DE102022107397A1

DE102022107397A1 - Vorrichtung zum Bestimmen des Vorliegens einer Eigenschaft einer Probe und insbesondere zur Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei

Info

Publication number: DE102022107397A1
Application number: DE102022107397.1A
Authority: DE
Inventors: Helene DÖRKSEN; Harald Klausing; Jürgen Krahl
Original assignee: Technische Hochschule Ostwestfalen Lippe Koerperschaft Des Oeffentlichen Rechts
Current assignee: Technische Hochschule Ostwestfalen Lippe Koerperschaft Des Oeffentlichen Rechts
Priority date: 2022-03-29
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2023-10-05
Also published as: WO2023186734A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung (10) zum Bestimmen des Vorliegens einer Eigenschaft einer Probe (12), mit- einer Lichtquelle (14) zur Emission von gepulster Anregungsstrahlung (16),- einer Detektionsvorrichtung (18) zum Erfassen einer von der Probe (12) ausgesendeten Eigenfluoreszenzstrahlung (20), und- einer computerbasierten Auswerteeinrichtung (22), wobei die Detektionsvorrichtung (18) dazu ausgestaltet ist, bei unterschiedlichen Wellenlängen mittels zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung die Eigenfluoreszenzstrahlung (20) der Probe (12) zeitaufgelöst zu erfassen und der Auswerteeinrichtung (22) zweidimensionale Daten mit einer Wellenlängendimension und einer Zeitdimension bereitzustellen, wobei die Auswerteeinrichtung (22) dazu ausgestaltet ist, mittels eines Klassifikators die bereitgestellten Daten in Klassen zu klassifizieren, wobei die Auswerteeinrichtung (22) dazu ausgestaltet ist, bei der Klassifikation auf Basis von in der Zeitdimension der Daten gebildeten Merkmalen spezifische zu priorisierende Wellenlängen zu identifizieren, und wobei die Auswerteeinrichtung (22) dazu ausgestaltet ist, zum Bestimmen des Vorliegens der Eigenschaft der Probe (12) die Daten bei den spezifischen Wellenlängen priorisiert zu berücksichtigen.Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei (12).Zudem Betrifft die Erfindung die Verwendung der obigen Vorrichtung (10).

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Bestimmen des Vorliegens einer Eigenschaft einer Probe, und bevorzugt zum Bestimmen eines Geschlechts eines befruchteten Vogeleis.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der obigen Vorrichtung.
Derzeit gibt es das Bestreben das Geschlecht eines zukünftigen Kükens bereits beim befruchteten Hühnerei bestimmen zu können.
Im Vogelei entstehen im Verlauf der Entwicklung bei männlichen und weiblichen Küken unterschiedliche Fluorophore. Die entsprechenden Moleküle besitzen aufgrund ihrer komplexen Struktur ein nicht vorhersagbares Fluoreszenzvermögen. Bei der Fluoreszenz werden energetische Übergänge vom angeregten Zustand zum Grundzustand des Moleküls beobachtet. Dieser Vorgang ist zeitabhängig.
Das Dokument WO 2021/144420 A1 beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren zur optischen in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei. Die Vorrichtung umfasst eine Lichtquelle zur Emission von Anregungsstrahlung für eine Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich im Inneren des Vogeleis, eine spektroskopische Einrichtung zur zeit- und/oder spektralaufgelösten Analyse von aus dem Bereich im Inneren des Vogeleis emittierter Fluoreszenzstrahlung, und eine Auswerteeinheit zur Geschlechtsbestimmung aus den mittels der spektroskopischen Einrichtung ermittelten Daten.
Ausgehend davon ist es Aufgabe der Erfindung Mittel anzugeben, bei denen die Treffsicherheit der in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem vereinfachten Aufbau der Vorrichtung erhöht ist.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben, die jeweils einzeln oder in Kombination einen Aspekt der Erfindung darstellen können.
Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung zum Bestimmen des Vorliegens einer Eigenschaft einer Probe, und bevorzugt zum Bestimmen eines Geschlechts eines befruchteten Vogeleis, bereitgestellt mit

- einer Lichtquelle zur Emission von gepulster Anregungsstrahlung,
- einer Detektionsvorrichtung zum Erfassen einer von der Probe ausgesendeten Eigenfluoreszenzstrahlung, und
- einer computerbasierten Auswerteeinrichtung,

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei, mit den Schritten

- Emission von gepulster Anregungsstrahlung für eine Anregung von Eigenfluoreszenz in einem Bereich im Inneren des Vogeleis, auf einer Eimembran des Vogeleis und/oder auf der Eischale des Vogeleis mittels einer Lichtquelle,
- zeitaufgelöstes Erfassen der aus dem Bereich im Inneren, von der Eimembran und/oder von der Eischale des Vogeleis emittierter Eigenfluoreszenzstrahlung mittels einer Detektionsvorrichtung bei unterschiedlichen Wellenlängen durch zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung,
- Bereitstellen zweidimensionale Daten mit einer Wellenlängendimension und einer Zeitdimension durch die Detektionsvorrichtung an eine Auswerteeinrichtung,
- Geschlechtsbestimmung des befruchteten Vogeleis aus den bereitgestellten zweidimensionalen Daten mittels der Auswerteeinrichtung, durch

Klassifikation der bereitgestellten Daten mittels eines Klassifikators in zwei Klassen, wobei eine erste Klasse ein männliches Geschlecht des befruchteten Vogeleis und eine zweite Klasse ein weibliches Geschlecht des befruchteten Vogeleis repräsentiert, wobei bei der Klassifikation auf Basis von in der Zeitdimension der Daten gebildeten Merkmalen spezifische zu priorisierende Wellenlängen identifiziert werden, und Geschlechtsbestimmung des Vogeleis durch priorisierte Berücksichtigung der Daten bei den spezifischen Wellenlängen.
Das Verfahren wird bevorzugt mittels der obigen Vorrichtung durchgeführt.
Es wurde festgestellt, dass bei der Klassifikation der zweidimensionalen Daten in Klassen zwecks Bestimmens des Vorliegens einer Eigenschaft der Probe eine verbesserte Treffsicherheit erzielt wird für Daten mit einer höheren Zeitauflösung. Zudem wurde festgestellt, dass im Abklingverhalten der Eigenfluoreszenzstrahlung vorhandene Information nicht bei allen Wellenlängen gleich relevant ist, sondern dass spezifische Wellenlängen identifiziert werden können, deren prioritäre Berücksichtigung bei der Klassifikation eine verbesserte Treffsicherheit erlauben. Entsprechend weist die Vorrichtung und das Verfahren durch die Erfassung der Eigenfluoreszenzstrahlung mittels Einzelphotonenzählung und durch die Identifikation der spezifischen Wellenlängen, eine verbesserte Treffsicherheit auf.
In Bezug zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei ist in anderen Worten also die Kenntnis der Lebensdauer und des Abklingprofils angeregter molekularer Zustände (Zeitdimension der zweidimensionalen Daten) neben der Energie der emittierten Photonen (Wellenlängendimension der zweidimensionalen Daten) für die Identifikation des Geschlechtes des befruchteten Vogeleis relevant, wobei die Zeitdimension bei den spezifischen Wellenlängen gegenüber anderen Wellenlängen aussagekräftigere Informationen umfasst und entsprechend bei der Auswertung priorisiert berücksichtigt wird.
In Bezug zur Vorrichtung ist vorgesehen, dass die Vorrichtung die Lichtquelle zur Emission der gepulsten Anregungsstrahlung, die Detektionsvorrichtung zum Erfassen der Eigenfluoreszenzstrahlung bei mehreren unterschiedlichen Wellenlängen mittels zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung und die computerbasierten Auswerteeinrichtung umfasst.
Zwecks Detektion der Eigenfluoreszenzstrahlung mit hoher Zeitauflösung wird vorliegend die Eigenfluoreszenzstrahlung mittels zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung, TCSPC (engl. Time Correlated Single Photon Counting), erfasst. Anstatt wie im Stand der Technik ( WO 2021/144420 A1 ), bei dem ein Verfahren Verwendung findet, bei dem jeweils zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einem Anregungspuls der Lichtquelle mittels einer ICCD Kamera das komplette Spektrum aufgenommen wird, wird bei der TCSPC nicht nach jedem Anregungspuls das komplette Spektrum aufgezeichnet.
Bei TCSPC werden einzelne Photonen eines periodischen Lichtsignals - vorliegend die Eigenfluoreszenzstrahlung - detektiert und die jeweiligen Zeiten zwischen dem Anregungspuls der gepulsten Anregungsstrahlung und dem Eintreffen des Photons in der Detektionsvorrichtung bestimmt. In anderen Worten werden also mittels der gepulsten Anregungsstrahlung der Lichtquelle die Fluorophore in der zu untersuchenden Probe - bevorzugt dem Vogelei - angeregt. Die Zeitmessung wird durch den Anregungspuls gestartet und das beim Übergang vom angeregten Zustand in den Grundzustand emittierte Photon stoppt die Messung. Die Messung wird vielfach wiederholt und die einzelnen zeitlich korrelierten Photonen (in Bezug zum Anregungspuls) werden entsprechend ihrer gemessenen Zeit in ein so genanntes TCSPC-Histogramm einsortiert. Das TCSPC-Histogramm repräsentiert den zeitlichen Verlauf der Eigenfluoreszenzstrahlung nach der Anregung. Bevorzugt weist das mittels der Detektionsvorrichtung erzeugte TCSPC-Histogramm eine Klassenbreite, die auch Bin-Width oder Behälterbreite genannt wird, für die Histogrammklassen von 1 ps bis 50 ps, bevorzugt von 10 ps bis 20 ps auf. Bevorzugt lässt sich die Klassenbreite des TCSPC-Histogramms an die Vorrichtung und/oder zu untersuchende Probe anpassen. Weiter bevorzugt wird bei der Anpassung der Klassenbreite des TCSPC-Histogramms, eine zeitliche Auflösung der gesamten Vorrichtung - und besonders bevorzugt eine Halbwertsbreite (FWHM) der Instrument Response Function (IRF) berücksichtigt. Die FWHM der IRF ist im Wesentlichen von der Lichtquelle und einer von der Lichtquelle erzeugten Pulslänge und/oder von einem Detektorelement der Detektionsvorrichtung abhängig.
Anders formuliert wird also nicht zu unterschiedlichen Zeitpunkten das komplette Spektrum (Wellenlängendimension der zweidimensionalen Daten) gemessen, sondern das den zeitlichen Verlauf der Eigenfluoreszenzstrahlung repräsentierende TCSPC-Histogramm - also die Zeitdimension der zweidimensionalen Daten - wird mittels einer Vielzahl von Messzyklen - typischerweise im Bereich von 10⁶ - ermittelt, wobei ein Messzyklus jeweils von einem Anregungspuls der Lichtquelle gestartet wird.
Die Detektionsvorrichtung ist dazu ausgestaltet der Auswerteeinrichtung zweidimensionale Daten mit einer Wellenlängendimension und einer Zeitdimension bereitzustellen. Die zweidimensionalen Daten stellen bevorzugt das Abklingverhalten der Eigenfluoreszenz (Zeitdimension) bei den unterschiedlichen Wellenlängen (Wellenlängendimension) dar. Die zweidimensionalen Daten können der Auswerteeinrichtung beispielsweise in Form einer m × n Matrix übergeben werden. Bevorzugt weisen die zweidimensionalen Daten in der Zeitdimension mehr Datenpunkte auf, als in der Wellenlängendimension. Dies hat sich für die Bestimmung des Vorliegens einer Eigenschaft der Probe und insbesondere für das Bestimmen des Geschlechts des Vogeleis als besonders vorteilhaft erwiesen.
Auf Basis der zweidimensionalen Daten kann die Auswerteeinrichtung die zu priorisierenden spezifischen Wellenlängen identifizieren. Dies wird erreicht, indem der Klassifikator die bereitgestellten Daten in Klassen klassifiziert. Je nach Probe und möglichen Eigenschaften der Probe, kann eine unterschiedliche Anzahl von Klassen vorhanden sein, wobei die Klassen mögliche Eigenschaften der Probe repräsentieren.
Bevorzugt basiert das Identifizieren der spezifischen Wellenlängen auf dem Prinzip des überwachten maschinellen Lernens, wobei die spezifischen Wellenlängen aus den zweidimensionalen Daten, die die Proben entsprechender Klassen repräsentieren, mittels der Auswerteeinrichtung errechnet werden. Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung ist die Auswerteeinrichtung derart ausgestaltet, dass aus dem Abklingverhalten der Eigenfluoreszenz der Wellenlängen - also aus der Zeitdimension der zweidimensionalen Daten - ein oder mehrere charakteristische Merkmale und dazugehörende klassenspezifische Trenneigenschaften berechenbar sind und/oder berechnet werden. Die charakteristischen Merkmale können aus Zeitreihen, die einzelne Wellenlängen repräsentieren, errechnet werden.
Alternativ können die charakteristischen Merkmale aus linear Kombinationen von Zeitreihen, die einzelne Wellenlängen repräsentieren, errechnet werden.
Weiter bevorzugt ist die Auswerteeinrichtung derart ausgestaltet, dass diejenigen Wellenlängen mit relativ höherer Trenneigenschaft als spezifische Wellenlängen identifiziert werden. Bevorzugt werden nur so viele spezifische Wellenlängen identifiziert, bis die gewünschte und/oder für die betrachtete Probe ausreichende Klassifikationsquote erreicht ist. Die nichtpriorisierten Wellenlängen liefern bevorzugt keinen Beitrag zur Trennung der Klassen, werden daher vernachlässigt und für die Klassifikation nicht weiter berücksichtigt.
Es hat sich gezeigt, dass eine Klassifikation ohne Priorisierung der Wellenlänge, was äquivalent zu einer Klassifikation ist, bei der alle Wellenlängen gleich priorisiert sind, eine niedrigere Trefferquote aufweist, als eine Klassifikation mit Priorisierung der Wellenlänge. Weiter bevorzugt wird bei der Identifikation der spezifischen Wellenlängen eine Metrik der Trenneigenschaftsanalyse berücksichtigt. In Zusammenhang mit dem Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung ist bevorzugt vorgesehen, dass lineare Diskriminanzanalyse (LDA) als Metrik verwendet wird. LDA ist besonders geeignet für Daten, die eine Gaußverteilung aufweisen.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Auswerteeinrichtung dazu ausgestaltet ist, zum Bestimmen des Vorliegens der Eigenschaft der Probe die Daten bei den spezifischen Wellenlängen priorisiert zu berücksichtigen, und insbesondere in der Zeitdimension der Daten gebildete Merkmale bei den spezifischen Wellenlängen priorisiert zu berücksichtigen. In Bezug auf das Verfahren erfolgt die Geschlechtsbestimmung des Vogeleis also bevorzugt durch priorisierte Berücksichtigung der Daten bei den spezifischen Wellenlängen und insbesondere indem in der Zeitdimension der Daten gebildete Merkmale bei den spezifischen Wellenlängen priorisiert berücksichtigt werden.
Die Vorrichtung zum Bestimmen des Vorliegens einer Eigenschaft einer Probe kann nicht nur zum Bestimmen des Geschlechts des befruchteten Vogeleis verwendet werden. Die Vorrichtung eignet sich auch, um Proben hinsichtlich anderer Eigenschaften zu klassifizieren. Dafür ist es nicht notwendig die Proben besonders vorzubereiten. Insbesondere wenn Proben und/oder Objekte hinsichtlich einer Eigenschaft authentifiziert werden, also festgestellte wird, ob eine behauptete Eigenschaft der Probe zutreffend ist, wie beispielsweise bei der Fälschung-Authentifikation bei Banknoten, oder bei der Authentifikation von einer behaupteten Herkunftseigenschaft eines Lebensmittels, kann die beschriebenen Vorrichtung verwendet werden. Besonders geeignet ist die Vorrichtung für Authentifikationen, wenn die Probe, die die behauptete Eigenschaft aufweist - also beispielsweise die originale Banknote - sehr ähnlich ist zu der Probe, die die behauptete Eigenschaft nicht aufweist - im vorliegenden Beispiel also die gefälschte Banknote.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung ist die Detektionsvorrichtung dazu ausgestaltet, bei den als priorisiert identifizierten spezifischen Wellenlängen mittels zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung die Eigenfluoreszenzstrahlung der Probe zeitaufgelöst zu erfassen und der Auswerteeinrichtung zweidimensionale Daten mit der Wellenlängendimension und der Zeitdimension bereitzustellen, wobei die Wellenlängendimension der Anzahl spezifischer Wellenlängen entspricht und wobei die Auswerteeinrichtung dazu ausgestaltet ist, mittels des Klassifikators die bereitgestellten Daten in die Klassen zu klassifizieren. In anderen Worten bestimmt also die Auswerteeinrichtung auf Basis der zweidimensionalen Daten, ob die Eigenschaft in einer Probe vorliegt oder nicht. Dies wird bevorzugt erreicht, indem von der Detektionsvorrichtung gezielt bei den spezifischen Wellenlängen das TCSP-Histogramm ermittelt und derart Zeitreihen lediglich bei den spezifischen Wellenlängen der Auswerteeinrichtung zur Verfügung stellt. Derart ist es möglich eine hohe Trefferquote beim Bestimmen der Eigenschaft der Probe zu ermöglichen, ohne dass die Eigenfluoreszenz bei allen möglichen Wellenlängen erfasst werden muss.
Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist in Bezug zur Vorrichtung vorgesehen, dass die Lichtquelle als gepulstes Anregungslasersystem oder als gepulst betriebene LED ausgestaltet ist. Besonders bevorzugt ist die Lichtquelle derart ausgestaltet, dass die Probe mit einer Wellenlänge im UV-Bereich, besonders bevorzugt in einem Bereich um 266 nm und/oder bei 266 nm angeregt wird. Weiter bevorzugt ist die Lichtquelle dazu ausgestaltet als Anregungsstrahlung eine Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich von größer oder gleich 250 nm bis kleiner oder gleich 520 nm, bevorzugt größer oder gleich 280 nm bis kleiner oder gleich 400 nm zu emittieren.
Hinsichtlich des Anregungslasersystems ist weiterhin bevorzugt vorgesehen, dass das Anregungslasersystem als ein Festkörperlaser , mit Frequenzkonversionsstufe und/oder optischem parametrischen Oszillator (OPO) ausgestaltet ist. Bevorzugt wird ein Titan-Saphir Laser mit Frequenzkonversionsstufe und/oder optischem parametrischen Oszillator (OPO) verwendet. Alternativ ist das Anregungslasersystem bevorzugt als ein frequenzvervierfachter Nd:YAG-Laser mit optionalem optischem parametrischen Oszillator ausgestaltet. Weiter bevorzugt ist das Anregungslasersystem ein Diodenlasersystem, bevorzugt in MOFA-Konfiguration. Weiter bevorzugt ist das Anregungslasersystem als ein Master Oszillator Power Amplifier (MOPA) und/oder als ein Master Oszillator Fiber Amplifier (MOFA) ausgestaltet. MOPA und/oder MOFA sind Lasersysteme, die einen Seed Laser als Master Oszillator verwenden, um einer Verstärkungseinheit die Eigenschaften der Emissionsstrahlung bei hoher Kohärenz vorzugeben. Besonders bevorzugt wird eine Infrarotlaserdiode und/oder eine Nahinfrarotlaserdiode als Master Oscillator bzw. Seed Laser verwendet, um in der MOFA-Anordnung einem mehrstufigen Faserverstärker die Eigenschaften der Laseremission vorzugeben. Mittels doppelbrechender Kristalle können durch nichtlinearen Frequenzkonversion zudem die Wellenlängen der zweiten, dritten und/oder vierten Harmonischen erzeugt werden. Dies erlaubt einen besonderes kompakten und transportablen Messaufbau.
Alternativ kann vorgesehen sein, dass die Lichtquelle als gepulst betriebene LED ausgestaltet ist. LEDs haben den Vorteil, dass sie kostengünstig sind. Zudem kann die im Vergleich zum Anregungslasersystem erhöhte spektrale Bandbreite der LED-Emission den Vorteil haben, dass durch die LED als Lichtquelle eine größere Zahl von Absorptionsprozessen bei unterschiedlichen Fluorophoren in der Probe induziert werden. Bevorzugte LEDs zur Verwendung als Lichtquelle emittieren bei Wellenlängen im UV-Bereich, besonders bevorzugt bei 265 nm, 285 nm, 310 nm und/oder > 310 nm, mit einer spektralen Bandbreite von jeweils ± 10 nm. Zudem kann die spektrale Bandbreite durch entsprechende Interferenzfilter reduziert werden.
Um eine möglichst hohe Zeitauflösung bei der Detektion der Eigenfluoreszenzstrahlung zu ermöglichen ist es von Vorteil, wenn die Länge des Anregungspulses der gepulsten Anregungsstrahlung möglichst kurz ist. In diesem Zusammenhang ist bevorzugt vorgesehen, dass die Lichtquelle dazu ausgestaltet ist gepulste Anregungsstrahlung mit einer Pulslänge von ≤ 500 ps, bevorzugt ≤ 200 ps, besonders bevorzugt ≤ 100 ps zu emittieren. Dies ist insbesondere mittels der Ausgestaltung der Lichtquelle als gepulstes Anregungslasersystem möglich. Alternativ ist vorgesehen, dass die Lichtquelle dazu ausgestaltet ist gepulste Anregungsstrahlung mit einer Pulslänge von ≤ 5 ns, bevorzugt ≤ 2 ns, besonders bevorzugt ≤ 1 ns zu emittieren. Dies ist insbesondere in Zusammenhang mit der Ausgestaltung der Lichtquelle als LED möglich. Die geringe Pulslänge erhöht die Zeitauflösung und derart die Treffsicherheit beim Bestimmen des Vorliegens einer Eigenschaft der Probe.
Da bei der mittels TCSPC erfassten Eigenfluoreszenzstrahlung eine Vielzahl von Messzyklen zur Generierung des TCSPC-Histogramms durchgeführt werden, ist zudem bevorzugt vorgesehen, dass die Lichtquelle dazu ausgestaltet ist, gepulste Anregungsstrahlung mit einer Pulsrepetitionsrate von ≥ 10 MHz zu emittieren. Dies verringert den Zeitaufwand für das Erfassen der zweidimensionalen Daten erheblich.
Zudem wird bei TCSPC zum Erfassen der Eigenfluoreszenzstrahlung die Anregungsintensität bevorzugt derart klein gehalten, dass eine Detektionswahrscheinlichkeit für ein Fluoreszenzphoton pro Anregungszyklus kleiner oder gleich 1 ist, sprich im Rahmen jedes Anregungszyklus höchstens ein Photon detektiert wird. In diesem Zusammenhang ist gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, dass die Vorrichtung im Strahlengang zwischen der Lichtquelle und der Probe einen optischen Abschwächer zum Einstellen einer Energie der Anregungsstrahlung umfasst. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen variablen Abschwächer, insbesondere um einen variablen Laserstrahlabschwächer. Weiter bevorzugt ist der Abschwächer derart, dass die Energie pro Puls zur Anregung der Probe derart klein ist, dass die Detektionswahrscheinlichkeit für ein Fluoreszenzphoton pro Anregungszyklus kleiner oder gleich 1 ist. Typerweise kann eine Einzelphotonenstatistik ermöglicht werden, wenn ein Zählimpuls am Detektorelement im Mittel nur durch einen von 20 bis 100 Anregungspulsen ausgelöst wird. In anderen Worten bedeutet dies, dass eine Zählrate am Detektorelement bevorzugt im Bereich von 1-5 % der Anregungsrate liegt. Dies heißt beispielsweise, dass bei einer Pulsrepetitionsrate von 80 MHz der Abschwächer derart eingestellt ist, dass die mittlere Zählrate des Detektorelementes 4 MHz nicht überschreitet. Derart kann auf einfach Weise sichergestellt werden, dass das TCSPC-Histogramm nicht durch vom sogenannten Pile-up-Effekt verursachten systematischen Messfehlern behaftet ist.
Wie bereits erwähnt ist die Detektionsvorrichtung dazu ausgestaltet, bei unterschiedlichen Wellenlängen mittels zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung die Eigenfluoreszenzstrahlung der Probe zeitaufgelöst zu erfassen. Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist in diesem Zusammenhang vorgesehen, dass die Detektionsvorrichtung zum Erfassen der Eigenfluoreszenzstrahlung bei unterschiedlichen Wellenlängen einen Monochromator, einen Spektrographen und/oder ein Spektrometer umfasst. Dies vereinfacht die Erfassung der der Eigenfluoreszenzstrahlung bei unterschiedlichen Wellenlängen stark. Die Detektionsvorrichtung kann beispielsweise ein schrittweise drehbares Beugungsgitter und einen Monochromator umfassen. Dies hat den Vorteil, dass ein breiter Spektralbereich beispielsweise von 370 nm bis 700 nm schrittweise abgefahren werden kann und für die abgefahrenen Wellenlängen jeweils ein TCSPC-Histogramm erfasst werden kann.
In einer alternativen Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung für die spektrale Trennung bevorzugt einen austauschbaren Interferenzfilter zwischen der Probe und einem Detektorelement der Detektionsvorrichtung. Der Interferenzfilter kann je nach zu erfassender Wellenlänge gegen einen anderen Interferenzfilter ausgetauscht werden. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn gezielt bei den als priorisiert identifizierten spezifischen Wellenlängen mittels zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung die Eigenfluoreszenzstrahlung der Probe zeitaufgelöst erfasst wird. In einer weiteren bevorzugten Alternative umfasst die Detektionsvorrichtung mehrere Detektorelemente und einen oder mehrere Strahlteiler, der die Eigenfluoreszenzstrahlung in mehrere Teilstrahlen aufspaltet. Derart kann bei jedem Teilstrahl mittels eines bevorzugt austauschbaren Interferenzfilters und mittels des Detektorelementes ein TCSPC-Histogramm aufgezeichnet werden.
Weiterhin ist in Zusammenhang mit der Detektionsvorrichtung vorgesehen, dass die Detektionsvorrichtung als Detektorelement bevorzugt einen Hybrid-Photomultiplier (Hybrid-PMT) - auch Hybridphotodetektor genannt - umfasst. Bevorzugt handelt es sich beim Detektorelement um eine Kombination eines Front End-PMT mit einer Avalanche-Photodiode (APD) als zusätzlicher Verstärkungsstufe. Weiter bevorzugt ist das Detektorelement dazu ausgestaltet ein in der letzteren Verstärkungsstufe ausgelöste Photoelektron um das 50000-fache bis 150000-fache zu vervielfältigen. Weiter bevorzugt ist das Detektorelement dazu ausgestaltet eine Zeitauflösung von ca. 120 ps (FWHM der Instrument Response Function (IRF)) zu erreichen.
Das Detektorelement ist weiter bevorzugt als Mehrkanaldetektor, bevorzugt als Multichannel-Plate-PMT (MC-PMT) ausgestaltet, so dass gleichzeitig mehrere unterschiedliche Wellenlängen erfasst werden können. Beispielsweise weist der Mehrkanaldetektor zur Erfassung 16 Kanäle auf. Die Ausgestaltung der Detektionsvorrichtung als Kombination aus Spektrographen mit starr positioniertem Beugungsgitter und MCP-PMT ermöglicht eine gleichzeitige, multi-spektrale Detektion bei äquidistanter Unterteilung des insgesamt erfassten Wellenlängenbereichs. Die Unterteilung und die Breite der Wellenlängenintervalle richtet sich nach der Anzahl Kanäle des MCP-PMT.
Bevorzugt ist die Detektionsvorrichtung dazu ausgestaltet die Eigenfluoreszenzstrahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich von größer oder gleich 200 nm bis kleiner oder gleich 700 nm zu empfangen.
In Zusammenhang mit dem TCSPC-Histogramm ist gemäß einer bevorzugten Weiterbildung vorgesehen, dass die Vorrichtung zur Generierung eines synchron zum Anregungspulses erzeugbaren elektrischen Trigger-Signals einen Pulssignalgenerator umfasst. Derart kann mittels eines Zeit-Amplitudenwandler mit Hilfe des synchron zum Anregungspuls erzeugten elektrischen Trigger-Signals eine schnelle Spannungsrampe gestartet werden, die durch die Messung eines Photons der Eigenfluoreszenzstrahlung gestoppt wird. Als Pulssignalgenerator kann beispielsweise direkt das Anregungslasersystem verwendet werden, der das elektrische Trigger-Signal zur Verfügung stellt. Alternativ kann das elektrische Trigger-Signal mit Hilfe einer Trigger-Photodiode generiert werden, für die ein Bruchteil der Anregungsstrahlung über einen Strahlteiler ausgekoppelt wird.
Zudem ist in diesem Zusammenhang weiter bevorzugt vorgesehen, dass das Detektorelement für jedes detektierte Photon bevorzugt einen elektrischen Ausgangspuls erzeugt, der in einem schnellen Diskriminator zu einem Normpuls geformt wird. Derart kann der Detektor-Normpuls die vom elektrischen Trigger-Signal des Anregungslasersystems gestartete Spannungsrampe stoppen. Jedem Stopp-Zeitpunkt ist also eine Spannung zugeordnet, so dass derart das TCSPC-Histogramm generieren werden kann.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist bevorzugt vorgesehen, dass die Vorrichtung im Strahlengang zwischen der Probe und der Detektionsvorrichtung einen Langpass-Kantenfilter, zur Filterung einer Wellenlänge der Anregungsstrahlung umfasst. Derart kann auf einfache Art die an der Probe gestreute Anregungsstrahlung herausgefiltert werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung ist zudem vorgesehen, dass die Vorrichtung im Strahlengang zwischen der Probe und der Detektionsvorrichtung eine optische Komponente zum Fokussieren der von der Probe ausgesendeten Eigenfluoreszenzstrahlung auf die Detektionsvorrichtung umfasst. Die optische Komponente kann beispielsweise als Linse und insbesondere als Sammellinse ausgestaltet sein. Insbesondere bei Verwendung von LEDs als Lichtquelle kann darüber hinaus vorgesehen sein, dass die Vorrichtung zwischen Lichtquelle und Probe optische Komponenten zum Fokussieren der Anregungsstrahlung umfasst.
Hinsichtlich der Bestrahlung der Probe ist gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, dass die Vorrichtung dazu ausgestaltet ist, die Probe im Freiraum mit der Anregungsstrahlung zu bestrahlen und derart ausgestaltet ist, dass die in einem Winkel ungleich Null zur Anregungsstrahlung abgestrahlte Eigenfluoreszenzstrahlung im Freiraum auf die Detektionsvorrichtung gelenkt wird. Mit Freiraum ist in diesem Zusammenhang gemeint, dass das Licht nicht über ein faserbasiertes Lichtleitsystem transportiert wird, sondern im Raum frei propagiert. In dieser bevorzugten Weiterbildung weist die Vorrichtung also kein faserbasiertes Lichtleitsystem auf, mittels dessen das Licht geleitet wird, wie beispielsweise eine optische Faser. Durch den Verzicht auf ein faserbasiertes Lichtleitsystem kann verhindert werden, dass es zu Verlusten der Pulsenergie im Lichtleitsystem und/oder zu einer Verbreiterung des Anregungspulses kommt, was insbesondere bei Anregungswellenlängen im UV-Bereich problematisch sein kann. Zudem weist die Vorrichtung ohne faserbasiertes Lichtleitsystem den Vorteil auf, dass auf einen Messkopf zur Bestrahlung der Probe und/oder zum Empfangen der Eigenfluoreszenzstrahlung aus der Probe verzichtet werden kann, so dass die Vorrichtung sehr einfach aufgebaut ist.
In Zusammenhang mit der Propagation im Freiraum ist gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung vorgesehen, dass die Vorrichtung eine Abschirmeinrichtung zum Abschirmen von Umgebungslicht aufweist. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Abschirmeinrichtung um eine Probenkammer, die derart ausgestaltet ist, dass die von der Lichtquelle abgegebene Anregungsstrahlung von Umgebungslicht abgeschirmt zur in der Probenkammer vorliegenden Probe propagieren kann, und dass die von der Probe ausgesendete Eigenfluoreszenzstrahlung von Umgebungslicht abgeschirmt zur Detektionsvorrichtung propagieren kann.
Gemäß einer alternativen Weiterbildung der Erfindung ist bevorzugt vorgesehen, dass die Vorrichtung einen Messkopf umfasst,

a) wobei der Messkopf zum Aussenden der Anregungsstrahlung in und/oder auf die Probe ausgestaltet ist, oder
b) wobei der Messkopf zum Empfangen der Eigenfluoreszenzstrahlung aus und/oder von der Probe ausgestaltet ist, oder
c) wobei der Messkopf zum gemeinsamen Aussenden der Anregungsstrahlung in und/oder auf die Probe und zum Empfangen der Eigenfluoreszenzstrahlung aus und/oder von der Probe ausgestaltet ist.

Bevorzugt kann vorgesehen sein, dass der Messkopf an ein Lichtleitsystem angeschlossen ist. Weiter bevorzugt kann es sich insbesondre im Falle c), um ein Y-förmiges Lichtleitsystem mit zwei Lichtleitersträngen handeln, die auf Seiten des Messkopfes zusammengeführt sind.
Dabei ist insbesondere vorgesehen, dass Lichtleiterstränge als Lichtleiterbündel ausgebildet sind, deren einzelne Lichtleiter auf Seiten eines Kopfendes des Messkopfes ineinandergeschlungen, beispielsweise verzwirbelt sind. Alternativ können die einzelnen Lichtleiter über den in der Regel kreisförmigen Querschnitt gleichmäßig verteilt sein. Weiter alternativ können die die Anregungsstrahlung führenden Lichtleiter beispielsweise in einer kreisförmigen Anordnung im inneren Bereich des Querschnittes liegen, und die die Eigenfluoreszenzstrahlung führenden Lichtleiter beispielsweise in einem konzentrischen Ring außen herum angeordnet sein. Derart kann also mit dem gleichen Messkopf auf einfache Weise das Aussenden der Anregungsstrahlung in und/oder auf die Probe und das Empfangen der Eigenfluoreszenzstrahlung aus und/oder von der Probe realisiert werden.
Hinsichtlich der computerbasierten Auswerteeinrichtung ist wie bereits erwähnt vorgesehen, dass die Auswerteeinrichtung dazu ausgestaltet ist, mittels des Klassifikators die bereitgestellten Daten in Klassen zu klassifizieren, wobei wenigstens eine Klasse die Eigenschaf der Probe repräsentiert. In diesem Zusammenhang ist bevorzugt vorgesehen, dass der Klassifikator ein linearer Klassifikator ist. Ein linearer Klassifikator trennt die Klassen entlang einer linearen Hyperebene. Weiter bevorzugt ist vorgesehen, dass der Klassifikator mittels Merkmalselektion mit Hilfe von linearer Diskriminanzanalyse auf Basis von Trainingsdaten konstruiert wird. In anderen Worten handelt es sich bevorzugt um eine auf maschinellem Lernen beruhende Auswerteeinrichtung. Bevorzugt lernt die Auswerteeinrichtung aus Beispielen - den Trainingsdaten - und kann diese nach Beendigung der Lernphase verallgemeinern. Dazu bauen Algorithmen beim maschinellen Lernen ein statistisches Modell auf, das auf den Trainingsdaten beruht.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Auswerteeinrichtung eine auf sogenanntem Feature-Engineering beruhende Auswerteeinrichtung ist. Das Feature-Engineering ist eine Form der Aufbereitung von Daten und beschreibt die Auswahl und Aufbereitung von Merkmalen, die zur Erstellung eines Machine Learning Modells herangezogen werden. In diesem Zusammenhang ist zudem bevorzugt vorgesehen, dass die in der Zeitdimension der Daten gebildete Merkmale die zentralen Momente 1. Ordnung (Mittelwert), 2. Ordnung (Standardabweichung) und 3. Ordnung (Skewness) umfassen, und/oder dass die in der Zeitdimension der Daten gebildete Merkmale Histogramm-basierte Merkmale, Signal-Reihen-basierte Merkmale und/oder Transformation-basierte Merkmale sind. Bevorzugt kann zudem vorgesehen sein, dass die Auswerteeinrichtung dazu eingerichtet ist, Merkmale mit schwachen Trenneigenschaften zu eliminieren, vorzugsweise mit Hilfe Fischer's Linearer Diskriminantenanalyse (LDA).
Weiterhin ist gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung vorgesehen, dass die Auswerteeinrichtung dazu ausgestaltet ist, mittels maschinellen Lernens die spezifischen Wellenlängen zu identifizieren. Derart kann mit zweidimensionalen Daten, die in der Wellenlängendimension eine geringe Auflösung aufweisen trotz der geringen spektralen Auflösung eine gute Treffsicherheit beim Bestimmen des Vorliegens einer Eigenschaft der Probe erzielt werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Auswerteeinrichtung dazu ausgestaltet ist, unter Berücksichtigung der zweidimensionalen Daten das Geschlechts des befruchteten Vogeleis zu bestimmen. In anderen Worten wird die Vorrichtung also bevorzugt dazu verwendet das Geschlecht des befruchteten Vogeleis zu bestimmen. In diesem Zusammenhang ist weiterhin vorgesehen, dass die Auswerteeinrichtung dazu ausgestaltet ist, mittels des Klassifikators die bereitgestellten Daten in zwei Klassen zu klassifizieren, wobei eine erste Klasse die Eigenschaf männliches Geschlecht und eine zweite Klasse die Eigenschaft weiblich Geschlecht des Vogeleis als Probe repräsentiert.
Wie bereits erwähnt betrifft die Erfindung weiterhin das Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei dem befruchteten Vogelei, mit den Schritten

Klassifikation der bereitgestellten Daten mittels eines Klassifikators in zwei Klassen, wobei eine erste Klasse ein männliches Geschlecht des befruchteten Vogeleis und eine zweite Klasse ein weibliches Geschlecht des befruchteten Vogeleis repräsentiert, wobei bei der Klassifikation auf Basis von in der Zeitdimension der Daten gebildeten Merkmalen spezifische zu priorisierende Wellenlängen identifiziert werden, und Geschlechtsbestimmung des Vogeleis durch priorisierte Berücksichtigung der Daten bei den spezifischen Wellenlängen.
Bei dem Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei dem befruchteten Vogelei ist also vorgesehen, dass die Eigenfluoreszenz in einem Bereich im Inneren des Vogeleis, von der Eimembran des Vogeleis und/oder von der Eischale des Vogeleis mittels einer Lichtquelle angeregt wird. Bevorzugt wird die Eigenfluoreszenz auf der Eimembran des Vogeleis und/oder auf der Eischale des Vogeleis angeregt. Weiterhin ist vorgesehen, dass der Bereich im Inneren des Vogeleis bevorzugt ein Blutbahn-Bereich und/oder ein Bereich embryonaler Strukturen ist. Weiter bevorzugt ist vorgesehen, dass das Vogelei zur Geschlechtsbestimmung nicht geöffnet werden muss. Stattdessen ist es möglich direkt auf, an und/oder durch die Eischale des Vogeleis das Geschlecht mit der beschriebenen Vorrichtung und/oder dem beschriebenen Verfahren zu bestimmen. In anderen Worten, ist also bevorzugt vorgesehen, dass die Emission von gepulster Anregungsstrahlung auf die Eischale des Vogeleis gerichtet ist. Dies hat den Vorteil, dass das Verfahren sehr einfach und schnell durchzuführen ist und das Risiko einer Infektion des Vogeleis stark verringert ist. Welcher der Bereiche gewählt wird kann insbesondere vom Entwicklungsstadium im befruchteten Vogelei abhängen. Zudem ist es nicht notwendig, dass das Vogelei bebrütet ist. Das Geschlecht kann auch an einem unbebrüteten Vogelei bestimmt werden.
Alternativ kann das Vogelei zur Geschlechtsbestimmung geöffnet werden. Diesbezüglich wird bevorzugt ein Loch in die Eischale des Vogeleis erstellt. Das Loch hat dann bevorzugt eine Lochgröße mit einer Dimension bzw. einem Durchmesser D im Bereich 0,5 mm ≤ D ≤ 3 mm. Dabei ist insbesondere vorgesehen, dass das Loch erstellt wird, ohne eine unter der Eischale liegende Eihaut zu perforieren und/oder ohne eine unter der Eischale liegende Schalenmembran und/oder Eimembran zu perforieren. Die Messung der Eigenfluoreszenz kann an der Eihaut, der Schalenmembran und/oder der Eimembran erfolgen.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann vorgesehen sein, dass ein Inneres des Vogeleis und/oder der Bereich im Inneren des Vogeleis aus der Eischale entnommen wird und die Verfahrensschritte entsprechend außerhalb der Eischale durchgeführt werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist zudem vorgesehen, dass das Verfahren die Schritte

- zeitaufgelöstes Erfassen der aus dem Bereich im Inneren, von der Eimembran und/oder von der Eischale des Vogeleis emittierter Eigenfluoreszenzstrahlung mittels der Detektionsvorrichtung bei den spezifischen Wellenlängen durch zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung, und
- Bereitstellen zweidimensionale Daten mit einer Wellenlängendimension und einer Zeitdimension durch die Detektionsvorrichtung an die Auswerteeinrichtung, wobei die Wellenlängendimension der Anzahl spezifischer Wellenlängen entspricht,

Sobald also die Auswerteeinrichtung die spezifischen zu priorisierenden Wellenlängen identifiziert hat, kann bei weiteren Proben zwecks Geschlechtserkennung gezielt bei den spezifischen Wellenlängen die Eigenfluoreszenz erfasst werden. Die weiteren Wellenlängen müssen nicht weiter berücksichtigt werden.
Wie bereits erwähnt kann die Vorrichtung nicht nur zum Bestimmen des Geschlechts des befruchteten Vogeleis verwendet werden. In diesem Zusammenhang betrifft die Erfindung die Verwendung der zuvor beschriebenen Vorrichtung

- zum Bestimmen eines Alterungsgrades von Kraftstoffen und/oder industriellen Betriebsstoffen, wie Tauchbäder, Hydrauliköle und/oder Schmiermitteln,
- zur Qualitätskontrolle, insbesondere von Lebensmitteln und/oder Medikamenten,
- zum Bestimmen einer Herkunftseigenschaft der Probe, insbesondere eines Lebensmittels,
- zum Bestimmen eines Kontaminationsgrades der Probe, insbesondere einer Oberfläche,
- zum Erkennen einer Fälschung, und/oder
- zum Erkenne einer Änderung im Zellstoffwechsel.

Beim Erkennen einer Änderung im Zellstoffwechsel handelt es sich bevorzugt um ein Erkennen einer Änderung im Zellstoffwechsel zu anderen als Heilzwecken. Weiter bevorzugt handelt es sich bevorzugt um ein Erkennen einer Änderung im Zellstoffwechsel für nicht-diagnostische und/oder nicht-therapeutische Zwecke.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen exemplarisch erläutert, wobei die nachfolgend dargestellten Merkmale sowohl jeweils einzeln als auch in Kombination einen Aspekt der Erfindung darstellen können. Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines Aufbaus mit Vogelei und Vorrichtung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei diesem Vogelei gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung,
2 eine schematische Darstellung zweier Alternativen hinsichtlich der Führung der Anregungsstrahlung und der abgestrahlten Eigenfluoreszenzstrahlung zu dem in 1 gezeigten Aufbau mit Vogelei gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung,
3 eine schematische Darstellung einer Lichtquelle des in 1 gezeigten Aufbaus,
4 eine schematische Darstellung des mittels der Vorrichtung in 1, 5 oder 6 erzielten TCSPC Histogramms, gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung,
5 eine schematische Darstellung eines zu 1 alternativen Aufbaus der Vorrichtung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung, und
6 eine schematische Darstellung eines weiteren alternativen Aufbaus der Vorrichtung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung.

1 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 10 zum Bestimmen eines Geschlechts eines befruchteten Vogeleis 12 gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung. Die Vorrichtung 10 umfasst eine Lichtquelle 14 zur Emission von gepulster Anregungsstrahlung 16, eine Detektionsvorrichtung 18 zum Erfassen einer vom Vogelei 12 emittierten Eigenfluoreszenzstrahlung 20 und eine computerbasierten Auswerteeinrichtung 22.
Die Detektionsvorrichtung 18 ist dazu ausgestaltet, bei unterschiedlichen Wellenlängen mittels zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung (TCSPC) die Eigenfluoreszenzstrahlung 20 des Vogeleis 12 zeitaufgelöst zu erfassen und der Auswerteeinrichtung 22 zweidimensionale Daten mit einer Wellenlängendimension und einer Zeitdimension bereitzustellen. Die Auswerteeinrichtung 22 ist dazu ausgestaltet, mittels eines Klassifikators die bereitgestellten Daten in zwei Klassen zu klassifizieren, wobei eine erste Klasse ein männliches Geschlecht des befruchteten Vogeleis 12 und eine zweite Klasse ein weibliches Geschlecht des befruchteten Vogeleis 12 repräsentiert, und wobei bei der Klassifikation in der Zeitdimension der Daten gebildete Merkmale bei spezifischen Wellenlängen priorisiert berücksichtigt werden.
Das Vogelei 12 ist vorliegend auf einem Probenhalter 24 befestigt und derart im Strahlengang platziert, dass die frei propagierende Anregungsstrahlung 16 der Lichtquelle 14 auf das Vogelei 12 trifft. Zwischen der Lichtquelle 14 und dem Vogelei 12 ist zudem ein variabler Laserstrahlabschwächer 26 vorgesehen um eine Anregungsenergie auf eine für TCSPC geeignete Anregungsenergie zu reduzieren.
Die aus einem Bereich im Inneren des Vogeleis 12 emittierte Eigenfluoreszenzstrahlung 20 wird mittels der Detektionsvorrichtung 18 erfasst. Dazu ist die Detektionsvorrichtung 18 derart zum Vogelei 12 angeordnet, dass die in einem Winkel von etwa 90 Grad abgestrahlte Eigenfluoreszenzstrahlung 20 frei propagierend auf die Detektionsvorrichtung 18 trifft. Zwecks Fokussierung der Eigenfluoreszenzstrahlung 20 auf die Detektionsvorrichtung 18 weist die Vorrichtung 10 im Strahlengang zwischen dem Vogelei 12 und der Detektionsvorrichtung 18 eine Linse 28 auf. Zudem wird mittels eines Langpassfilters 30 zwischen dem Vogelei 12 und der Detektionsvorrichtung 18 die am Vogelei 12 gestreute Wellenlänge der Anregungsstrahlung 16 herausgefiltert. Bevor die Eigenfluoreszenzstrahlung 20 auf die Detektionsvorrichtung 18 trifft, wird sie zudem mittels einer Blende 32 abgeschwächt.
Die Vorrichtung 10 weist also in der in 1 gezeigten Ausführungsform kein faserbasiertes Lichtleitsystem 34 auf, mittels dessen das Licht auf das Vogelei 12 und/oder auf die Detektionsvorrichtung 18 geleitet wird. 2 zeigt zwei Ausschnitte der Vorrichtung 10 in alternativen Ausführungsformen, bei denen die Vorrichtung 10 ein Lichtleitsystem 34 mit einem Messkopf 36 umfasst.
In der in 2a) gezeigten Variante ist das Lichtleitsystem 34 Y-förmig ausgestaltet und umfasst zwei Lichtleiterstränge 38, 40, einen Lichtleiterstrang 38 für die Anregungsstrahlung und einen Lichtleiterstrang 40 für die Eigenfluoreszenzstrahlung 20. Die beiden Lichtleiterstränge 38, 40 werden im Messkopf 36 zusammengeführt, so dass der Messkopf 36 zum gemeinsamen Aussenden der Anregungsstrahlung 16 auf das Vogelei 12 und zum Empfangen der vom Vogelei 12 emittierten Eigenfluoreszenzstrahlung 20 ausgestaltet ist.
In der in 2b) gezeigten Variante ist das Lichtleitsystem 34 als einfaches Lichtleitsystem ausgestaltet und umfasst lediglich einen Lichtleiterstrang 40 für die Eigenfluoreszenzstrahlung 20. Die Anregungsstrahlung 16 propagiert weiterhin frei von der Lichtquelle 14 (in 2 nicht gezeigt) bis zum Vogelei 12. Der Messkopf 36 des Lichtleitsystems 34 ist entsprechend zum Empfangen der Eigenfluoreszenzstrahlung 20 vom Vogelei 12 ausgestaltet.
3 zeigt eine schematische Darstellung der Lichtquelle 14 des in 1 gezeigten Aufbaus. Die Lichtquelle 14 ist vorliegend als Lasersystem 14 realisiert, das Anregungspulse mit einer Pulslänge von ungefähr 80 ps erzeugt. Das Lasersystem 14 umfasst eine Infrarotlaserdiode 42, die Laserstrahlung bei 1064 nm emittiert und die als Master Oscillator bzw. Seed Laser verwendet wird, um einem mehrstufigen Faserverstärker 44 die Eigenschaften der Laseremission vorzugeben. Mittels der im Strahlengang vorhandenen doppelbrechenden Kristalle 46 und den dichroitischen Spiegeln 48 lassen sich mittels nichtlinearer Frequenzkonversion, die Wellenlängen der zweiten Harmonischen 50a (532 nm), der dritten Harmonischen 50b (355 nm) und der vierten Harmonischen 50c (266 nm) generieren. Im in 1 gezeigten Aufbau wird als Anregungsstrahlung der Probe die vierte Harmonischen 50c bei 266 nm verwendet.
In Zusammenhang mit der in 1 gezeigten Detektionsvorrichtung 18 stellt 4 eine schematische Darstellung des bei der Erfassung der Eigenfluoreszenzstrahlung 20 ermittelten TCSPC Histogramms 52 dar, das den zeitlichen Verlauf der Eigenfluoreszenzstrahlung nach der Anregung repräsentiert. Wie bereits erwähnt ist die Detektionsvorrichtung 18 dazu ausgestaltet, bei mehreren unterschiedlichen Wellenlängen mittels TCSPC die Eigenfluoreszenzstrahlung 20 des Vogeleis 12 zeitaufgelöst zu erfassen. Dafür weist die Detektionsvorrichtung 18 in der in 1 gezeigten Ausführungsform eine spektrometrische Vorrichtung mit Monochromator 54 auf. Als Detektorelement 56 weist die Detektionsvorrichtung 18 einen Hybrid-Photomultiplier 56a auf. Der Monochromator 54 besteht im Wesentlichen aus einem schrittweise drehbaren Beugungsgitter. Der zu untersuchende Spektralbereich kann durch schrittweises Drehen des Beugungsgitters durchgescannt werden.
5 zeigt eine alternative Ausführungsform der Vorrichtung 10, bei der das Detektorelement 56 ist als MCP-PMT 56b ausgestaltet, der vorliegend 16 Kanäle umfasst. Im Unterschied zu 1 ist zudem das Beugungsgitter des Monchromators 54 fest positioniert. Mit dieser Ausführungsform der Vorrichtung 10 lässt sich der zu untersuchende Spektralbereich in bis zu 16 WL-Teilintervalle (Detektionskanäle) „zerlegen“.
6 zeigt eine weitere alternative Ausführungsform der Vorrichtung 10, bei der mehrere Detektorelemente 56 verwendet werden. Beide Detektorelemente 56 sind analog zu 1 als Hybrid-Photomultiplier 56a ausgestaltet. Statt eines Beugungsgitters wird ein Strahlteiler 57 verwendet. Zwischen dem Strahlteiler 57 und beiden Hybrid-PMTs 56a ist jeweils ein Interferenzfilter 59 eingebracht, das jeweils eine spezifische Wellenlänge transmittiert.
Bei TCSPC werden einzelne Photonen 58a, 58b der Eigenfluoreszenzstrahlung 20 - detektiert und die jeweiligen Zeiten 62 zwischen einem Anregungspuls 60 der gepulsten Anregungsstrahlung 16 und dem Eintreffen des jeweiligen Photons 58 in der Detektionsvorrichtung 18 bestimmt. Dafür umfasst die Detektorvorrichtung TCSPC-Elektronik 61, die schematisch in den 1, 5, und 6 dargestellt ist. In Bezug zu 4 wird die Zeitmessung durch den Anregungspuls 60a gestartet und das beim Übergang vom angeregten Zustand in den Grundzustand emittierte Photon 58a stoppt die Messung (4a). Beim nächsten Anregungspuls 60b und dem nächsten Photon 58b wiederholt sich der Vorgang ( 4b). Durch vielfaches Wiederholen der Messung entsteht entsprechend der gemessenen Zeiten 62 der einzelnen Photonen 58 das in 4c dargestellte TCSPC-Histogramm 52. Wie in den 1, 5 und 6 zudem angedeutet ist, weist die Vorrichtung 10 zwecks Messung des zeitlichen Abstandes 62 eine elektrische Verbindung 64 auf, um ein synchron zum Anregungspuls 60 erzeugtes elektrisches Trigger-Signal der Detektionsvorrichtung 18 zu übermitteln. Die TCSPC-Elektronik 61, die in den 1, 5 und 6 schematisch als Kasten dargestellt ist, und beispielsweise physikalisch als PC-Einschubkarte ausgestaltet sein kann, wertet die Signale aus und erstellt das TCSPC-Histogramm, das als zweidimensionale Daten mit einer Wellenlängendimension und einer Zeitdimension der Auswerteinrichtung 22 bereitgestellt wird.
Die Detektionsvorrichtung 18 ist also dazu ausgestaltet, bei mehreren unterschiedlichen Wellenlängen mittels TCSPC die Eigenfluoreszenzstrahlung 20 zu erfassen und der Auswerteinrichtung 22 zweidimensionale Daten zur Verfügung zu stellen Vorliegend liegen die Daten als mathematische Matrizen A G R ^{m × n} vor, wobei die Matrix in der Wellenlängendimension m Datenpunkte umfasst, im vorliegenden Beispiel sind es 74 Datenpunkte. In der Zeitdimension weist die Matrix n Datenpunkte auf, die die für die notwendige Trefferquote hohe Zeitauflösung ermöglichen, im vorliegenden Beispiel sind es 250 Datenpunkte: $A = (\begin{matrix} a_{11} & a_{12} & \dots & a_{1 n} \\ a_{21} & a_{22} & \dots & a_{2 n} \\ ⋮ & ⋮ & \dots & ⋮ \\ a_{m 1} & a_{m 2} & \dots & a_{m n} \end{matrix}),$
wobei die Zeilen von A, also (a_j1, ... , a_jn), j = 1,... ,m jeweils einem TCSPC Histogramm und somit physikalisch im Wesentlichen den zeitaufgelösten Messungen für bestimmte feste Wellenlängen entsprechen.
Zwecks Bestimmung des Geschlechts des Vogeleis 12 klassifiziert ein Klassifikator die bereitgestellten Daten in zwei Klassen, wobei eine erste Klasse ein männliches Geschlecht des befruchteten Vogeleis 12 und eine zweite Klasse ein weibliches Geschlecht des befruchteten Vogeleis 12 repräsentiert, wobei bei der Klassifikation auf Basis von in der Zeitdimension der Daten gebildeten Merkmalen spezifische zu priorisierende Wellenlängen identifiziert werden und eine Geschlechtsbestimmung des Vogeleis 12 durch priorisierte Berücksichtigung der Daten bei den spezifischen Wellenlängen durchgeführt wird. Als Klassifikator wird vorliegend ein linearer Klassifikator verwendet, der die Daten entlang einer Hyperebene trennt. Bei den in der Zeitdimension der Daten gebildeten Merkmalen handelt es sich vorliegend um die ersten drei Momente der zentralen Momente von a_j := (a_j1, ... , a_jn), j = 1, . nämlich Mittelwert µ, Standardabweichung σ und Schiefe S.
Bezugszeichen

10: Vorrichtung
12: Vogelei
14: Lichtquelle
16: Anregungsstrahlung
18: Detektionsvorrichtung
20: Eigenfluoreszenzstrahlung
22: Auswerteeinrichtung
24: Probenhalter
26: variabler Laserstrahlabschwächer
28: Linse
30: Langpassfilter
32: Blende
34: Lichtleitsystem
36: Messkopf
38: Lichtleitstrang
40: Lichtleitstrang
42: Infrarotlaserdiode
44: mehrstufiger Faserverstärker
46: doppelbrechender Kristall
48: dichroitischer Spiegel
50: zweite bis vierte Harmonische der Laserwellenlänge 1064nm
52: TCSPC-Histogramm
54: Monochromator
56a: Detektorelement, Hybrid-PMT
56b: Detektorelement, MCP-PMT
57: Strahlteiler
58: Photon
59: Interferenzfilter
60: Anregungspuls
61: TCSPC-Elektronik
62: Zeit zwischen Anregungspuls und Detektion des Photons
64: elektrische Verbindung

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2021/144420 A1 [0006, 0016]

Claims

Vorrichtung (10) zum Bestimmen des Vorliegens einer Eigenschaft einer Probe (12), und bevorzugt zum Bestimmen eines Geschlechts eines befruchteten Vogeleis (12), mit - einer Lichtquelle (14) zur Emission von gepulster Anregungsstrahlung (16), - einer Detektionsvorrichtung (18) zum Erfassen einer von der Probe (12) ausgesendeten Eigenfluoreszenzstrahlung (20), und - einer computerbasierten Auswerteeinrichtung (22), wobei die Detektionsvorrichtung (18) dazu ausgestaltet ist, bei unterschiedlichen Wellenlängen mittels zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung die Eigenfluoreszenzstrahlung (20) der Probe (12) zeitaufgelöst zu erfassen und der Auswerteeinrichtung (22) zweidimensionale Daten mit einer Wellenlängendimension und einer Zeitdimension bereitzustellen, wobei die Auswerteeinrichtung (22) dazu ausgestaltet ist, mittels eines Klassifikators die bereitgestellten Daten in Klassen zu klassifizieren, wobei wenigstens eine Klasse die Eigenschaf der Probe (12) repräsentiert, wobei die Auswerteeinrichtung (22) dazu ausgestaltet ist, bei der Klassifikation auf Basis von in der Zeitdimension der Daten gebildeten Merkmalen spezifische zu priorisierende Wellenlängen zu identifizieren, und wobei die Auswerteeinrichtung (22) dazu ausgestaltet ist, zum Bestimmen des Vorliegens der Eigenschaft der Probe (12) die Daten bei den spezifischen Wellenlängen priorisiert zu berücksichtigen.
Vorrichtung (10) nach Anspruch 1, wobei die Lichtquelle (14) als gepulstes Anregungslasersystem oder als gepulst betriebene LED ausgestaltet ist.
Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle (14) dazu ausgestaltet ist, gepulste Anregungsstrahlung (16) mit einer Pulsrepetitionsrate von ≥ 10 MHz zu emittieren und/oder wobei die Lichtquelle (14) dazu ausgestaltet ist, gepulste Anregungsstrahlung (16) mit einer Pulslänge von ≤ 500 ps zu emittieren und/oder wobei die Lichtquelle (14) dazu ausgestaltet ist, gepulste Anregungsstrahlung (16) mit einer Pulslänge von ≤ 5 ns zu emittieren.
Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung (10) im Strahlengang zwischen der Lichtquelle (14) und der Probe (12) einen optischen Abschwächer (26) zum Einstellen einer Energie der Anregungsstrahlung (16) umfasst.
Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektionsvorrichtung (18) zum Erfassen der Eigenfluoreszenzstrahlung (20) bei unterschiedlichen Wellenlängen einen Monochromator (54), einen Spektrographen, einen Strahlteiler (57) mit mehreren Interferenzfiltern (59) und/oder ein Spektrometer umfasst und/oder wobei die Detektionsvorrichtung (18) als Detektorelement (56) einen Hybrid-Photomultiplier (56a) und/oder einen Multichannel-Plate-Photomultiplier (56b) umfasst.
Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung (10) im Strahlengang zwischen der Probe (12) und der Detektionsvorrichtung (18) einen Langpass-Kantenfilter (30) zur Filterung einer Wellenlänge der Anregungsstrahlung (16) umfasst.
Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung (10) dazu ausgestaltet ist, die Probe (12) im Freiraum mit der Anregungsstrahlung (16) zu bestrahlen und derart ausgestaltet ist, dass die in einem Winkel ungleich Null zur Anregungsstrahlung (16) abgestrahlte Eigenfluoreszenzstrahlung (20) im Freiraum auf die Detektionsvorrichtung (18) gelenkt wird.
Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Vorrichtung (10) einen Messkopf (36) umfasst, und a) wobei der Messkopf (36) zum Aussenden der Anregungsstrahlung (16) in und/oder auf die Probe (12) ausgestaltet ist, oder b) wobei der Messkopf (36) zum Empfangen der Eigenfluoreszenzstrahlung (20) aus und/oder von der Probe (12) ausgestaltet ist, oder c) wobei der Messkopf (36) zum gemeinsamen Aussenden der Anregungsstrahlung (16) in und/oder auf die Probe (12) und zum Empfangen der Eigenfluoreszenzstrahlung (20) aus und/oder von der Probe (12) ausgestaltet ist.
Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Auswerteeinrichtung (22) dazu ausgestaltet ist, mittels maschinellen Lernens die spezifischen Wellenlängen zu identifizieren.
Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Auswerteeinrichtung (22) dazu ausgestaltet ist, unter Berücksichtigung der zweidimensionalen Daten das Geschlechts des befruchteten Vogeleis (12) zu bestimmen.
Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei (12), mit den Schritten - Emission von gepulster Anregungsstrahlung (16) für eine Anregung von Eigenfluoreszenz in einem Bereich im Inneren des Vogeleis (12), auf einer Eimembran des Vogeleis (12) und/oder auf der Eischale des Vogeleis (12) mittels einer Lichtquelle (14), - zeitaufgelöstes Erfassen der aus dem Bereich im Inneren, von der Eimembran und/oder von der Eischale des Vogeleis (12) emittierter Eigenfluoreszenzstrahlung (20) mittels einer Detektionsvorrichtung (18) bei unterschiedlichen Wellenlängen durch zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung, - Bereitstellen zweidimensionale Daten mit einer Wellenlängendimension und einer Zeitdimension durch die Detektionsvorrichtung (18) an eine Auswerteeinrichtung (22), - Geschlechtsbestimmung des befruchteten Vogeleis (12) aus den bereitgestellten zweidimensionalen Daten mittels der Auswerteeinrichtung (22), durch Klassifikation der bereitgestellten Daten mittels eines Klassifikators in zwei Klassen, wobei eine erste Klasse ein männliches Geschlecht des befruchteten Vogeleis (12) und eine zweite Klasse ein weibliches Geschlecht des befruchteten Vogeleis (12) repräsentiert, wobei bei der Klassifikation auf Basis von in der Zeitdimension der Daten gebildeten Merkmalen spezifische zu priorisierende Wellenlängen identifiziert werden, und Geschlechtsbestimmung des Vogeleis (12) durch priorisierte Berücksichtigung der Daten bei den spezifischen Wellenlängen.
Verwendung der Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 10 - zum Bestimmen eines Alterungsgrades von Kraftstoffen und/oder industriellen Betriebsstoffen, wie Tauchbäder, Hydrauliköle und/oder Schmiermitteln, - zur Qualitätskontrolle, insbesondere von Lebensmitteln und/oder Medikamenten, - zum Bestimmen einer Herkunftseigenschaft der Probe, insbesondere eines Lebensmittels, - zum Bestimmen eines Kontaminationsgrades der Probe, insbesondere einer Oberfläche, - zum Erkennen einer Fälschung und/oder - zum Erkennen einer Änderung im Zellstoffwechsel.