DE3938598A1 - Optischer biosensor - Google Patents

Optischer biosensor

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DE3938598A1
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Herbert Hugl
Eberhard Kuckert
Dietmar Moebius
Holger Ohst
Meinhard Rolf
Hans-Juergen Rosenkranz
Heinrich-Christian Schopper
Hans-Ulrich Siegmund
Klaus Sommer
Rolf Wehrmann
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen optischen Biosensor mit einem neuartigen Aufbau für eine Detek­ tionsmethode für Moleküle, die mit einem Fluoreszenz­ farbstoff markiert sind, zur Erkennung gelöster Sub­ stanzen oder gelöster Analyte, wie sich beispielsweise wie Antigen und Antikörper verhalten. Es handelt sich hierbei um einen Festphasensensor mit Fluoreszenzfarb­ stoff, der einen Energietransferprozeß auf ein zu detek­ tierendes, mit einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff mar­ kiertes Molekül erlaubt.
Es gibt verschiedene Methoden, Analyten, wie Hormone, Enzyme, andere Proteine, Kohlehydrate, Nucleinsäuren, pharmakologische Wirkstoffe, Toxine und andere, in flüs­ sigen Proben biologischen Ursprungs nachzuweisen. Unter den bekannten Methoden ragen speziell Immunoassays als eine empfindliche Nachweismethode zur Bestimmung sehr kleiner Mengen organischer Substanzen heraus. Immuno­ assay-Methoden beruhen allgemein auf der Fähigkeit eines Rezeptormoleküls, beispielsweise eines Antikörpers, die Struktur und molekulare Organisation eines Ligandenmole­ küls, sei sie durch unpolare und/oder polare Wechsel­ wirkungen definiert, spezifisch zu erkennen und dieses Molekül auf derartige Weise ganz spezifisch zu binden.
Immunoassays werden mit verschiedenen Methoden durchge­ führt. Dazu zählen der Einsatz verschiedener Markie­ rungstechniken, meist radioaktiver, enzymgekoppelter und auch fluoreszierender Natur (Methods in Enzymology, 74 (1981), 28-60).
Einige dieser bekannten Immunoassay-Methoden beinhalten die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff-Molekülen F₁, die in der Lage sind, Licht einer Wellenlänge λ₁ zu ab­ sorbieren und Licht einer zweiten, größeren Wellenlän­ ge λ₂ zu emittieren. In Gegenwart eines anderen Fluores­ zenzfarbstoff-Moleküls F₂ erfolgt unter bestimmten Be­ dingungen nach der Anregung von F₁ durch Licht der Wellenlänge λ₁ eine strahlungslose Energieübertragung auf F₂, der dann seinerseits Licht einer dritten, noch größeren Wellenlänge λ₃ emittiert.
Dieses Prinzip des Energietransfers ist von Förster in der Theorie beschrieben worden und ist Anregung für vie­ lerlei mögliche Anwendungen gewesen (Annual Reviews in Biochemistry 47 (1978), 819-846). Eine wichtige Eigen­ schaft dieses Energietransfers ist dabei seine Abstands­ abhängigkeit. Die Wirksamkeit der Energieübertragung nach Förster wird durch den kritischen Radius R₀, näm­ lich den Abstand zwischen Donor und Akzeptor, beschrie­ ben, bei dem der Betrag des intermolekularen Energie­ transfers gleich der Summe aller anderen Desaktivie­ rungsprozesse des Donors ist. Dieser Abstand beträgt etwa 50-100 Å. Analog zu R₀ kann eine "kritische Konzen­ tration" C₀ des Akzeptors berechnet werden. Vereinfacht kann die zwischen R₀ und C₀ des Akzeptors vorhandene Beziehung durch R₀ (Å)= wiedergegeben werden.
Es sind bereits Immunoassays beschrieben worden, die auf der Ausnützung des abstandsabhängigen Energietransfers beruhen. So wird in EP 150 905 ein in homogener Lösung arbeitender Immunoassay beschrieben, in dem Analyt bzw. Antigen mit einem Fluoreszenzfarbstoff F₁ markiert und der dazu spezifisch bindende Antikörper mit einem Fluor­ eszenzfarbstoff F₂ versehen wurde. Zum Nachweis der spe­ zifischen Bindung und damit als analytische Methode wird die Tatsache genützt, daß beim Einstrahlen von Licht der Wellenlänge λ₁ eine Emission der Wellenlänge λ₃ nur dann beobachtet werden kann, wenn Analyt und Antikörper in ausreichender Konzentration in für eine Energieübertra­ gung nach Förster genügend kleinem Abstand vorliegen. Dies ist nur dann der Fall, wenn Analyt und Antikörper eine spezifische Bindung eingegangen sind.
In einem anderen Beispiel wird einer der beiden markier­ ten Bindungspartner an einer Festkörperoberfläche ange­ bracht und der entsprechend spezifisch bindende Partner aus einer homogenen Lösung gebunden. Wieder erfolgt der Nachweis der spezifischen Bindung, wie oben bereits er­ läutert, durch einen entsprechenden Energietransfer mit­ tels der Evanescent-wave-Technologie (Nature 320 (1986), 179-181).
Sowohl der hier erwähnte Energietransfer in homogener Lösung als auch der beschriebene Festphasen-Immunoassay mit Energietransfer haben prinzipiell den Nachteil, daß die spezifisch miteinander bindenden Moleküle jeweils mit einem der beiden notwendigen Fluoreszenzfarbstoffe F₁ und F₂ markiert werden müssen, bzw. maximal ein Ver­ hältnis F₁ : F₂ von 2 : 1 gestatten. Es ist bereits be­ schrieben worden, die durch das Verhältnis der beiden Fluoreszenzfarbstoffe F₁ und F₂ limitierte Empfindlich­ keit des fluoreszenzspektroskopischen Nachweises zu ver­ bessern. So wird in EP 1 74 744 vorgeschlagen, mehrere organische Farbstoffmoleküle gleichzeitig an ein "licht­ sammelndes" Protein kovalent zu binden, d. h. es erfolgt ein Energietransfer mehrerer organischer Farbstoffmole­ küle an nur ein Akzeptormolekül, nämlich ein Phycobili­ protein (Allophycocyanin). Dieses Molekülsystem wiederum wird dann als ein "Marker" für andere biologische Mole­ küle vorgeschlagen. Die Methode wird begrenzt durch das Farbstoff : Protein-Kupplungsverhältnis, d. h. die Nach­ weisgrenzen der Methoden sind auf die Empfindlichkeit der Fluoreszenzspektroskopie beschränkt.
Weiterhin ist ein Nachteil der aufgeführten Systeme dadurch gegeben, daß komplementäre Systeme jeweils spe­ zifisch markiert werden müssen und damit nicht viel­ seitig verwendet werden können. Ein weiterer Nachteil des in heterogener Phase aufgebauten Systems ist die spezielle verwendete Evanescent-wave-Technik. Zudem ist die Fixierung der spezifisch bindenden Moleküle an die Festkörperoberfläche über ein System aus Kupplungskom­ ponente/Antikörper/Antigen/Antikörper präparativ sehr aufwendig. Ein weiterer prinzipieller Nachteil dieser Festphasen-Technologie bei Immunoassays ist die repro­ duzierbare Herstellung von Beschichtungen der Testmatrix mit den Reaktanden der Immunreaktion. Für analytische Methoden ist jedoch neben Empfindlichkeit und Selektivi­ tät bezüglich einer Zielsubstanz die Reproduzierbarkeit ein wesentliches Qualitätsmerkmal.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartig aufge­ bauten Sensor für eine Detektionsmethode von mit Fluor­ eszenzfarbstoff markierten Molekülen zur Erkennung dieser gelösten Substanzen oder Analyte durch Energie­ transfer mit einer einfachen Fluoreszenztechnik und gesteigerter Empfindlichkeit in der Detektion sowie vielseitiger Anwendung bei unterschiedlichen Aufgaben und reproduzierbarer Herstellungsmöglichkeit für an Festkörperoberflächen gebundenen Schichten. Neben dem deutlichen Gewinn an Sensitivität werden alle oben aufgeführten Nachteile gleichzeitig vermieden.
Die Erfindung betrifft einen optischen Biosensor auf der Basis des Fluoreszenz-Energietransfers, bestehend aus
  • a) einem festen Träger,
  • b) einer auf a) angebrachten ein- oder mehrlagigen Langmuir-Blodgett(LB)-Schicht,
  • c) mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff F₁, der in mindestens einer der oberen 4 Lagen der LB-Schicht angeordnet ist,
  • d) einem zur biologischen Wechselwirkung befähigten Molekül (Rezeptor), das in oder an der obersten Lage der LB-Schicht gebunden oder angeordnet ist, und
  • e) einem mobilen Fluoreszenzfarbstoff F₂, dessen Anre­ gungsbande für einen Energietransfer ausreichend mit der Emissionsbande von F₁ überlappt und der kovalent an einen Liganden gebunden ist, der an den Rezeptor bindungsfähig ist oder der kovalent an einen anderen Rezeptor gebunden ist, der an den Komplex aus erstem Rezeptor und Ligand bindungsfä­ hig ist, wobei der Ligand bzw. der Ligand und der zweite Rezeptor zunächst nicht an die LB-Schicht gebunden sind.
Als Träger kommen alle dem Fachmann für die LB-Technik geeigneten Träger in Frage, wie Glas, Quarzglas, Porzel­ lan, Silizium, Metalle, bevorzugt korrosionsfeste Edel- und Halbedelmetalle oder solche, die durch Oberflächen­ behandlung eine korrosionsfeste Oberfläche ausbilden, wobei die LB-Beschichtung ihrerseits die Metallober­ fläche korrosionsfest macht, Kunststoffe, wie Poly­ methylmethacrylat, Polycarbonat, Polystyrol und andere metallisierte Kunststoffe. In bevorzugter Weise handelt es sich um Träger aus Glas, Quarzglas, Silizium, Kunst­ stoff oder einem metallisierten Kunststoff. Weiterhin bevorzugte Träger sind optisch transparent. Alle Träger­ materialien sind weiterhin durch eine gleichmäßige Ober­ fläche, bevorzugt durch eine ebene Oberfläche, ausge­ zeichnet.
Auf solche Träger werden mit Hilfe der LB-Technik eine oder mehrere monomolekulare Schichten aufgebracht. Diese geordneten LB-Schichten können aus niedermolekularen oder polymeren Amphiphilen, bevorzugt aus polymeren Amphiphilen, bestehen und kovalent gebundene Fluores­ zenzchromophorefarbstoffe und/oder amphiphile Fluor­ eszenzfarbstoffe, die im folgenden als F₁ bezeichnet werden, enthalten.
Weiterhin sind in diesen LB-Schichten funktionelle Mole­ küle, beispielsweise Glykolipide, Proteine, Haptene und andere, enthalten oder damit kovalent verknüpft. An diese funktionellen Moleküle kann nun eine spezifische Bindung eines hierzu komplementären Moleküls, wie ein Lectin, ein Antigen, ein Antikörper und andere, das mit einem zweiten, zu F₁ für einen Energietransfer passenden Fluoreszenzfarbstoff F₂ markiert ist, erfolgen. Hierbei soll der sogenannte Förster-Abstand, wie er für den oben beschriebenen Energietransfer nötig ist, eingehalten werden. Diese Bedingung wird durch die Anwendung der LB- Technik gewährleistet, die eine gezielte molekulare Architektur in Dimensionen von etwa 15-40 Å, beispiels­ weise in der Nähe von 20 Å gestattet. Wird das im voran­ gegangenen beschriebene System nun mit Licht der Wellenlänge λ₁ angeregt, so läßt sich eine Emission des Fluoreszenzfarbstoffes F₂ mit einer Wellenlänge λ₃ detektieren, die als Nachweis für die Bindung des mit F₂ markierten Moleküls an der Sensoroberfläche, die mit F₁ dotiert ist, gilt. Die Anregung mit Licht der Wellen­ länge λ₁ kann so erfolgen, daß F₁ in der LB-Schicht durch den optisch transparenten Träger hindurch in Transmission oder durch Evanescent-wave-Technik, wenn der optisch transparente Träger als Lichtleiter fun­ giert, oder aber durch direkte Bestrahlung angeregt wird.
Insbesondere bei einem hohen Überschuß an F₁ wird zu­ sätzlich eine Fluoreszenz-Emission der Wellenlänge λ₂ beobachtet, die auf der Fluoreszenz von F₁-Molekülen beruht, die nach ihrer Anregung nicht strahlungslos desaktiviert werden.
Der so beschriebene Sensoraufbau kann in dieser Funktion nicht nur einen in Lösung vorhandenen Analyten, der mit Fluoreszenzfarbstoff F₂ markiert ist, nachweisen; der Sensoraufbau kann auch genutzt werden, um in einer kom­ petitiven Funktionsweise einen nichtfluoreszenzmarkier­ ten Analyten nachzuweisen. Hierzu werden bei der Präpa­ ration des Sensors die spezifisch bindenden Stellen der funktionellen Moleküle in der LB-Schicht mit fluor­ eszenzmarkierten, komplementär bindenden Molekülen ab­ gesättigt. Man beobachtet dann bei Anregung mit Licht der Wellenlänge λ₁ eine maximale Fluoreszenz-Emission der Wellenlänge λ₃, deren Abnahme über einen zeitlichen Verlauf beobachtet werden kann, wenn bei Kontakt mit der zu untersuchenden Lösung das mit F₂ fluoreszenzmarkier­ te, komplementär bindende Molekül in einer Gleichge­ wichtsreaktion durch nichtfluoreszenzmarkierte, komple­ mentär bindende Moleküle des gleichen Typs verdrängt werden.
Für den Aufbau von LB-Schichten verwendet man amphiphile Moleküle, d. h. Moleküle, die ein hydrophiles Ende (einen "Kopf") und ein hydrophobes Ende (einen "Schwanz") haben. Solche amphiphilen Moleküle können niedermoleku­ lare Verbindungen mit einem Molekulargewicht von bis etwa 2000 sein. In einer weiteren Variante können diese niedermolekularen Amphiphile polymerisationsfähige bzw. zur Polykondensation und Polyaddition befähigte funk­ tionelle Gruppen enthalten, so daß nach dem Aufbau der LB-Schichten aus niedermolekularen Amphiphilen in einer nachträglichen Reaktion in der LB-Schicht diese Amphi­ phile zu hochmolekularen Verbindungen verknüpft werden können. Diese nachträgliche Reaktion zu hochmolekularen Verbindungen ist deshalb von Vorteil, weil LB-Schichten aus polymeren Amphiphilen höhere thermische und mecha­ nische Stabilitäten aufweisen. Insbesondere die Verwen­ dung polymerer Amphiphile ist für die Herstellung sta­ biler LB-Schichten besonders geeignet, um die Erforder­ nisse der dargelegten Anwendung zu erfüllen. Beispiele für polymere Amphiphile, wie sie für den erfindungs­ gemäßen optischen Biosensor geeignet sind, sind α- Olefin-Maleinsäureanhydrid-Copolymere (British Polymer Journal 17 (1985), 368 ff; J. Macromol. Sci.-Phys. B 23 (1985), 549-573), Polyoctadecyl-methacrylat, Polyvinyl­ stearat (J. Coll. Interface Sci. 86 (1982), 485), Poly­ vinylphosphorlipide (Angew. Chem. 100 (1988), 117-162), Cellulose-tristearat und amphiphile Polyamide (DE-OS 38 30 325). In bevorzugter Weise für die Herstellung stabiler LB-Schichten sind Polyurethane gemäß DE-OS 38 27 438 und Polyester gemäß DE-OS 38 30 862. Unter den polymeren Amphiphilen sei weiterhin ganz besonders auf statistische Poly(alkylmethacrylat)-Copolymere des fol­ genden Typs verwiesen, die in ihrer Zusammensetzung breit variierbar sind:
in der
R¹, R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl darstellen,
R⁴ geradkettiges C₁₄-C₂₂-Alkyl ist,
R⁵ das Wasserstoff-, Natrium- oder Kaliumion ist oder eine der Gruppen -CH₂-CH₂OH, -CH₂-CH₂-NH-tert.- butyl, -CH₂-CH₂-N(CH₃)₂,
darstellt,
R⁶ ein dem Fachmann bekannter Fluoreszenzchromophor ist, wie er weiter unten dargestellt ist, und
x einen Wert von 0,2-1,
y einen Wert von 0-0,8 und
z einen Wert von 0-0,2 annimmt, wobei die Summe x+y+z=1 beträgt.
Beispiele für Polymere der Formel (I) sind die folgenden
Bei den hier beispielhaft genannten Substanzen für LB- Mono- und -Multischichten ist der Fluoreszenzchromophor an das amphiphile Polymer kovalent geknüpft. Wenngleich diese Anordnung die größtmögliche Stabilität der F₁ ent­ haltenden LB-Schichten ermöglicht, ist es aber auch mög­ lich, F₁ enthaltende LB-Schichten durch Cospreiten eines amphiphilen Polymers mit amphiphilen Fluoreszenzfarb­ stoffen auf der Wasseroberfläche vor dem Beschichtungs­ vorgang zu erzielen. Als Beispiele für solche amphiphile Fluoreszenzfarbstoffe, die mit amphiphilen Polymeren, welche keine Chromophore enthalten, gemeinsam eingesetzt werden können, sind etwa Cyaninfarbstoffe der Typen
und
in denen
X für Sauerstoff oder Schwefel und
R für geradkettiges C₁₄-C₂₂-Alkyl stehen.
Weitere Beispiele für dem Fachmann grundsätzlich bekann­ te und erfindungsgemäß einsetzbare Fluoreszenzfarbstoffe sind Cumarinfarbstoffe der folgenden Typen:
Diese Aufzählung ist nur beispielhaft. Weitere amphiphi­ le Fluoreszenzfarbstoffe sind beschrieben in der Mono­ graphie Physical Methods of Chemistry, Vol. 1, Part. 3B, S. 577 ff, John Wiley, New York 1972. Will man solche amphiphile Fluoreszenzfarbstoffe in LB-Schichten ein­ bringen, muß auf eine gleichmäßige Verteilung des Farb­ stoffs in der gesamten Schicht geachtet werden. So ist zu vermeiden, daß die Übertragung einzelner Schichten nicht bei einem solchen angelegten Schub erfolgt, bei dem ein Coexistenzbereich der festanalogen- und flüssig­ analogen Phase durchlaufen wird, da der amphiphile Fluoreszenzfarbstoff in der Regel in den beiden Phasen nicht die gleiche Löslichkeit besitzt und so inhomogene, für die Sensoranwendung weniger geeignete Schichten ge­ bildet werden. Diese Erscheinung ist bei LB-Schichten aus niedermolekularen Substanzen bekannt (Angew. Chem. 100 (1988), 750); auch bei polymerisierten Phosphorli­ piden ist diese Erscheinung beobachtet worden (Polymer Sci. 267 (1989), 97-107).
Bei der Herstellung erfindungsgemäßer optischer Biosen­ soren wurde überraschenderweise gefunden, daß LB-Schich­ ten aus Polymeren der Formel (II) beim Anlegen von Schü­ ben bis zum Zusammenbruch der LB-Schicht bei <45 mN/m Schub nicht zur Ausbildung phasenseparierter Domänen neigen. Dies gilt neben Polymeren der Formel (II) auch für eine Mischung aus einem Polymer vom Typ der Formel (V) und einem Farbstoff, beispielsweise der Formel (IV), wobei das Polymer vom Typ der Formel (V) als "Matrix" anzusehen ist, in welcher sich 0,1 bis 25 Mol-% des amphiphilen Farbstoffs, beispielsweise der Formel (IV) aufhalten können.
Derart hergestellte LB-Schichten zeigen sowohl auf Wasser als Subphase als auch nach dem Übertragen auf einen festen Träger lichtmikroskopisch homogene Schichten ohne Störungen und sind für die erfindungs­ gemäßen Biosensoren besonders geeignet.
Eine weitere Steigerung der Empfindlichkeit des erfin­ dungsgemäßen optischen Biosensors kann erreicht werden, wenn Fluoreszenzfarbstoffe F₁ als Donor in LB-Schichten verwendet werden, die aufgrund ihres speziellen Verhal­ tens Aggregate mit fluoreszenzspektroskopischen Eigen­ schaften, die von denen des monomeren Farbstoffs sehr verschieden sind und die sich in der Regel durch eine entsprechend schärfere und intensivere Absorptionsbande und entsprechend schärfere und intensivere Fluoreszenz- Emissionsbande auszeichnen. Solche Aggregate sind dem Fachmann als J-Aggregate oder Scheibe-Aggregate bekannt (Physical Methods of Chemistry, Vol. 1, Part. 3B, S. 579, John Wiley, New York 1972). Mit dem speziellen Ver­ halten solcher J-Aggregate kann zum einen eine sehr hohe Farbstoffdichte F₁ in den LB-Schichten und zum anderen aufgrund der starken Absorption von Licht der Wellen­ länge λ₁ eine hohe Energiedichte, die nach der Theorie von Förster auf entsprechende Moleküle F₂ übertragen werden kann, erreicht werden. Die hohe Schärfe der Emissionsbande bedeutet sowohl einen Verstärkungseffekt des Meßsignals, als auch eine Verminderung der Stör­ strahlung durch geringere Überlappung der Emissionen von F₁ mit F₂.
Fluoreszenzfarbstoffe, die in LB-Schichten in der Lage sind, J-Aggregate zu bilden, sind in der obengenannten Literatur beschrieben worden. Beispielhaft seien ge­ nannt: Cyaninfarbstoffe sowie Spiropyrane, die nach photochemischer Anregung in Merocyanine übergehen und dann J-Aggregate bilden (Thin Solid Films 133 (1985), 21-28).
Der Einbau funktioneller Moleküle in die den Fluores­ zenzfarbstoff F₁ enthaltende LB-Schicht kann auf unter­ schiedliche Art und Weise erfolgen:
  • - Das funktionelle Molekül kann kovalent, gegebenen­ falls unter Verwendung von Spacer-Molekülen, an die LB-Schicht geknüpft sein, sei es von Beginn des Spreitungsvorganges auf der Wasseroberfläche an oder durch eine nachträgliche Kupplungsreaktion an die LB-Schicht entweder auf der Subphase oder nach Auf­ bringen der LB-Schicht auf einen festen Träger.
  • - Das funktionelle Molekül kann als Amphiphil mitge­ spreitet und so physikalisch mit "Anker" in die LB- Schicht eingebaut werden.
Für beide Einbauvarianten sind aus der Literatur Metho­ den bekannt. Beispielsweise kann die Verknüpfung biolo­ gischer funktioneller Gruppen an LB-Schichten auf feste Träger in analoger Weise zu den aus der Biochemie dem Fachmann bekannten Immobilisierungsmethoden erfolgen (Methods in Enzymology, Vol. 135 und Vol. 136 (1987)). Mit langen Alkylketten versehene Moleküle werden in DE- OS 35 46 150 als Membrananker-Wirkstoffkonjugate in großer Auswahl genannt und können durch Cospreiten auf der Subphase in den LB-Film eingebaut werden. Als ein Beispiel für solche amphiphilen funktionellen Moleküle seien Glykolipide, insbesondere Ceramide, genannt. Weitere Beispiele sind Antikörper/Antigen-Systeme sowie komplementäre Nucleotidsequenzen. Eine große Anzahl solcher Beispiele ist dem Fachmann bekannt (Angew. Chem. 100 (1988), 117-162).
Entscheidend für die Steigerung der Empfindlichkeit des Sensorsystems ist ein möglichst hohes Verhältnis F₁ : F₂ innerhalb des "Förster-Radius" und damit eine entspre­ chende Verstärkung des Fluoreszenzsignals eines mit F₂ markierten Moleküls nach erfolgter Bindung an eine mit F₁ dotierte Oberfläche. Es ist demnach vorteilhaft, möglichst viele F₁-Chromophore in den obersten LB- Schichten, insbesondere in den obersten vier Lagen ein­ zubringen. In besonders bevorzugter Weise ist der Farb­ stoff F₁ in mindestens einer der beiden oberen Lagen an­ geordnet.
Wenngleich in der Fluoreszenzspektroskopie üblicherweise Konzentrationen an Fluoreszenzfarbstoff unter 1% ver­ wendet werden, um Wechselwirkungen zwischen den einzel­ nen Farbstoffmolekülen und damit Änderungen ihres Fluor­ eszenzverhaltens zu vermeiden, ist es im erfindungsge­ mäßen optischen Biosensor dennoch vorteilhaft, den Fluoreszenzfarbstoff F₁ in hohen Konzentrationen in die LB-Schichten einzubringen. Damit kann die Konzentration den großen Bereich von 0,1-99%, bevorzugt 5-50 Mol-%, betragen. Insbesondere polymere amphiphile Fluoreszenz­ farbstoffe zeigen eine geringere Tendenz zur Eigen­ löschung und Eximerenbildung bei Farbstoffkonzentra­ tionen bis zu 25 Mol-%.
Der erfindungsgemäße optische Biosensor zeigt weiterhin den Vorteil, daß unabhängig von den in die Schicht der festen Phase eingebrachten funktionellen Molekülen der für das Prinzip des Energietransfers erforderliche Farb­ stoff F₁ frei wählbar in weiten spektralen Bereichen in die LB-Schicht eingebracht werden kann. Dies bedeutet, daß zum einen das funktionelle Molekül nicht spezifisch mit F₁ markiert werden muß und zum anderen der spektrale Bereich von F₁ optimal für einen Energietransfer auf den als Marker verwendeten Farbstoff F₂ abgestimmt werden kann. Beispiele von Paaren sind das Polymer der Formel (IIa)/TRITC und das Cyanin der Formel (IIIb) mit X=Sauerstoff und n=18/TRITC, wobei TRITC für Tetra­ methylrhodamin-isothiocyanat steht.
Im erfindungsgemäßen optischen Biosensor wird weiterhin die Steigerung der Empfindlichkeit des fluoreszenz­ spektroskopischen Nachweises dadurch erreicht, daß eine möglichst hohe Farbstoffkonzentration F₁ in die LB- Schicht eingebracht wird und somit mehrere Moleküle F₁ in den für den Energietransfer auf ein an die Schicht gebundenes Molekül F₂ notwendigen "Förster-Radius" gelangen. Dieser Aufbau, eine möglichst hohe Farbstoff­ dichte F₁ in der gleichen Schicht wie das funktionelle, spezifisch bindende Molekül einzubringen, ohne jedoch das funktionelle Molekül in lediglich stöchiometrischen Mengen zu markieren, erlaubt im Gegensatz zu den bisher bekannten, auf Energietransfer beruhenden Nachweismetho­ den eine viel günstigere Ausnutzung dieses Meßprinzips und damit eine deutlich erhöhte Empfindlichkeit.
Aus der Nutzung aller innerhalb des Förster-Radius von F₂ liegenden Farbstoffmoleküle F₁ folgert auch, daß nicht nur die laterale Verteilung von F₁ innerhalb der obersten LB-Schichten von entscheidender Bedeutung ist, sondern eine möglichst hohe Konzentration von F₁ auch in den darunterliegenden Schichten. Aus diesem Grund beschränkt sich das Meßprinzip auf Schichten bis zu etwa 100 Å wirksamer Schichtdicke, denn darunterliegende Moleküle F₁ können nach Anregung durch Licht ihre Energie nicht mehr auf den dann zu weit entfernten Farb­ stoff F₂ übertragen und würden das zu detektierende Sig­ nal, nämlich die Lichtemission der Wellenlänge λ₃ des durch Transfer angeregten Farbstoffs F₂, durch ihre eigene Fluoreszenz mit der Wellenlänge λ₂ nur stören und die Empfindlichkeit des Nachweises unnötig herabsetzen.
Aus diesem Grund eignen sich für die Herstellung dünner Schichten (100 Å oder darunter), die F₁ enthalten, ein­ zig die LB-Schicht-Technologie und die Chemisorption. Nämlich bereits die in der Dünnschichttechnologie ver­ breitete Methode des Spin-coating bereitet mit minimalen Schichtdicken von 200 bis 500 Å Probleme. Gegenüber dem Aufbringen dünner Schichten durch Chemisorption besitzt die LB-Technik den Vorteil, daß die Schichten in ihrer Zusammensetzung sehr definiert eingestellt werden können, was für die Herstellung reproduzierbarer Ober­ flächen für Sensoren von entscheidender Bedeutung ist.
Der Donorfarbstoff F₁ und die bereits genannten aktiven Stellen zur Anbindung eines Biomoleküls können sich dabei auch in verschiedenen, übereinander liegenden LB- Schichten befinden. Die Gesamtzahl der aufgebrachten LB- Schichten bewegt sich im Zahlenbereich von 1 bis 10.
Zum erfindungsgemäßen optischen Biosensor gehören weiterhin mobile, fluoreszierende Moleküle der Farb­ stoffkomponente F₂, die an die fest in der LB-Schicht verankerten Rezeptormoleküle reversibel gebunden werden. Lediglich im einfachsten Fall, nämlich der Bestimmung eines selbstfluoreszierenden und damit als F₂ wirkenden Analyten, ist diese Komponente nicht erforderlich. Zum einen können die Bindungsstellen der Rezeptoren auf der LB-Schicht durch fluoreszenzmarkierte Derivate oder Ana­ loga des Analytenmoleküls abgesättigt sein, die dann im Kontakt mit der Probenlösung vom Analyten kompetitiv verdrängt werden können. Zum anderen ist jedoch auch ein Sandwich-Immunoassay möglich, bei dem eine zweite Art von Rezeptoren, beispielsweise Antikörpern, entweder an den Komplex zwischen erstem Rezeptor und dem Analyten oder an eine Domäne des Analyten, die an der Bindung zum ersten Rezeptor nicht beteiligt ist, binden. Diese Methoden der Festphasen-Immunoassays sind prinzipiell Stand der Technik und beispielsweise in der Monographie P. Tÿssen, Pratice and Theory of Enzyme Immunoassays (R. H. Burdon, Ph. H. van Knippenberg, Herausgeber) Elsevier, Amsterdam 1985, dargestellt.
Beispiel 1 Herstellung eines amphiphilen Fluoreszenzfarbstoffs
Zu 1,53 g (5 mmol) 7-Diethylamino-3-(p-aminophenyl)- cumarin und 0,61 g (5 mmol) Triethylamin in 10 ml trockenem Chloroform wurden unter Eisbadkühlung 1,51 g (5 mmol) Octadecylsäurechlorid in 5 ml trockenem Chloro­ form getropft. Man ließ eine Stunde bei 0-5°C und 5 Stunden bei Raumtemperatur nachrühren. Der Ansatz wurde zunächst mit verdünnter Natronlauge, zuletzt mit Wasser gewaschen. Das Rohprodukt wurde zweimal aus Chloroform mit Petrolether 60/70°C gefällt.
Es wurden 64% der theoretischen Ausbeute des Produktes der obigen Formel mit einem Schmelzpunkt von 159°C er­ halten.
¹H-NMR (CDCl₃, int. TMS): δ=7,66-6,52 (Multiplett, aromatische Protonen);
3,42 (-CH₂CH₃),
1,22 (-CH₂CH₃).
In analoger Weise wurden auch die weiter vorn aufgeführ­ ten Verbindungen IVb bis IVi hergestellt. Einige spek­ troskopische Daten sind in Tab. 1 zusammengestellt.
Tabelle 1
Spektroskopische Daten amphiphiler Farbstoffe
Beispiel 2 Herstellung eines polymerisierbaren Fluoreszenzfarbstoffs
Zu 1,53 g (5 mmol) 7-Diethylamino-3-(p-aminophenyl)- cumarin und 0,61 g (5 mmol) Triethylamin in 10 ml trockenem Chloroform wurden unter Eisbadkühlung 0,52 g (5 mmol) Methacrylsäurechlorid in 5 ml trockenem Chloro­ form getropft. Man ließ eine Stunde bei 0-5°C und 5 Stunden bei Raumtemperatur nachrühren. Der Ansatz wurde zunächst mit Natronlauge, zuletzt mit Wasser bis zur Salzfreiheit gewaschen und zur Trockne eingeengt.
Ausbeute: 1,6 g entsprechend einer theoretischen Ausbeu­ te von 86% des Produktes der weiter vorn aufgeführten Formel VIa mit einem Schmelzpunkt von 193-195°C.
¹H-NMR (CDCl₃, int. TMS): δ=9,43 (NH), 7,77-6,49 (Multiplett, arom. Protonen); 5,86 und 5,47 (H₂C=); 3,44 (-CH₂CH₃); 2,04 (=C-CH₃); 1,22 (-CH₂CH₃).
In analoger Weise wurden auch die weiter unten (Tab. 2) aufgeführten Verbindungen VIb bis VIf hergestellt. Eini­ ge spektroskopische Daten sind in Tab. 2 zusammengestellt.
Tabelle 2
Spektroskopische Daten polymerisierbarer Fluoreszenzfarbstoffe
Beispiel 3 Herstellung eines Fluoreszenzfarbstoff enthaltenden Polymeren
6,77 g (20 mmol) Octadecylmmethcrylat, 4,00 g (20 mmol) (2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)-methylenmethacrylat und 1,51 g (4 mmol) des Farbstoffmonomeren des Beispiels 2 wurden in 90 ml absolutem Dioxan gelöst und nach Zugabe von 1,44 g (0,2 Mol-%) Azo-bis(isobutyronitril) unter Rühren auf 65-70°C erwärmt und 16 Stunden lang bei dieser Temperatur gehalten. Nach Abkühlen wurde aus der Reaktionslösung das Polymer durch Eintragen in Wasser ausgefällt. Das Polymer wurde durch zweimaliges Lösen in Chloroform und Fällen in Methanol gereinigt.
Es wurden 3,93 g eines gelbgrünen Polymers erhalten, das durch Gelpermeationschromatographie in CH₂Cl₂ charakte­ risiert wurde. Gleichzeitige Detektion von Brechungsin­ dex und UV-Spektroskopie lieferte identische Molekular­ gewichtsverteilungskurven, so daß ein gleichmäßiger Ein­ bau des Fluoreszenzfarbstoffs in das Polymer gewährlei­ stet war. Gegenüber einer Polystyrol-Eichung ergaben sich rechnerisch Molmassenwerte Mn=64 000 und Mw= 1 290 000 entsprechend einer Uneinheitlichkeit von 18.1.
Nach dieser allgemeinen präparativen Vorschrift wurden alle Methacrylat-Copolymere hergestellt.
Beispiel 4 Herstellung eines Schichtelements mit Fluoreszenzfarbstoff a) Polymer Farbstoff
Ein durch Behandlung mit H₂O₂/H₂SO₄ gereinigter Objektträger aus Floatglas wurde bis zu einer Tiefe von 30 mm in die wäßrige Subphase einer Langmuir- Filmwaage (KSV 2200) eingetaucht. 150 µl einer Lö­ sung der Verbindung der Formel (IIa) in Chloroform (1 mg/ml) wurden auf die Wasseroberfläche aufge­ spreitet. Nach dem Zusammenschieben der Schicht auf einen Oberflächendruck von 25 mN/m wurden durch sukzessives Aus- und Eintauchen (Tauchgeschwindig­ keit: 10 mm/min) des Objektträgers drei monomole­ kulare Lagen Polymer übertragen. Die letzte Schicht wurde dabei beim Austauchen übertragen. Der Träger wurde anschließend an der Luft getrocknet. Eine Seite des Trägers wurde durch Reinigung mit Chloroform von der Farbstoffschicht befreit.
b) Polymer mit dispergiertem monomerem Farbstoff
Anstelle der Lösung des farbstoffhaltigen Polymers der Formel (IIa) wurde eine Mischung des Polymers der Formel (I), 1 mg/ml, und des monomeren amphi­ philen Farbstoffs der Formel (IIIb) mit X=0, n=18, 1 mg/ml, im Verhältnis 4 : 1 verwendet.
Beispiel 5 Adsorption von Fluoreszenzfarbstoffen an ein Schichtele­ ment und Beobachtung von Fluoreszenz-Energietransfer
Ein nach Beispiel 4 hergestelltes Schichtelement wurde in eine Lösung von 10-7 mol/l Fluorescein in Phosphat­ puffer, pH 7,0, 5 min lang getaucht. Vor und nach dem Versuch wurde ein Fluoreszenzspektrum aufgenommen. Das Emissionsspektrum verschob sich zum Maximum von Fluores­ cein hin.
Beispiel 6 Adsorption von fluoreszenzmarkiertem Protein an ein Schichtelement und Beobachtung von Fluoreszenz-Energie­ transfer
Ein nach Beispiel 4 hergestelltes Schichtelement wurde mit 50 µl einer Lösung von mit Tetramethylrhodamin-iso­ thiocyanat (TRITC) markiertem Lectin Concanavalin A (1 mg/ml) betropft und ein zweiter, unbehandelter Ob­ jektträger gleicher Größe derart angepreßt, daß sich die Flüssigkeit gleichmäßig und ohne Luftblasen auf der Langmuir-Blodgett(LB)-Schicht verteilte. Nach einer Stunde Einwirkungszeit wurden beide Träger getrennt und der beschichtete dreimal mit wäßrigem Phosphatpuffer, 10 mmol/l, pH 6,8, gewaschen. Anschließend wurde ein Fluoreszenzspektrum gemessen und mit dem eines nicht mit Protein behandelten Schichtelements verglichen. Man er­ kannte eine zusätzliche Bande der TRITC-Emission. Wurden über die farbstoffhaltige LB-Schicht zwei bis sechs Farbstoff-freie Lagen aufgebracht, so sinkt die Intensi­ tät dieser Bande in Abhängigkeit von der Schichtdicke bis auf Null.
Es konnten 25 pmol TRITC-markiertes Protein nachgewiesen werden.

Claims (10)

1. Optischer Biosensor auf der Basis des Fluoreszenz- Energietransfers, bestehend aus
  • a) einem festen Träger,
  • b) einer auf a) angebrachten ein- oder mehrlagi­ gen Langmuir-Blodgett(LB)-Schicht,
  • c) mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff F₁, der in mindestens einer der oberen 4 Lagen der LB- Schicht angeordnet ist,
  • d) einem zur biologischen Wechselwirkung befähig­ ten Molekül (Rezeptor), das in oder an der obersten Lage der LB-Schicht gebunden oder an­ geordnet ist, und
  • e) einem mobilen Fluoreszenzfarbstoff F₂, dessen Anregungsbande für einen Energietransfer aus­ reichend mit der Emissionsbande von F₁ über­ lappt und der kovalent an einen Liganden gebunden ist, der an den Rezeptor bindungs­ fähig ist oder der kovalent an einen anderen Rezeptor gebunden ist, der an den Komplex aus erstem Rezeptor und Ligand bindungsfähig ist, wobei der Ligand bzw. der Ligand und der zweite Rezeptor zunächst nicht an die LB- Schicht gebunden sind.
2. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete feste Träger aus Glas, Quarz­ glas, Porzellan, Silizium, einem Kunststoff oder einem metallisierten Kunststoff besteht.
3. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix der LB-Schicht ein Polymer ist.
4. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß F₁ kovalent an die Matrix gebunden ist.
5. Bisensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff F₁ mit einer amphiphilen Matrix kogespreitet ist.
6. Biosensor nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff F₁ in mindestens einer der beiden oberen Lagen der LB-Schicht angeordnet ist.
7. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormolekül kovalent, bevorzugt über ein Spacermolekül, an die oberste LB-Schicht ange­ bunden ist.
8. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormolekül über einen hydrophoben Mem­ brananker an die oberste Schicht angeordnet ist.
9. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an die Bindungsstellen der Rezeptormoleküle ein fluoreszenzfarbstoffmarkierter oder selbstfluores­ zierender Ligand gebunden ist.
10. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zu der Analytenlösung ein zweites, mit dem Fluoreszenzfarbstoff F₂ markiertes Rezeptormolekül zugesetzt wird, das entweder spezifisch an den Kom­ plex aus Rezeptor und Analyt oder an eine andere Domäne des Analyten als der Rezeptor in der Art eines Sandwich-Assay bindet.
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