WO2021019099A1 - Verfahren zum kalibrieren eines mikroskops, mikroskopanordnung und verwendung - Google Patents

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WO2021019099A1
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microscope
optical
optical center
light beam
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PCT/EP2020/071747
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Ilja GERHARDT
Ingmar JAKOBI
Julia Michl
Jörg Wrachtrup
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • G01R33/02—Measuring direction or magnitude of magnetic fields or magnetic flux
    • G01R33/032—Measuring direction or magnitude of magnetic fields or magnetic flux using magneto-optic devices, e.g. Faraday or Cotton-Mouton effect

Definitions

  • the invention relates to a method for calibrating a microscope, an associated microscope arrangement and an associated use.
  • Microscopes are used for a variety of applications. For example, they can be used for biological, microbiological and material science issues. By means of various super-resolution techniques, resolutions can now be achieved which are considerably better than the resolution that is limited due to diffraction.
  • the invention relates to a method for calibrating a microscope.
  • the microscope has the following:
  • excitation optics for directing an excitation light beam onto the sample, interrogation optics for receiving light emitted by the sample, and
  • a detector for detecting light picked up by the interrogation optics.
  • the procedure consists of the following steps:
  • Solid body has at least one first optical center which emits light after excitation
  • a solid body with an optical center is used. It has been shown that such solid bodies with an optical center are considerably more resistant and have a longer service life than samples known from the prior art. Accordingly, a calibration can be carried out much more reliably and different comparisons can be made, for example between different times and / or between different microscopes. In addition, for example, comparisons between different microscope parts such as objectives or different
  • the procedure is particularly for use with a microscope such as
  • the solid body can be continuous or one-piece
  • Act solid it can also be one, for example
  • composite solids For example, several nano-particles or nano-diamonds can be combined to form a solid.
  • Solids can be done for example by spin coating, for example by spin coating of nanodiamonds in a polymer such as polymethyl methacrylate (PMMA). Nanodiamonds can also be unassembled in fixed positions in a carrier material. Crystals have particular advantages in terms of being stronger
  • the emission of light after excitation can be understood to mean, for example, an emission, the optical center being excited in a known manner by means of an excitation light, that is to say in a
  • the emission of light can also be a matter of scattering, which is understood here as emission after excitation.
  • an excitation light beam is directed onto the optical center and the light is scattered so that it can be detected at another location. This is also understood here as the emission of light after being stimulated.
  • the sample holder can, for example, be designed to hold the sample in a defined and / or reproducible position. This can be monitored, for example, by means of the method, which will be discussed in more detail below.
  • the excitation optics can, for example, be designed to direct a laser beam onto the sample.
  • a laser can be provided as part of the excitation optics. This can be manipulated by optical components such as mirrors, lenses, beam splitters and other components as required for the respective purpose.
  • the excitation light beam can be focused on the sample and / or on the optical center.
  • a non-focused light beam can also be used.
  • the detector can, for example, be an analog detector such as a
  • Be photo plate It can also be a digital detector.
  • a CCD detector a camera, in particular a sensitive camera, a CCD camera, or a CMOS camera or a film, in particular a
  • the detector can, for example, be designed such that it can detect at only one location, for example with a photodiode, avalanche photodiode (APD), or one
  • Photomultiplier can also be designed to be movable, for example, so that a larger area can be imaged by means of a detector that basically only detects at one location. It can also be provided that the detector consists of a plurality of individual detectors at different locations
  • the sample, the beam and / or an objective can also be moved relative to the detector, for example.
  • Calibrating the microscope can be understood to mean that the entire microscope is calibrated or that only a part of the microscope, for example an objective, is calibrated, or else that a microscope method is calibrated. This should also be understood as calibrating the microscope.
  • microscopy methods can be used only or at least in the evaluation which
  • a calibration is understood to mean that a value of the sample is measured by means of the microscope, for example a distance between two optical centers, and that this value is calibrated against a value determined by a measurement or another measurement and / or with a value determined by a measurement or another measurement.
  • Measurement determined value is compared.
  • the method described herein which is based on the application of magnetic and high-frequency fields, can be used for such a measurement.
  • other designs are also possible. By comparing it with a measured value,
  • a microscopy method or a microscopy method can also be calibrated, with other method aspects also being able to be taken into account, for example.
  • a comparison, an adjustment, an adjustment or the like can also take place.
  • certain parameters of a microscope setup can be changed in order to maintain specified properties.
  • a calibration can, for example, be traceable to the SI system or other standards. Examples are illustrated herein. However, other designs are also possible.
  • ⁇ can also be calibrated by means of a calibration, so that a secondary standard can be established.
  • a Defect determination and / or a deviation determination can be carried out.
  • Relevant device parameters can also be checked, which can be referred to as a “performance test”, for example.
  • compliance with specifications can also be checked.
  • the sample has at least one second optical center. This enables further functionalities relating to the calibration of the microscope, which will be discussed in greater detail below.
  • the excitation light beam can in particular be directed onto the sample, so that the first optical center and the second optical center are excited. This can take place in particular by means of the same excitation light beam, that is to say in particular without spatial variation of the excitation light beam relative to the sample, and / or at the same time. This means that several optical centers can be used for calibration.
  • the first optical center and the second optical center can, for example, have a spacing of at least one grid position or of at least 1 nm or of at least 3 nm from one another. Such distances as a minimum distance have proven to be advantageous for typical applications and can be measured as well as used for the purpose of a reference. However, other distances can also be used.
  • the first optical center and the second optical center are preferably at a distance of at most 100 nm or at most 50 nm or at most 20 nm from one another. Such distances as the upper limit have proven to be particularly advantageous because up to such distances in typical constellations a coupling of the optical centers is possible, which for different
  • spin-active optical centers can be used as optical centers non-magnetic or non-magnetic or non-magnetically coupled optical centers are used.
  • Optical centers that can not be magnetically coupled are, in particular, optical centers that can be coupled, but that are non-magnetically coupled, that is, for example, can be coupled in some other way. This can
  • optical center can be used in particular to couple these when at least two optical centers are present and thus to be able to fall back on quantum mechanical effects, for example to determine their distance or to address them selectively.
  • quantum mechanical effects for example to determine their distance or to address them selectively.
  • Diamond or silicon carbide (SiC) in particular can be used as the solid.
  • Such solid bodies have proven to be particularly durable and suitable for the purposes pursued here. It should be understood, however, that other solid bodies can also be used.
  • the solid body can be formed in one piece and / or as a single crystal. It can also be polycrystalline or amorphous. According to one embodiment, it can be composed of nano-particles or nano-diamonds. A nano-diamond can be understood as an example of a nano-particle. Under a nano-particle can
  • a body with an extension of only a few nanometers for example at most 5 nm or at most 10 nm, can be understood.
  • nitrogen vacancies can be used as optical centers.
  • nitrogen vacancies in diamond can be used. These have proven to be advantageous for typical calibration tasks, such as those which are described in more detail below, and are otherwise well known with regard to their physical behavior. It should be mentioned, however, that other types of optical centers, for example other types of defects or other Versions of optical centers or substitution atoms in the solid can be used.
  • the excitation light beam can for example have a wavelength corresponding to an excitation maximum of the optical centers.
  • the wavelength can, for example, be in the optical spectrum, in the UV spectrum or in the IR spectrum. A particularly effective excitation can thereby be achieved. Also the
  • the characteristics of the excitation optics or other behavior of the optical centers can be taken into account.
  • the microscope can be, for example, a confocal microscope, a near-field microscope, a scattering microscope or a wide-field microscope.
  • the method described herein has proven to be particularly advantageous for such types of microscopes. All other types of microscopes or any other optical device that meets the requirements described at the outset can also be used to carry out the method.
  • the calibration can in particular be a calibration of the entire microscope. This means in particular that the microscope is viewed as a whole and is calibrated as a whole.
  • the calibration can also be a calibration of a part of the microscope,
  • the microscope can also be fully calibrated.
  • the calibration can also be a calibration of a microscopy method. This can in particular mean that certain processes of the method or software used for this purpose are calibrated.
  • the method can in particular be carried out repeatedly several times.
  • Calibrations, which are determined in different versions, can be compared with one another to determine changes over time. This allows, for example, a temporal observation of the behavior of a microscope, whereby, for example, long-term effects can be recognized and / or corrected. It is also possible to make comparisons between different versions.
  • a microscope can be measured at different times, different microscopes can be compared or different states of a microscope can be compared. For example, a component of a microscope can be changed between two measurements. For example, a screw of the microscope can be turned.
  • the calibration can take place at least transversely to a direction of propagation of the excitation light beam. This can mean in particular that measurement data are recorded and used for the calibration, which have a distance or some other variable transverse to the direction of propagation and / or parallel to a
  • the surface of the solid through which the excitation light beam penetrates reproduce. This means that the calibration can go beyond pure depth calibration and, for example, offer calibration in all three spatial directions. However, calibration in just one or two spatial directions is also possible. A calibration of vector components, e.g. polarization components of the excitation light beam, is also possible.
  • the calibration is a calibration of a distance.
  • the sample preferably has at least one second optical center.
  • This second optical center can, for example, have a distance from the first optical center which lies within the lower and / or upper limits already indicated above as advantageous.
  • the method can preferably include a step of determining a distance between the first optical center and the second optical center by means of an electromagnetic coupling measurement.
  • Excitation of the two optical centers by means of an excitation light beam, application of a first electromagnetic alternating field, preferably in
  • electromagnetic alternating field changes the magnetic moment, which can be expressed, for example, in the case of a nitrogen vacancy in diamond, that it becomes dark,
  • the first electromagnetic alternating field is a time-limited pulse, so that the magnetic moment of the first optical center ends in a superposition of the light and dark state and a precession starts around the applied magnetic field ( Larmor precession), Applying a second alternating electromagnetic field with a frequency so that the other optical center becomes dark, whereby the
  • electromagnetic alternating field is a time-limited pulse so that the magnetic moment of the second optical center is changed, which in the event of an interaction of the two optical centers leads to a change in the precession frequency of the first optical center,
  • the procedure can also be referred to as a Ramsey sequence and can easily be extended to an extended pulse sequence, for example as a flahn echo sequence.
  • the distance between two optical centers can be determined very precisely, so that a resolution with regard to individual grid positions is possible.
  • a timing of the pulses can determine when the respective field is present and when not.
  • a timing of pulses that is reduced to a standard measure is preferably used in the coupling measurement.
  • This can be the aforementioned first and / or second alternating electromagnetic fields, for example.
  • a return to a standard measure means that the timing or the frequency of this electromagnetic wave is calibrated to the SI unit second.
  • an atomic clock or another correspondingly precise clock for example from a satellite navigation signal, can be used.
  • This can in particular be calibrated to the corresponding SI standard dimension.
  • such an atomic clock can be made available by a standardization organization.
  • the standard dimension can be on a
  • Standard size a sample can be achieved in which two optical centers are present with a spacing which is calibrated to a standard size or to a SI standard size. A sample is thus provided which can serve as a reference in the nanometer range and is SI-calibrated.
  • a distance determined by means of a detector is preferably calibrated. This can mean, for example, that a distance is determined by means of the detector, which distance is specified, for example, in pixels of the detector, in a distance traveled by the detector or another unit of measurement used by the detector. For example, lens or beam scanners or wide-field cameras can also be used. The distance between the two optical centers in the sample is included
  • the distance determined by means of the detector can be calibrated against a known distance in the solid body.
  • the distance in the solid can be determined as described herein.
  • calibration can in particular be understood to mean that a distance determined by the detector is scaled or otherwise corrected so that an end result corresponds to the actual distance.
  • the distance determined by means of the detector can be calibrated against a distance in the solid body measured by another measurement.
  • Another measurement can be understood to mean, in particular, a measurement of the distance that is not carried out by observation with the detector. Such a different measurement can, for example, by the installation of
  • calibration can in particular mean that a distance determined by the detector is scaled or otherwise corrected so that an end result corresponds to the actual distance.
  • the distance can be determined for example by means of emitter-selective activation of the optical centers and / or by means of super resolution methods, correlation evaluation or cross-correlation evaluation of signals recorded by the detector based on the detected light.
  • the optical centers which can be referred to as emitters, are selectively activated or deactivated and corresponding light is detected by the detector.
  • Signals generated based on this can be evaluated, for example by fitting a respective Gaussian function to a signal and using the maximum of the Gaussian function as the position of the respective optical center in the coordinate system of the detector. Accordingly, a
  • Cross-correlation evaluation can be made.
  • Corresponding techniques are known, for example, as super resolution methods or super resolution microscopy, which are generally carried out by looking at certain areas in the
  • a plurality of distances between the first optical center and the second optical center become different Points in time each determined vectorially. This can mean in particular that not only a length, but also the orientation of the distance in one
  • a rotation for example, can then be determined from the vectorial distances.
  • a plurality of distances between the first optical center and the second optical center become different
  • the distance can be in three dimensions or in two dimensions, in particular across
  • Direction of propagation of the excitation light beam and / or an optical axis of the microscope can be determined. This can mean in particular that not only a length, but also the orientation of the distance is determined in a three-dimensional coordinate system or as a projection in a two-dimensional coordinate system.
  • a rotation of the sample can then be determined, for example, from the three-dimensional vectorial distances or from the two-dimensional projections of the distances.
  • a rotation of a vector between two optical centers can be determined, i.e. the vector extends between the two optical centers and an optical center or the optical centers vary their position in space. This is differentiated in particular for the determination of the relative position of distance vectors between two optical centers at the same point in time. It is also differentiated from determining a rotation correction.
  • Microscope In particular, the same sample can always be used.
  • the calibration is a measurement of the excitation light beam.
  • the first optical center preferably has at least one optical center
  • Transition dipole moment This is preferably immutable.
  • the excitation light beam can be measured very precisely, so that data such as intensity, electric field vector or polarization of the excitation light beam can be recorded with a high spatial resolution.
  • results obtained by means of the microscope can be interpreted much more precisely and better.
  • the term polarization of the excitation light beam can be understood to mean, in particular, a state before it passes through an optical system located in front of the sample, wherein such a polarization can be set in a targeted manner.
  • the vector electric field at the location of the optical center is fundamentally relevant, which can depend on the polarization, but also on other factors.
  • the first optical center can, for example, be moved relative to the excitation light beam, which can be done, for example, by moving the sample holder or using appropriate mechanisms in the sample holder. In particular, changes in the emitted light can be determined.
  • Such changes can be, for example, changes in intensity or changes in color. These can be detected, for example, by means of the microscope's detector. This can be used to determine how this differs from the sample
  • the optical transition dipole moment in the solid body and / or relative to the sample holder can have a constant or at least only limited movable orientation.
  • a constant orientation is understood to mean in particular an orientation which does not change over time relative to the reference system, in particular while the method is being carried out.
  • An orientation that is only movable to a limited extent is understood to mean, in particular, an orientation which is only within predetermined limits, for example within a predetermined one
  • an electric field of the excitation light beam can have a constant orientation relative to the solid body. This can apply in particular to a period in which measurement data relevant for the calibration are collected. This allows the
  • Measurement accuracy can be improved.
  • the measurement can in particular be vectorial, that is to say in particular depending on the orientation of the optical
  • the method of the sample can, for example, in a plane transverse to
  • Excitation light beam take place. However, it can also take place differently, for example, alternatively or additionally, a movement can take place parallel to the excitation light beam. It is also possible to define planes which are perpendicular to the
  • the excitation light beam is polarized.
  • the polarization can be, for example, linear, circular, trivial or highly complex, trivial polarization being understood to mean a locally invariable polarization and highly complex polarization being understood to be different at different locations.
  • the polarization can be rotated relative to the sample and the sample can be left locally unchanged relative to the excitation light beam.
  • Polarization-dependent changes in the emitted light can be determined. This makes it possible to determine the reaction of the sample or the optical center to changes in polarization. As a result, it can be determined much more precisely than in previous versions how a sample behaves in the event of changes, in particular in the event of rotations in polarization, and the
  • Excitation light beam can be characterized very precisely, since its polarization or electrical field vectors can be measured in this way.
  • the measurement is three-dimensional and vectorial.
  • the already mentioned, preferably invariant, optical transition dipole moment of the optical center can be used for this purpose.
  • the optical transition dipole moment of the optical center can be used for this purpose.
  • the optical transition dipole moment of the optical center can be used for this purpose.
  • Excitation light beam is, and that a minimal emission or no emission occurs when the optical transition dipole moment is transverse to the electric field of the excitation light beam.
  • This can be used, for example, in that the sample and thus also the optical transition dipole moment is rotated relative to the excitation light beam, with the sample or optical center being able to remain in the same location, for example.
  • the excitation light beam can also be measured.
  • a change in an intensity can be measured, for example, starting from a maximum intensity, for example with an optical transition dipole moment lying parallel to the electric field of the excitation light beam, but also starting from a non-existent emission, for example when the electric field of the Excitation light beam lying optical transition dipole moment can be measured. In the latter case, detection can be simpler in certain situations, since a change can be determined from a zero signal.
  • any optical field can be characterized using the method described herein.
  • it can be a plane wave, a focus or a focused wave, evanescent fields or around trade any fashion such as a TEMOO fashion.
  • the method just described can be used to characterize the polarization or a vector electric field.
  • the excitation light beam can be polarized, for example as already described above.
  • the polarization can be left unchanged relative to the sample and the sample can be left locally unchanged relative to the excitation light beam, the emitted light being determined at different times. Changes in the emitted light can then be determined between the points in time.
  • the procedure for monitoring the microscope can be different
  • Points in time whereby the same sample can preferably always be used. Due to the high stability of the sample, which is formed by a solid body, comparisons between different points in time, even those that are longer apart, are possible. This enables the stability of the microscope to be continuously monitored over a longer period of time.
  • the excitation light beam can be polarized, for example as already described above. During the calibration, the polarization can be rotated and the first optical center can be moved relative to the excitation light beam
  • the measured intensity is meant.
  • an associated intensity maximum or an associated intensity distribution can be determined for each applied polarization.
  • the measured intensity typically depends on the scalar product between the electric field at the location of the optical center and the optical one
  • Transition dipole moment of the optical center can be distorted, for example, by astigmatism in an excitation optics.
  • the calibration is a calibration of an absolute intensity or a collection efficiency of the microscope. In this way it can be recorded, for example, how many photons are detected by a microscope and / or which proportion of photons which are emitted by a sample is actually detected by the microscope or its detector. This allows the optical system of the microscope to be characterized. In particular, in such a
  • the excitation light beam can, for example, have an intensity at which the first optical center emits at a rate corresponding to the inverse of the lifetime of its excited state.
  • the intensity can also be so high that the first optical center emits at the maximum photon emission rate.
  • Such an embodiment can ensure that the number of photons emitted, for example emitted, is known in a certain period of time, for example within one second, and it is therefore easy to calculate back using the photons detected by the detector which proportion of the
  • the excitation light beam has an intensity with which the first optical center at a rate of at most 90%, at most 80%, at most 50%, at most 30%, at most 20%, at most 10%, at most 1%, at most 0 , 1% or at most 0.01% of the inverse of the lifetime of its excited state and / or with a maximum of 90%, a maximum of 80%, a maximum of 50%, a maximum of 30%, a maximum of 20%, a maximum of 10%, a maximum of 1%, a maximum Emits 0.1% or at most 0.01% of its maximum photon emission rate.
  • a rate corresponding to the inverse of the lifetime of the excited state can be achieved in particular if the first optical center is a pure two- Level system is or corresponds as closely as possible to an idealized two-level system, which can mean, for example, that no competing
  • Disintegration paths are available.
  • the system is typically excited from a basic state, which remains on average for the life of the
  • excited state in excited state returns to the ground state by emission of a photon and is immediately brought back into the excited state due to the sufficient intensity of the excitation light beam.
  • maximum photon emission rate is more general and includes not only the case just described of a correspondingly excited two-level system, but also takes into account the case that competing decay processes are present. For example, from an excited state, not only can relaxation be possible directly into the ground state, but it can also be
  • an intermediate state which is arranged energetically between the ground state and the excited state and in which a decay from the excited state can take place. This typically takes place without photon emission or at least with photon emission in a different wavelength.
  • the intermediate state can, for example, have a different, for example significantly longer, lifetime than the excited state.
  • Such states can also be referred to as dark states. They can be caused, for example, by trapping, for example by defects, contamination or others
  • the excitation light beam can, for example, when the
  • a defined excitation power is, for example, a predetermined power of the excitation light beam or a predetermined intensity of the
  • Understood excitation light beam which can be so high, for example, that, as already described above, a maximum photon emission rate and / or a photon emission rate corresponding to the inverse of the lifetime of the excited state is achieved, but a defined excitation power which is smaller can also be used. Due to the otherwise unchanged and defined conditions, such a defined excitation power leads to
  • the detection or a behavior of the detector and / or an interrogation optics can also be calibrated. They are applicable accordingly.
  • a sample can for example also be rotated or moved relative to the detector.
  • the collection efficiency of the microscope can be calculated, for example, as the quotient of photons captured in a time interval divided by photons emitted in the time interval. This allows a simple and convenient
  • Calculation of the collection efficiency It indicates how many of the emitted photons are actually recorded by the detector.
  • the method can for example be carried out by means of a plurality of microscopes using the same sample. Results at the respective
  • Calibrations of the microscopes can be compared with each other. This enables a comparison of different microscopes, which can also be located at different locations, for example. Also comparisons between
  • Microscopes can represent an independent aspect of the invention.
  • the method can be used in all of the embodiments and variants described herein.
  • the invention also relates to a microscope arrangement.
  • the microscope arrangement has a microscope.
  • the microscope has the following:
  • an excitation optics for directing an excitation light beam onto the sample, an interrogation optics for receiving light emitted by the sample, a detector for detecting light received by the interrogation optics, an electronic control device which is configured to carry out a method as described herein.
  • the microscope arrangement also has a sample in the form of a solid, wherein the solid has at least one first optical center that detects
  • the microscope assembly is a combination of a microscope including its Control device is with a sample in the form of a solid. These can for example be arranged spatially adjacent to one another. In particular, the sample can also be inserted into the sample holder.
  • the control device can for example be a computer or another programmable device which is adjacent to the others
  • Components of the microscope can be located in a remote location. It should be understood that in a microscope data acquisition and data evaluation can in principle also take place spatially separated from one another, so that, for example, the method can also be carried out in a data center
  • control device is typically configured to carry out the method only to the extent that this is technically possible. For example, steps such as inserting the sample and / or certain adjustment tasks can
  • the invention also relates to a non-transitory computer readable
  • Execution a processor executes a method described herein. With regard to the method, all embodiments and variants described herein can be used
  • the invention also relates to a use of a sample for calibrating a microscope.
  • the sample is a solid body with at least one first optical center which emits light after being excited.
  • the microscope can have the following when used:
  • excitation optics for directing an excitation light beam onto the sample, interrogation optics for picking up light emitted by the sample, a detector for detecting light picked up by the interrogation optics.
  • the sample can for example have only one optical center or a first and a second optical center.
  • the first optical center and the second optical center can be at a distance of at least one grid position or of at least 1 nm or of at least 3 nm from one another.
  • the first optical center and the second optical center can also be at a distance of at most 100 nm or at most 50 nm or at most 20 nm from one another.
  • Diamond or silicon carbide for example, can be used as the solid.
  • other types of solids can also be used.
  • nitrogen vacancies can be used as optical centers, it also being possible to use other types of optical centers.
  • the calibration can in particular take place according to the method.
  • all embodiments and variants described herein can be used
  • the calibration can in particular also be carried out using one described herein
  • the invention also relates to a sample in the form of a solid body with at least one optical center which emits light after being excited.
  • the rehearsal is there intended and / or configured for use in a method according to the invention, in a microscope arrangement according to the invention or in a use according to the invention.
  • the microscope arrangement and the use all of the embodiments and variants described herein can be used.
  • DNA origami samples are known for colocalization.
  • these can be two or more
  • the sample described herein can, for example, be based on fluorescent or luminescent defect centers in solids, such as nitrogen vacancies in diamond. These do not bleach and can be used with alternatives
  • ESR Localize electron spin resonance
  • Diffusion probability of such defects is constant over long periods of time, such a sample enables a long-lasting sample for microscope calibration.
  • fluorescent defect centers in solids can be used for the examination of microscopes.
  • nitrogen vacancies in diamond can be used, the fluorescence properties of which have been very well investigated and can correspond to those of biological samples relevant in microscopy.
  • the localization of the individual emitters can also be determined independently of optical microscopy using electron spin resonance methods, for example by applying a gradient field or, in the case of colocalization, using magnetic dipolar coupling or electrical field measurements between two emitters. This can be used, for example, to cover distances of approx. 3 nm to 100 nm.
  • Fluorescent defect centers or other optical centers in solids are usually photostable, i.e. they do not bleach or diffuse. This means that the samples are stable and usable for a long time. Since the emitters are in a
  • the samples are solids, handling, storage and transportation of the samples are easy. They are also temperature resistant. With regard to the colocalization, it is also advantageous that the distance is precisely fixed to the size of the fluorophore and no longer changes. That means: Once the relative distance of an emitter pair has been determined, the sample can be used repeatedly to adjust and characterize
  • Microscopes are used. Since the distance is precisely defined, no statistics have to be carried out on an ensemble of emitter pairs.
  • the distance determination can be traced back to the SI unit system
  • the distance is determined in the case of magnetic dipolar coupling
  • optical dipolar transition moments are also fixed and do not rotate. This allows not only the measurement of the intensity of the focus, but also the vectorial one
  • the optical transition dipole moments can be derived from the crystal axes.
  • the scattering, depth and concentration of the fluorophores can be tailored.
  • corresponding optical centers can be located at a uniform depth of approximately 30 nm with a deviation of, for example, +/- 1 nm.
  • Fig. 2 Details of a sample
  • Fig. 3 Details of an optical center
  • FIG. 5 a course of an electric field corresponding to FIG. 4
  • Fig. 7 a sample
  • Fig. 8 a sample and its image
  • Fig. 12 polarization-dependent intensity distributions
  • Fig. 1 shows schematically a microscope arrangement 1 according to a
  • the microscope arrangement 1 has a microscope 5 and a sample 100. These components will be discussed in more detail below.
  • the microscope 5 has excitation optics 10 and query optics 30.
  • the excitation optics 10 in the present case have a light source 12 in the form of a laser, a mirror 14 and corrective optics 16, which are shown purely schematically. It should be understood that the described components of the excitation optics are only mentioned here as examples and that completely different components can also be used.
  • the excitation optics 10 generate an excitation light beam 20 which can be directed onto the sample 100 in a manner to be described below.
  • the interrogation optics 30 are designed to receive and process light 40 emitted by the sample 100.
  • the interrogation optics 30 have, for example, two lenses 32, 36 as well as a diaphragm 34 arranged between them.
  • the diaphragm 34 can be used, for example, in the context of confocal microscopy to select a visible area.
  • the microscope 5 has a detector 60.
  • the interrogation optics 30 direct the emitted light 40 onto this.
  • the microscope 5 also has an electronic control device 70 which is configured to carry out a method according to the invention. This will be discussed in more detail below.
  • the electronic control device 70 is connected to the detector 60 as shown and can thus receive signals which the detector 60 generates based on detected light 40.
  • the microscope 5 has further optics in the form of a beam splitter plate 50 which optically separate the excitation optics 10 and the interrogation optics 30 from one another.
  • Excitation light beam 20 is guided by beam splitter plate 50 in the direction of sample 100. Between the beam splitter plate 50 and the sample 100 there is also a purely schematically illustrated sample optics 80. This ensures that the
  • Excitation light beam 20 hits the sample 100 as desired, the
  • Excitation light beam 20 is focused in the present case.
  • the microscope 5 also has a sample holder 90 in which the sample 100 is stored.
  • the sample 100 can thus in a defined manner from the
  • Excitation light beam 20 are illuminated. It should be mentioned that, for example, a sample scanner, a beam scanner or an objective scanner can be used as an embodiment.
  • the above-mentioned emitted light 40 is generated, which is also picked up by the sample optics 80 and passed through the beam splitter plate 50 into the interrogation optics 30. There it is fed to the detector 60 as already described. However, it should be mentioned that for
  • the sample 100 is a sample in the form of a solid body in which at least one optical center is present.
  • Such an optical center can generate light 40 emitted based on the excitation light beam 20. This can be done by scattering or by exciting a system with at least two levels into an excited state and subsequent relaxation with emission of photons into a ground state. Possibilities that result from this are described in more detail below.
  • FIG. 2 shows a typical interior of a sample 100 in the present case with two optical
  • optical centers namely a first optical center 110 and a second optical center 120.
  • Such optical centers 110, 120 can, for example, as
  • Nitrogen vacancies in diamond can be realized as solids.
  • a distance d such optical centers 110, 120 is, for example, between 3 nm and 20 nm, in which the effects already described above and below can be observed and used particularly advantageously. However, other distances are also possible.
  • the first optical center 110 has a first orientation 115.
  • the second optical center 120 has a second orientation 125.
  • Orientations 115, 125 are a respective main axis of symmetry which is relevant for the magnetic coupling. It is known that
  • Nitrogen vacancies in diamond have four possible orientations relative to the crystal lattice, each of which has an angle of 54.7 ° to an (OOI) surface.
  • the orientations 115, 125 shown, among other things, define a magnetic coupling between the two optical centers 110, 120, which is shown schematically by the field lines shown in FIG.
  • the magnetic coupling between two optical centers 110, 120 can be used to determine their distance independently of optical measurements.
  • a procedure that is independent of the microscope 5 shown in FIG. 1 is available in order to measure the distance d between the two optical centers 110, 120 very precisely.
  • the method already described above can be used for this purpose.
  • a spatial calibration of the detector 60 is not necessary for this.
  • the timing already mentioned above can, as described in the references already cited above, be assigned to intervals.
  • This timing can be measured very precisely and, in particular, can also be traced back to a standard measure of the SI unit system, namely the second.
  • an atomic clock that is appropriately calibrated can be used for this purpose.
  • the distance d can basically only have discrete values which are predetermined by the grid.
  • 3 shows the first optical center 110 in a spatial orientation with a specified coordinate system and its axes x, y and z. The respective projections onto the (x, y) plane, the (y, z) plane and the (x, z) plane are also shown.
  • the orientation 115 is also shown.
  • the first optical center 110 which in the present case is in the form of a
  • Nitrogen vacancy is formed, two optical transition dipole moments 117, 118, which lie in a plane transverse to the orientation 115.
  • the two optical transition dipole moments 117, 118 which lie in a plane transverse to the orientation 115.
  • Transition dipole moments 117, 118 are to be understood as preferred orientations in which an excitation of the first optical center 110 is particularly efficient with a parallel electric field of an excitation light. Incidentally, this applies equally to the plane spanned by the two optical transition dipole moments 117, 118, a rotation of the electrical field in this plane having no effect.
  • Transition dipole moments 117, 118 twisted out in the spanned plane this has the effect that the excitation is less efficient.
  • the phenomenon just described can be used to measure an excitation light beam 20. This is shown in more detail in FIG. 4 and the associated FIGS. 5 and 6, only components being shown here in one plane for the sake of simplicity.
  • the z-axis lies in the direction of the propagation direction of the
  • FIG. 4 shows the excitation light beam 20 in particular before and after exiting the sample optics 80, the excitation light beam 20 being focused on a focal plane 25.
  • the electric field of the excitation light beam 20 changes, with it being aligned transversely to the direction of propagation in front of the sample optics 80, as indicated by the unfilled arrows below, but then changing and only being in the focal plane 25 again transversely to the direction of propagation.
  • the electric field of the excitation light beam 20 from the location is transverse to
  • FIG. 5 the arrows not filled in showing the electric field of the excitation light beam 20 as a function of the location.
  • Fig. 4 and in Fig. 5 two points are shown at which optical centers can be located, for example. These can in principle from
  • Excitation light beam 20 are excited. The positions are shown by vertical dashed lines. Also, they are through the circles shown
  • FIG. 5 Associated optical transition dipole moments of the two optical centers are shown in FIG. 5 with filled arrows. As can be seen, the two optical transition dipole moments are aligned in the same way. However, the electric field of the excitation light beam 20 is clearly different at the two locations, with the electric field of the excitation light beam 20 being almost transverse to the optical transition dipole moment in the left position, whereas the electric field of the excitation light beam 20 in the right position is only a small angle to the optical one Transition dipole moment assumes.
  • a corresponding sample 100 with such an optical center 110 can be inserted into the sample holder 90 and moved in a targeted manner.
  • changes in intensity can be determined, with a scalar product between the optical transition dipole moment of the optical center and the electric field of the excitation light beam 20 being greater the higher it is at a specific location detected brightness.
  • FIG. 7 shows an exemplary sample 100 in the form of a solid body 105 in which the aforementioned optical centers 110, 120 are located at a distance d from one another.
  • Typical electric fields E and / or magnetic fields B are shown, which here, for example, pass through the sample 100 and can interact with the two optical centers 110, 120.
  • FIG. 8 shows the sample 100 already shown in FIG. 7 and its effect on the
  • Detector 60 the optics 30, 50, 80 located between them being shown purely schematically.
  • the two optical centers 110, 120 are imaged by the interposed optics 30, 50, 80 on the detector 60 as a first point 62 and second point 64, which are at a distance d ‘from one another on the detector 60.
  • This distance d ' can easily be determined and initially relates to the coordinate system of the detector 60.
  • the distance d' can be determined by a number of pixels lying between the two points 62, 64 or by a distance by which the detector 60 is Whole procedure has to be specified.
  • the distance d between the two optical centers 110, 120 in the sample can be measured very precisely, as already mentioned above, independently of a spatial calibration of the detector 60, it is now possible to calibrate the distance d ′ in the detector 60, since therefrom It can be assumed that the distance d ′ measured in the coordinate system of the detector 60 corresponds to the distance d in the sample 100.
  • the sample 100 can thus be used as a reference for the measured distance. If another sample is subsequently used in which an unknown distance is to be measured, this calibration can be used to determine the distance in the other sample. It has been shown to be particularly advantageous that the sample 100 with the solid body 105 is very photostable, remains stable over long periods of time and is easy to handle. You don't need any
  • Deviations that can occur over time are recognized.
  • a respective calibration by means of the sample 100 can also be carried out before measurements to be carried out on other samples, so that a respective distance in the other sample can be determined very precisely.
  • it can also be used to detect rotations which can occur, for example, due to long-term changes in the sample holder 90.
  • Fig. 9 is shown separately how a sample 100 for measuring the
  • Excitation light beam 20 or can be used to determine a collection efficiency.
  • the excitation light beam 20 is focused on the sample 100 by the already mentioned optics 10, 50, 80, which are only shown schematically in FIG. 9, and thus has a location-dependent course of its electrical path already shown in FIGS. 4, 5 and 6 Field.
  • the electric field is shown schematically by means of arrows 22.
  • Excitation light beam 20 with a defined intensity can be used, which thus also leads to a defined emission of the optical center 110.
  • an excitation light beam 20 can be used with an intensity which is so great that the first optical center 110 emits at its maximum photon emission rate. This is for typical optical centers 110 such as
  • the detector 60 can then be used to determine how many photons actually arrive at the detector 60.
  • the collection efficiency of the microscope 5 can then be determined from a quotient of the photons actually arriving in a specific time interval divided by the number of photons emitted in this time interval. This can be, for example, a few percent, but also below or above.
  • the optical center 110 contained in the sample 100 has an already described optical transition dipole moment 117, the more efficient the excitation, the more parallel the electric field of the excitation light beam 20 and the optical one
  • Transition dipole moment 117 are. This enables the
  • Excitation light beam 20 for example by moving the sample 100 in
  • Such a spatial method can be used to determine, for example, an intensity distribution shown in FIG. 10.
  • Excitation light beam 20 used which corresponds to a polarization parallel to the y-axis.
  • the optical center is located in a plane 200 nm behind a focal plane of the excitation light beam.
  • a focus of the measured brightness is on the x-axis, but about 66 nm above the y-axis.
  • the central line already drawn in FIG. 4 in the direction of the direction of propagation of the is used as the zero point
  • Excitation light beam 20 used.
  • the surrounding lines indicate at which points the measured intensity, which is indicative of the excitation strength, drops by ten percentage points.
  • the immediately surrounding line thus shows an intensity of 90% of the maximum intensity or the intensity at the center of gravity
  • the line labeled “0.8” shows an intensity of 80% of the maximum intensity or the intensity at the center of gravity
  • 10 thus shows that a maximum or a center of gravity of the excitation efficiency occurs outside an actual zero point at which the highest excitation efficiency would be expected without taking into account the polarization dependence or field dependency. This phenomenon can be used to measure the excitation light beam 20, as already mentioned.
  • FIG. 11 shows how the focus of the excitation shown in FIG. 10 changes into
  • a plane 200 nm behind a focal plane of the excitation light beam is also used here.
  • the excitation maximum is very close to the zero point, i.e. approximately located on an intersection of the y-axis and x-axis.
  • the excitation maximum is around (+20 nm, +18 nm).
  • the maximum excitation is around (-20 nm, + 18 nm).
  • the solid line shows the elliptical course, des
  • Excitation maximum which, for example, by moving the sample 100 im
  • Sample holder 90 can be determined, is thus dependent on the polarization of the excitation light beam 20. This can be used to measure the excitation light beam 20 as calibration of the microscope 5.
  • Excitation light beam 20 can be used.
  • FIG. 13 shows the course of corresponding excitation maxima for the case that astigmatism is present in the excitation optics 10.
  • a first focal plane FE1 and a second focal plane FE2 are shown by way of example. With these two
  • Focal planes FE1, FE2 the excitation maxima as a function of the polarization no longer run along an ellipse, as shown for example in FIG. 11, but rather along a respective straight line. These straight lines can be measured, and an intersection of these straight lines can indicate an actual sample position. This can be used to measure the excitation light beam 20 and in particular also to detect any astigmatisms in the excitation optics 10 or in other optics of the microscope 5 can be used. This also makes it possible to calibrate the excitation light beam 20 and in particular also to detect any astigmatisms in the excitation optics 10 or in other optics of the microscope 5 can be used. This also makes it possible to calibrate the excitation light beam 20 and in particular also to detect any astigmatisms in the excitation optics 10 or in other optics of the microscope 5 can be used. This also makes it possible to calibrate the excitation light beam 20 and in particular also to detect any astigmatisms in the excitation optics 10 or in other optics of the microscope 5 can be used

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kalibrieren eines Mikroskops, wobei zum Kalibrieren eine Probe in Form eines Festkörpers mit zumindest einem optischen Zentrum verwendet wird. Damit können beispielsweise Kalibrierungen in Bezug auf eine Sammlungseffizienz, auf einen Abstand, auf eine Polarisation oder auf ein vektorielles elektrisches Feld eines Anregungslichtstrahls durchgeführt werden. Die verwendete Probe hat sich als stabil und einfach handhabbar erwiesen.

Description

Verfahren zum Kalibrieren eines Mikroskops,
Mikroskopanordnung und Verwendung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kalibrieren eines Mikroskops, eine zugehörige Mikroskopanordnung sowie eine zugehörige Verwendung.
Mikroskope, insbesondere hochauflösende Mikroskope, werden für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Beispielsweise können sie für biologische, mikrobiologische und materialwissenschaftliche Fragestellungen eingesetzt werden. Mittels diverser Superresolutionstechniken können mittlerweile Auflösungen erzielt werden, welche erheblich besser sind als die aufgrund von Beugung beschränkte Auflösung.
Um Ergebnisse, welche mittels eines Mikroskops gewonnen wurden, korrekt interpretieren zu können, ist es von Vorteil, wenn eine Referenz für diverse
Eigenschaften eines Mikroskops zur Verfügung steht. Bekannte Referenzen, beispielsweise für ein Längenmaß, basieren beispielsweise darauf, dass Fluorophore bewusst in DNA-Moleküle eingebracht werden. Derartige Proben haben sich jedoch als wenig langlebig erwiesen und sind eher für Größenordnungen von mehreren hundert Nanometern geeignet.
Es ist deshalb eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Kalibrieren eines Mikroskops vorzusehen, welches im Vergleich zu bekannten Lösungen alternativ oder besser ausgeführt ist. Es sind des Weiteren Aufgaben der Erfindung, eine zugehörige Mikroskopanordnung sowie eine zugehörige Verwendung bereitzustellen.
Dies wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren, eine Mikroskopanordnung sowie eine Verwendung gemäß den jeweiligen Hauptansprüchen erreicht. Vorteilhafte
Ausgestaltungen können beispielsweise den jeweiligen Unteransprüchen entnommen werden. Der Inhalt der Ansprüche wird durch ausdrückliche Inbezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kalibrieren eines Mikroskops. Das Mikroskop weist Folgendes auf:
einen Probenhalter zur Aufnahme einer Probe,
eine Anregungsoptik zum Richten eines Anregungslichtstrahls auf die Probe, eine Abfrageoptik zum Aufnehmen von durch die Probe ausgesendetem Licht, und
einen Detektor zum Erfassen von durch die Abfrageoptik aufgenommenem Licht.
Das Verfahren weist folgende Schritte auf:
Einsetzen eines Festkörpers als Probe in den Probenhalter, wobei der
Festkörper zumindest ein erstes optisches Zentrum aufweist, welches nach Anregung Licht aussendet,
Richten eines Anregungslichtstrahls auf die Probe, so dass das erste optische Zentrum angeregt wird,
Erfassen des von der Probe ausgesendeten Lichts mittels der Abfrageoptik und des Detektors, und
Kalibrieren des Mikroskops basierend auf dem vom Detektor erfassten Licht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Festkörper mit einem optischen Zentrum verwendet. Es hat sich gezeigt, dass derartige Festkörper mit optischem Zentrum erheblich widerstandsfähiger und langlebiger sind als aus dem Stand der Technik bekannte Proben. Dementsprechend kann eine Kalibrierung wesentlich zuverlässiger durchgeführt werden und es können unterschiedliche Vergleiche, beispielsweise zwischen verschiedenen Zeitpunkten und/oder zwischen verschiedenen Mikroskopen, angestellt werden. Außerdem können beispielsweise Vergleiche zwischen unterschiedlichen Mikroskopteilen wie Objektiven oder unterschiedlichen
Auswerteverfahren oder Algorithmen angestellt werden. Beispielhafte Ausführungen dazu werden weiter unten näher beschrieben werden.
Das Verfahren ist insbesondere für die Verwendung mit einem Mikroskop wie
angegeben geeignet. Eine alternative Formulierung des Verfahrens kann wie folgt lauten:
Einsetzen eines Festkörpers als Probe in einen Probenhalter eines Mikroskops, wobei der Festkörper zumindest ein erstes optisches Zentrum aufweist, welches nach Anregung Licht aussendet,
Richten eines Anregungslichtstrahls mittels einer Anregungsoptik des Mikroskops auf die Probe, so dass das erste optische Zentrum angeregt wird,
Erfassen des von der Probe ausgesendeten Lichts mittels einer Abfrageoptik des Mikroskops und eines Detektors des Mikroskops,
Kalibrieren des Mikroskops basierend auf dem vom Detektor erfassten Licht.
Bei dem Festkörper kann es sich um einen durchgehenden bzw. einstückigen
Festkörper handeln. Es kann sich jedoch beispielsweise auch um einen
zusammengesetzten Festkörper handeln. Beispielsweise können mehrere Nano- Partikel oder Nano-Diamanten zu einem Festkörper zusammengesetzt werden.
Besondere Vorteile ergeben sich bei einem kristallinen, insbesondere monokristallinen Festkörper, es können jedoch auch beispielsweise polykristalline, glasartige oder auch zusammengesetzte Festkörper verwendet werden. Eine Herstellung derartiger
Festkörper kann beispielsweise durch Spincoating erfolgen, beispielsweise durch Spincoating von Nanodiamanten in einem Polymer wie Polymethylmethacrylat (PMMA). Nanodiamanten können auch nicht zusammengesetzt an festen Positionen in einem Trägermaterial liegen. Kristalle haben insbesondere Vorteile hinsichtlich fester
Geometrie und bekannter Ausrichtungen anhand von Oberflächen. Begriffe wie Gitter oder Gitterplatz sind aber auch in amorphen Materialien vernünftig anwendbar.
Es sei des Weiteren verstanden, dass unter dem Aussenden von Licht nach Anregung beispielsweise eine Emission verstanden werden kann, wobei in bekannter Weise das optische Zentrum mittels eines Anregungslichts angeregt wird, also in einen
energiereicheren quantenmechanischen Zustand übergeht. Von diesem aus kann es über einen oder mehrere Zerfallspfade wieder in einen Grundzustand übergehen und dabei ein Photon aussenden. Es kann sich jedoch bei dem Aussenden von Licht auch um eine Streuung handeln, welche hier als Aussenden nach Anregung verstanden wird. Anders ausgedrückt wird ein Anregungslichtstrahl auf das optische Zentrum gerichtet und das Licht wird gestreut, so dass es an einer anderen Stelle erfasst werden kann. Auch dies wird hier als Aussenden von Licht nach Anregung verstanden. Der Probenhalter kann beispielsweise dazu ausgebildet sein, die Probe in einer definierten und/oder reproduzierbaren Stellung zu halten. Dies kann beispielsweise mittels des Verfahrens überwacht werden, worauf weiter unten näher eingegangen wird.
Die Anregungsoptik kann beispielsweise dazu ausgebildet sein, einen Laserstrahl auf die Probe zu richten. Hierzu kann beispielsweise ein Laser als Teil der Anregungsoptik vorgesehen sein. Dieser kann durch optische Komponenten wie Spiegel, Linsen, Strahlteiler und andere Komponente so manipuliert werden, wie es für den jeweiligen Zweck erforderlich ist. Beispielsweise kann der Anregungslichtstrahl auf die Probe und/oder auf das optische Zentrum fokussiert werden. Es kann jedoch auch ein nicht fokussierter Lichtstrahl verwendet werden.
Der Detektor kann beispielsweise ein analoger Detektor wie beispielsweise eine
Fotoplatte sein. Es kann sich auch um einen digitalen Detektor handeln. Beispielsweise kann ein CCD-Detektor, eine Kamera, insbesondere eine empfindliche Kamera, eine CCD-Kamera, oder eine CMOS-Kamera oder ein Film, insbesondere ein
photographischer Film oder ein optischer Film, verwendet werden. Der Detektor kann beispielsweise so ausgebildet sein, dass er an nur einem Ort detektieren kann, beispielsweise mit einer Photodiode, Avalanche-Photodiode (APD), oder einem
Photomultiplier. Er kann jedoch beispielsweise auch verfahrbar ausgebildet sein, so dass mittels eines grundsätzlich nur an einem Ort detektierenden Detektors eine größere Fläche abgebildet werden kann. Außerdem kann vorgesehen sein, dass der Detektor aus einer Mehrzahl von Einzeldetektoren an unterschiedlichen Orten
ausgebildet ist. Auch damit kann eine größere Fläche abgedeckt werden. Alternativ können beispielsweise auch die Probe, der Strahl und/oder ein Objektiv relativ zum Detektor bewegt werden.
Unter einem Kalibrieren des Mikroskops kann verstanden werden, dass das gesamte Mikroskop kalibriert wird oder auch dass nur ein Teil des Mikroskops, beispielsweise ein Objektiv, kalibriert wird, oder auch dass ein Mikroskopierverfahren kalibriert wird. Auch dies sei als ein Kalibrieren des Mikroskops verstanden. Beispielsweise können sich Mikroskopierverfahren lediglich oder zumindest in der Auswertung, welche
beispielsweise in Software realisiert sein kann, unterscheiden. Insbesondere kann unter einer Kalibrierung verstanden werden, dass mittels des Mikroskops ein Wert der Probe gemessen wird, beispielsweise ein Abstand zweier optischer Zentren, und dass dieser Wert gegen einen durch eine Messung bzw. eine anderweitige Messung ermittelten Wert kalibriert und/oder mit einem durch eine Messung bzw. eine anderweitige
Messung ermittelten Wert verglichen wird. Beispielsweise kann zu einer solchen Messung das hierin beschriebene Verfahren verwendet werden, welches auf dem Anlegen von Magnet- und Hochfrequenzfeldern basiert. Auch andere Ausführungen sind jedoch möglich. Durch den Vergleich mit einem gemessenen Wert kann
typischerweise eine höhere Genauigkeit erzielt werden, als wenn beispielsweise mit einem durch Simulation oder Schätzung ermittelten Wert verglichen wird. Beispiele einer Kalibrierung werden hierin beschrieben, beispielsweise bezüglich Abstand, Anregungslichtstrahl oder Sammlungseffizienz. Derartige Kalibrierungen können jeweils für das ganze Mikroskop, für einen Teil davon und/oder für ein Kalibrierverfahren ausgeführt werden.
Auch eine Mikroskopiermethode bzw. ein Mikroskopierverfahren kann kalibriert werden, wobei beispielsweise auch weitere Verfahrensaspekte berücksichtigt werden können.
Insbesondere kann im Rahmen einer Kalibrierung ermittelt werden, ob und in wieweit über das Mikroskop gemessene Größen wie beispielsweise Relativabstände, absolute Positionen, Intensitäten oder Orientierungen den wahren Werten entsprechen. Dabei kann insbesondere ein Vergleich zwischen einem Eingangswert und einem
Kalibrierwert erfolgen.
Es kann auch ein Abgleich, eine Justage, ein Justieren oder dergleichen erfolgen.
Dabei können beispielsweise bestimmte Parameter eines Mikroskopieaufbaus verändert werden, um die Einhaltung vorgegebener Eigenschaften zu erreichen.
Eine Kalibrierung kann beispielsweise rückführbar auf das Sl-System oder andere Normen sein. Beispiele werden hierin erläutert. Auch andere Ausführungen sind jedoch möglich.
Auch können mittels einer Kalibrierung andere Normale kalibriert werden, so dass ein Sekundärstandard etabliert werden kann. Im Rahmen einer Kalibrierung kann auch eine Fehlerbestimmung und/oder eine Abweichungsbestimmung durchgeführt werden. Es können auch relevante Geräteparameter überprüft werden, was beispielsweise als „performance test“ bezeichnet werden kann. Im Rahmen der Kalibrierung kann auch die Einhaltung von Spezifikationen überprüft werden.
Gemäß einer Ausführung weist die Probe zumindest ein zweites optisches Zentrum auf. Dadurch können weitere Funktionalitäten bezüglich des Kalibrierens des Mikroskops ermöglicht werden, auf welche weiter unten näher eingegangen wird.
Der Anregungslichtstrahl kann dabei insbesondere auf die Probe gerichtet werden, so dass das erste optische Zentrum und das zweite optische Zentrum angeregt werden. Dies kann insbesondere mittels des gleichen Anregungslichtstrahls, also insbesondere ohne räumliche Variation des Anregungslichtstrahls relativ zur Probe, und/oder gleichzeitig erfolgen. Dadurch können mehrere optische Zentren für die Kalibrierung herangezogen werden.
Das erste optische Zentrum und das zweite optische Zentrum können beispielsweise einen Abstand von mindestens einem Gitterplatz oder von mindestens 1 nm oder von mindestens 3 nm voneinander haben. Derartige Abstände als Mindestabstand haben sich für typische Anwendungen als vorteilhaft erwiesen und sind sowohl messbar wie auch für den Zweck einer Referenz verwendbar. Auch andere Abstände können jedoch verwendet werden.
Bevorzugt haben das erste optische Zentrum und das zweite optische Zentrum einen Abstand von höchstens 100 nm oder von höchstens 50 nm oder von höchstens 20 nm voneinander. Derartige Abstände als obere Grenze haben sich insbesondere deshalb als vorteilhaft erwiesen, weil bis zu derartigen Abständen in typischen Konstellationen eine Kopplung der optischen Zentren möglich ist, welche für unterschiedliche
Funktionalitäten wie beispielsweise eine unabhängige Abstandsbestimmung oder eine emitterselektive Ansteuerung verwendet werden kann. Auch andere Abstände können jedoch verwendet werden.
Gemäß jeweiligen Ausführungen können als optische Zentren spinaktive optische Zentren, magnetisch koppelbare optische Zentren oder anderweitig, also beispielsweise nicht magnetisch bzw. nichtmagnetisch bzw. nicht-magnetisch koppelbare optische Zentren verwendet werden. Nicht-magnetisch koppelbare optische Zentren sind insbesondere optische Zentren, welche koppelbar sind, aber eben nicht-magnetisch koppelbar sind, also beispielsweise anderweitig koppelbar sind. Dies kann
insbesondere dazu benutzt werden, um bei Vorhandensein von mindestens zwei optischen Zentren diese zu koppeln und somit auf quantenmechanische Effekte zurückgreifen zu können, beispielsweise um deren Abstand zu bestimmen oder um sie selektiv anzusprechen. Auch im Fall eines einzelnen optischen Zentrums kann mittels einer solchen Ausführung, beispielsweise mittels der Verwendung eines spinaktiven optischen Zentrums, beispielsweise ein optisches Übergangsdipolmoment des optischen Zentrums erreicht werden, welches für Kalibrieraufgaben verwendet werden kann. Hierauf wird weiter unten näher eingegangen. Ist das optische Zentrum in einem Kristall eingebettet so ergeben sich insbesondere Vorteile hinsichtlich fester
Gitterplatzabstände, fester Kristallachsen, fester Geometrie und an den
Kristalloberflächen vermessbarer Kristallachsen.
Als Festkörper kann insbesondere Diamant oder Siliziumcarbid (SiC) verwendet werden. Derartige Festkörper haben sich als besonders dauerhaft und für die hier verfolgten Zwecke geeignet erwiesen. Es sei jedoch verstanden, dass auch andere Festkörper verwendet werden können. Der Festkörper kann gemäß einer jeweiligen Ausführung einstückig und/oder als Einkristall ausgebildet sein. Er kann auch polykristallin oder amorph sein. Er kann gemäß einer Ausführung aus Nano-Partikeln oder Nano-Diamanten zusammengesetzt sein. Ein Nano-Diamant kann als Beispiel eines Nano-Partikels verstanden werden. Unter einem Nano-Partikel kann
insbesondere ein Körper mit einer Ausdehnung von nur wenigen Nanometern, beispielsweise höchsten 5 nm oder höchstens 10 nm, verstanden werden.
Als optische Zentren können beispielsweise Stickstofffehlstellen verwendet werden. Insbesondere können Stickstofffehlstellen in Diamant verwendet werden. Diese haben sich für typische Kalibrieraufgaben wie beispielsweise solche, welche weiter unten näher beschrieben werden, als vorteilhaft erwiesen und sind im Übrigen bezüglich ihres physikalischen Verhaltens gut bekannt. Es sei jedoch erwähnt, dass auch andere Arten von optischen Zentren, beispielsweise andere Arten von Fehlstellen oder sonstige Ausführungen optischer Zentren bzw. Substitutionsatome im Festkörper, verwendet werden können.
Der Anregungslichtstrahl kann beispielsweise eine Wellenlänge entsprechend einem Anregungsmaximum der optischen Zentren aufweisen. Die Wellenlänge kann beispielsweise im optischen Spektrum, im UV-Spektrum oder im IR-Spektrum liegen. Dadurch kann eine besonders effektive Anregung erreicht werden. Auch die
Verwendung eines Anregungslichts mit einem breiten Spektrum bzw. einem
kontinuierlichen Spektrum oder mit einer Wellenlänge, welche außerhalb eines
Anregungsmaximums der optischen Zentren liegt, ist jedoch möglich, wobei
beispielsweise auf Charakteristika der Anregungsoptik oder auf ein sonstiges Verhalten der optischen Zentren Rücksicht genommen werden kann.
Das Mikroskop kann beispielsweise ein Konfokalmikroskop, ein Nahfeldmikroskop, ein Streumikroskop oder ein Weitfeldmikroskop sein. Für derartige Arten von Mikroskopen hat sich das hierin beschriebene Verfahren als besonders vorteilhaft erwiesen. Auch alle anderen Arten von Mikroskopen oder jedes andere beliebige optische Gerät, welche die eingangs beschriebenen Erfordernisse erfüllen, kann für die Ausführung des Verfahrens verwendet werden.
Das Kalibrieren kann insbesondere ein Kalibrieren des gesamten Mikroskops sein. Dies bedeutet insbesondere, dass das Mikroskop als Gesamtheit betrachtet wird und als Ganzes kalibriert wird.
Das Kalibrieren kann auch ein Kalibrieren eines Teils des Mikroskops sein,
beispielsweise wenn nicht das gesamte Mikroskop kalibriert werden soll, sondern ein Teil beispielsweise schon anderweitig kalibriert ist und ein anderer Teil noch kalibriert werden soll. Das Mikroskop kann jedoch auch ganz kalibriert werden.
Das Kalibrieren kann auch ein Kalibrieren eines Mikroskopierverfahrens sein. Dies kann insbesondere bedeuten, dass bestimmte Abläufe des Verfahrens oder eine dazu verwendete Software kalibriert werden. Das Verfahren kann insbesondere mehrfach wiederholt ausgeführt werden. Dabei können Kalibrierungen, welche bei unterschiedlichen Ausführungen ermittelt werden, zur Feststellung von Änderungen im Zeitverlauf miteinander verglichen werden. Dies erlaubt beispielsweise eine zeitliche Beobachtung des Verhaltens eines Mikroskops, wodurch beispielsweise Langzeiteffekte erkannt und/oder korrigiert werden können. Es können auch Vergleiche zwischen unterschiedlichen Ausführungen angestellt werden. Es kann ein Mikroskop zu unterschiedlichen Zeiten vermessen werden, es können unterschiedliche Mikroskope verglichen werden oder es können unterschiedliche Zustände eines Mikroskops verglichen werden. Beispielsweise kann eine Komponente eines Mikroskops zwischen zwei Messungen verändert werden. Beispielsweise kann eine Schraube des Mikroskops verdreht werden.
Insbesondere kann die Kalibrierung zumindest quer zu einer Ausbreitungsrichtung des Anregungslichtstrahls erfolgen. Dies kann insbesondere bedeuten, dass Messdaten aufgenommen und für die Kalibrierung verwendet werden, welche einen Abstand oder eine sonstige Größe quer zur Ausbreitungsrichtung und/oder parallel zu einer
Oberfläche des Festkörpers, durch welche der Anregungslichtstrahl eindringt, wiedergeben. Dadurch kann die Kalibrierung über eine reine Tiefenkalibrierung hinausgehen und beispielsweise eine Kalibrierung in allen drei Raumrichtungen bieten. Auch eine Kalibrierung in nur einer oder zwei Raumrichtungen ist jedoch möglich. Auch eine Kalibrierung von vektoriellen Komponenten, z.B. Polarisationskomponenten des Anregungslichtstrahls, ist möglich.
Gemäß einer Ausführung ist das Kalibrieren ein Kalibrieren eines Abstands. Die Probe weist dabei bevorzugt zumindest ein zweites optisches Zentrum auf. Dieses zweite optische Zentrum kann beispielsweise zum ersten optischen Zentrum einen Abstand aufweisen, welcher innerhalb der weiter oben bereits als vorteilhaft angegebenen unteren und/oder oberen Grenzen liegt.
Das Verfahren kann dabei bevorzugt einen Schritt des Bestimmens eines Abstands zwischen dem ersten optischen Zentrum und dem zweiten optischen Zentrum mittels einer elektromagnetischen Kopplungsmessung beinhalten. Eine solche
elektromagnetische Kopplungsmessung ist vom Grundsatz her bekannt, beispielsweise aus den folgenden Publikationen: P. Neumann, R. Kolesov, B. Naydenov, J. Beck, F. Rempp, M. Steiner, V. Jacques,
G. Balasubramanian, M. L. Markham, D. J. Twitchen, S. Pezzagna, J. Meijer,
J. Twamley, F. Jelezko, J. Wrachtrup, "Quantum register based on coupled electron spins in a room-temperature solid", Nature Physics, vol. 6, no. 4, pp. 249-253, Apr.
2010. [Online]; http://www.nature.com/articles/nphys1536
H. S. Knowles, D. M. Kara, M. Atatüre, "Demonstration of a coherent electronic spin duster in diamond", Physical Review Leiters, vol. 117, no. 10, Sep. 2016. [Online]; https://doi.Org/10.1103/physrevlett.117.100802
F. Dolde, M. W. Doherty, J. Michl, I. Jakobi, B. Naydenov, S. Pezzagna, J. Meijer, P. Neumann, F. Jelezko, N. B. Manson, J. Wrachtrup,“Nanoscale Detection of a Single Fundamental Charge in Ambient Conditions Using the NV Center in Diamond”, Physical Review Leiters, vol. 112, no. 9, p. 097603, März 2014. [Online];
https://link.aps.0rg/d0i/l 0.1103/PhysRevLett.112.097603
Grob zusammengefasst kann eine solche Kopplungsmessung oder Abstandsmessung beispielsweise folgendermaßen erfolgen:
Anlegen eines Magnetfelds an die Probe,
Anregen der beiden optischen Zentren mittels eines Anregungslichtstrahls, Anlegen eines ersten elektromagnetischen Wechselfelds bevorzugt im
Mikrowellenspektrum, wobei beobachtet wird, dass jedes der beiden optischen Zentren bei beispielsweise jeweils zwei Frequenzen des ersten
elektromagnetischen Wechselfelds das magnetische Moment ändert, was sich beispielsweise bei einer Stickstofffehlstelle in Diamant dadurch äußern kann, dass es dunkel wird,
Anlegen des ersten elektromagnetischen Wechselfelds mit einer dieser
Frequenzen, so dass eines der beiden optischen Zentren dunkel wird, wobei das erste elektromagnetische Wechselfeld ein zeitlich begrenzter Puls ist, so dass das magnetische Moment des ersten optischen Zentrums in einer Überlagerung des hellen und dunklen Zustandes endet und eine Präzession um das angelegte Magnetfeld startet (Larmor-Präzession), Anlegen eines zweiten elektromagnetischen Wechselfeldes mit einer Frequenz, so dass das andere optische Zentrum dunkel wird, wobei das
elektromagnetische Wechselfeld ein zeitlich begrenzter Puls ist, so dass das magnetische Moment des zweiten optischen Zentrums verändert wird, was im Falle einer Wechselwirkung der beiden optischen Zentren zu einer Änderung der Präzessionsfrequenz des ersten optischen Zentrum führt,
Anlegen des ersten elektromagnetischen Wechselfelds mit derselben Frequenz und Pulsdauer, so dass das erste optische Zentrum die Präzession beendet und entsprechend der Phase/des Fortschritts in der Präzession entweder dunkel oder hell wird,
Variieren der Zeitpunkte, zu denen die elektromagnetischen Pulse angelegt werden, so dass der Verlauf der Präzession und somit die Änderung der
Präzessionsfrequenz beobachtet werden kann,
Rückrechnen aus der Änderung der Präzessionsfrequenz auf den Abstand zwischen den beiden optischen Zentren.
Die Vorgehensweise kann auch als Ramsey-Sequenz bezeichnet werden und kann leicht zu einer erweiterten Pulssequenz, beispielsweise als Flahn-Echo-Sequenz, erweitert werden.
Es hat sich gezeigt, dass mittels einer solchen elektromagnetischen
Kopplungsmessung der Abstand zwischen zwei optischen Zentren sehr genau bestimmt werden kann, so dass eine Auflösung bezüglich einzelner Gitterpositionen möglich ist. Eine Zeitgebung der Pulse kann dabei bestimmen, wann das jeweilige Feld anliegt und wann nicht.
Bevorzugt wird bei der Kopplungsmessung eine auf ein Standardmaß zurückgeführte Zeitgebung von Pulsen verwendet. Dabei kann es sich beispielsweise um die bereits erwähnten ersten und/oder zweiten elektromagnetischen Wechselfelder handeln. Eine Rückführung auf ein Standardmaß bedeutet dabei, dass die Zeitgebung oder die Frequenz dieser elektromagnetischen Welle auf die SI-Einheit Sekunde kalibriert wird. Flierzu kann beispielsweise eine Atomuhr oder eine andere entsprechend genau gehende Uhr, beispielsweise aus einem Satellitennavigationssignal, verwendet werden. Diese kann insbesondere auf das entsprechende Sl-Standardmaß kalibriert sein. Beispielsweise kann eine solche Atomuhr von einer Standardisierungsorganisation zur Verfügung gestellt werden. Insbesondere kann das Standardmaß auf einem
Frequenznormal und/oder auf einer Atomuhr basieren.
Durch das Rückführen der Zeitgebung bei einer Kopplungsmessung auf ein
Standardmaß kann eine Probe erreicht werden, in welcher zwei optische Zentren mit einem Abstand vorhanden sind, welcher auf ein Standardmaß bzw. auf ein Sl- Standardmaß kalibriert ist. Somit wird eine Probe bereitgestellt, welche als Referenz im Nanometer-Bereich dienen kann und Sl-kalibriert ist.
Es sei verstanden, dass das Rückführen auf ein Standardmaß bzw. das Bereitstellen einer entsprechend kalibrierten Probe, eine solche Probe an sich und ein zugehöriges Verfahren sowie eine Verwendung einer solchen Probe für die hierin genannten Zwecke einen jeweiligen eigenständigen Erfindungsaspekt darstellen können.
Bevorzugt wird ein mittels eines Detektors ermittelter Abstand kalibriert. Dies kann beispielsweise bedeuten, dass mittels des Detektors ein Abstand ermittelt wird, welcher beispielsweise in Pixeln des Detektors, in einer vom Detektor verfahrenen Strecke oder einer sonstigen vom Detektor verwendeten Maßeinheit angegeben wird. Es können beispielsweise auch Objektiv- oder Beamscanner oder Weitfeldkameras verwendet werden. Der Abstand der beiden optischen Zentren in der Probe ist dabei
typischerweise bekannt, beispielsweise mittels der weiter oben bereits beschriebenen Kopplungsmessung. Dies ermöglicht es, ein im Detektor verwendetes Maß oder Koordinatensystem auf den tatsächlichen Abstand zu kalibrieren. Dies erlaubt eine sehr genaue Kalibration des Detektors, des mikroskopischen Aufbaus und/oder des eingesetzten Auswerteverfahrens, so dass man sicher sein kann, exakte Abstände zu messen, insbesondere im Nanometer-Bereich.
Insbesondere kann der mittels des Detektors ermittelte Abstand gegen einen bekannten Abstand in dem Festkörper kalibriert werden. Dabei kann beispielsweise der Abstand im Festkörper wie hierin beschrieben ermittelt werden. Unter einem Kalibrieren kann insbesondere in diesem Fall insbesondere verstanden werden, dass ein vom Detektor ermittelter Abstand skaliert oder anderweitig korrigiert wird, so dass ein Endergebnis dem tatsächlichen Abstand entspricht. Insbesondere kann der mittels des Detektors ermittelte Abstand gegen einen durch eine anderweitige Messung gemessenen Abstand in dem Festkörper kalibriert werden. Unter einer anderweitigen Messung kann dabei insbesondere eine Messung des Abstands verstanden werden, welche nicht durch Beobachtung mit dem Detektor erfolgt. Eine solche anderweitige Messung kann beispielsweise durch das Anlagen von
Magnetfeldern und elektromagnetischen Wechselfeldern erfolgen, beispielsweise wie hierin beschrieben. Unter einem Kalibrieren kann insbesondere in diesem Fall insbesondere verstanden werden, dass ein vom Detektor ermittelter Abstand skaliert oder anderweitig korrigiert wird, so dass ein Endergebnis dem tatsächlichen Abstand entspricht.
Der Abstand kann beispielsweise mittels emitterselektiver Aktivierung der optischen Zentren und/oder mittels Superresolutionsmethoden, Korrelationsauswertung oder Kreuzkorrelationsauswertung von durch den Detektor basierend auf dem erfassten Licht aufgenommenen Signalen ermittelt werden.
Dies kann beispielsweise bedeuten, dass, wie weiter oben bereits beschrieben, durch das Anlegen einer elektromagnetischen Welle aus dem Mikrowellenspektrum die optischen Zentren, welche als Emitter bezeichnet werden können, selektiv aktiviert bzw. deaktiviert werden und entsprechendes Licht vom Detektor erfasst wird. Basierend darauf erzeugte Signale können ausgewertet werden, beispielsweise indem eine jeweilige Gauß-Funktion auf ein Signal angefittet wird und das Maximum der Gauß- Funktion als Position des jeweiligen optischen Zentrums im Koordinatensystem des Detektors verwendet wird. Dementsprechend kann auch eine
Kreuzkorrelationsauswertung vorgenommen werden. Entsprechende Techniken sind beispielsweise als Superresolutionsmethoden oder Superresolutionsmikroskopie bekannt, welche allgemein durch die Betrachtung gewisser Bereiche im
mikroskopischen Aufbau, beispielsweise im Detektor oder Detektorsystem eine
Auflösung ermöglichen, welche besser ist als die aufgrund des Beugungslimits begrenzte Auflösung des Mikroskops.
Gemäß einer Ausführung wird eine Mehrzahl von Abständen zwischen dem ersten optischen Zentrum und dem zweiten optischen Zentrum zu unterschiedlichen Zeitpunkten jeweils vektoriell ermittelt. Dies kann insbesondere bedeuten, dass nicht nur eine Länge, sondern auch die Orientierung des Abstands in einem
dreidimensionalen Koordinatensystem ermittelt wird. Aus den vektoriellen Abständen kann dann beispielsweise eine Rotation ermittelt werden.
Gemäß einer Ausführung wird eine Mehrzahl von Abständen zwischen dem ersten optischen Zentrum und dem zweiten optischen Zentrum zu unterschiedlichen
Zeitpunkten jeweils mittels des vom Detektor erfassten Lichts bestimmt. Dabei kann der Abstand in drei Dimensionen oder in zwei Dimensionen, insbesondere quer zur
Ausbreitungsrichtung des Anregungslichtstrahls und/oder einer optischen Achse des Mikroskops, bestimmt werden. Dies kann insbesondere bedeuten, dass nicht nur eine Länge, sondern auch die Orientierung des Abstandes in einem dreidimensionalen Koordinatensystem oder als Projektion in einem zweidimensionalen Koordinatensystem ermittelt wird. Aus den dreidimensionalen vektoriellen Abständen oder aus den zweidimensionalen Projektionen der Abstände kann dann beispielsweise eine Rotation der Probe ermittelt werden. Mit Wissen des dreidimensionalen vektoriellen Abstandes aus der magnetischen Abstandsbestimmung, beispielsweise wie weiter oben
beschrieben, kann beispielsweise eine genauere Aussage über diese Rotation ermittelt werden.
Insbesondere kann eine Rotation eines Vektors zwischen zwei optischen Zentren ermittelt werden, d.h. der Vektor erstreckt sich zwischen den zwei optischen Zentren und ein optisches Zentrum oder die optischen Zentren variieren ihre Lage im Raum. Dies grenzt sich insbesondere zur Ermittlung der relativen Lage von Abstandsvektoren zwischen jeweils zwei optischen Zentren zum gleichen Zeitpunkt ab. Es grenzt sich auch gegenüber einer Ermittlung einer Rotationskorrektur ab.
Beispielhafte Vorgehensweisen sind in folgenden Veröffentlichungen beschrieben:
Travis J. Gould, Daniel Burke, Joerg Bewersdorf, Martin J. Booth,
„Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens“,
Optics Express 20, 19, 20998-21009 (2012) B. Huang, W. Wang, M. Bates, X. Zhuang,“Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy”, Science 319,
810-813 (2008)
Durch eine solche Ausführung können beispielsweise Rotationen der Probe aufgrund von langfristigen Veränderungen des Probenhalters oder sonstiger Komponenten des Mikroskops ermittelt werden. Dadurch kann eine langfristige Überwachung des
Mikroskops erfolgen. Insbesondere kann dabei immer die gleiche Probe verwendet werden.
Gemäß einer Ausführung ist das Kalibrieren ein Vermessen des Anregungslichtstrahls. Das erste optische Zentrum weist dabei bevorzugt zumindest ein optisches
Übergangsdipolmoment auf. Dieses ist bevorzugt unveränderlich.
Mittels eines solchen Verfahrens kann der Anregungslichtstrahl sehr genau vermessen werden, so dass Daten wie Intensität, elektrischer Feldvektor oder Polarisation des Anregungslichtstrahls mit einer hohen Ortsauflösung erfasst werden können. Dadurch können beispielsweise Ergebnisse, welche mittels des Mikroskops gewonnen werden, wesentlich genauer und besser interpretiert werden. Es sei erwähnt, dass unter dem Begriff einer Polarisation des Anregungslichtstrahls insbesondere ein Zustand vor Durchgang durch eine vor der Probe befindlichen Optik verstanden werden kann, wobei eine solche Polarisation gezielt eingestellt werden kann. Für die Wechselwirkung mit einem optischen Zentrum ist grundsätzlich das vektorielle elektrische Feld am Ort des optischen Zentrums relevant, welches von der Polarisation, aber auch von anderen Faktoren abhängen kann.
Das erste optische Zentrum kann dabei beispielsweise relativ zum Anregungslichtstrahl verfahren werden, was beispielsweise durch Verfahren des Probenhalters erfolgen kann oder durch entsprechende Mechanismen im Probenhalter erfolgen kann. Dabei können insbesondere Änderungen des ausgesendeten Lichts ermittelt werden.
Bei solchen Änderungen kann es sich beispielsweise um Intensitätsänderungen oder um Farbänderungen handeln. Diese können beispielsweise mittels des Detektors des Mikroskops erfasst werden. Dadurch kann ermittelt werden, wie sich das von der Probe ausgesendete Licht verändert, wenn sich das optische Zentrum an unterschiedlichen Stellen relativ zum Anregungslichtstrahl befindet. Es sei erwähnt, dass dies mittels aus dem Stand der Technik bekannter Proben, welche beispielsweise auf DNA-Molekülen basieren, nicht möglich ist, da diese sich beispielsweise drehen, wackeln oder ausbleichen können.
Insbesondere kann das optische Übergangsdipolmoment in dem Festkörper und/oder relativ zum Probenhalter eine konstante oder zumindest nur eingeschränkt bewegliche Orientierung haben. Unter einer konstanten Orientierung wird dabei insbesondere eine Orientierung verstanden, welche sich relativ zum Bezugssystem zeitlich nicht verändert, insbesondere während der Durchführung des Verfahrens. Unter einer nur eingeschränkt beweglichen Orientierung wird insbesondere eine Orientierung verstanden, welche sich nur in vorgegebenen Grenzen, beispielsweise innerhalb eines vorgegebenen
einschränkenden Raumwinkelbereichs, beweglich ist. Ebenso kann insbesondere ein elektrisches Feld des Anregungslichtstrahls relativ zum Festkörper eine konstante Orientierung haben. Dies kann insbesondere für einen Zeitraum gelten, in welchem für die Kalibrierung relevante Messdaten gesammelt werden. Dadurch kann die
Messgenauigkeit verbessert werden. Das Vermessen kann insbesondere vektoriell sein, also insbesondere abhängig von der Orientierung des optischen
Übergangsdipolmoments und des elektrischen Felds des Anregungslichtstrahls.
Das Verfahren der Probe kann beispielsweise in einer Ebene quer zum
Anregungslichtstrahl erfolgen. Es kann jedoch auch andersartig erfolgen, beispielsweise kann alternativ oder zusätzlich eine Bewegung parallel zum Anregungslichtstrahl erfolgen. Es können auch Ebenen definiert werden, welche quer zum
Anregungslichtstrahl stehen und in welchen das Verfahren erfolgt. Grundsätzlich kann eine beliebige Überlagerung der beschriebenen Bewegungen je nach Anwendungsfall erfolgen.
Gemäß einer Ausführung ist der Anregungslichtstrahl polarisiert. Die Polarisation kann dabei beispielsweise linear, zirkular, trivial oder hochkomplex sein, wobei unter einer trivialen Polarisation eine örtlich unveränderliche Polarisation verstanden wird und unter einer hochkomplexen Polarisation verstanden wird, dass sie an verschiedenen Orten verschieden ist. Während des Kalibrierens kann die Polarisation relativ zur Probe gedreht werden und die Probe kann relativ zum Anregungslichtstrahl örtlich unverändert belassen werden. Dabei können polarisationsabhängige Änderungen des ausgesendeten Lichts ermittelt werden. Dies ermöglicht es, die Reaktion der Probe bzw. des optischen Zentrums auf Änderungen in der Polarisation zu ermitteln. Dadurch kann wesentlich genauer als bei bisherigen Ausführungen ermittelt werden, wie sich eine Probe bei Änderungen, insbesondere bei Drehungen der Polarisation, verhält, und es kann der
Anregungslichtstrahl sehr genau charakterisiert werden, da dessen Polarisation oder elektrische Feldvektoren auf diese Weise vermessen werden können.
Die Vermessung ist dreidimensional vektoriell möglich. Hierzu kann beispielsweise das bereits erwähnte, bevorzugt invariante, optische Übergangsdipolmoment des optischen Zentrums verwendet werden. Beispielsweise kann das optische
Übergangsdipolmoment derart ausgebildet sein, dass eine maximale Emission erfolgt, wenn das optische Übergangsdipolmoment parallel zum elektrischen Feld des
Anregungslichtstrahls steht, und dass eine minimale Emission oder auch gar keine Emission erfolgt, wenn das optische Übergangsdipolmoment quer zum elektrischen Feld des Anregungslichtstrahls steht. Dies kann beispielsweise dadurch ausgenutzt werden, dass die Probe und damit auch das optische Übergangsdipolmoment relativ zum Anregungslichtstrahl gedreht wird, wobei Probe oder optisches Zentrum dabei beispielsweise am gleichen Ort bleiben können. Dadurch kann beispielsweise ebenfalls der Anregungslichtstrahl vermessen werden. Es sei verstanden, dass eine Änderung einer Intensität beispielsweise ausgehend von einer maximalen Intensität, also beispielsweise bei parallel zum elektrischen Feld des Anregungslichtstrahls liegendem optischem Übergangsdipolmoment, gemessen werden kann, jedoch auch ausgehend von einer nicht vorhandenen Emission, also beispielsweise bei quer zum elektrischen Feld des Anregungslichtstrahls liegendem optischem Übergangsdipolmoment gemessen werden kann. Im letzteren Fall kann die Detektion in bestimmten Situationen einfacher sein, da von einem Nullsignal aus eine Veränderung festgestellt werden kann.
Es sei verstanden, dass mittels des hierin beschriebenen Verfahrens jedes optische Feld charakterisiert werden kann. Beispielsweise kann es sich dabei um eine ebene Welle, um einen Fokus oder eine fokussierte Welle, um evaneszente Felder oder um jede Mode wie beispielsweise eine TEMOO-Mode handeln. Insbesondere kann mittels des eben beschriebenen Verfahrens die Polarisation oder ein vektorielles elektrisches Feld charakterisiert werden.
Der Anregungslichtstrahl kann polarisiert sein, beispielsweise so wie weiter oben bereits beschrieben. Während des Kalibrierens kann die Polarisation relativ zur Probe unverändert belassen werden und die Probe kann relativ zum Anregungslichtstrahl örtlich unverändert belassen werden, wobei das ausgesendete Licht jeweils zu unterschiedlichen Zeitpunkten ermittelt wird. Änderungen des ausgesendeten Lichts können dann zwischen den Zeitpunkten ermittelt werden. Durch eine solche
Vorgehensweise kann eine Überwachung des Mikroskops zu unterschiedlichen
Zeitpunkten erfolgen, wobei vorzugsweise immer die gleiche Probe verwendet werden kann. Aufgrund der hohen Stabilität der Probe, welche durch einen Festkörper gebildet wird, sind Vergleiche zwischen unterschiedlichen, auch länger voneinander entfernten Zeitpunkten möglich. Dies ermöglicht eine laufende Überwachung der Stabilität des Mikroskops über einen längeren Zeitraum.
Der Anregungslichtstrahl kann polarisiert sein, beispielsweise wie weiter oben bereits beschrieben. Während des Kalibrierens kann die Polarisation gedreht und das erste optische Zentrum relativ zum Anregungslichtstrahl verfahren werden, um
polarisationsabhängige Intensitätsmaxima zu ermitteln, wobei hierbei die gemessene Intensität gemeint ist. Insbesondere kann zu jeder angelegten Polarisation ein zugehöriges Intensitätsmaximum oder eine zugehörige Intensitätsverteilung ermittelt werden. Die gemessene Intensität hängt typischerweise vom Skalarprodukt zwischen elektrischem Feld am Ort des optischen Zentrums mit dem optischen
Übergangsdipolmoment des optischen Zentrums ab. Das elektrische Feld kann dabei beispielsweise durch einen Astigmatismus in einer Anregungsoptik verzerrt sein.
Dadurch kann ermittelt werden, an welchen Stellen die Probe eine besonders hohe Emission von Licht zeigt, wodurch ebenfalls die Polarisation oder das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls kalibriert werden können. Anders ausgedrückt ist es durch die eben beschriebene Vorgehensweise bekannt, an welchen Stellen die Wirkung des Anregungslichtstrahls auf eine bestimmte Probe oder auf ein bestimmtes optisches Zentrum besonders hoch oder eben auch geringer ist. Gemäß einer Ausführung ist das Kalibrieren ein Kalibrieren einer absoluten Intensität oder einer Sammlungseffizienz des Mikroskops. Dadurch kann beispielsweise erfasst werden, wie viele Photonen von einem Mikroskop detektiert werden und/oder welcher Anteil von Photonen, welche von einer Probe ausgesendet werden, vom Mikroskop bzw. von dessen Detektor tatsächlich erfasst wird. Dies erlaubt eine Charakterisierung des optischen Systems des Mikroskops. Insbesondere können in einer solchen
Kalibrierung nicht nur der Detektor, sondern auch die gesamte davor geschaltete Optik und/oder weitere Komponenten, ein Verfahren oder eine Software kalibriert werden.
Der Anregungslichtstrahl kann beispielsweise eine Intensität aufweisen, bei welcher das erste optische Zentrum mit einer Rate entsprechend dem Inversen der Lebensdauer seines angeregten Zustands emittiert. Die Intensität kann auch so hoch sein, dass das erste optische Zentrum mit maximaler Photonenemissionsrate emittiert.
Durch eine solche Ausführung kann erreicht werden, dass die Anzahl der in einem bestimmten Zeitraum, beispielsweise innerhalb einer Sekunde, ausgesendeten, beispielsweise emittierten Photonen bekannt ist und somit anhand der vom Detektor erfassten Photonen leicht zurückgerechnet werden kann, welcher Anteil der
ausgesendeten Photonen durch die Abfrageoptik bis zum Detektor gelangt und von diesem detektiert wird.
Gemäß einer Ausführung weist der Anregungslichtstrahl eine Intensität auf, mit welcher das erste optische Zentrum mit einer Rate von höchsten 90 %, höchstens 80 %, höchstens 50 %, höchstens 30 %, höchstens 20 %, höchstens 10 %, höchstens 1 %, höchstens 0,1 % oder höchstens 0,01 % des Inversen der Lebensdauer seines angeregten Zustands emittiert und/oder mit höchsten 90 %, höchstens 80 %, höchstens 50 %, höchstens 30 %, höchstens 20 %, höchstens 10 %, höchstens 1 %, höchstens 0,1 % oder höchstens 0,01 % seiner maximalen Photonenemissionsrate emittiert.
Dadurch kann ebenfalls eine definierte Emission erreicht werden, so dass auf eine Sättigung verzichtet werden kann. Dadurch kann beispielsweise die Belastung des optischen Zentrums und/oder des Mikroskops verringert werden.
Eine Rate entsprechend dem Inversen der Lebensdauer des angeregten Zustands kann insbesondere dann erreicht werden, wenn das erste optische Zentrum ein reines Zwei- Niveau-System ist bzw. einem idealisierten Zwei-Niveau-System möglichst weitgehend entspricht, was beispielsweise bedeuten kann, dass keine konkurrierenden
Zerfallswege vorhanden sind. Das System wird in diesem Fall typischerweise aus einem Grundzustand angeregt, verbleibt im Schnitt mit der Lebensdauer des
angeregten Zustands im angeregten Zustand, gelangt durch Emission eines Photons in den Grundzustand zurück und wird aufgrund der dafür ausreichenden Intensität des Anregungslichtstrahls sofort wieder in den angeregten Zustand gebracht. Eine
maximale Photonenemissionsrate ist allgemeiner gefasst und umfasst nicht nur den eben beschriebenen Fall eines entsprechend angeregten Zwei-Niveau-Systems, sondern berücksichtigt auch den Fall, dass konkurrierende Zerfallsprozesse vorhanden sind. Beispielsweise kann aus einem angeregten Zustand nicht nur eine Relaxation unmittelbar in den Grundzustand möglich sein, sondern es kann auch ein
Zwischenzustand vorhanden sein, welcher energetisch zwischen Grundzustand und angeregtem Zustand angeordnet ist und in welchen ein Zerfall vom angeregten Zustand aus stattfinden kann. Dies erfolgt typischerweise ohne Photonenemission oder zumindest mit einer Photonenemission in einer anderen Wellenlänge. Der
Zwischenzustand kann beispielsweise eine andere, beispielsweise deutlich längere Lebensdauer als der angeregte Zustand haben. Derartige Zustände können auch als Dunkelzustände bezeichnet werden. Sie können beispielsweise durch Trapping, hervorgerufen beispielsweise durch Fehlstellen, Verunreinigungen oder andere
Merkmale, entstehen. Dies kann dazu führen, dass die Photonenemissionsrate auch bei hoher Anregung geringer, beispielsweise auch deutlich geringer, sein kann als das Inverse der Lebensdauer des angeregten Zustands. Trotzdem sind bei typischen optischen Zentren die entsprechenden Lebensdauern der Zustände bekannt, so dass die Photonenemissionsrate berechnet werden kann, oder sie ist aus anderweitigen Messungen bekannt. Die hier beschriebene Anregung eines optischen Zentrums kann auch als Sättigung bezeichnet werden.
Der Anregungslichtstrahl kann beispielsweise bei mehrfacher Durchführung des
Verfahrens zu unterschiedlichen Zeitpunkten und/oder mit unterschiedlichen
Mikroskopen und/oder mit unterschiedlichen Teilen von Mikroskopen und/oder mit unterschiedlichen Konfigurationen und/oder mit unterschiedlichen Auswerteverfahren, jedoch mit gleicher Probe, eine jeweils gleiche Intensität aufweisen. Dies ermöglicht einen Vergleich der detektierten Photonen pro Zeiteinheit zu unterschiedlichen Zeitpunkten und/oder zwischen unterschiedlichen Mikroskopen. Derartige Vergleiche sind mit den hierin beschriebenen Proben in Form von Festkörpern möglich, da diese über längere Zeiträume konstant und unverändert bleiben und ein konstantes Verhalten zeigen. Entsprechende Proben können beispielsweise aufgrund ihrer Robustheit auch über längere Strecken ungekühlt und ohne sonstigen großen Aufwand und ohne Beschädigung transportiert werden, um auf diese Weise Mikroskope an
unterschiedlichen Standorten miteinander zu vergleichen. Insbesondere kann
dementsprechend das Verfahren mehrfach wiederholt ausgeführt werden,
beispielsweise um Vergleiche zwischen den Ausführungen anzustellen.
Unter einer definierten Anregungsleistung wird beispielsweise eine vorgegebene Leistung des Anregungslichtstrahls oder eine vorgegebene Intensität des
Anregungslichtstrahls verstanden, welche beispielsweise so hoch sein kann, dass wie weiter oben bereits beschrieben eine maximale Photonenemissionsrate und/oder eine Photonenemissionsrate entsprechend dem Inversen der Lebensdauer des angeregten Zustands erreicht wird, es kann jedoch auch eine definierte Anregungsleistung verwendet werden, welche kleiner ist. Aufgrund der ansonsten unveränderten und definierten Verhältnisse führt eine solche definierte Anregungsleistung zu
unterschiedlichen Zeitpunkten und/oder bei unterschiedlichen Mikroskopen
typischerweise zu einer gleichen Aussendung von Licht, wobei aus Änderungen in einer solchen Aussendung von Licht ebenfalls auf Veränderungen eines Mikroskops zwischen den Zeitpunkten und/oder auf Unterschiede zwischen unterschiedlichen Mikroskopen geschlossen werden kann.
Mit den hier beschriebenen Maßnahmen kann insbesondere auch die Detektion oder ein Verhalten des Detektors und/oder einer Abfrageoptik kalibriert werden. Sie sind dafür entsprechend anwendbar. Eine Probe kann dabei beispielsweise auch relativ zum Detektor rotiert oder bewegt werden.
Die Sammlungseffizienz des Mikroskops kann beispielsweise als Quotient aus erfassten Photonen in einem Zeitintervall geteilt durch emittierte Photonen in dem Zeitintervall berechnet werden. Dies ermöglicht eine einfache und zweckmäßige
Berechnung der Sammlungseffizienz. Sie gibt an, wie viele der emittierten Photonen tatsächlich vom Detektor erfasst werden. Das Verfahren kann beispielsweise mittels einer Mehrzahl von Mikroskopen unter Verwendung derselben Probe durchgeführt werden. Ergebnisse beim jeweiligen
Kalibrieren der Mikroskope können miteinander verglichen werden. Dies ermöglicht einen Vergleich unterschiedlicher Mikroskope, welche sich beispielsweise auch an unterschiedlichen Standorten befinden können. Auch Vergleiche zwischen
unterschiedlichen Teilen von Mikroskopen oder Auswerteverfahren sind möglich. Dabei wird in vorteilhafter Weise die Tatsache ausgenutzt, dass bei den hierin beschriebenen Proben in Form von Festkörpern ein Transport auch über längere Strecken und längere Zeiträume möglich ist, ohne dass hierfür ein besonderer Aufwand wie beispielsweise Kühlung erforderlich wäre. Dies ist mit aus dem Stand der Technik bekannten Proben nicht möglich. Es sei verstanden, dass ein entsprechender Vergleich zwischen
Mikroskopen einen eigenständigen Erfindungsaspekt darstellen kann. Dabei kann das Verfahren in allen hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten verwendet werden.
Die Erfindung betrifft des Weiteren eine Mikroskopanordnung. Die Mikroskopanordnung weist ein Mikroskop auf. Das Mikroskop weist Folgendes auf:
einen Probenhalter zur Aufnahme einer Probe,
eine Anregungsoptik zum Richten eines Anregungslichtstrahls auf die Probe, eine Abfrageoptik zum Aufnehmen von durch die Probe ausgesendetem Licht, einen Detektor zum Erfassen von durch die Abfrageoptik aufgenommenem Licht, eine elektronische Steuerungsvorrichtung, welche dazu konfiguriert ist, ein Verfahren wie hierin beschrieben auszuführen.
Die Mikroskopanordnung weist ferner eine Probe in Form eines Festkörpers auf, wobei der Festkörper zumindest ein erstes optisches Zentrum aufweist, welches nach
Anregung Licht aussendet.
Mittels der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung können die bereits weiter oben mit Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren in all seinen Varianten beschriebenen Vorteile erreicht werden. Bezüglich des Verfahrens kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten zurückgegriffen werden. Es sei verstanden, dass die Mikroskopanordnung eine Kombination eines Mikroskops einschließlich seiner Steuerungsvorrichtung mit einer Probe in Form eines Festkörpers ist. Diese können beispielsweise räumlich benachbart zueinander angeordnet sein. Die Probe kann insbesondere auch in den Probenhalter eingesetzt sein.
Die Steuerungsvorrichtung kann beispielsweise ein Computer oder eine andere programmierbare Vorrichtung sein, welche sich benachbart zu den sonstigen
Komponenten des Mikroskops oder auch an einem davon entfernten Ort befinden kann. Es sei verstanden, dass bei einem Mikroskop Datengewinnung und Datenauswertung grundsätzlich auch räumlich voneinander getrennt stattfinden können, so dass beispielsweise die Durchführung des Verfahrens auch auf ein Rechenzentrum
ausgelagert werden kann. Es sei außerdem verstanden, dass die
Steuerungsvorrichtung typischerweise nur insofern zur Ausführung des Verfahrens konfiguriert ist, als dies technisch möglich ist. So können beispielsweise Schritte wie das Einsetzen der Probe und/oder gewisse Justageaufgaben anderweitig,
beispielsweise manuell, ausgeführt werden.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein nichtflüchtiges computerlesbares
Speichermedium, auf welchem ein Programmcode gespeichert ist, bei dessen
Ausführung ein Prozessor ein hierin beschriebenes Verfahren ausführt. Bezüglich des Verfahrens kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten
zurückgegriffen werden.
Die Erfindung betrifft des Weiteren eine Verwendung einer Probe zum Kalibrieren eines Mikroskops. Die Probe ist dabei ein Festkörper mit zumindest einem ersten optischen Zentrum, welches nach Anregung Licht aussendet. Mittels einer solchen Verwendung können die bereits weiter oben mit Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren beschriebenen Vorteile erreicht werden. Es kann bezüglich aller Varianten der
Verwendung auf die mit Bezug auf das Verfahren beschriebenen Varianten
zurückgegriffen werden.
Insbesondere kann das Mikroskop bei der Verwendung folgendes aufweisen:
einen Probenhalter zur Aufnahme einer Probe,
eine Anregungsoptik zum Richten eines Anregungslichtstrahls auf die Probe, eine Abfrageoptik zum Aufnehmen von durch die Probe ausgesendetem Licht, einen Detektor zum Erfassen von durch die Abfrageoptik aufgenommenem Licht.
Die Probe kann beispielsweise nur ein optisches Zentrum oder ein erstes und ein zweites optisches Zentrum aufweisen.
Das erste optische Zentrum und das zweite optische Zentrum können einen Abstand von mindestens einem Gitterplatz oder von mindestens 1 nm oder von mindestens 3 nm voneinander haben. Das erste optische Zentrum und das zweite optische Zentrum können auch einen Abstand von höchstens 100 nm oder von höchstens 50 nm oder von höchstens 20 nm voneinander haben.
Als optische Zentren können spinaktive optische Zentren, magnetisch koppelbare optische Zentren oder anderweitig koppelbare optische Zentren, insbesondere nicht magnetisch koppelbare optische Zentren, verwendet werden.
Als Festkörper kann beispielsweise Diamant oder Siliziumcarbid verwendet werden. Auch andere Arten von Festkörpern können jedoch verwendet werden. Als optische Zentren können insbesondere Stickstofffehlstellen verwendet werden, wobei auch andere Arten von optischen Zentren verwendet werden können.
Auch ansonsten sei verstanden, dass auf alle mit Bezug auf das Verfahren
beschriebenen Ausführungen und Varianten bezüglich der Verwendung zurückgegriffen werden kann.
Das Kalibrieren kann insbesondere gemäß dem Verfahren erfolgen. Bezüglich des Verfahrens kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten
zurückgegriffen werden.
Das Kalibrieren kann insbesondere auch mittels einer hierin beschriebenen
Mikroskopanordnung erfolgen. Auch diesbezüglich kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten zurückgegriffen werden.
Die Erfindung betrifft des Weiteren eine Probe in Form eines Festkörpers mit zumindest einem optischen Zentrum, welches nach Anregung Licht aussendet. Die Probe ist dabei zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren, in einer erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung oder in einer erfindungsgemäßen Verwendung vorgesehen und/oder konfiguriert. Bezüglich des Verfahrens, der Mikroskopanordnung und der Verwendung kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten zurückgegriffen werden.
Allgemein kann mittels der hierin beschriebenen Maßnahmen, beispielsweise des Verfahrens, der Verwendung und der Mikroskopanordnung, eine Mehrzahl von
Aufgaben ausgeführt werden, welche mit bisher aus dem Stand der Technik bekannten Ausführungen nicht möglich waren.
Dies sind beispielsweise:
1. Kalibrierung des genauen Abstands zweier Fluorophore, beispielsweise für die Konfokalmikroskopie oder für Konfokalmikroskope,
2. Verwendung zweier Fluorophore als rückführbares Standardmaß (Normal) für Nanometerabstände,
3. Kalibrierung der genauen Verteilung der Lichtintensität und der Polarisation bzw. elektrischem Feld am Ort des Fokus,
4. Kalibrierung der absoluten Intensität und der Sammlungseffizienz des
mikroskopischen Aufbaus,
5. Vergleich von Mikroskopen unter Verwendung der gleichen Probe.
Es sei verstanden, dass diese Aufzählung lediglich beispielhaft und keineswegs einschränkend zu verstehen ist. Die genannten Punkte können jedoch als jeweils eigenständige Erfindungsaspekte aufgefasst werden.
Im Stand der Technik sind beispielsweise zu Untersuchungen an der Quanteneffizienz von Emittern gewisse Standards bekannt. Für die Kolokalisation sind beispielsweise DNA-Origamiproben bekannt. Diese können beispielsweise zwei oder mehr
Fluorophore enthalten, die abgebildet werden können. Derartige Proben haben sich jedoch als nicht langlebig erwiesen, was deren Verwendung als Referenz für
unterschiedliche Zeitpunkte und/oder für an unterschiedlichen Orten befindliche
Mikroskope oder Mikroskopteile ausschließt. Es hat sich des Weiteren gezeigt, dass es bei DNA-Molekülen, die zwei oder mehr Fluorophore enthalten, zum Bleichen von Fluorophoren kommen kann, wobei diese ihre Fluoreszenzeigenschaften verlieren. Dies kann als ein Flauptproblem derartiger Proben betrachtet werden. Passiert dies bei einem Molekül, so ist dieses nicht mehr zur Eichung verwendbar. Die Proben sind temperaturempfindlich und müssen häufig gekühlt werden, was einen erheblichen Aufwand verursacht. Selbst bei guter Lagerung sind die Moleküle nur für wenige Monate verwendbar. Es ist auch bekannt, dass der Abstand zwischen den Fluorophoren bei DNA-Origami bei einem Molekül nur auf einige Nanometer genau angegeben werden kann. Messungen damit erlauben keine Aussage über die Polarisation bzw. die vektorielle Zusammensetzung des angelegten Lichtfelds. Als Resultat aus dem Bleichen der Fluorophore ist auch ein Vergleich verschiedener Mikroskope am selben Emitterpaar nur bedingt oder nicht möglich. Für eine
Verwendung als Standardmaß müssten Abstandsmessungen an Molekülen mit einem geeichten Mikroskop vollzogen werden, wofür geeichte Messschrauben verwendet werden müssten. Diese sind jedoch bei Weitem nicht so genau wie die weiter oben beschriebene Zeitreferenz.
Es hat sich gezeigt, dass insbesondere bei der Anwendung von Techniken zur
Messung unterhalb des Brechungslimits (Superresolution) eine genaue Bestimmung des Felds im Fokus von Bedeutung sein kann. Außerdem ist es von Vorteil, wenn Mikroskope vergleichbar und akkurat sind. Die Kolokalisation kann von besonderer Bedeutung sein, da Drift oder sonstige Positionsänderungen, zum Beispiel Neuauflegen der Probe, hierbei die Präzision der Messung nicht verändern.
Die hierin beschriebene Probe kann beispielsweise auf fluoreszierenden oder lumineszenten Defektzentren in Festkörpern wie beispielsweise Stickstofffehlstellen in Diamant basieren. Diese bleichen nicht und lassen sich mit alternativen
Elektronenspinresonanz (ESR)-Methoden lokalisieren. Außerdem besteht die
Möglichkeit, die Anzahl der Emitter über ihre Photonenstatistik zu bestimmen. Da der Abstand zweier Emitter in einem Festkörper aufgrund der niedrigen
Diffusionswahrscheinlichkeit solcher Defekte über lange Zeiträume konstant ist, ermöglicht eine solche Probe eine lang haltbare Probe zur Mikroskopeichung. Insbesondere können fluoreszierende Defektzentren in Festkörpern zur Untersuchung von Mikroskopen verwendet werden. Beispielsweise können Stickstofffehlstellen in Diamant verwendet werden, deren Fluoreszenzeigenschaften sehr gut untersucht sind und denen von in der Mikroskopie relevanten biologischen Proben entsprechen können. Die Lokalisation der einzelnen Emitter kann bei Defektzentren auch unabhängig von optischer Mikroskopie über Elektronenspinresonanzmethoden ermittelt werden, wie zum Beispiel durch Anlegen eines Gradientenfelds oder im Falle einer Kolokalisation über magnetische dipolare Kopplung oder elektrische Feldmessungen zwischen zwei Emittern. Hiermit lassen sich beispielsweise Abstände von ca. 3 nm bis 100 nm abdecken.
Fluoreszierende Defektzentren oder andere optische Zentren in Festkörpern sind üblicherweise photostabil, das heißt sie bleichen und diffundieren nicht. Das bedeutet, dass die Proben über lange Zeit stabil und nutzbar sind. Da die Emitter in einem
Festkörper sind, sind Handhabung, Lagerung und Transport der Proben einfach. Sie sind zudem temperaturbeständig. In Hinsicht auf die Kolokalisation ist zudem von Vorteil, dass der Abstand auf die Größe des Fluorophors genau festgelegt ist und sich nicht mehr verändert. Das heißt: Ist der Relativabstand eines Emitterpaars einmal bestimmt, so kann die Probe wiederholt zum Justieren und Charakterisieren von
Mikroskopen eingesetzt werden. Da der Abstand genau festgelegt ist, muss auch keine Statistik über ein Ensemble aus Emitterpaaren durchgeführt werden. Durch eine
Rückführung der Abstandsbestimmung auf das Sl-Einheitensystem lassen sich
Emitterpaare als Nanometerstandardmaß (Normal) verwenden. Die
Abstandsbestimmung erfolgt im Falle der magnetischen dipolaren Kopplung
beispielsweise über eine Zeitmessung der Elektronenspinresonanz. Die optischen dipolaren Übergangsmomente sind zudem fest und rotieren nicht. Dies ermöglicht nicht nur die Messung der Intensität des Fokus, sondern auch der vektoriellen
Zusammensetzung des elektrischen Felds. Sind die Fluorophore in einem Kristallgitter eingebettet, wie dies bei Stickstofffehlstellen in Diamant der Fall ist, so können die optischen Übergangsdipolmomente aus den Kristallachsen abgeleitet werden.
Verfahren zur Herstellung von Festkörperproben mit einzelnen Fluorophoren und Fluorophorpaaren sind bekannt, wie zum Beispiel bei Stickstofffehlstellen durch
Ionenimplantation durch nanoskopische Masken. Derartige Verfahren sind
beispielsweise in der folgenden Veröffentlichung beschrieben: I. Jakobi, S. A. Momenzadeh, F. F. De Oliveira, J. Michl, F. Ziem, M. Schreck, P.
Neumann, A. Denisenko, J. Wrachtrup,“Efficient creation of dipolar coupled nitrogen- vacancy spin qubits in diamond", Journal of Physics: Conference Series, vol. 752, no. 1 , 2016
Eine Ausführung ohne Masken ist beispielsweise in der folgenden Veröffentlichung beschrieben:
M. Flaruyama, S. Onoda, T. Higuchi, W. Kada, A. Chiba, Y. Flirano, T. Teraji,
R. Igarashi, S. Kawai, H. Kawarada, Y. Ishii, R. Fukuda, T. Tanii, J. Isoya,
T. Ohshima, 0. Hanaizumi,“Triple nitrogen-vacancy centre fabrication by C5N4Hn ion Implantation", Nature Communications, vol. 10, no. 1 , p. 2664, 2019. [Online];
http://www.nature.com/articles/s41467-019-10529-x
Dabei können die Streuung, Tiefe und Konzentration der Fluorophore maßgeschneidert werden. Beispielsweise können sich entsprechende optische Zentren in einer einheitlichen Tiefe von etwa 30 nm mit einer Abweichung von beispielsweise +/- 1 nm befinden.
Weitere Merkmale und Vorteile wird der Fachmann den nachfolgend mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung beschriebenen Ausführungsbeispielen entnehmen. Dabei zeigen:
Fig. 1 : eine Mikroskopanordnung,
Fig. 2: Details einer Probe,
Fig. 3: Details eines optischen Zentrums,
Fig. 4: einen Verlauf eines Anregungslichtstrahls,
Fig. 5: einen zu Fig. 4 korrespondierenden Verlauf eines elektrischen Feldes des
Anregungslichtstrahls,
Fig. 6: Verläufe von Anregungseffizienzen,
Fig. 7: eine Probe,
Fig. 8: eine Probe und deren Abbildung,
Fig. 9: eine Probe zur Vermessung des Anregungslichtstrahls,
Fig. 10: eine Intensitätsverteilung in einer Ebene, Fig. 11 : Schwerpunkte von Intensitäten in Abhängigkeit von einer Polarisation,
Fig. 12: polarisationsabhängige Intensitätsverteilungen,
Fig. 13: polarisationsabhängige Intensitätsverteilungen mit Astigmatismus,
Fig. 14: eine Legende für die vorhergehenden Fig. 10 bis 13.
Fig. 1 zeigt schematisch eine Mikroskopanordnung 1 gemäß einem
Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Mikroskopanordnung 1 weist ein Mikroskop 5 sowie eine Probe 100 auf. Auf diese Bestandteile wird nachfolgend näher eingegangen werden.
Das Mikroskop 5 weist eine Anregungsoptik 10 sowie eine Abfrageoptik 30 auf. Die Anregungsoptik 10 weist vorliegend eine Lichtquelle 12 in Form eines Lasers, einen Spiegel 14 und eine rein schematisch dargestellte Korrekturoptik 16 auf. Es sei verstanden, dass die beschriebenen Komponenten der Anregungsoptik hier lediglich beispielhaft genannt sind und dass auch völlig andere Komponenten verwendet werden können. Die Anregungsoptik 10 erzeugt einen Anregungslichtstrahl 20, welcher in noch zu beschreibender Weise auf die Probe 100 geleitet werden kann.
Die Abfrageoptik 30 ist dazu ausgebildet, von der Probe 100 ausgesendetes Licht 40 aufzunehmen und zu verarbeiten. Hierzu weist die Abfrageoptik 30 beispielhaft zwei Linsen 32, 36 sowie eine dazwischen angeordnete Blende 34 auf. Die Blende 34 kann beispielsweise im Rahmen einer Konfokalmikroskopie zur Auswahl eines sichtbaren Bereichs verwendet werden.
Das Mikroskop 5 weist einen Detektor 60 auf. Auf diesen richtet die Abfrageoptik 30 das ausgesendete Licht 40.
Das Mikroskop 5 weist ferner eine elektronische Steuerungsvorrichtung 70 auf, welche dazu konfiguriert ist, ein erfindungsgemäßes Verfahren auszuführen. Hierauf wird weiter unten näher eingegangen werden. Die elektronische Steuerungsvorrichtung 70 ist wie gezeigt mit dem Detektor 60 verbunden und kann somit Signale empfangen, welche der Detektor 60 basierend auf erfasstem Licht 40 erzeugt. Das Mikroskop 5 weist eine weitere Optik in Form einer Strahlteilerplatte 50 auf, welche optisch die Anregungsoptik 10 und die Abfrageoptik 30 voneinander trennt. Der
Anregungslichtstrahl 20 wird von der Strahlteilerplatte 50 in Richtung auf die Probe 100 zu geleitet. Zwischen der Strahlteilerplatte 50 und der Probe 100 befindet sich noch eine rein schematisch dargestellte Probenoptik 80. Diese sorgt dafür, dass der
Anregungslichtstrahl 20 wie gewünscht auf die Probe 100 trifft, wobei der
Anregungslichtstrahl 20 vorliegend fokussiert wird.
Das Mikroskop 5 weist ferner einen Probenhalter 90 auf, in welchem die Probe 100 gelagert ist. Die Probe 100 kann somit in definierter Weise von dem
Anregungslichtstrahl 20 beleuchtet werden. Es sei erwähnt, dass beispielsweise ein sample-scanner, ein beam-scanner oder ein objective-scanner als Ausführung verwendet werden können.
Tritt Licht von der Probe 100 aus, beispielsweise aufgrund von Emission oder aufgrund von Streuung des Anregungslichtstrahls 20, so entsteht dabei das bereits erwähnte ausgesendete Licht 40, welches ebenfalls von der Probenoptik 80 aufgenommen und durch die Strahlteilerplatte 50 in die Abfrageoptik 30 geleitet wird. Dort wird es wie bereits beschrieben dem Detektor 60 zugeführt. Es sei jedoch erwähnt, dass für
Anregung und Abfrage grundsätzlich auch komplett unterschiedliche optische Pfade verwendet werden können.
Bei der Probe 100 handelt es sich vorliegend um eine Probe in Form eines Festkörpers, in welchem mindestens ein optisches Zentrum vorhanden ist. Ein solches optisches Zentrum kann basierend auf dem Anregungslichtstrahl 20 ausgesendetes Licht 40 erzeugen. Dies kann durch Streuung oder auch durch Anregung eines Systems mit zumindest zwei Niveaus in einen angeregten Zustand und anschließender Relaxation unter Photonenaussendung in einen Grundzustand erfolgen. Möglichkeiten, die sich hieraus ergeben, werden weiter unten näher beschrieben werden.
Fig. 2 zeigt ein typisches Inneres einer Probe 100 vorliegend mit zwei optischen
Zentren, nämlich einem ersten optischen Zentrum 110 und einem zweiten optischen Zentrum 120. Derartige optische Zentren 110, 120 können beispielsweise als
Stickstofffehlstellen in Diamant als Festkörper realisiert werden. Ein Abstand d derartiger optischer Zentren 110, 120 beträgt beispielsweise zwischen 3 nm und 20 nm, in welchem sich die bereits weiter oben und nachfolgend beschriebenen Effekte besonders vorteilhaft beobachten und nutzen lassen. Auch andere Abstände sind jedoch möglich.
Das erste optische Zentrum 110 weist eine erste Orientierung 115 auf. Das zweite optische Zentrum 120 weist eine zweite Orientierung 125 auf. Bei diesen
Orientierungen 115, 125 handelt es sich um eine jeweilige Hauptsymmetrieachse, welche für die magnetische Kopplung relevant ist. Es ist bekannt, dass
Stickstofffehlstellen in Diamant relativ zum Kristallgitter vier mögliche Orientierungen haben, welche jeweils einen Winkel von 54,7° zu einer (OOI )-Oberfläche haben. Unter anderem durch die gezeigten Orientierungen 115, 125 wird eine magnetische Kopplung zwischen den beiden optischen Zentren 110, 120 definiert, welche durch in Fig. 2 dargestellte Feldlinien schematisch gezeigt ist.
Wie bereits weiter oben erwähnt wurde, kann die magnetische Kopplung zwischen zwei optischen Zentren 110, 120 dazu verwendet werden, um deren Abstand unabhängig von optischen Messungen zu bestimmen. Anders ausgedrückt steht eine vom in Fig. 1 dargestellten Mikroskop 5 unabhängige Vorgehensweise zur Verfügung, um den Abstand d zwischen den beiden optischen Zentren 110, 120 sehr genau zu vermessen. Hierzu kann insbesondere das weiter oben bereits beschriebene Verfahren verwendet werden. Eine räumliche Kalibrierung des Detektors 60 ist hierzu nicht erforderlich.
Die bereits weiter oben erwähnte Zeitgebung lässt sich, wie in den weiter oben bereits zitierten Referenzen beschrieben, Abständen zuordnen. Diese Zeitgebung kann dabei sehr genau gemessen werden und kann insbesondere auch auf ein Standardmaß des Sl-Einheitensystems, nämlich die Sekunde, zurückgeführt werden. Beispielsweise kann hierzu eine Atomuhr verwendet werden, welche entsprechend geeicht ist. Auf diese Weise kann nicht nur der Abstand d, welcher in Fig. 2 dargestellt ist, sehr genau bestimmt werden, sondern dieser kann auch auf eine Sl-Norm zurückgeführt werden. Hierbei kann auch ausgenutzt werden, dass der Abstand d grundsätzlich nur diskrete Werte haben kann, welche durch das Gitter vorgegeben sind. Fig. 3 zeigt das erste optische Zentrum 110 in einer räumlichen Orientierung mit einem angegeben Koordinatensystem und dessen Achsen x, y und z. Dabei sind auch jeweilige Projektionen auf die (x, y)-Ebene, die (y, z)-Ebene und die (x, z)-Ebene gezeigt. Die Orientierung 115 ist ebenfalls eingezeichnet.
Wie mit Pfeilen, welche in einer Ebene quer zur Orientierung 115 liegen, angezeigt ist, weist das erste optische Zentrum 110, welches vorliegend in Form einer
Stickstofffehlstelle ausgebildet ist, zwei optische Übergangsdipolmomente 117, 118 auf, welche in einer Ebene quer zur Orientierung 115 liegen. Die beiden optischen
Übergangsdipolmomente 117, 118 sind als Vorzugsorientierungen zu verstehen, in welchen eine Anregung des ersten optischen Zentrums 110 bei parallelem elektrischem Feld eines Anregungslichts besonders effizient ist. Dies gilt im Übrigen gleichermaßen für die durch die beiden optischen Übergangsdipolmomente 117, 118 aufgespannte Ebene, wobei eine Drehung des elektrischen Felds in dieser Ebene keinen Effekt hat.
Ist das elektrische Feld des Anregungslichts jedoch aus der durch die optischen
Übergangsdipolmomente 117, 118 aufgespannten Ebene heraus verdreht, so bewirkt dies, dass die Anregung weniger effizient ist.
Das eben beschriebene Phänomen kann zur Vermessung eines Anregungslichtstrahls 20 verwendet werden. Dies ist in Fig. 4 sowie den zugehörigen Fig. 5 und 6 näher dargestellt, wobei hier zur Vereinfachung nur Komponenten in einer Ebene dargestellt sind. Die z-Achse liegt dabei in Richtung der Ausbreitungsrichtung des
Anregungslichtstrahls 20. Fig. 4 zeigt den Anregungslichtstrahl 20 insbesondere vor und nach Austritt aus der Probenoptik 80, wobei der Anregungslichtstrahl 20 auf eine Fokusebene 25 fokussiert ist. Aufgrund der Fokussierung ändert sich das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20, wobei dieses vor der Probenoptik 80 quer zur Ausbreitungsrichtung ausgerichtet ist, wie durch die unten liegenden nicht ausgefüllten Pfeile angezeigt, sich dann jedoch verändert und lediglich in der Fokusebene 25 wieder quer zur Ausbreitungsrichtung steht. In einer Ebene 27 hinter der Fokusebene 25 ist das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 vom Ort quer zur
Ausbreitungsrichtung abhängig. Dies ist in Fig. 5 näher dargestellt, wobei die nicht ausgefüllten Pfeile das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 in Abhängigkeit vom Ort zeigen. In Fig. 4 und in Fig. 5 sind zwei Stellen eingezeichnet, an welchen sich beispielhaft optische Zentren befinden können. Diese können grundsätzlich vom
Anregungslichtstrahl 20 angeregt werden. Die Positionen sind durch senkrechte gestrichelte Linien dargestellt. Außerdem sind sie durch die gezeigten Kreise
dargestellt. Es sei erwähnt, dass ein Vorsehen zweier optischer Zentren äquivalent dazu ist, dass ein optisches Zentrum zwischen zwei Orten verschoben wird.
Zugehörige optische Übergangsdipolmomente der beiden optischen Zentren sind in Fig. 5 dargestellt, und zwar mit ausgefüllten Pfeilen. Wie zu sehen ist, sind die beiden optischen Übergangsdipolmomente gleich ausgerichtet. Das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 ist jedoch an den beiden Orten deutlich unterschiedlich, wobei bei der linken Position das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 nahezu quer zum optischen Übergangsdipolmoment steht, wohingegen das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 bei der rechten Position nur einen kleinen Winkel zum optischen Übergangsdipolmoment einnimmt.
Dies führt zu dem in Fig. 6 dargestellten Verlauf der Anregungseffizienz. Gäbe es das bereits beschriebene Phänomen der Polarisationsabhängigkeit bzw. Feldabhängigkeit der Anregung nicht, so hätte eine Anregungseffizienz den in Fig. 6 gestrichelt
dargestellten Verlauf, welcher durch die Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls 20 bestimmt wird. Aufgrund des eben beschriebenen Phänomens der Feldabhängigkeit hat die Anregungseffizienz jedoch den durchgezogen dargestellten Verlauf, wobei aufgrund der besseren Ausrichtung des Felds das rechte optische Zentrum wesentlich stärker angeregt wird als das linke optische Zentrum, trotz eines gleichen Abstands von einer durchgezogenen senkrechten Mittellinie. Dies ist auch durch den größeren
Leuchtpunkt in Fig. 6 dargestellt.
Das eben beschriebene Phänomen der Feldabhängigkeit der Anregung kann dazu verwendet werden, einen Anregungslichtstrahl 20 zu vermessen. Hierzu kann
beispielsweise eine entsprechende Probe 100 mit einem solchen optischen Zentrum 110 in den Probenhalter 90 eingesetzt werden und gezielt verfahren werden. Dadurch können Intensitätsänderungen ermittelt werden, wobei ein Skalarprodukt zwischen optischem Übergangsdipolmoment des optischen Zentrums und elektrischem Feld des Anregungslichtstrahls 20 umso größer ist, je höher die an einem bestimmten Ort detektierte Helligkeit ist. Auch ist es möglich, die Polarisation des Anregungslichtstrahls 20 aktiv zu drehen, um entsprechende Helligkeitsänderungen zu detektieren.
Fig. 7 zeigt eine beispielhafte Probe 100 in Form eines Festkörpers 105, in dem sich die bereits erwähnten optischen Zentren 110, 120 mit einem Abstand d voneinander befinden. Dabei sind typische elektrische Felder E und/oder magnetische Felder B eingezeichnet, welche hier beispielhaft durch die Probe 100 hindurchgehen und mit den beiden optischen Zentren 110, 120 interagieren können.
Fig. 8 zeigt die bereits in Fig. 7 dargestellte Probe 100 und ihre Wirkung auf den
Detektor 60, wobei die dazwischen befindlichen Optiken 30, 50, 80 lediglich rein schematisch dargestellt sind. Die beiden optischen Zentren 110, 120 werden durch die dazwischenliegenden Optiken 30, 50, 80 auf den Detektor 60 als erster Punkt 62 und zweiter Punkt 64 abgebildet, welche auf dem Detektor 60 einen Abstand d‘ voneinander haben. Dieser Abstand d‘ kann leicht ermittelt werden und bezieht sich zunächst einmal auf das Koordinatensystem des Detektors 60. Beispielsweise kann der Abstand d‘ durch eine Anzahl von zwischen den beiden Punkten 62, 64 liegenden Pixeln oder durch einen Abstand, um welchen der Detektor 60 als Ganzes verfahren wurde, angegeben werden.
Da der Abstand d der beiden optischen Zentren 110, 120 in der Probe wie bereits weiter oben erwähnt sehr genau unabhängig von einer räumlichen Kalibrierung des Detektors 60 gemessen werden kann, ist es nun möglich, den Abstand d‘ im Detektor 60 zu kalibrieren, da davon ausgegangen werden kann, dass der im Koordinatensystem des Detektors 60 gemessene Abstand d‘ dem Abstand d in der Probe 100 entspricht. Die Probe 100 kann somit als Referenz für den gemessenen Abstand verwendet werden. Wird nachfolgend eine andere Probe eingesetzt, in welcher ein unbekannter Abstand vermessen werden soll, so kann diese Kalibrierung dazu verwendet werden, den Abstand in der anderen Probe zu bestimmen. Als Vorteil hat sich dabei insbesondere herausgestellt, dass die Probe 100 mit dem Festkörper 105 sehr photostabil ist, über lange Zeiträume stabil bleibt und einfach zu handhaben ist. Sie bedarf keiner
besonderen Lagerung und kann auch über weite Strecken transportiert werden, ohne ihre Eigenschaften zu verändern. Dies ermöglicht einen Vergleich unterschiedlicher Mikroskope 5, welche an verschiedenen Orten stehen, und ermöglicht auch eine Kontrolle beispielsweise eines einzigen Mikroskops 5, welches zu verschiedenen Zeitpunkten mit der gleichen Probe 100 kalibriert werden kann. Dabei können
Abweichungen, welche im Laufe der Zeit beispielsweise aufgrund von Änderungen an den Komponenten des Mikroskops 5 auftreten können, erkannt werden. Beispielsweise kann auch vor jeweils durchzuführenden Messungen an anderen Proben eine jeweilige Kalibrierung mittels der Probe 100 durchgeführt werden, so dass ein jeweiliger Abstand in der anderen Probe sehr genau bestimmt werden kann. Beispielsweise können damit auch Rotationen erkannt werden, welche beispielsweise aufgrund von langfristigen Veränderungen des Probenhalters 90 auftreten können.
In Fig. 9 ist separat dargestellt, wie eine Probe 100 zur Vermessung des
Anregungslichtstrahls 20 oder zur Ermittlung einer Sammlungseffizienz verwendet werden kann. Der Anregungslichtstrahl 20 wird dabei durch die bereits erwähnten Optiken 10, 50, 80, welche in Fig. 9 lediglich schematisch dargestellt sind, auf die Probe 100 fokussiert und hat somit einen bereits in den Fig. 4, 5 und 6 dargestellten ortsabhängigen Verlauf seines elektrischen Felds. Das elektrische Feld ist dabei schematisch mittels Pfeilen 22 dargestellt.
Bei der in Fig. 9 gezeigten Ausführung mit lediglich einem optischen Zentrum 110 oder auch bei einer Probe 100 mit mehreren optischen Zentren ist es möglich, eine
Sammlungseffizienz des Mikroskops 5 zu kalibrieren. Hierzu kann ein
Anregungslichtstrahl 20 mit definierter Intensität verwendet werden, welcher somit auch zu einer definierten Emission des optischen Zentrums 110 führt. Es kann insbesondere ein Anregungslichtstrahl 20 mit einer Intensität verwendet werden, welche so groß ist, dass das erste optische Zentrum 110 mit seiner maximalen Photonenemissionsrate emittiert. Diese ist für typische optische Zentren 110 wie beispielsweise
Stickstofffehlstellen in Diamant bekannt. Mittels des Detektors 60 kann dann ermittelt werden, wie viele Photonen beim Detektor 60 tatsächlich ankommen. Aus einem Quotienten der in einem bestimmten Zeitintervall tatsächlich ankommenden Photonen geteilt durch die Anzahl der in diesem Zeitintervall emittierten Photonen kann dann die Sammlungseffizienz des Mikroskops 5 ermittelt werden. Diese kann beispielsweise bei einigen Prozent, jedoch auch darunter oder darüber liegen. Das in der Probe 100 enthaltene optische Zentrum 110 weist ein bereits beschriebenes optisches Übergangsdipolmoment 117 auf, wobei die Anregung umso effizienter ist, je paralleler das elektrische Feld des Anregungslichtstrahls 20 und das optische
Übergangsdipolmoment 117 sind. Dies ermöglicht ein Vermessen des
Anregungslichtstrahls 20, beispielsweise durch Verfahren der Probe 100 im
Probenhalter 90.
Durch ein solches räumliches Verfahren kann beispielsweise eine in Fig. 10 dargestellte Intensitätsverteilung ermittelt werden. Dabei wird eine Polarisation von 90° des
Anregungslichtstrahls 20 verwendet, welche einer Polarisation parallel zur y-Achse entspricht. Das optische Zentrum befindet sich dabei in einer Ebene 200 nm hinter einer Fokusebene des Anregungslichtstrahls.
Ein Schwerpunkt der gemessenen Helligkeit befindet sich dabei auf der x-Achse, jedoch etwa 66 nm oberhalb der y-Achse. Als Nullpunkt wird dabei die bereits in Fig. 4 eingezeichnete mittige Linie in Richtung der Ausbreitungsrichtung des
Anregungslichtstrahls 20 verwendet. Die umgebenden Linien zeigen an, an welchen Stellen die gemessene Intensität, welche anzeigend ist für die Anregungsstärke, um jeweils zehn Prozentpunkte abfällt. Die unmittelbar umgebende Linie zeigt somit eine Intensität von 90 % der maximalen Intensität bzw. der Intensität am Schwerpunkt an, die mit„0.8“ bezeichnete Linie zeigt eine Intensität von 80 % der maximalen Intensität bzw. der Intensität am Schwerpunkt an, und so weiter. Fig. 10 zeigt somit, dass ein Maximum bzw. ein Schwerpunkt der Anregungseffizienz außerhalb eines eigentlichen Nullpunkts, bei welchem die höchste Anregungseffizienz ohne Berücksichtigung der Polarisationsabhängigkeit bzw. Feldabhängigkeit zu erwarten wäre, auftritt. Dieses Phänomen kann dazu verwendet werden, den Anregungslichtstrahl 20 wie bereits erwähnt zu vermessen.
Fig. 11 zeigt, wie der in Fig. 10 dargestellte Schwerpunkt der Anregung sich in
Abhängigkeit von einer Ausgangspolarisation des Anregungslichtstrahls 20 verhält, wobei auch hier eine Ebene 200 nm hinter einer Fokusebene des Anregungslichtstrahls verwendet wird. Hierzu sei auf die in Fig. 14 dargestellte Legende verwiesen, welche für alle Fig. 10 bis 13 gilt. Bei einer Polarisation von 0°, welche einer Polarisation parallel zur x-Achse entspricht, ist das Anregungsmaximum sehr nah am Nullpunkt, also etwa auf einem Schnittpunkt von y-Achse und x-Achse gelegen. Bei einer Polarisation von +45° liegt das Anregungsmaximum bei einem Wert von etwa (+20 nm, +18 nm). Bei einer Polarisation von -45° liegt das Anregungsmaximum bei einem Wert von etwa (-20 nm, + 18 nm). Die durchgezogene Linie zeigt den elliptischen Verlauf, des
Anregungsmaximums bei kontinuierlicher Drehung der Polarisation. Das
Anregungsmaximum, welches beispielsweise durch Verfahren der Probe 100 im
Probenhalter 90 ermittelt werden kann, ist somit abhängig von der Polarisation des Anregungslichtstrahls 20. Dies kann zum Vermessen des Anregungslichtstrahls 20 als Kalibrierung des Mikroskops 5 verwendet werden.
Fig. 12 zeigt eine dreidimensionale Abhängigkeit der Intensitätsmaxima, wobei die Ausbreitungsrichtung des Anregungslichtstrahls 20 als z-Koordinate dargestellt ist und der Nullpunkt in z-Richtung in die Fokusebene 25 gelegt wird, welche bereits in Fig. 4 dargestellt ist. Es ist des Weiteren eine Ebene E eingezeichnet, welche der in den Fig. 10 und 11 dargestellten (x, y)-Ebene entspricht.
In Fig. 12 sind jeweilige Verläufe von Anregungsmaxima für unterschiedliche
Polarisationen dargestellt. Bezüglich der Polarisationen sei dabei auf Fig. 14 verwiesen. Beispielsweise ist dabei zu erkennen, dass für den Fall einer Polarisation von 0° sich das Anregungsmaximum nicht mit der z-Koordinate verändert. Für andere
Polarisationen verändert sich jedoch das Anregungsmaximum mit der z-Koordinate entlang jeweiliger Geraden oder zumindest entlang von Strecken, welche in erster Ordnung Geraden sind. Dieses Verhalten kann zum Vermessen des
Anregungslichtstrahls 20 verwendet werden.
Fig. 13 zeigt den Verlauf entsprechender Anregungsmaxima für den Fall, dass in der Anregungsoptik 10 ein Astigmatismus vorhanden ist. Dabei sind beispielhaft eine erste Fokusebene FE1 und eine zweite Fokusebene FE2 gezeigt. Bei diesen beiden
Fokusebenen FE1 , FE2 sind die Anregungsmaxima in Abhängigkeit der Polarisation nicht mehr wie beispielsweise in Fig. 11 dargestellt entlang einer Ellipse verlaufend, sondern entlang einer jeweiligen Geraden. Diese Geraden können vermessen werden, wobei ein Schnittpunkt dieser Geraden eine tatsächliche Probenposition angeben kann. Dies kann zur Vermessung des Anregungslichtstrahls 20 und insbesondere auch zum Erkennen etwaiger Astigmatismen in der Anregungsoptik 10 oder in anderen Optiken des Mikroskops 5 verwendet werden. Auch hierdurch ist eine Kalibrierung des
Mikroskops 5 möglich.
Insgesamt hat es sich gezeigt, dass die Verwendung von Proben 100 in Form eines Festkörpers 105 mit optischen Zentren 110, 120 unterschiedliche Kalibrierungen eines Mikroskops 5 ermöglicht, wobei eine solche Kalibrierung im Vergleich zu Kalibrierungen mit bekannten Kalibrierproben wie beispielsweise DNA-Molekülen erhebliche Vorteile mit sich bringt. Insbesondere sind hier die Langlebigkeit der Probe 100, deren einfache Handhabung und Lagerung, eine hohe Resistenz gegenüber Ausbleichen, eine leichte Transportierbarkeit und ein langzeitstabiler Abstand zwischen optischen Zentren 110, 120 zu nennen.
Erwähnte Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens können in der angegebenen Reihenfolge ausgeführt werden. Sie können jedoch auch in einer anderen Reihenfolge ausgeführt werden, soweit dies technisch sinnvoll ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer seiner Ausführungen, beispielsweise mit einer bestimmten
Zusammenstellung von Schritten, in der Weise ausgeführt werden, dass keine weiteren Schritte ausgeführt werden. Es können jedoch grundsätzlich auch weitere Schritte ausgeführt werden, auch solche welche nicht erwähnt sind.
Es sei darauf hingewiesen, dass in den Ansprüchen und in der Beschreibung Merkmale in Kombination beschrieben sein können, beispielsweise um das Verständnis zu erleichtern, obwohl diese auch separat voneinander verwendet werden können. Der Fachmann erkennt, dass solche Merkmale auch unabhängig voneinander mit anderen Merkmalen oder Merkmalskombinationen kombiniert werden können.
Rückbezüge in Unteransprüchen können bevorzugte Kombinationen der jeweiligen Merkmale kennzeichnen, schließen jedoch andere Merkmalskombinationen nicht aus.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Kalibrieren eines Mikroskops (5),
wobei das Mikroskop (5) folgendes aufweist:
einen Probenhalter (90) zur Aufnahme einer Probe (100),
eine Anregungsoptik (10) zum Richten eines Anregungslichtstrahls (20) auf die Probe (100),
eine Abfrageoptik (30) zum Aufnehmen von durch die Probe (100) ausgesendetem Licht (40),
einen Detektor (60) zum Erfassen von durch die Abfrageoptik (30) aufgenommenem Licht,
wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
Einsetzen eines Festkörpers (105) als Probe (100) in den Probenhalter (90), wobei der Festkörper (105) zumindest ein erstes optisches Zentrum (110) aufweist, welches nach Anregung Licht aussendet,
Richten eines Anregungslichtstrahls (20) auf die Probe (100), so dass das erste optische Zentrum (110) angeregt wird,
Erfassen des von der Probe (100) ausgesendeten Lichts (40) mittels der Abfrageoptik (30) und des Detektors (60),
Kalibrieren des Mikroskops (5) basierend auf dem vom Detektor (60) erfassten Licht.
2. Verfahren nach Anspruch 1 ,
wobei die Probe (100) zumindest ein zweites optisches Zentrum (120) aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
wobei der Anregungslichtstrahl (20) auf die Probe (100) gerichtet wird, so dass das erste optische Zentrum (110) und das zweite optische Zentrum (120) angeregt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3,
wobei das erste optische Zentrum (110) und das zweite optische Zentrum (120) einen Abstand (d) von mindestens einem Gitterplatz oder von mindestens 1 nm oder von mindestens 3 nm voneinander haben; und/oder
wobei das erste optische Zentrum (110) und das zweite optische Zentrum (120) einen Abstand (d) von höchstens 100 nm oder von höchstens 50 nm oder von höchstens 20 nm voneinander haben.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei als optische Zentren (110, 120) spinaktive optische Zentren verwendet werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei als optische Zentren (110, 120) magnetisch koppelbare optische Zentren verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
wobei als optische Zentren (110, 120) nicht-magnetisch koppelbare optische Zentren verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei als Festkörper (105) Diamant oder Siliziumcarbid verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei der Festkörper (105) einstückig ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei der Festkörper (105) ein Einkristall ist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei der Festkörper (105) polykristallin ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei der Festkörper (105) amorph ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei der Festkörper (105) aus Nano-Partikeln zusammengesetzt ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei der Festkörper (105) aus Nano-Diamanten zusammengesetzt ist.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei als optische Zentren (110, 120) Stickstofffehlstellen verwendet werden.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei das Mikroskop (5) ein Konfokalmikroskop, ein Nahfeldmikroskop, ein Streumikroskop oder ein Weitfeldmikroskop ist.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei das Kalibrieren ein Kalibrieren des gesamten Mikroskops (5) ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16,
wobei das Kalibrieren ein Kalibrieren eines Teils des Mikroskops (5) ist.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei das Kalibrieren ein Kalibrieren eines Mikroskopierverfahrens ist.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
welches mehrfach wiederholt ausgeführt wird,
wobei Kalibrierungen, welche bei unterschiedlichen Ausführungen ermittelt werden, zur Feststellung von Änderungen im Zeitverlauf miteinander verglichen werden.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei die Kalibrierung zumindest quer zu einer Ausbreitungsrichtung des Anregungslichtstrahls (20) erfolgt.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
wobei das Kalibrieren ein Kalibrieren eines Abstands (d, d‘) ist, und
wobei die Probe (100) zumindest ein zweites optisches Zentrum (120) aufweist.
23. Verfahren nach Anspruch 22,
welches einen Schritt des Bestimmens eines Abstands (d) zwischen dem ersten optischen Zentrum (110) und dem zweiten optischen Zentrum (120) mittels einer elektromagnetischen Kopplungsmessung beinhaltet.
24. Verfahren nach Anspruch 23,
wobei bei der Kopplungsmessung eine auf ein Standartmaß zurückgeführte Zeitgebung von Pulsen verwendet wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24,
wobei das Standartmaß auf einem Frequenznormal basiert.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 oder 25,
wobei das Standardmaß auf einer Atomuhr basiert.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26,
wobei ein mittels des Detektors (60) ermittelter Abstand (d‘) kalibriert wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27,
wobei der mittels des Detektors (60) ermittelte Abstand (d‘) gegen einen bekannten Abstand (d) in dem Festkörper (105) kalibriert wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 oder 28,
wobei der mittels des Detektors (60) ermittelte Abstand (d‘) gegen einen durch eine Messung gemessenen Abstand (d) in dem Festkörper (105) kalibriert wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29,
wobei der Abstand (d, d‘) mittels emitterselektiver Aktivierung der optischen Zentren (110, 120) und/oder mittels Superresolutionsmethoden,
Korrelationsauswertung oder Kreuzkorrelationsauswertung von durch den Detektor (60) basierend auf dem erfassten Licht aufgenommenen Signalen ermittelt wird.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 30,
wobei eine Mehrzahl von Abständen (d, d‘) zwischen dem ersten optischen Zentrum (110) und dem zweiten optischen Zentrum (120) zu unterschiedlichen Zeitpunkten jeweils vektoriell ermittelt werden, und
wobei aus den vektoriellen Abständen (d, d‘) eine Rotation ermittelt wird.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 ,
wobei das Kalibrieren ein Vermessen des Anregungslichtstrahls (20) ist, und wobei das erste optische Zentrum (110) zumindest ein optisches
Übergangsdipolmoment (117, 118) aufweist.
33. Verfahren nach Anspruch 32,
wobei das optische Übergangsdipolmoment (117, 118) in dem Festkörper (105) und/oder relativ zum Probenhalter (90) eine konstante Orientierung hat.
34. Verfahren nach Anspruch 32,
wobei das optische Übergangsdipolmoment (117, 118) in dem Festkörper (105) und/oder relativ zum Probenhalter (90) eine nur eingeschränkt bewegliche Orientierung hat.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 34,
wobei ein elektrisches Feld des Anregungslichtstrahls (20) relativ zum Festkörper (105) eine konstante Orientierung hat.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 35,
wobei das erste optische Zentrum (110) relativ zum Anregungslichtstrahl (20) verfahren wird und dabei Änderungen des ausgesendeten Lichts (40) ermittelt werden.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 36,
wobei der Anregungslichtstrahl (20) polarisiert ist, und
wobei während des Kalibrierens die Polarisation relativ zur Probe (100) gedreht und die Probe (100) relativ zum Anregungslichtstrahl (20) örtlich unverändert belassen wird, um polarisationsabhängige Änderungen des ausgesendeten Lichts (40) zu ermitteln.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 37,
wobei der Anregungslichtstrahl (20) polarisiert ist,
wobei während des Kalibrierens die Polarisation relativ zur Probe (100) unverändert belassen wird und die Probe (100) relativ zum Anregungslichtstrahl (20) örtlich unverändert belassen wird, wobei das ausgesendete Licht (40) jeweils zu unterschiedlichen Zeitpunkten ermittelt wird, und
wobei Änderungen des ausgesendeten Lichts (40) zwischen den Zeitpunkten ermittelt werden.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 38,
wobei der Anregungslichtstrahl (20) polarisiert ist, und
wobei während des Kalibrierens die Polarisation gedreht und das erste optische Zentrum (110) relativ zum Anregungslichtstrahl (20) verfahren wird, um polarisationsabhängige Intensitätsmaxima zu ermitteln.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 ,
wobei das Kalibrieren ein Kalibrieren einer absoluten Intensität oder einer Sammlungseffizienz des Mikroskops (5) ist.
41. Verfahren nach Anspruch 40,
wobei der Anregungslichtstrahl (20) eine Intensität aufweist, mit welcher das erste optische Zentrum (110) mit einer Rate entsprechend dem Inversen der Lebensdauer seines angeregten Zustands emittiert und/oder mit maximaler Photonenemissionsrate emittiert.
42. Verfahren nach Anspruch 40,
wobei der Anregungslichtstrahl (20) eine Intensität aufweist, mit welcher das erste optische Zentrum (110) mit einer Rate von höchsten 90 %, höchstens 80 %, höchstens 50 %, höchstens 30 %, höchstens 20 %, höchstens 10 %, höchstens 1 %, höchstens 0,1 % oder höchstens 0,01 % des Inversen der Lebensdauer seines angeregten Zustands emittiert und/oder mit höchsten 90 %, höchstens 80 %, höchstens 50 %, höchstens 30 %, höchstens 20 %, höchstens 10 %, höchstens 1 %, höchstens 0,1 % oder höchstens 0,01 % seiner maximalen Photonenemissionsrate emittiert.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 42,
wobei der Anregungslichtstrahl (20) bei mehrfacher Durchführung des
Verfahrens zu unterschiedlichen Zeitpunkten und/oder mit unterschiedlichen Mikroskopen (5) und/oder mit unterschiedlichen Teilen von Mikroskopen (5) und/oder mit unterschiedlichen Konfigurationen und/oder mit unterschiedlichen Auswerteverfahren, jedoch mit gleicher Probe (100), eine jeweils gleiche
Intensität aufweist.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 43,
wobei die Sammlungseffizienz des Mikroskops (5) als Quotient aus erfassten Photonen in einem Zeitintervall geteilt durch emittierte Photonen in dem
Zeitintervall berechnet wird.
45. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
welches mittels einer Mehrzahl von Mikroskopen (5) unter Verwendung derselben Probe (100) durchgeführt wird,
wobei Ergebnisse beim jeweiligen Kalibrieren der Mikroskope (5) miteinander verglichen werden.
46. Mikroskopanordnung (1 ), welche folgendes aufweist:
ein Mikroskop (5), aufweisend
einen Probenhalter (90) zur Aufnahme einer Probe (100),
eine Anregungsoptik (10) zum Richten eines Anregungslichtstrahls (20) auf die Probe (100),
eine Abfrageoptik (30) zum Aufnehmen von durch die Probe (100) ausgesendetem Licht (40),
einen Detektor (60) zum Erfassen von durch die Abfrageoptik (30) aufgenommenem Licht, eine elektronische Steuerungsvorrichtung (70), welche dazu konfiguriert ist, ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche auszuführen, und
eine Probe (100) in Form eines Festkörpers (105), wobei der Festkörper (105) zumindest ein erstes optisches Zentrum (110) aufweist, welches nach Anregung Licht aussendet.
47. Mikroskopanordnung (1 ) nach Anspruch 46,
wobei die Probe (100) in den Probenhalter (90) eingesetzt ist.
48. Verwendung einer Probe (100) zum Kalibrieren eines Mikroskops (5),
wobei die Probe (100) ein Festkörper (105) mit zumindest einem ersten optischen Zentrum (110) ist, welches nach Anregung Licht aussendet.
49. Verwendung nach Anspruch 48,
wobei das Mikroskop (5) folgendes aufweist:
einen Probenhalter (90) zur Aufnahme einer Probe (100), eine Anregungsoptik (10) zum Richten eines Anregungslichtstrahls (20) auf die Probe (100),
eine Abfrageoptik (30) zum Aufnehmen von durch die Probe (100) ausgesendetem Licht (40),
einen Detektor (60) zum Erfassen von durch die Abfrageoptik (30) aufgenommenem Licht;
und/oder
wobei die Probe (100) zumindest ein zweites optisches Zentrum (120) aufweist; und/oder
wobei das erste optische Zentrum (110) und das zweite optische Zentrum (120) einen Abstand (d) von mindestens einem Gitterplatz oder von mindestens 1 nm oder von mindestens 3 nm voneinander haben;
und/oder
wobei das erste optische Zentrum (110) und das zweite optische Zentrum (120) einen Abstand (d) von höchstens 100 nm oder von höchstens 50 nm oder von höchstens 20 nm voneinander haben;
und/oder wobei als optische Zentren (110, 120) spinaktive optische Zentren, magnetisch koppelbare optische Zentren, anderweitig koppelbare optische Zentren, oder nicht-magnetisch koppelbare optische Zentren verwendet werden;
und/oder
wobei als Festkörper (105) Diamant oder Siliziumcarbid verwendet wird;
und/oder
wobei als optische Zentren (110, 120) Stickstofffehlstellen verwendet werden.
50. Verwendung nach einem der Ansprüche 48 oder 49,
wobei das Kalibrieren nach einem der Ansprüche 1 bis 45 erfolgt;
und/oder
welche mittels einer Mikroskopanordnung (1 ) nach einem der Ansprüche 46 oder 47 erfolgt.
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