DE102020134261A1

DE102020134261A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Untersuchung von Desoxyribonukleinsäure-Fragmenten

Info

Publication number: DE102020134261A1
Application number: DE102020134261.6A
Authority: DE
Inventors: Michael Kempe; Ralf Wolleschensky
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH; Carl Zeiss AG
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH; Carl Zeiss AG
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-06-23
Also published as: WO2022129040A1

Abstract

Es werden Vorrichtungen und Verfahren zur Untersuchung von DNS-Fragmenten offenbart. Dabei werden DNS-Fragmente (12) mit schlitzförmigen Blendenöffnungen (42A) abgerastert, die sich senkrecht zu einer Vorzugsrichtung (44) der DNS-Fragmente (12) erstrecken.

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur Untersuchung von Desoxyribonukleinsäure(DNS)-Fragmenten.
Für verschiedene Anwendungen ist ein Bestimmen von in DNS codierter genetischer Informationen erforderlich. Hierzu existieren zahlreiche verschiedene Technologien, zum Beispiel zum Auslesen eines gesamten genetischen Codes (das heißt der Sequenz von so genannten Basenpaaren in der DNS) eines Organismus oder eines Teils davon. Für diese Technologien muss die DNS aus Zellen des jeweiligen Organismus extrahiert werden und in kleinere Abschnitte, sogenannte Fragmente, zerschnitten werden. Diese Fragmente werden dann untersucht. Eine Anwendung derartiger Untersuchungen ist die Identifikation von Organismen, beispielsweise Viren oder Bakterien, anhand ihres genetischen Codes.
Ein Verfahren, das zur Identifikation von Genen oder Organismen eingesetzt wird, ist das sogenannte Optical Mapping. Dabei werden die extrahierten DNS-Fragmente an einer spezifischen Sequenz von Basen, die typischerweise vier bis sieben Basenpaare lang ist, mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder mehreren verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (Farbstoffmoleküle 13) markiert, der selektiv nur an diese Sequenz von Basen bindet. In einer Ausprägungsform des Optical Mapping werden die DNS-Fragmente anschließend auf ein Substrat aufgebracht und auf dem Substrat fixiert. Die Orientierung der Fragmente auf dem Substrat ist dabei im Wesentlichen in einer Raumrichtung, im Rahmen dieser Anmeldung als Vorzugsrichtung bezeichnet. Dies ist in der 1 veranschaulicht. Hier ist ein Substrat 10 mit darauf fixierten DNS-Fragmenten 12 gezeigt. Ein Ausschnitt 11 aus dem Substrat ist vergrößert dargestellt. Insbesondere in dieser Vergrößerung ist ersichtlich, dass die DNS-Fragmente 12 im Wesentlichen in der Vorzugsrichtung ausgerichtet sind, in der 1 in der im Bild vertikalen Richtung. Im Wesentlichen ausgerichtet, kann dabei eine Ausrichtung in einem Winkelbereich von weniger als ± 20° oder wenigstens ± 10° für mindestens 80%, beispielsweise mindestens 90% der DNS-Fragmente bedeuten. Die DNS-Fragmente weisen wie durch einen Pfeil 14 gekennzeichnet typischerweise eine Länge im Bereich von 10 µm auf und sind mit den erwähnten Farbstoffmolekülen 13 markiert.
Durch optische Bildgebung wird dann die Abfolge der Farbstoffmoleküle 13 ermittelt. Die Abfolge der Farbstoffmoleküle 13, die auch als „Barcode“ des DNS-Fragments bezeichnet werden kann, ist dabei typisch für ein bestimmtes Gen oder einen Genabschnitt. Wie in 1 gezeigt kann beispielsweise aus dem Abstand der Farbstoffmoleküle 13, der davon abhängt, in welchen Abständen die jeweilige spezifische Bindungs-Sequenz in dem DNS-Fragment auftritt, der Barcode dieses DNS-Fragments ermittelt werden. Zur Identifikation eines Organismus oder der in einer komplexen Probe, wie z.B. einem Abstrich, enthaltenen Vielzahl von Organismen oder der darin enthaltenen Spuren von Organismen, ist dabei eine Analyse sehr vieler DNS Fragmente nötig, beispielsweise je nach Länge bis zu mehrerer 100.000 Fragmente, die dann z.B. 10¹⁰ Basenpaaren entsprechen. Insbesondere für kommerzielle Anwendungen ist es daher nötig, die Detektion der Farbstoffmoleküle und somit das Auslesen dieses „Barcodes“ mit möglichst hohem Durchsatz zu ermöglichen.
Zur Detektion der Farbstoffmoleküle werden diese durch Beleuchtung zur Fluoreszenz angeregt, und die Position der Farbstoffmoleküle wird mittels optischer Bildgebung bestimmt. Die erforderliche Auflösung hängt hierfür vom mittleren Abstand der Farbstoffmoleküle voneinander ab und kann je nach Anwendung deutlich unter diesem mittleren Abstand liegen. Sind die Farbstoffmoleküle beispielsweise sensitiv für eine spezifische Sequenz aus vier Basenpaaren, beträgt der mittlere Abstand bei statistischer Verteilung der möglichen Basenpaare 4⁴ = 256 Basenpaare, was etwa 256 × 0,34 nm = 87 nm entspricht. Mit der Fixierung auf dem Substrat 10 kann eine Streckung der DNS-Fragmente verbunden sein, wodurch dieser Abstand z.B. um etwa das 1,5-fache größer sein kann. In jedem Fall kann dieser Abstand im sichtbaren Wellenlängenbereich, in welchem zumindest einige der eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe emittieren, mit konventioneller Mikroskopie aufgrund des Beugungslimits nicht aufgelöst werden.
Bekannte Verfahren zur Mikroskopie jenseits des Beugungslimits sind beispielsweise Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM, Structured Illumination Microscopy), Mikroskopie mit stimulierter Emissionsabregung (STED, Stimulated Emission Depletion) oder Lokalisierungsmikroskopie (PALM, Photoactivated Localization Microscopy). Diese Verfahren haben alle den Nachteil, dass sie keine schnelle Bildgebung in einem großen Bildfeld, was für hohen Durchsatz erforderlich ist, ermöglichen. Daher erfordert eine Analyse eines Substrats 10 mit darauf angeordneten DNS-Fragmenten 12 wie in 1 gezeigt mit derartigen Verfahren eine sehr lange Zeit.
Die WO 2019/122161 A1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung der superauflösenden Mikroskopie jenseits des Beugungslimits mit einem plasmonischen Chip, wobei der Chip als individuell adressierbares Array von Nanoblenden eine Beleuchtung eines Objektes, das sich auf dem Chip befindet, im Nahfeld ermöglicht. Als Nanoblenden sind dabei Flächenabschnitte auf dem Array zu verstehen, deren Zustand bezüglich der Anregung von Oberflächenplasmonen gezielt adressierbar gesteuert werden kann. Die Nanoblenden auf dem lithographisch hergestellten plasmonischen Chip können dabei eine Größe von 25 nm oder kleiner erreichen. Eine entsprechende Vorrichtung 20 ist in der 2 schematisch dargestellt.
Bei der Vorrichtung 20 der 2 ist eine zu untersuchende Probe 23 auf einem Substrat 24 bereitgestellt. Die Dicke des Substrats 24 kann im Bereich von 25 nm liegen. Das Substrat enthält einen plasmonischen Chip 29 mit einer Vielzahl von einzeln ansteuerbaren Nanoblenden, wobei mit dem Bezugszeichen 27 geschlossene Nanoblenden (Oberflächenplasmonen können nicht durch einfallendes Licht angeregt werden) und mit dem Bezugszeichen 26 geöffnete Nanoblenden (Oberflächenplasmonen können durch einfallendes Licht angeregt werden) bezeichnet sind. Der plasmonische Chip 29 ruht auf einem Glassubstrat 210.
Zur Messung erfolgt Beleuchtung mittels einer Lichtquelle von der Seite des Glassubstrats 210, wie durch Pfeile 28 angedeutet. Die Nanoblenden 26, 27 können beispielsweise einen Durchmesser der Größenordnung 25 nm aufweisen. Die Lichtwellenlänge der Beleuchtung liegt darüber und kann beispielsweise im sichtbaren Bereich liegen.
Die Funktionsweise der Nanoblenden 26, 27 beruht darauf, dass die Anregung von Oberflächenplasmonen durch das einfallende Licht im plasmonischen Chip 29 sensitiv von den physikalischen Eigenschaften der Umgebung, z.B. der Temperatur, abhängig ist, die durch eine entsprechende Steuerelektronik eingestellt werden können. Somit können die Nanoblenden von geschlossen bis offen gesteuert werden.
Die geöffneten Nanoblenden 26 erlauben es, dass das Beleuchtungslicht entsprechend den Pfeilen 28 zu dem zu untersuchenden Objekt 23 gelangt. Aufgrund der Größe der Nanoblenden kleiner als die Lichtwellenlänge ist ein entstehendes Lichtfeld 25 zur Beleuchtung des Objekts 23 allerdings lediglich ein evaneszentes Lichtfeld, das nur wenige 100 nm in die Probe 23 propagiert und dabei eine laterale Ausdehnung hat, die wesentlich durch die Größe der Nanoblenden 26, 27 bestimmt wird. Hierdurch wird eine lokalisierte Anregung mit einer Ortsauflösung in der Größenordnung von 25 nm erreicht. Durch das Lichtfeld 25 angeregte Fluoreszenz wird dann mittels einer Detektionseinrichtung wie einem Detektionsmikroskops, von dem ein Detektionsobjektiv 21 schematisch dargestellt ist, detektiert und kann beugungsbegrenzt bestimmt werden. Die hohe Ortsauflösung ergibt sich hier also nicht durch eine hochaufgelöste Detektion - diese ist beugungsbegrenzt -, sondern durch eine entsprechend ortsaufgelöste Anregung. Zwischen dem Detektionsobjektiv 21 und dem Substrat 24 befindet sich bei manchen Anwendungsfällen eine Immersionsflüssigkeit 22, beispielsweise Wasser, welches die Probe 23 umgibt.
Ein ganzes Bildfeld, beispielsweise das Substrat 10 der 1, kann dann durch sequenzielles Schalten der Nanoblenden 26, 27 abgetastet werden. Wegen der kleinen Größe dieser Nanoblenden wird hier jedoch auch eine relativ lange Zeit benötigt.
Eine Parallelisierung dieser Abtastung ist dadurch möglich, dass für jede Chipfläche von der Größe eines Beugungsscheibchen der verwendeten Detektionsoptik (Detektionsobjektiv 21) jeweils eine Nanoblende 26, 27 geöffnet wird und jedes Objektfeld von der Größe des Beugungsschaltens abgetastet wird, dies aber für alle derartigen Objektfelder parallel geschieht. Als „Beugungsscheibchen der verwendeten Detektionsoptik“ ist dabei die beugungsbegrenzte Abbildung eines Pixels des Detektors mittels Objektiv 21 in die Objektebene zu verstehen. Dies ist der Bereich, innerhalb dessen aufgrund der Beugungsbegrenzung keine Trennung verschiedener Objekte detektierbar ist. Dies ist in 3 visualisiert. Hier ist eine Vielzahl von Beugungsscheibchen 30 dargestellt. Der minimale Durchmesser d jedes Beugungsscheibchens ist ungefähr gegeben durch d = λ/NA, wobei λ die zu detektierende Wellenlänge und NA die numerische Apertur des Objektivs (im Beispiel der 2 des Objektivs 21) ist. Die Anzahl N der Bilder, die zum Abrastern eines einzigen Beugungsscheibchens bei einem Nanoblendendurchmesser b nötig ist, ist dann gegeben durch $N = {(\frac{λ}{N A \cdot b})}^{2}$
Für ein Objektiv mit NA = 1,2, einer Wellenlänge von 550 nm und einem Nanoblendendurchmesser b von 25 nm sind demnach ungefähr 340 Aufnahmen pro Beugungsscheibchen erforderlich. Da die Beugungsscheibchen parallel abgearbeitet werden können, sind also insgesamt 340 Aufnahmen nötig, um ein gesamtes Bildfeld abzurastern.
Auch wenn dies eine deutliche Zeitersparnis gegenüber einem Abrastern eines gesamten Bildfeldes bedeutet, ist es dennoch wünschenswert, diese Zeit weiter zu verringern.
Eine Möglichkeit der weiteren Parallelisierung ist es, das Schalten der Nanoblenden, das mit hohen Frequenzen im Kilohertz-Bereich erfolgen kann, für eine parallele Heterodyn-Detektion zu nutzen. Das bedeutet, dass verschiedene Blenden, die nahe beieinander (innerhalb eines Beugungsscheibchens) geöffnet werden, mit verschiedenen Frequenzen moduliert werden, so dass auch das entsprechende Fluoreszenzlicht, das durch das evaneszente Lichtfeld angeregt wird, mit einer entsprechenden Frequenz codiert ist und somit spezifisch detektierbar ist. Eine derartige Detektion erfordert allerdings in der Regel eine spezielle Kamera mit direkter Demodulation, zum Beispiel eine sogenannte Time-of-Flight-Kamera, die meist nur eine geringe Pixelzahl aufweist, was die Auflösung wiederum beschränkt. Darüber hinaus sinken der Dynamikbereich und das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der Detektion stark. Innerhalb eines Beugungsscheibchens gilt bei einer derartigen Herangehensweise für N Beiträge mit verschiedenen Frequenzen bei 100 % Modulationstiefe $S = \sum_{n = 1}^{N} (1 + c o s v_{n}) = N + \sum_{n = 1}^{N} c o s v_{n}$
wobei S das gemessene Signal ist und ν_n die verwendeten Frequenzen sind. Dies bedeutet, dass jede Signalkomponente mit einer Amplitude von 2 willkürlichen Einheiten aus einem Untergrund mit Amplitude 2N willkürliche Einheiten herauszufiltern ist, was den Dynamikbereich der Detektion und das SNR substantiell verringert.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Möglichkeiten bereitzustellen, die Messzeit zur optischen Vermessung von fluoreszenzmarkierten DNS-Fragmenten mit relativ geringem Aufwand möglichst gering zu erhalten.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung nach Anspruch 1 sowie ein Verfahren gemäß Anspruch 11. Die Unteransprüche definieren weitere Ausführungsformen.
Gemäß einem ersten Aspekt wird eine Vorrichtung zur Untersuchung von Desoxyribonukleinsäure, DNS-Fragmenten bereitgestellt, umfassend:

einen plasmonischen Chip, auf dem DNS-Fragmente anordenbar, sind,
eine Beleuchtungseinrichtung zum Beleuchten des plasmonischen Chips von einer der den DNS-Fragmenten abgewandten Seite,
eine Detektionseinrichtung zum Detektieren von Fluoreszenz von den DNS-Fragmenten in Antwort auf eine Beleuchtung durch die Beleuchtungseinrichtung, und
eine Steuerung, welche eingerichtet ist, den plasmonischen Chip zum Abrastern der DNS-Fragmente mit schlitzförmigen Blendenöffnungen anzusteuern, wobei die schlitzförmigen Blendenöffnungen eine Breite kleiner 100 nm und eine Länge, die mindestens das Doppelte der Breite ist, aufweisen und in Richtung ihrer Länge im Wesentlichen senkrecht zu einer Vorzugsrichtung der DNS-Fragmente ausgerichtet sind.

Ein plasmonischer Chip ist dabei ein Chip, in dem wie in der Beschreibungseinleitung beschrieben Nanoblenden geöffnet und geschlossen werden können, wobei diese Nanoblenden im Gegensatz zum Stand der Technik schlitzförmige Blendenöffnungen bilden. Dass DNS-Fragmente auf diesem plasmonischen Chip anordenbar sind bedeutet insbesondere, dass die DNS-Fragmente in Kontakt mit dem plasmonischen Chip gebracht werden können oder zumindest so nah an den plasmonischen Chip gebracht werden können, dass sie in einem evaneszenten Feld liegen, das sich bei Beleuchtung bei den schlitzförmigen Blendenöffnungen bildet. Die DNS-Fragmente können dabei auf einem von dem plasmonischen Chip verschiedenen Substrat angeordnet sein.
Durch die Verwendung von derartigen schlitzförmigen Blendenöffnungen ist dabei ein schnelleres Abrastern und somit eine schnellere Untersuchung einer Probe möglich. Dabei wird ausgenutzt, dass die Fragmente mit einer bekannten Orientierung vorliegen und nur die Auflösung entlang der Hauptrichtung des Fragments hoch, insbesondere jenseits des Beugungslimits, sein muss. Im Wesentlichen senkrecht kann hier in einem Bereich von 70° bis 110°, beispielsweise von 80° bis 100°, bedeuten. Die Vorzugsrichtung der DNS-Fragmente ist dabei die Richtung, in der die Stränge der DNS-Fragmente hauptsächlich oder im Mittel angeordnet sind.
Schlitzförmige Blendenöffnungen können durch Zusammenschalten mehrerer Nanoblenden wie oben erläutert möglich, oder der plasmonische Chip kann zur Bereitstellung schlitzförmiger Blendenöffnungen eingerichtet sein. Die Verwendung einzelner Nanoblenden, die zusammen zu der schlitzförmigen Blendenöffnung geschaltet werden, ermöglicht dabei eine größere Flexibilität als feststehende schlitzförmige Blendenöffnungen, ist jedoch hinsichtlich der Ansteuerung unter Umständen aufwendiger.
Die Steuerung kann eingerichtet sein, das Abrastern für mehrere Bereiche parallel durchzuführen. Die Bereiche können dabei die Größe von Beugungsscheiben der Detektionseinrichtung aufweisen. Auf diese Weise kann der Durchsatz erhöht werden.
Die Länge der schlitzförmigen Blendenöffnungen kann sich über mehrere derartige Bereiche erstrecken. Alternativ kann die Länge der schlitzförmigen Blendenöffnungen einem Durchmesser der Bereiche ± 20 % oder ± 10 % entsprechen, also etwa dem Durchmesser der Bereiche. Im letzteren Fall können gleichzeitig geöffnete schlitzförmige Blendenöffnungen benachbarter Bereiche zueinander in Richtung der Breite der Schlitze versetzt sein, was eine Trennung von Signalen verschiedener Bereiche erleichtern kann.
Die Steuerung kann eingerichtet sein das Abrastern zumindest innerhalb der Bereiche, wenn sie benutzt werden, sequenziell durchzuführen, d.h. in jedem Bereich ist dann nur eine schlitzförmige Blendenöffnung gleichzeitig geöffnet.
Alternativ kann die Steuerung eingerichtet ist, zum Abrastern mehrere schlitzförmige Blendenöffnungen parallel mit verschiedenen Frequenzen zu öffnen und zu schließen, also ein Heterodyn-Detektionsverfahren durchzuführen. Aufgrund der Verwendung der schlitzförmigen Blendenöffnungen sind hier deutlich weniger Frequenzkomponenten erforderlich wie bei herkömmlichen Verfahren, was die Detektion erleichtert.
Genauer gesagt sind durch die schlitzförmigen Blendenöffnungen nur N' = √N Bildaufnahmen (im Falle der sequenziellen Abrasterung) oder Frequenzen (im Falle einer parallelen Heterodyn-Detektion) erforderlich, statt N bei herkömmlichen Herangehensweisen. Dies bedeutet eine kürzere Aufnahmezeit im Fall der sequenziellen Abrasterung oder ein geringeres Rauschen und höhere Detektionsdynamik im Falle der Heterodyn-Detektion.
Die Vorrichtung kann eingerichtet sein, vor dem Abrastern ein Übersichtsbild aufzunehmen, und zumindest eines der folgenden auf Basis des Übersichtsbildes zu bestimmen:

- die Vorzugsrichtung,
- Gebiete, in denen ein Fluoreszenzsignal von DNS-Fragmenten vorliegt, und
- eine Lage einzelner DNS-Fragmente.

Dies kann dazu beitragen, das nachfolgende Abrastern mit den schlitzförmigen Blendenöffnungen zu optimieren. Der Begriff „Gebiet“ wird hier verwendet, um eine Verwechslung mit den oben erwähnten Bereichen zu vermeiden.
Die Steuerung kann eingerichtet sein, das Abrastern mit den schlitzförmigen Blendenöffnungen nur in den Bereichen, in denen Fluoreszenz vorliegt, durchzuführen. Auf diese Weise kann die Auswertung erleichtert werden.
Die Steuerung kann eingerichtet sein, eine Ausrichtung der schlitzförmigen Blendenöffnungen an die Lage der jeweiligen DNS-Fragmente anzupassen. Hier kann also die allgemeine Ausrichtung im Wesentlichen senkrecht zu der Vorzugsrichtung der tatsächlich detektierten Lage angepasst werden. Die Lage kann dabei durch Schwerpunktsbestimmung ermittelt werden.
Gemäß einem zweiten Aspekt wird ein Verfahren zur Untersuchung von DNS-Fragmenten bereitgestellt, umfassend:

Anordnen von DNS-Fragmenten auf einem plasmonischen Chip,
Beleuchten des plasmonischen Chips von einer DNS-Fragmenten abgewandten Seite, und
Ansteuern des plasmonischen Chips, um die DNS-Fragmente mit schlitzförmigen Blendenöffnungen, wobei eine Breite der schlitzförmigen Blendenöffnungen kleiner als 100 nm liegt und eine Länge der schlitzförmigen Blendenöffnungen mindestens das Doppelte der Breite besteht und sich im Wesentlichen senkrecht zu einer Vorzugsrichtung der DNS-Fragmente erstreckt, und
Detektieren von Fluoreszenz von den DNS-Fragmenten.

Für das Anordnen auf dem plasmonischen Chip gelten die Erläuterungen, die zur Vorrichtung gemacht wurden, entsprechend.
Für das Verfahren sind Variationen und zusätzliche Merkmale entsprechend den für die Vorrichtung oben erläuterten Variationen und zusätzlichen Merkmalen möglich.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:

1 eine Probenpräparation von DNS-Fragmenten gemäß dem Stand der Technik,
2 eine Vorrichtung zur superauflösenden Mikroskopie gemäß dem Stand der Technik,
3 ein Diagramm zur Veranschaulichung der Parallelisierung der Vorrichtung der 2 gemäß dem Stand der Technik,
4A eine Vorrichtung zur Analyse von DNS-Fragmenten gemäß einem Ausführungsbeispiel,
4B eine Vorrichtung zur Untersuchung von DNS-Fragmenten gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel,
5A und 5B Diagramme zur Veranschaulichung verschiedener Ausführungsbeispiele,
6 ein Flussdiagram zur Veranschaulichung eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel,
7 ein Diagramm zur Veranschaulichung mancher Ausführungsbeispiele, und
8 ein Diagramm zur Veranschaulichung mancher Ausführungsbeispiele.

Im Folgenden werden verschiedene Ausführungsbeispiele detailliert erläutert. Diese Ausführungsbeispiele sind nur als Beispiel zu verstehen und sind nicht als einschränkend auszulegen.
Bei Ausführungsbeispielen werden im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren schlitzförmige Blendenöffnungen verwendet. Abgesehen von der Verwendung schlitzförmiger Blendenöffnungen und hiermit verbundener Möglichkeiten und Techniken können die verwendeten Vorrichtungen und Verfahren entsprechend herkömmlicher Vorrichtungen und Verfahren ausgestaltet sein, beispielsweise Vorrichtungen und Verfahren wie in der WO 2019/122161 A1 erläutert. Diese herkömmlichen Teile werden daher nicht detailliert beschrieben.
Merkmale (Elemente, Komponenten, Verfahrensschritte und dergleichen) verschiedener Ausführungsbeispiele können kombiniert werden, sofern nichts anderes angegeben ist. Variationen und Abwandlungen, die für eines der Ausführungsbeispiele beschrieben werden, sind auch auf andere Ausführungsbeispiele anwendbar und werden daher nicht wiederholt beschrieben.
Gleiche oder einander entsprechende Elemente in verschiedenen Figuren sind mit dem gleichen Bezugszeichen bezeichnet und werden daher nicht wiederholt detailliert erläutert.
Die 4A zeigt eine Vorrichtung 40A zur Untersuchung von DNS-Fragmenten 12 gemäß einem Ausführungsbeispiel. Die Vorrichtung 40A der 4A beruht auf der in der Beschreibungseinleitung unter Bezugnahme auf die 2 beschriebene Vorrichtung zur superauflösenden Mikroskopie, und gleiche Elemente tragen die gleichen Bezugszeichen und werden nicht nochmals detailliert erläutert. Stattdessen werden im Folgenden hauptsächlich die Unterschiede zu der Vorrichtung 20 der 2 dargestellt.
Bei der Vorrichtung 40A der 4A besteht die Probe im Gegensatz zu der allgemeinen Probe 23 der Vorrichtung 20 der 2 aus DNA-Fragmenten 12, welche in einer Vorzugsrichtung angeordnet sind, die durch einen Pfeil 44 angedeutet ist. Zur optischen Untersuchung der DNS-Fragmente 12 werden in einem plasmonischen Chip 41 gesteuert durch eine Steuerung 45 schlitzförmige Blendenöffnungen 42 geöffnet, welche sich senkrecht zu der Vorzugsrichtung 44 erstrecken. Andere Blendenöffnungen 27 bleiben geschlossen. Die schlitzförmigen Blendenöffnungen 42 können geöffnet werden, indem mehrere in Reihe liegende Nanoblenden der Vorrichtung 20 von der Steuerung 45 zur Öffnung angesteuert werden. Bei anderen Ausführungsbeispielen ist der plasmonische Chip 41 von vornherein so eingerichtet, dass die Nanoblenden schlitzförmig sind. Unter einer Schlitzform wird dabei eine Form verstanden, die in einer Längsrichtung eine mindestens zwei Mal größere, beispielsweise mindestens drei Mal größere Länge hat als eine Breite in Querrichtung, wobei in der Querschnittsansicht der 4A die Querrichtung sichtbar ist. Die Breite der schlitzförmigen Blendenöffnung kann deutlich unterhalb des Beugungslimits liegen, beispielsweise kleiner als 100nm oder kleiner als 40 nm, beispielsweise etwa 25 nm. Die Länge kann in der Größenordnung des Durchmessers eines Beugungsscheibchens der verwendeten Detektionsoptik (Detektionsobjektiv 21) liegen, also in der Größenordnung λ/NA, wobei λ die zu detektierende Wellenlänge und NA die numerische Apertur ist. Beispielsweise kann für eine Wellenlänge von 550 nm und eine numerische Apertur NA von 1,2 wie oben als Beispiel verwendet in der Größenordnung von 450 nm liegen. In der Größenordnung des Durchmessers des Beugungsscheibchens kann dabei der Durchmesser des Beugungsscheibchens ± 20 %, oder ± 10 % bedeuten, wobei auch eine größere Länge möglich ist. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann die Länge in Längsrichtung auch über eine Vielzahl von Beugungsscheibchens oder sogar über das ganze Bildfeld gehen.
Beispiele hierfür sind in den 5A und 5B dargestellt. Die 5A und 5B zeigen jeweils ein DNS-Fragment 12 mit einer Vielzahl von Fluoreszenzmolekülen 13. Mit 30 sind wie in der 3 Beugungsscheibchen bezeichnet, in denen parallel eine Detektion stattfindet.
In der 5A werden schlitzförmige Blendenöffnungen 42A verwendet, welche sich senkrecht zu der Vorzugsrichtung 44 über viele Beugungsscheibchen, beispielsweise über das gesamte Bildfeld, erstrecken. Im Falle der 5B werden schlitzförmige Blendenöffnungen 42B verwendet, deren Ausdehnung in Längsrichtung jeweils in der Größenordnung des Durchmessers einer Beugungsscheibe liegt und die für benachbarte Reihen von Beugungsscheibchen, in denen separat detektiert wird, wie dargestellt versetzt angeordnet sind. Durch die versetzte Anordnung kann eine Trennung von Signalen von verschiedenen Beugungsscheibchen erleichtert werden.
Bei manchen Ausführungsbeispielen kann, wie später näher erläutert werden wird, die Steuerung 45 wie durch einen Pfeil 43 angedeutet auch ein Übersichtsbild, welches mittels der Bildaufnahmeeinrichtung mit dem Detektionsobjektiv 21 erstellt wurde, erhalten, und daraus kann die Vorzugsrichtung 44 bestimmt werden. Im Falle einzelner Nanoblenden, bei denen Reihen zu schlitzförmigen Blendenöffnungen geöffnet werden, kann dann die Längsrichtung der schlitzförmigen Blendenöffnungen entsprechend angepasst werden. Zudem kann die Steuerung 45 auch die während der eigentlichen Messungen erhaltenen Bildaufnahmen erhalten und entsprechend auswerten, beispielsweise um die genaue Lage und Zuordnung von einzelnen Detektionsereignissen zu bestimmen. In diesem Fall dient die Steuerung gleichzeitig der Auswertung. Es kann aber auch eine separate Auswertungseinrichtung, beispielsweise ein separater Computer, bereitgestellt sein, der die Messungen (Bildaufnahmen) erhält. Eine derartige se parate Auswertungseinrichtung kann auch entfernt zu den dargestellten Vorrichtungen angeordnet sein und die Bildaufnahmen beispielsweise über eine Netzwerkverbindung erhalten.
Bevor zusätzliche Details der Detektion von Fluoreszenz mittels schlitzförmiger Blendenöffnungen im Falle der Untersuchung von DNS-Fragmenten noch genauer erörtert wird, wird unter Bezugnahme auf die 4B eine Variante des Ausführungsbeispiels der 4A erläutert. Größtenteils entspricht eine Vorrichtung 40B der 4B der Vorrichtung 40A der 4A. Lediglich die Beleuchtung erfolgt anstelle der Beleuchtung 28 der 4A als schräge Beleuchtung 28' in Totalreflektion. Das heißt, das Beleuchtungslicht wird an einer Grenzfläche zwischen dem plasmonischen Chip und dem Glassubstrat 210 total reflektiert, wobei dadurch an geöffneten schlitzförmigen Blendenöffnungen Oberflächenplasmonen effektiv angeregt werden können, wodurch sich ein evaneszentes Lichtfeld 25 in die DNS-Fragmente 12 erstreckt. Ansonsten erfolgt die Ansteuerung als schlitzförmige Blendenöffnungen 42 wie für die 4A bzw. die 5A und 5B beschrieben.
Die Effekte von schlitzförmigen Blendenöffnungen wie den schlitzförmigen Blendenöffnungen 42, 42A und 42B der 4A, 4B, 5A und 5B werden nunmehr erläutert.
Zunächst ist zu bemerken, dass durch die Verwendung von schlitzförmigen Blendenöffnungen mit entsprechender Ausdehnung in Längsrichtung neben dem evaneszenten Lichtfeld auch ein propagierendes Lichtfeld entstehen kann. Für ein Objekt, welches eine Dicke von mehr als einigen Mikrometern aufweist, würde dadurch eine Auflösung jenseits des Beugungslimits verloren gehen. Bei der vorliegenden Anwendung auf DNS-Fragmente spielt dies jedoch keine Rolle, da DNS-Fragmente nur wenige Nanometer dick sind, so dass das propagierende Feld keinen Einfluss auf die Bildgebung hat.
Bei der Anwendung der schlitzförmigen Blendenöffnungen auf DNS-Fragmente wird auch ausgenutzt, dass bei der Probenpräparation wie unter Bezugnahme auf 1 in der Beschreibungseinleitung erläutert, der Abstand der einzelnen DNS-Fragmente zueinander senkrecht zu der Vorzugsrichtung relativ groß ist und mit hoher Wahrscheinlichkeit über dem Beugungslimit liegt. Dies bedeutet, dass mit zumindest sehr hoher Wahrscheinlichkeit durch ein Beugungsscheibchen 30, das heißt einen Detektionsbereich, nur ein DNS-Fragment verläuft und es sehr unwahrscheinlich ist, dass zwei DNS-Fragmente durch das gleiche Beugungsscheibchen 30 verlaufen. Daher ist eine hohe Auflösung nur in der Vorzugsrichtung 44 notwendig, da hier einzelne Farbstoffmoleküle je nach Anordnung der Basen auf dem DNS-Fragment eben auch sehr nahe beieinanderliegen können und dies aufgelöst werden muss, um die Fragmente entsprechend analysieren zu können.
Durch die schlitzförmigen Blendenöffnungen muss ein Abrastern der Beugungsscheibchen nur noch in einer Richtung erfolgen. Hierdurch wird die Zahl von N Bildaufnahmen, die in der Beschreibungseinleitung verwendet wurde, auf N'=√N reduziert. Gleiches gilt auch für die angesprochenen Heterodynverfahren, wo statt N Frequenzen nur noch N' = √N verschiedene Frequenzen nötig sind. Um eine simultane, demodulierte Detektion zu realisieren, genügen also N' Frequenzen, was mit typischen Bildaufnahmezeiten praktisch realisierbar ist. Bei einer typischen Fluoreszenzmarkierung an einer Vier-Basenpaare-Sequenz kann beispielsweise eine Blendengröße (Breite der schlitzförmigen Blendenöffnungen in Querrichtung) von 80 nm verwendet werden, wodurch man mit den sonstigen Parametern N' = 550/(1,2 × 80) ≈ 6 erhält. Bei 50 Bildaufnahmen (Frames) pro Sekunde als Bildrate erhält man dann ein vollständiges, hochaufgelöstes Bild einer Probe in ungefähr 120 ms. Bevorzugt ist es, die Beugungsscheibchen sequenziell abzutasten, indem die Blende mit schlitzförmigen Blendenöffnungen die Beugungsscheibchen jeweils sequenziell abrastert.
Zusätzliche mögliche Merkmale und Abwandlungen werden nunmehr unter Bezugnahme auf die 6 bis 8 beschrieben.
Die 6 zeigt ein Flussdiagram eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel, und die 7 und 8 zeigen Diagramme zur Erläuterung des Verfahrens der 6.
In Schritt 60 der 6 wird ein Übersichtsbild der Probe aufgenommen, das heißt ein Übersichtsbild des Substrats 10 mit den darauf angeordneten DNS-Fragmenten. Dieses Übersichtsbild kann mittels der durch das Detektionsobjektiv 21 repräsentierten Detektionseinrichtung aufgenommen werden, indem sämtliche Nanoblenden des plasmonischen Chips 41 geöffnet werden und somit eine vollständige Beleuchtung erfolgt. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann auch eine Auflichtbeleuchtung, beispielsweise durch das Detektionsobjektiv 21 hindurch, erfolgen. Das Übersichtsbild kann ein Fluoreszenzbild sein, bei dem die Fluoreszenzmoleküle zur Fluoreszenz angeregt werden, oder es kann beispielsweise ein Hellfeld - oder Phasenkontrastbild sein. Aus dem Übersichtsbild wird dann in Schritt 61 die Vorzugsrichtung 44 bestimmt. Zusätzlich oder alternativ können auch die relevanten Gebiete bestimmt werden, das heißt diejenigen Beugungsscheibchen 30, innerhalb derer überhaupt eine Fluoreszenz auftritt oder auftreten kann (weil sich dort Fragmente befinden). Auch wenn diese im Falle des Übersichtsbilds noch nicht mit der zur letztendlichen Analyse notwendigen Auflösung aufgenommen wird, kann doch anhand eines Übersichtsbildes erkannt werden, in welchen Beugungsscheibchen sich überhaupt relevante Gebiete befinden.
In Schritt 62 werden dann die relevanten Gebiete mit schlitzförmigen Blendenöffnungen abgerastert. Dies ist in 7 dargestellt, wo schlitzförmigen Blendenöffnungen nur diejenigen Beugungsscheibchen 30 abrastern, in welchen mittels des Übersichtsbildes in Schritt 61 bestimmt wurde, dass DNS-Fragmente vorhanden sind. Wie bereits erläutert kann das Abrastern sequenziell innerhalb jedes Beugungsscheibchens vorgenommen werden, oder alle schlitzförmigen Blendenöffnungen in dem Beugungsscheibchen können parallel mit verschiedenen Frequenzen zum Öffnen und Schließen angesteuert werden, um mittels eines Heterodynverfahrens Signale von verschiedenen schlitzförmigen Blendenöffnungen zu unterscheiden.
Das Beschränken des Abrasterns auf diejenigen Beugungsscheiben 30, in denen tatsächlich Signal vorhanden ist, kann für die Eindeutigkeit und Zuverlässigkeit der Auswertung vorteilhaft sein, da so Signale von verschiedenen DNS-Fragmenten noch besser getrennt sein können.
Bei der 7 sind alle schlitzförmigen Blendenöffnungen senkrecht zu der Vorzugsrichtung 44 ausgerichtet. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann zudem bei 61 die individuelle Lage der einzelnen Fragmente abgeschätzt werden.
Hierzu kann die Bestimmung der Lage der einzelnen DNS-Fragmente aus einem Fluoreszenzübersichtsbild durch Schwerpunktbestimmung der beugungsbegrenzten Signale über mehrere Beugungsscheiben erfolgen. Dabei werden die beugungsbegrenzt in dem Übersichtsbild vorhandenen Fluoreszenzsignale dann beispielsweise mit einer Linie 80 der 8 gefittet, um die Lage des entsprechenden DNS-Fragments 12 zu approximieren. Auch ohne die Bestimmung des Schwerpunkts kann die Orientierung der einzelnen Fragmente aus der Lage der beugungsbegrenzt aufgenommenen Signale über mehrere Beugungsscheiben approximiert werden. Die Schwerpunktbestimmung erlaubt es jenseits des Beugungslimits die Orientierung des Fragments zu bestimmen, da senkrecht zur Vorzugsrichtung nicht zwei Fluoreszenzmoleküle gleichzeitig zum Signal beitragen können. Bei anderen Ausführungsbeispielen ist diese verbesserte Lagebestimmung mittels Schwerpunktbestimmung nicht realisiert, da im Regelfall die Genauigkeit durch eine „Perlenkette“ von Beugungsscheiben pro Fragment, in denen Fluoreszenz auftritt, für das Verfahren ausreichen ist.
Ist somit die Lage der einzelnen Fragmente bekannt, kann durch entsprechende Ansteuerung nebeneinanderliegender Nanoblenden in dem plasmonischen Chip die Ausrichtung der schlitzförmigen Blendenöffnungen dem jeweiligen Fragment 12 angepasst werden, so dass sie senkrecht zur Richtung des Fragments verläuft. Dies ist in der 8 für Schlitze 42D für zwei verschiedene DNS-Fragmente 12 gezeigt. Auf diese Weise kann die Genauigkeit bei manchen Ausführungsbeispielen noch erhöht werden. Es ist jedoch zu bemerken, dass auch eine Ausrichtung senkrecht zur allgemeinen Vorzugsrichtung 44 wie in 7 gezeigt bereits eine hohe Genauigkeit bei entsprechendem Durchsatz mit sich bringen kann.
Auch wenn bei dem Verfahren in 6 die Vorzugsrichtung der DNS-Fragmente durch ein Übersichtsbild bestimmt wird, ist dies bei anderen Ausführungsbeispielen nicht nötig. Beispielsweise kann die Vorzugsrichtung 44 auch aus der Probenpräparation des in 1 dargestellten Substrats 10 bekannt sein, das heißt durch die Art der Probenpräparation festgelegt sein. In diesem Fall kann beispielsweise das Substrat 10 einfach in einer entsprechenden Richtung in die Vorrichtung 40A oder 40B eingelegt werden.
Die Beleuchtung 28 bzw. 28', die zur Durchführung des Verfahrens verwendet wird, weist dabei eine Beleuchtungsleistung auf. Die benötigte Beleuchtungsleistung ist neben Parametern des Farbstoffs auch von der Bildfeldgröße abhängig. Die Bildfeldgröße sollte für einen hohen Durchsatz so groß wie möglich sein, hängt aber neben dem Bildfeld des Objektivs 21 auch von der Größe des Bildsensors (Kamerachips) und der Pixelgröße auf dem Chip ab. Für typische, hochwertige Kameras mit 2000 × 2000 Pixeln und einer Beugungsscheibe 30 mit einem Durchmesser 550 nm/1,2 -450 nm ergibt sich ein Bildfeld von (0,45 µm × 2000)² = (920 µm)². Dabei werden wiederum eine Wellenlänge von 550 nm und eine numerische Apertur von 1,2 angenommen. Dies erfordert bei einer Objektivvergrößerung von 20 × eine Zwischenbildgröße von 18 mm und eine Gesamtvergrößerung von ca. 6 µm/0,45 µm = 13 × bei typischen 6 µm großen Kamerapixeln. Um ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis von mindestens 10 in jedem Beugungsscheibchen zu erreichen, benötigt man ca. 100 emittierte Photonen während einer jeweiligen Messzeit. Bei 50 Bildern (Frames) pro Sekunde kann eine Messzeit von ca. 10 ms angenommen werden, was 10⁴ emittierten Photonen/s bedeutet. Unter Vernachlässigung von Enhancement-Effekten beträgt die dafür benötigte einfallende Lichtintensität für typische Fluoreszenzmoleküle ca. 10⁴ × 10^-19W/(10^-16cm²) also ungefähr 10 W/cm². Bei einer Chipfläche von 1 mm² bedeutet das eine benötigte Lichtleistung von etwa 100 mW. Diese kann mit entsprechenden Lichtquellen wie cw-(continuous wave, Dauerstrich-) Lasern gut erreicht werden.
Wie aus den obigen Erläuterungen ersichtlich sind verschiedene Variationen möglich. Daher sind die dargestellten Ausführungsbeispiele nicht als einschränkend auszulegen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2019/122161 A1 [0007, 0037]

Claims

Vorrichtung (40A, 40B) zur Untersuchung von Desoxyribonukleinsäure, DNS,-Fragmenten (12), umfassend: einen plasmonischen Chip (41), auf dem DNS-Fragmente (12) anordenbar sind, eine Beleuchtungseinrichtung (28, 28') zum Beleuchten des plasmonischen Chips (41) von einer der den DNS-Fragmenten (12) abgewandten Seite, eine Detektionseinrichtung (21) zum Detektieren von Fluoreszenz von den DNS-Fragmenten (12) in Antwort auf eine Beleuchtung durch die Beleuchtungseinrichtung (28, 28'), und eine Steuerung (45), welche eingerichtet ist, den plasmonischen Chip (41) zum Abrastern der DNS-Fragmente (12) mit schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) anzusteuern, wobei die schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) eine Breite kleiner 100 nm und eine Länge, die mindestens das Doppelte der Breite ist, aufweisen und in Richtung ihrer Länge im Wesentlichen senkrecht zu einer Vorzugsrichtung der DNS-Fragmente (12) ausgerichtet sind.
Vorrichtung (40A, 40B) nach Anspruch 1, wobei die Steuerung (45) eingerichtet ist, das Abrastern für mehrere Bereiche (30) parallel durchzuführen.
Vorrichtung (40A, 40B) nach Anspruch 1, wobei die Bereiche (30) die Größe von Beugungsscheiben der Detektionseinrichtung (21) aufweisen.
Vorrichtung (40A, 40B) nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Länge der schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) sich über mehrere Bereiche (30) erstreckt.
Vorrichtung (40A, 40B) nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Länge der schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) einem Durchmesser der Bereiche (30) ± 20 % entspricht.
Vorrichtung (40A, 40B) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Steuerung (45) eingerichtet ist, das Abrastern sequenziell durchzuführen.
Vorrichtung (40A, 40B) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Steuerung (45) eingerichtet ist, zum Abrastern mehrere schlitzförmige Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) parallel mit verschiedenen Frequenzen zu öffnen und zu schließen.
Vorrichtung (40A, 40B) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Vorrichtung (40A, 40B) eingerichtet ist, vor dem Abrastern ein Übersichtsbild aufzunehmen, und zumindest eines der folgenden auf Basis des Übersichtsbildes zu bestimmen: - die Vorzugsrichtung (44), - Gebiete, in denen ein Fluoreszenzsignal von DNS-Fragmenten (12) vorliegt, und - eine Lage einzelner DNS-Fragmente (12).
Vorrichtung (40A, 40B) nach Anspruch 8, wobei die Steuerung (45) eingerichtet ist, das Abrastern mit den schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) nur in den Gebieten, in denen Fluoreszenz vorliegt, durchzuführen.
Vorrichtung (40A, 40B) nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Steuerung (45) eingerichtet ist, eine Ausrichtung der schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) an die Lage der jeweiligen DNS-Fragmente (12) anzupassen.
Verfahren zur Untersuchung von DNS-Fragmenten (12), umfassend: Anordnen von DNS-Fragmenten (12) auf einem plasmonischen Chip (41), Beleuchten des plasmonischen Chips (41) von einer DNS-Fragmenten (12) abgewandten Seite, und Ansteuern des plasmonischen Chips (41), um die DNS-Fragmente (12) mit schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D), wobei eine Breite der schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) kleiner als 100 nm liegt und eine Länge der schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) mindestens das Doppelte der Breite besteht und sich im Wesentlichen senkrecht zu einer Vorzugsrichtung (44) der DNS-Fragmente (12) erstreckt, und Detektieren von Fluoreszenz von den DNS-Fragmenten (12).
Verfahren (40A, 40B) nach Anspruch 11, wobei das Abrastern für mehrere Bereiche (30) parallel durchgeführt wird.
Verfahren (40A, 40B) nach Anspruch 11, wobei die Bereiche (30) die Größe von Beugungsscheiben des Detektierens aufweisen.
Verfahren (40A, 40B) nach Anspruch 12 oder 13, wobei eine Länge der schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) sich über mehrere Bereiche (30) erstreckt.
Verfahren (40A, 40B) nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Länge der schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) einem Durchmesser der Bereiche (30) ± 20 % entspricht.
Verfahren (40A, 40B) nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei das Abrastern sequenziell erfolgt.
Verfahren (40A, 40B) nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei zum Abrastern mehrere schlitzförmige Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) parallel mit verschiedenen Frequenzen geöffnet und geschlossen werden.
Verfahren (40A, 40B) nach einem der Ansprüche 11 bis 17, weiter umfassend: Aufnehmen eines Übersichtsbildes vor dem Abrastern , und Bestimmen zumindest eines der folgenden auf Basis des Übersichtsbildes: - die Vorzugsrichtung (44), - Gebiete, in denen ein Fluoreszenzsignal von DNS-Fragmenten (12) vorliegt, und - eine Lage einzelner DNS-Fragmente (12).
Verfahren (40A, 40B) nach Anspruch 18, wobei das Abrastern mit den schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) nur in den Gebieten, in denen Fluoreszenz vorliegt, durchzuführen.
Verfahren (40A, 40B) nach Anspruch 18 oder 19, weiter umfassend Anpassen einer Ausrichtung der schlitzförmigen Blendenöffnungen (42, 42A, 42B, 42D) an die Lage der jeweiligen DNS-Fragmente (12).