalibrierung einer Quantifizierung der Messsignale, insbesondere der Anzahl von Photonen pro Zeiteinheit gemessen mit einem Sensor und/oder zur Kalibrierung der Auflösung der Messeinrichtung.
Verfahren zur Helligkeitskalibrierung einer Messeinrichtung, umfassend die Schritte: – Bereitstellen mindestens einer Kalibrierungsprobe mit einer vorbestimmten Anzahl von Markermolekülen, insbesondere einer Anordnung mit einer Kalibrierungsprobe nach einem der Ansprüche 1 bis 7; – Messen dieser mindestens einen Kalibrierungsprobe unter gegebener Anregungsleistung mit einem geeigneten Sensor; – Kalibrieren der Messeinrichtung auf Basis der Messung der emittierten Photonen pro Zeiteinheit mit einem Sensor, bevorzugt mit Hilfe einer Rechnereinheit.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Messeinrichtung eine Einrichtung zur Messung der Fluoreszenz ist, insbesondere ein Fluoreszenzmikroskop.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass bei gegebener Anregungsleistung durch eine Lichtquelle die Messung die Anzahl an Photonen, emittiert von Fluorophoren als Markermoleküle pro Zeit, mit einem Sensor misst und a.) mit Hilfe des gemessenen Wertes und einer vorgegebenen Standardkurve die Kalibrierung durchgeführt wird und/oder b.) mit Hilfe von mindestens zwei Messwerten erhalten von mindestens zwei Kalibrierungsproben eine Kalibrierung durch Berechnung einer Standardkurve durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 9 bis 11 zur Kalibrierung der Messeinrichtung zur quantitativen Messung von Fluoreszenz.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei mindestens zwei unterschiedliche Markermoleküle, insbesondere zwei unterschiedliche Fluorophore mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen, kalibriert werden.
Kit zum Kalibrieren einer Meßeinrichtung, insbesondere einer Meßeinrichtung zur Messung von Fluoreszenzen, wie ein Fluoreszenzmikroskop, umfassend eine Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Computerprogramm mit Programmcodemitteln, insbesondere auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert, eingerichtet zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wenn das Computerprogramm auf einer Rechnereinheit durchgeführt wird.