JPH03176662A - 光学的バイオセンサー - Google Patents

光学的バイオセンサー

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JPH03176662A
JPH03176662A JP2307346A JP30734690A JPH03176662A JP H03176662 A JPH03176662 A JP H03176662A JP 2307346 A JP2307346 A JP 2307346A JP 30734690 A JP30734690 A JP 30734690A JP H03176662 A JPH03176662 A JP H03176662A
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dye
membrane
receptor
molecules
fluorescent dye
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JP2307346A
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Herbert Dr Hugl
ヘルベルト・フクル
Eberhard Kuckert
エバーハルト・クツケルト
Dietmar Moebius
デイートマル・メビウス
Holger Ohst
ホルガー・オースト
Meinhard Rolf
マインハルト・ロルフ
Hans J Rosenkranz
ハンス・ユルゲン・ローゼンクランツ
Heinrich C Schopper
ハインリツヒ・クリスチヤン・シヨツパー
Hans-Ulrich Siegmund
ハンス―ウルリツヒ・ジークムント
Klaus Sommer
クラウス・ゾマー
Rolf Wehrmann
ロルフ・ベールマン
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛍光染料で標識を付けた分子を検出し、例えば
抗原および抗体のような挙動をする溶解した物質または
溶解した検体を検出するのに用いられる新規構成をもっ
た光学的バイオセンサーに関する。本発明のセンサーは
蛍光染料を含む固相センサーの形をしており、該蛍光染
料が第二の蛍光染料で標識を付けられた検出すべき分子
にエネルギーを伝達するようになっている。
ホルモン、酵素、他の蛋白質、炭水化物、核酸、薬理活
性化合物、毒物および他の物質のような検体を生物的な
起源をもつ液体中において検出するには種々の方法があ
る。公知方法の中で特に免疫検定法が非常に少量の有機
物質を検出する高感度の検出法として優れている。免疫
検定法は一般に抗体のようなレセプター分子がリガンド
分子の構造および分子構成を選択的に検出して非極性お
よび／または極性の相互作用をなし得るかどうかを認識
し、このような相互作用で該分子を極めて選択的に結合
させ得る能力に基礎を置いている。
免疫検定法は種々の方法で行うことが、できる。
その中には種々の標識法が含まれ、通常は標識として放
射性物質、酵素結合物質および蛍光性物質が使用される
［メソッヅ・イン・エンチモロジ−（Ｍｅｔｂｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）誌７４巻（１９８１年）
２８〜６０頁］。
これらの公知免疫検定法の幾つかにおいては、波長に１
の光を吸収し第２のそれよりも長い波長ｋ。
の光を放出する蛍光染料分子Ｆ、を使用する。ある種の
条件下においては他の蛍光分子Ｆ２が存在すると、波長
に、の光で分子Ｆ！が励起された後エネルギーが無放射
的にＦ２に伝達され、分子Ｆ、が第３のさらに長い波長
に３の光を放出する場合もある。
このエネルギー伝達の原理はフェルスター（Ｆｉｒｓｔ
ｅｒ）により理論的に解明され、広範囲に亙る可能な用
途の開発の刺激となっている［アニュアル・レヴイユー
ズ・イン・バイオケミストリー（ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉ
ｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）誌４７巻（
１９７８年）８１９〜８４６頁］。このエネルギー伝達
の重要な性質の一つは距離に依存することである。フェ
ルスターによればエネルギー伝達の効率は臨界距離Ｒ０
によって君す述される。臨界距離とは、分子間のエネル
ギー伝達が供与体のすべての他の不活性化過程の和と同
じ確亨で起こるような供与体と受容体との間の距離であ
る。この距離は約５０〜１００人である。
距離に依存したエネルギー伝達を利用する免疫検定法は
公知である。即ちヨーロッパ特許第１５０゜９０５号に
おいては、検体または抗原に蛍光染料Ｆ１で標識を付け
、これに選択的に結合する抗体に第２の蛍光染料Ｆ！で
標識を付けて均一溶液中で検定を行う免疫検定法が記載
されている。選択的な結合を検出しこれを分析法として
用いるためには、波長に、の光を通した場合、フェルス
ターによるエネルギー伝達に対し十分中さな距離に検体
および抗体がかなりの濃度で存在する場合においてのみ
波長に３の光の放出が観測されるという事実を使用する
。これは検体および抗体が特定の結合距離の範囲に入っ
た場合においてのみ可能である。
他の例においては、２個の標識を付けられた結合対の一
つが同相表面に結合し、これに対応して選択的に結合す
る結合対が均一溶液から結合して来る。この場合も既に
説明したように消光波技術を用いて適切なエネルギー伝
達により特定の結合が検出される［ネイチャー　（Ｎａ
ｔｕｒｅ）誌３２０巻（１９８６年）１７９〜１８１頁
］。
ここで述べる均一溶液中でのエネルギー伝達、および上
述のエネルギー伝達による固相免疫検定法は両方とも、
いずれの場合も互いに選択的に結合する分子に２種の必
要な蛍光染料Ｆ、およびＦ２の一つで標識を付けなけれ
ばならず、ネイチャー誌３２０巻（１９８６年）１７９
〜１８１頁によればＦ、　：Ｆ、の比は最高２＝１にな
るという欠点をもっている。
蛍光スペクトルによる検出感度は２種の蛍光染料Ｆ１お
よびＦ２の比により制限を受けるが、この感度を改善す
る方法も公知である。即ちヨーロッパ特許第１７４゜７
４４号においては、数種の有機染料分子を同時に１個の
「光捕集」蛋白質に結合させる方法が提案されている。
即ち数個の有機染料分子が唯１個の受容体分子、ヨーロ
ッパ特許第１７４．７４４号の場合には１個のフィコビ
リ蛋白（アロフィコシアニン）に対してエネルギーが伝
達される。この場合この分子系は他の生物的な分子に対
しての「標識」として提案されている。この方法は染料
対蛋白質の結合費によって制限される。
上記系の他の欠点は、相補的な系にそれぞれ特殊な標識
を付けなければならず、従って融通性に富んだ使用が不
可能であるということによって生じる。不均一相でつく
られたこれらの系のさらに他の欠点は、特殊な消光波技
術を使用することである。さらにカップリング成分／抗
体／抗原／抗体系を通じて固相表面に選択的に結合する
分子を不動化するには非常に面倒な調製工程が必要であ
る。免疫検定法におけるこの固相法の原理的な他の欠点
は、免疫反応において反応物質で検定マトリックスを再
現性良く被覆調製しなければならない点である。しかし
分析法においては標的物質に関する感度および選択性の
他に、検出の再現性が本質的な質的基準となる。
本発明は溶解した物質または検体を検出するために蛍光
染料で標識を付けた分子をエネルギー伝達法により検出
し、この際簡単な蛍光技術を使用し、検出感度を増大さ
せ、種々の問題に対し融通性のある使用ができ、且つ固
体表面に結合した膜を再現性良く調製できる新規構成を
もったセンサーに関する。
本発明は（ａ）固体の支持体、 （ｂ）　（ａ）に取り付けられた単一層または多層のラ
ングミヤ・プロジェット（ＬＢ）膜、（ｃ）該ＬＢ膜の
外側の４層の中の少なくとも一つに存在する少なくとも
１Ｍの蛍光染料Ｆ１、（ｄ）該ＬＢ膜の最も外側の層の
中または上に結合または存在する特殊な相互作用をなし
得るレセプター分子、 （ｅ）励起バンドがエネルギー伝達を行い得るほど十分
にＦｌの発光バンドと重なっている動き得る蛍光染料Ｆ
２から成り、 （ｅ１）該蛍光染料Ｆ２は、最初はＬＢ膜と結合してい
ないリガンドと共有結合し、該リガンドがレセプターと
結合することができるか、或いは（ｅ２）該蛍光染料Ｆ
２は、最初はＬＢ膜と結合していない他のレセプターと
共有結合し、該レセプターが第１のレセプターおよび最
初はＬＢ膜と結合していないリガンドから成る錯体と結
合することができることを特徴とする蛍光エネルギー伝
達に基づく光学的バイオセンサーに関スる。
適当な支持体は当業界の専門家に対して公知のすべての
公知支持体であり、ＬＢ法に適した支持体、例えばガラ
ス、石英ガラス、他のガラス、例えばニオブ酸リチウム
、セレン化亜鉛、磁器、半導体材料、例えばゲルマニウ
ム、ＧａＡｓまたは珪素、および金属である。
またプラスチックス、例えばポリメタクリル酸メチル、
ポリカーボネート、ポリスチレンおよびその他のプラス
チックス、並びに金属メツキしたプラスチックスも適し
ている。固体支持材料はまた被覆する前に表面を変性し
たもの、例えばトリクロロメチルシラン、ジクロロジメ
チルシラン、トリクロロオクタデシルシラン、ヘキサメ
チルジシランで前処理するか、プラズマ・エツチングま
たはプラズマ重合により前処理したガラス、石英または
珪素であることができる。好適方法においては、支持体
は随時表面を変性したガラス、石英ガラス、珪素、プラ
スチックスまたは金属メツキしたプラスチックスの形を
している。他の好適な支持体は光学的に透明である。す
べての支持材料はまた均一な表面、好ましくは平らな表
面をもつことを特徴としている。
このような支持体にＬＢ法を用いて１層または数層の単
分子膜を被覆する。ＬＢ法とはラングミア・プロジェッ
ト（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）法により単
分子膜を液体（水）から固体の支持体に転写する方法を
言う。このためには実質的に滑らかな表面をもった固体
支持体を、液体表面上の圧縮された単分子膜を通してそ
れ自身は公知方法により浸漬し、これによって単分子膜
を支持体に転写する。
この方法で何回も浸漬および取り出しを繰り返すことに
より多層系をつくることができる。各浸漬毎に液体表面
上の膜を取り換え、支持体上に異なった層の順序をもつ
膜をつくることができる。
支持体の浸漬および取り出しは液面に対し直角または斜
めに行うことができる。さらにラングミア・セファ　−
（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−３ｃｈａｆｅｒ）法により支持体
を点または縁で液面と接触させ、これを液面の上でピボ
ット状に回転させることができる。最後に支持体を平行
にして液面へと降下させることができる（「水平浸漬法
」）。
転写は温度５〜４０℃、好ましくは室温で行われる。
これらの配向したＬＢ膜は低分子量および／または高分
子量の両親媒性物質、好ましくは高分子量の両親媒性物
質から成り、共有結合的に結合した蛍光発色体／染料お
よび／または両親媒性の蛍光発色体および／または染料
を含むことができ、以後これをＦｌと呼ぶことにする。
これらのＬＢ膜はまたレセプターとしての官能基をもっ
た分子、例えばグリコリピド、ポリ−およびオリゴヌク
レオチド、蛋白質またはこれらの断片を含んでいるか、
或いはこれと共有結合的に結合している。このようにし
てＦ、とエネルギー伝達が行われる関係にある第２の蛍
光染料Ｆ２で標識を付けられた、これらのレセプターと
相補的な分子（リガンド）により、例えばレクチン、抗
原、抗体およびその他の物質により、レセプターに選択
的に結合することが可能になる。レセプターとリガンド
との間の結合の場合、上記のエネルギー伝達に必要なＦ
ｌとＦ２との間でいわゆるフェルスター距離が成立しな
ければならない。この条件は分子の特殊な配置構成が、
特に今問題となっている約１０〜１００人の範囲の大き
さをもつことを可能にするＬＢ法により満たされる。こ
のような系が波長に１の光で励起された場合、蛍光染料
Ｆ２による波長に、の光の放出が検出でき、これにより
Ｆ２で標識を付けられた分子がＦ、をドーピングされた
センサーの表面に結合していることを示すことができる
。波長に、の光による励起は、光学的に透明な支持体中
に光を通すか、光学的に透明な支持体を光ガイドとして
作用させて消光波法を使用するか、或いは入射光を照射
してＬＢ模膜中Ｆｌを励起する方法で行われる。
互いに相補的な２個の分子の間の選択的な相互作用は生
物学、生化学および特に医学的（生理学的）に重要な分
子、例えば上記型の分子について専門家に対しては公知
である。このような相互作用は結局イオン結合、水素結
合およびファン・デル・ワールスカから導かれるが、こ
れらの作用は特殊な空間的（立体的）な環境をもつ場合
だけ上記分子の存在領域において有効である（鍵と鍵穴
の理論）。勿論本発明のバイオセンサーをこのような特
殊な空間的環境なしで選択的な相互作用の検出に使用す
ることができる。このような使用法は本発明の光学的バ
イオセンサーの機能の信頼性、測定精度および多の特性
を検査するために特に重要である。
このようなセンサーの構成においては、この機能により
溶液中に存在し蛍光染料Ｆ２で標識を付けた検体を検出
できるばかりではなく、これと競合する機能により蛍光
染料で標識を付けられていない検体の検出を行う用にセ
ンサーをつくることもできる。この目的に対してはセン
サーをつくる場合、ＬＢ模膜中官能基をもった分子の特
殊な結合部位は相補的に結合する蛍光染料で標識を付け
られた分子で飽和させる。この場合波長に１の光で励起
すると波長に３の最高の蛍光放出が観測され、検体溶液
と接触させてその時間による減少を観測することができ
、Ｆ２で標識が付けられた相補的に結合する分子は標識
が付けられていない相補的に結合する同じ種類の分子と
の間で平衡関係に保たれる。
両親媒性分子、即ち親水性の端（ヘッド）および疎水性
の端（テイル）をもつ分子を使用してＬＢ膜をつくる。
このような両親媒性分子は分子量が最高約２０００ｇ１
モルの低分子量化合物である。他の変形法においてはこ
のような低分子量の両親媒性分子は重合、縮重合および
付加重合し得る官能基をもち、低分子量の両親媒性分子
からＬＢ膜を作った後に、ＬＢ模膜中両親媒性分子は次
の反応で結合させ高分子化合物にすることができる。高
分子化合物をつくるこの次段階の反応は、両親媒性重合
体から成るＬＢ膜が高い熱的および機械的安定性を示す
ために有利である。
両親媒性単位を公知方法で液面の上に広げて単分子膜を
つくる前に両親媒性単位の結合の周りに架橋させること
により、両親媒性重合体からＬＢ膜をつくることができ
、この方法は特に巧妙な方法である。このようにして予
備重合させた両親媒性の重合体を使用することにより、
次いでＬＢ模膜中重合が起こり一度つくられた配向状態
が乱されるのを防ぐことができる。
本発明の光学的バイオセンサーに適した両親媒性重合体
の例はα−オレフィン／マレイン酸無水物共重合体［プ
リティッシ・ポリマー・ジャーナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　
Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｊｏｕｒｎａ１）１７巻（１９８５年
）３６８頁以降、ジャーナル・オヴ・マクロモレキュラ
ー・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｍａｃｒｏｍｏｌ、
　Ｓｃｉ、）、フィジックス（Ｐｈｙｓ、、　）８２３
巻（１９８５年）５４９〜５７３頁］、ポリオクタデシ
ルメタクリレート、ポリビニルステアレート［ジャーナ
ル・コロイダル・インターフェース・サイエンス（Ｊ、
　Ｃａ１１．　　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ、）８６
巻（１９８２年）４８５頁コ、ポリビニルフォスフォリ
ピド［アンゲヴアンテ・ヘミ−（＾ｎｇｅｗ、　Ｃｈｅ
ｍ、）１００巻（１９８８年）１１７〜１６２頁］セル
ローストリステアレート、両親媒性ポリアミド（ドイツ
特許公開明細書筒３．８３０．３２５号）およびアクリ
ルアミド共重合体である。安定なＬＢ膜の調製に適した
好適なものはドイツ特許公開明細書筒３．８２７．４３
８号記載のポリウレタンおよびドイツ特許公開明細書筒
３．８３０．８６２号記載のポリエステルである。両親
媒性重合体の中で下記の型の不規Ｉｌｌポリ（アルキル
メタクリレート）を特に挙げることができるが、この組
成は広く変えることができる。
ここでＲ１、Ｒ２およびＲ３は互いに独立に水素または
メチルを表し、 Ｒ４は直鎖のＣＩｌ〜Ｃ２２−アルキルであり、Ｒ５は
水素、ナトリウムまたはカリウムイオン、或いは基−Ｃ
Ｈ２−Ｃ）１２０Ｈ。
ＣＨ２−ＣＦＩ２−ＮＨ−ｔ−ブチル、−ＣＨ２−Ｃｌ
＋２−Ｎ（ＣＨ３）　２、−Ｃ１２−ＣＨ−ＣＩ（２−
０）１゜Ｈ の一つであり、 Ｒ６は当業界の専門家に公知の蛍光発色基であり、Ｘは
０．２〜１、 ｙは０〜０．８． ２はＯ〜０．２であって、和ｘ＋ｙ＋ｚは］である。
好ましくは、Ｘとｙはほぼ等しい。
式（Ｉ）のポリマーの例は次のとおりである。
ＬＢ単分子膜および多層膜の例としてここに挙げた物質
の場合、蛍光発色体は両親媒性重合体に共有結合で結合
している。この配置によりＦ、を含むＬＢ膜が最大の安
定性をもつが、両親媒性重合体を両親媒性の蛍光染料と
共に水の上に広げた後被覆を行うことによりＦ１含有Ｌ
Ｂ膜をつくることができる。発色体を含まない両親媒性
重合体と共に使用できるこのような両親媒性蛍光染料の
例としては例えば の型のシアニン染料がある。ここでＸおよびＹは互いに
独立に酸素、硫黄またはセレン、或いはＣ，（ＣＦ＋３
）、であり、 Ｒ７は水素またはメチルを表し、 Ｒ８およびＲ９は互いに独立に直鎖のＣ１〜Ｃ２２−ア
ルキルである。
当業界の専門家に公知の本発明に使用できる蛍光染料の
他の例は下記の種類のものである。
し２１１Ｂ Ｃ２１１゜ 上記リストは単に例示のためのものである。さらに他の
両親媒性蛍光染料は米国ニューヨークのジョン・ウィリ
ー（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ）社１９７２年発行の単行本
、フィジカル・メソッヅ・オヴ・ケミストリー（Ｐｈｙ
ｓｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）第１巻３Ｂ部５７７頁以降に記載されている。この
ような両親媒性蛍光染料をＬＢ腹膜中導入しようとする
場合、フィルム全体に亙り染料が均一に分布するように
注意しなければならない。即ち温度（典型的には５〜４
０℃、好ましくは約２０℃）に依存して、固相類似の相
および液相類似の相が共存する領域を通過するような押
圧力をかけて個々の膜を転写することは避ける必要があ
る。両親媒性の蛍光染料は一般に両方の相に対し同じ溶
解度をもっているから、センサーの用途にはあまり適当
でない不均一な膜が生成するために、このことは重要で
ある。この現象は低分子量物質から成るＬＢ膜に対して
知られており［アンゲヴアンテ・ヘミー誌１００巻（１
９８８年）７５０頁コ、重合したフォスフォリビドに対
しても観測されている［ポリマー・サイエンス（Ｐｏｌ
ｙｍｅｒ　Ｓｃｉ、　）誌２６７巻（１９８９年）９７
〜１０７頁コ。
本発明の光学的バイオセンサーを製造する場合、驚くべ
きことには式（ＴＩ）の重合体から成るＬＢ膜は、＞　
４５ｍＮ／ｍにおいて最大ＬＢ膜が潰れるまで／／／を
かけた場合、相分離領域を生じる傾向がないことが見出
された。このことは式（ＩＩ）の重合体の他に式（Ｖ）
の型の重合体と例えば式（ＩＶａ）の染料との混合物に
も適用される。この混合物は式（Ｖ）の重合体が「マト
リックス」と見做され、この中に０．１〜２５モル％の
両親媒性染料が混入される。この場合重合体中のモル％
を計算するには下記の反復単位を用いる。
二二でｍは０゜２５〜１、ｎはｌ−ｍである。
好適な方法ではｍは０．４〜０．６である。
この方法でつくられたＬＢ膜はサブフェーズとしての水
の上でもまた固相支持体に転写した後でも、光学顕微鏡
下において均一な膜をもち、欠陥はなく、本発明のバイ
オセンサーとして特に適している。
しかし相分離した領域をもつ系では、ＬＢ模膜中供与体
として蛍光染料Ｆ１を使用すると、本発明の光学的バイ
オセンサーの高感度を達成することができる。このＬＢ
膜は特殊な挙動のために単量体とは著しく異なった蛍光
スペクトル特性をもつ凝集体をつくる。この蛍光スペク
トルは一般に鋭く強い吸収帯をもち、それに対応して鋭
く強い蛍光を放出する。この種の凝集体は当業界の専門
家にはＪ凝集体またはディスク凝集体として知られてい
る［上記「フィジカル・メソッヅ・オヴ・ケミストリー
」第１巻３Ｂ部５７９頁参照］。このようなＪ凝集体の
特殊な挙動を用いると、片方ではＬＢ模膜中非常に高い
Ｆ、染料密度を得ることができ、他方では波長に、の光
の吸収が強いために高エネルギー密度が得られ、フェル
スターの理論によればこれを適当な分子Ｆ２に伝達する
ことができる。放出帯の半値幅が小さいことは測定信号
に増幅効果が得られ、Ｆ。
における放出がＦ２と重なり合うことが少ないために放
出の妨害が減少することを意味する。
ＬＢ模膜中Ｊ凝集体を生成し得る蛍光染料は上記文献に
記載されている。その例はシアニン染料およびメロシア
ニンである。
蛍光染料Ｆ１を含むＬＢ模膜中官能基をもった分子を導
入するには種々の方法がある。即ち適当にスペーサー分
子を使用して官能基をもった分子をＬＢ膜に共有結合で
結合させることができる。これは分子を水面上に広げる
工程の最初から、或いは次いでサブフェーズ上でまたは
ＬＢ膜を固相の支持体に取り付けた後にカップリング反
応を行わせて行う。
一官能基をもった分子を両親媒性分子と共に広げ、「錨
」により物理的にＬＢ模膜中導入することができる。
これらの混入法の変形法は文献に記載されている。例え
ば生化学の専門家には公知の不動化法［メソッヅ・オヴ
・エンチモロジー誌１３５巻および１３６巻（１９８７
年）］と似た方法により生物的な官能基を固相支持体上
のＬＢ膜に結合させることができる。膜に対する錨とし
て活性をもった化合物複合体として、長鎖アルキルをも
った多数の分子が選ばれ、ドイツ特許公開明細書第３．
５４６．１５０号に記載されており、これらはサブフェ
ーズ上で一緒に広げることによりＬＢ模膜中導入するこ
とができる。このような両親媒性の分子としてグリコリ
ピド、例えばセルアミドを挙げることができる。他の例
としては抗体／抗原系、並びに補足的なヌクレオチド連
鎖がある。このような多数の例は当業界の専門家には公
知である［アンゲヴアンテ・ヘミー誌１００巻（１９８
８年）１１７〜１６２頁］。
センサー系の感度の増加に対し、従ってＦ２をドーピン
グした表面に結合させた後のＦ２で標識を付けた分子の
蛍光信号の増強に対し、「フェルスターの半径」以内に
おける最大可能なＦｌ：Ｆ２比が重要である。従って最
大数のＦ、発色体を最も外側のＬＢ膜に、特に最も外側
の４層に導入することが有利である。特に好適な方法で
は染料Ｆ、を外側の２枚の層の少なくとも一つの中に導
入する。
個々の染料分子が相互作用してその蛍光挙動が変化する
ことを避けるためには、通常蛍光スペクトル峡では蛍光
染料を１％より少ない濃度で使用するが、本発明の光学
的バイオセンサーにおいては蛍光染料Ｆ１を高濃度でＬ
Ｂ腹膜中導入することが有利である。特に重合体の両親
媒性蛍光染料は０．１〜２５モル％の濃度において自己
消光および励起子生成の傾向が少ない。ＬＢ腹膜中分離
した発色体を均一に分散させる場合も同じ濃度が有利で
あることが判った。他方ディスク凝集体の特定の場合に
は、発色体を会合させることが望ましい。この会合は２
５モル％以上最高１００モル％の染料濃度で選択的に起
こる（重合体マトリックスなし）。
本発明の光学的バイオセンサーは固相の膜の中に導入さ
れた官能基をもった分子には無関係に、エネルギー伝達
の原理に必要な染料Ｆ１を広いスペクトル範囲において
自由に且つ選択的にＬＢ腹膜中導入し得るという利点を
もっている。このことは一方では官能基をもった分子に
特別にＦ、で標識を付ける必要はなく、他方ではＦｌの
スペクトル範囲を標識として使用される染料Ｆ２に対す
るエネルギー伝達に最適になるように調節し得ることを
意味する。このような対の例としては次のものがある。
Ｆ、　　　　　　　　　　Ｆ２ （ａ）重合体（ＩＩａ）　　　　　　　　ＴＲＩＴＣ（
ｂ）シアニン（ＩＩＩｂ）　　　　　　　ＴＲＩＴにこ
でｘ＝ｙ＝ｏ、Ｒ７＝Ｈ。
Ｒ１１＝Ｒ９・Ｃｌ８Ｈ３？ （ｃ）シアニン（工ＩＩａ）Ｆ工Ｔに こでＸ＝Ｓｅ、　Ｙ＝Ｓ。
Ｒ’　＝ＣＨ８、Ｒ’＝Ｒ’＝ＣｔｓｌｌｓｖＴＲＩＴ
Ｃ＝テトラメチルローダミンイソチオシアネート ＦＩＴＣ＝フルオレッセインチオイソシアネート本発明
の光学的バイオセンサーにおいて蛍光スペクトル検出の
感度を増加させるには、上記のように最高可能な濃度の
染料Ｆ、をＬＢ膜の中に導入し、数個のＦｌを分子Ｆ２
に対するエネルギー伝達に必要な「フェルスターの半径
」内で膜に結合させることにより行われる。この構成で
は、レセプターの他にＬＢ膜系に最高可能な染料密度Ｆ
、を導入するためには、従来公知のエネルギー伝達をベ
ースにした検出法とは対照的に、この測定原理をさらに
有利に利用し明確に感度を増加させることができる。
何故ならばレセプター分子に直接蛍光染料で標識を付け
た場合に比べ、レセプター分子１佃当たり遥かに多数の
染料分子が存在しているからである。
Ｆ２のフェルスター半径以内に存在するすべての染料分
子Ｆ、を使用する他の結果として、ＬＢ膜の最も外側の
層の内部でＦ、を横方向に分布させることばかりでなく
、下方の屑の中におけるＦｌの濃度が極めて重要になる
。このためこの測定原理は有効厚さが最高約１００人の
膜に限定される。何故ならば下層の分子Ｆ１は光で励起
された後では、遥かに遠いところにある染料Ｆ２にもは
や十分なエネルギーを伝達することはできず、検出信号
を妨害する主な原因となるからである。即ち波長に２を
もつ独自の蛍光を放出するために伝達によって励起され
た染料Ｆ２が波長に３の光を放出し、不必要に検出感度
を低下させるからである。
この理由によりＦｌを含む薄い膜（１００Å以下）をつ
くるためには、ＬＢ膜の製作技術および化学吸着法だけ
が適している。薄膜技術に広く使用されている回転被覆
法でさえも、２００〜５００人の最低の膜厚の場合には
問題を含んでいるからである。化学吸着によって薄膜を
被覆する場合と比べ、ＬＢ膜技術は膜の組成が明確に調
節でき、これはセンサーのための再現性の良い表面をつ
くる上で非常に重要であるという利点をもっている。
これと関連して、供与体の染料Ｆ１および生化学的分子
の結合に対する上記の活性部位を順次配列された異なっ
たＬＢ膜の中に存在することもできる。
センサーの原理に有効なＬＢ膜の全部の数は１〜１０の
範囲内で変化する。
本発明の光学的バイオセンサーはまた染料成分Ｆ２を含
みＬＢ膜にしっかりと固定されたレセプター分子に可逆
的に結合する動き得る蛍光分子を含んでいる。最も簡単
な場合、即ちＦ２として作用する自己蛍光性の検体の検
出の場合だけこの成分は不必要である。何故ならＦ２お
よびリガンドが同じであり検体となっているからである
。他方ＬＢ膜上でのレセプターの結合部位を、蛍光物質
で標識が付けられた誘導体または検体分子の同族体によ
り飽和させることができる。次いでこれは試料溶液と接
触すると検体により競合的に移動させられることができ
る。しかし他方第２の種類のレセプター例えば抗体を、
第１のレセプターと検体との錯体または第１のレセプタ
ーに対する結合に含まれていない検体の分子領域に結合
させるサンドウィッチ型免疫検定法も可能である。これ
らの固相免疫検定法は原理的に現在行われている方法で
あり、例えばオランダ、アムステルダムのエルセヴイア
−（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）出版社１９８５年発行、ピー・
テイイッセン（ｐ、　Ｔｉｊｓｓｅｎ）著［アール−エ
イチ・バートン（Ｒ。
Ｈ，Ｂｕｒｄｏｎ）、ビー・エイチ・ファン・クニッペ
ンベルグ（Ｐｈ、　Ｈｏｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒ
ｇ）編］「酵素免疫検定法の実際の理論」に記載されて
いる。
実施例１ 両親媒性の蛍光染料の製造 ５ｍｌの乾燥クロロフォルム中に塩化オクタデカン酸１
．５１．ｇ（５ミリモル）を含む溶液を、水浴中で冷却
しながら乾燥クロロフォルムｌＱｍＡ中に１．５３ｇ（
５ミリモル）の７−ジニチルアミノー３−（ｐ−アミノ
フェニル）クマリンおよび０．６１ｇ（５ミリモル）の
トリエチルアミンを含む溶液に滴下する。次いでこの混
合物を０〜５℃において１時間撹拌し、さらに室温で５
時間撹拌する。この混合物を先ず希水酸化ナトリウム溶
液で洗滌し、最後に水で洗滌する。石油エーテルを用い
てクロロフォルムから粗製物を６０／７０℃で沈澱させ
る。
融点１５９℃の上記式の生成物を理論値の６４％の収率
で得た。
’Ｈ−ＮＩＪＲ（ＣＤＣｌ２、内部基準ＴＭＳ）：　ｄ
＝７．６６〜６．５２（多重シグナル、芳香族プロトン
）；　３．４２（ＣＨ２ＣＨ３）、１．２２　（ＣＨ２
ＣＨ３） 上記ＴＶｂ−ＩＶｉの化合物も同様につくられる。下記
第１表にスペクトル・データを示す。
第１表：両親媒性染料に関するスペクトル・データ式　
　　　ＣＨ２Ｃ１９中のスペクトル・データＥＸＣ，ａ
ａｘ　　　Ｅｌｌｌ、ｍｍｘ　　　Δ５ｔｏｋｅｓλ（
ｒ＋ｍ）　　　　λ（ｎｍ）　　　　（ｎｍ）ＩＶａ　
　　　　　４０６　　　　４７６　　　　７０ＩＶｅ　
　　　　　５２８　　　　５４９　　　　２１１Ｖｆ　
　　　　　４７５　　　　５１１　　　　３６ＩＶｇ　
　　　　　５３１　　　　５８５　　　　５４ＩＶｈ　
　　　　　４６０　　　　４９５　　　　３５ＩＶｉ　
　　　　　３６８　　　　４５２　　　　８４実施例２ 両親媒性の蛍光染料重合体の製造 ５ＩＩＩＪの乾燥クロロフォルム中に塩化メタクリロル
０．５２ｇ（５ミリモル）を含む溶液を、水浴中で冷却
しながら乾燥クロロフォルム１０ｍＡ’中に１．５３ｇ
（５ミリモル）の７−ジニチルアミノー３−（ｐ−アミ
ノフェニル）クマリンおよび０．６１ｇ（５ミリモル）
のトリエチルアミンを含む溶液に滴下する。次いでこの
混合物を０〜５°Ｃにおいて１時間撹拌し、さらに室温
で５時間撹拌する。この混合物を先ず希水酸化ナトリウ
ム溶液で洗滌し、最後に塩がなくなるまで水で洗滌し、
濃縮乾個する。
融点１９３〜１９５℃の下記第２表に詳細に示す式ＶＩ
ａの生成物を理論値の８６％に対応する収率で得た。
！Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ２、内部基準ＴＭＳ）：　ｄ＝
９．４３（ＮＵ）、７．７７〜６．４９（多重シグナル
、芳香族プロトン）；５．８６および５．４７（Ｈ２Ｃ
＝）　：３．４４（−ＣＴ１２ＣＨ３）、２．０４←Ｃ
Ｈ２ＣＨ３）；１、２２（−ＣＨ２Ｃ１９）。
第２表に同様に示した化合物ＶＩｂ−１１１ｆも同様に
製造される。スペクトル・データを第２表に示す。
第 ２ 表 式 ％式％ （） 蛍光染料を含む重合体の製造 ６、７７ｇ（２０ミリモル）のメタクリル酸オクタデシ
ル、４．００ｇ（２０ミリモル）の（２，２−ジメチル
−１，３−ジオキソラン−４−イル）−メチレンメタク
リレートおよび１．５１ｇ（４ミリモル）の実施例２の
染料単量体を９０ｍ１の無水ジオキサンに溶解し、１．
４４ｇ（０，２モル％）のアゾビス（イソブチロニトリ
ル）を加えた後、撹拌しながら６５〜７０℃に加熱し、
この温度に１６時間保つ。冷却後水の中に入れて反応溶
液から重合体を沈澱させる。クロロフォルムに溶解し、
メタノール中で２回沈澱させて重合体を精製した。
黄緑色の重合体３．９３ｇを得た。これはＣ１１２Ｃ１
ｔ中でゲル透過クロマトグラフ法により確認した。屈折
率の測定およびＵＶスペクトル法により同一の分子量分
布曲線が得られ、重合体中に蛍光染料が均一に混入され
ていることが確かめられた。ポリスチレン標準と比較し
て計算された分子量はわが６４ｏｏｏＳｗ、が１．２９
０．０００であり、これは不均一値が１８１であること
に対応している。
この−膜内な製造法によりすべてのメタクリレート共重
合体を製造した。
実施例４ 蛍光染料を含む膜要素の製造 （ａ）重合体染料 フロート・ガラスからつくられたスライドをＨ２Ｏ、／
Ｈ，ＳＯ４で処理して清浄にし、２０℃においてラング
ミア膜バランス（ＫＳＶ　２２００）の水性サブフェー
ズの中に３０ｍｍの深さまで浸漬する。式（ＩＩａ）の
化合物をクロロフォルム中に含む溶液（１ａ＋ｇ／ｍＩ
）１５０μｌを水面に広げる。２５ｍＮ／ｅの表面圧ま
で膜が圧縮された後、スライドを順次出し入れして（浸
漬速度：１９ｍｍ７分）重合体の３層の単分子膜をスラ
イドに移す。この時点で最終の膜は引き出すときに移さ
れる。次いで支持体を空気乾燥する。クロロフォルムで
洗浄して支持体の片側から染料膜を除去する。
（ｂ）分散した単量体染料を含む重合体式（ＩＩａ）の
染料含有重合体の代わりに式（Ｖ）の重合体１ｍｇ／ｍ
ｉｓおよび式（ＩＩｂ）においてＸ＝Ｙ＝０、ｎ＝１８
、Ｒ’＝Ｈ，Ｒ’＝ＲＩ＝Ｃ，、Ｈ，、の両親媒性単量
体染料１ｍｇ／Ｊの１９＝１の混合物を使用した。
（Ｃ）ディスク凝集体をつくる分散した染料を含む重合
体 式（Ｖ）の重合体１ａｇ／ｍｌ、および式（ＩＩＩｂ）
においてＸ＝ＳｅＳＹ’Ｓ、　Ｒ”−Ｒ’＝Ｃ１１ｔｌ
ｓｔ、Ｒ”＝Ｃ１１３の染料１ｍｇ／ｍｌの重量比１：
ｌの混合物を使用した。
実施例５ａ 蛍光染料の膜要素への吸着および蛍光エネルギー伝達の
観測 実施例４でつくった膜要素を、フォスフェート緩衝液中
にフルオレッセインを含む１０−７モルｎ。
ｐＨ７，０の溶液に５分間浸漬する。実験の前後で蛍光
スペクトルを測定した。発光スペクトルはフルオレッセ
インの極大の方へ移動した。
実施例５ｂ 蛍光染料を含む膜要素の製造 水性洗剤溶液中で超音波処理を行って洗浄し、次いで純
水を用いて超音波処理により水洗し、さらに約５Ｘ１０
−２ＮのＮａ１ｌ中で超音波処理を行い（５分間）、５
気圧の圧力下で純水を噴霧した後乾燥することにより洗
滌したガラスの支持体を、デシケータ−中でヘキサメチ
ルジシラザンに露出する（水流ポンプの真空下において
６０℃で３０分間）ことにより撥水性を与える。処理後
ガラスの支持体を短時間水に浸漬し、水から取り出した
後注意して表面の水を拭き取る。ＬＢ法により支持体を
出し入れしてこの支持体に２枚のカドミウムアラキデー
トの膜を移す。
蛍光染料（ＶＩＩ）　＝　（ＩＩＩａ）、ｘ＝ｙ＝ｏ、
Ｉ＋７＝Ｈ，Ｒ’＝Ｒ’＝Ｃｌ８Ｈ３７の膜を順次つく
り、（ｉ）染料単量体として、（１１）染料のディスク
凝集体（Ｊ凝集体）として、異なった構成で転写した。
（ｉ）染料（ＶＩＩ）の単量体 クロロフォルム中に（ＶＩＩ）、メチルアラキデート、
アラキン酸およびヘキサデカンを１＋２：１８：２０の
モル比で含む溶液を水の上に広げて水面上に単分子膜を
つくる。
（ｉｉ）染料（ＶＩＩ）のディスク凝集体（ＶＩＩ）お
よびヘキサデカンを１・１のモル比でクロロフォルム中
に含む溶液を広げ水面上に単分子膜をつくる。
膜要素の以後の製造法は単量体およびディスク凝集体に
対して同じである。表面圧２０ｍＮ／ｍまで膜を圧縮し
１０分間一定の表面圧で貯蔵した後、支持体を単分子膜
に実質的に水平に接触させて膜を支持体に移す。次いで
支持体を完全に水に浸漬し、残った染料膜を除去し、ス
テアリン酸を１０−３モル含むクロロフォルム溶液を広
げ２０ｍＮ／Ｉ１１に圧縮することによりステアリン酸
の単分子膜をつくった。
次いで支持体を垂直に取り出すことにより支持体をステ
アリン酸の膜で被覆した。最後に支持体を実質的に水平
に接触させ完全に浸漬することにより臭化ジオクタデシ
ルジメチルアンモニウムとステアリン酸メチルとのモル
比１：１の混合膜で被覆し、当業界の専門家には公知の
方法で水中においてキュベツト機素を用いて蛍光測定用
のキュベツトを組み立てた［ピー・フロムハーツ（Ｐ、
　Ｆｒｏｍｈｅｒｚ）ビオキミカ・ビオフィジカ・アク
タ誌３２３巻（１９７３年）３２６〜３３４頁参照］。
実施例５Ｃ 実施例５ｂでつくった膜要素を、その表面を空気に露出
することなく水性媒質を取り替えることにより検体（Ｖ
ＩＩＩ）（下記式参照）を含むｐＨ＝７．０．１０−’
モルのフォスフェート緩衝水溶液と接触させる。
染料が膜要素の表面に結合する結果、ディスク凝集体の
場合（ＶＩＩ）の蛍光強度は隣接して存在する溶液中の
検体の濃度および接触させた以後の時間の関数として減
少する。（ＶＩＩＩ）のｌｏ−７モル溶液の場合には、
４０４ｎｍにおける発光強度および３６６ｎｍにおける
励起強度は９０分後に（ＶＩＩＩ）が存在しない場合の
強度の３３％になり、１ｏ−１０モル溶液の場合には８
５％になった。
予想通りステアリン酸の膜の間にステアリン酸カドミウ
ムの二重膜を入れた場合明らかに消光効果の距離依存性
が観測され、これは膜要素の表面から染料膜と接触する
と増大する。この場合（ＶＩＩＩ）の１０−７モル溶液
に対し４０４ｎｍにおけるディスク凝集体からの発光強
度は（ＶＩＩＩ）が存在しない時に観測される強度の９
０％であった。
５１０ｒ＋ｍにおける（ＶＩＩＩ）の蛍光を測定しても
検体（ＶＩＩＩ）が膜要素の表面に結合していることを
検出することができる。４７０ｎｍでは直接励起（検体
の発光）が可能であるが、３６６ｎｍ（単量体）または
４０２ｎｍ（ディスク凝集体）においては（ＶＩＩ）が
励起した後にエネルギー伝達が行われ検体の発光が最大
になる。間接的に励起させエネルギー伝達を行った場合
の蛍光強度（ＩＶＩＩ）と結合した検体の直接励起によ
る蛍光強度（ＩＶＨＩ）の比が増大因子であり、５１０
ｎ■における放出光の励起スペクトルから決定すること
ができる。次の値が見出された。
（ａ）単量体 Ｉｖ＋＋／Ｉ−＝　３、ｍＩＩ）の１０−７モル溶液Ｉ
ｖ、、／１．　＝　３５、（ＶＩＩＩ）の１０−８モル
溶液（ｂ）ディスク凝集体 ｈ＋＋／Ｌ　＝　３８０、ｍＩＩ）（７）１０−”モル
溶液実施例６ 蛍光物質で標識を付けた蛋白質の膜要素への吸着および
蛍光エネルギー伝達の観測 テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴ
Ｃ）で標識を付けたレクチンコン力ナヴアリンＡの溶液
（１＋ａｇ／ｍｊり５０μｌを、実施例４でつくった膜
要素の上に載せ、液が均一に分布しＬＢ膜の上に気泡が
生じないように第２の同じ大きさの未処理のスライドで
押える。１時間の露出を行った後、２枚の支持体を離し
、被覆された支持体をｐＨ６、８，１０ミリモル／ｌの
水性フォスフェート緩衝液で３回洗滌する。次いで蛍光
スペクトルを測定し、蛋白質で処理しなかった膜要素と
比較する。ＴＲＩＴＣの余分なバンドが検出された。染
料を含むＬＢ膜の上に２〜６枚の染料を含まない層を被
覆した場合、このバンドの強度は膜の厚さの関数として
最低０まで減少する。
実施例７（対照例） 別法を使用する膜要素の製造 （ａ）塗布法 クロロフォルム中に重合体（ＩＩａ）を含む（１ｍｇ／
ｍＩ）溶液５０μｌをスライドの上に置く。第２のスラ
イドを用いて染料溶液が第１のスライドの上でできるだ
け均一に塗布されるようにする。次いでこの染料層の上
に実施例６期差意のようにして５０μｌのＴＲＩＴＣ−
ＣｏｎＡを吸着させ、蛍光を測定する。（ＩＩａ）の非
常に強いバンドの他にＴＲＩＴＣの蛍光は明確には検出
できない。
（ｂ）回転被覆法 ０．０１９３〜０．２４４ｍｇの重合体（ＩＩａ）を０
．２５〜１５ｍｌのクロロフォルムまたはジメチルフォ
ルムアミドに溶解し、回転被覆機を用いて直径１０ｃｍ
の洗浄したガラスの支持体の上に被覆する。得られたガ
ラス板の蛍光スペクトルは染料密度が非常に不均一に分
布していることを示し、エネルギー伝達の測定は全く不
可能であった。
実施例８ フェルスター・エネルギー伝達系の限界感度の測定 実施例４でつくられた膜要素（染料供与体）をさらに、
先ず重合体（Ｖ）の２枚の層で被覆し、次いで重合体（
Ｖ）の１枚の層で被覆して一定量の両親媒性受容体染料
が付加されるようにする。この膜要素について蛍光を測
定する。受容体染料の量を変化させ、この物質の蛍光が
尚検出できる限界濃度を決定した。下記の表に種々の系
に対する値を示す。
供与体染料　受容体染料　　限界濃度 ［１０−１５モル／ｍｍ２］ ４ａから　　（Ｃ０８０−ダミン）　　　　　　３４ｂ
から　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３４Ｃか
ら　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３４ｃから
（Ｃ３，アミノフルオレッセイン）３本発明の主な特徴
及び態様は次の通りである。
１、　（ａ）固体の支持体、 （ｂ）　（ａ）に取り付けられた単一層または多層のラ
ングミヤ・プロジェット（ＬＢ）膜、（Ｃ）該ＬＢ膜の
外側の４層の中の少なくとも一つに存在する少なくとも
１種の蛍光染料Ｆ１、（ｄ）該ＬＢ膜の最も外側の層の
中または上に結合または存在する特殊な相互作用をなし
得る分子（レセプター）、 （ｅ）励起バンドがエネルギー伝達を行い得るほど十分
にＦｌの発光バンドと重なっている動き得る蛍光染料Ｆ
２から成り、 （ｅ１）該蛍光染料Ｆ２は、最初はＬＢ膜と結合してい
ないリガンドと共有結合し、該リガンドがレセプターと
結合することができるか、或いは（ｅ２）該蛍光染料Ｆ
２は、最初はＬＢ膜と結合していない他のレセプターと
共有結合し、該レセプターが第１のレセプターおよび最
初はＬＢ膜と結合していないリガンドから成る錯体と結
合することができる蛍光エネルギー伝達に基づく光学的
バイオセンサー ２、使用される固体の支持体はガラス、石英ガラス、ニ
オブ酸リチウム、セレン化亜鉛、磁器、半導体材料、例
えばゲルマニウム、ＧｅＡｓまたは珪素、金属、プラス
チックスまたは金属メツキしたプラスチックスであり、
該固体支持体の表面は変性されていることができる上記
第１項記載のバイオセンサー ３、　ＬＢ膜のマトリックスが重合体である上記第１項
記載のバイオセンサー ４、Ｆ、がマトリックスと共有結合している上記第１項
記載のバイオセンサー ５、染料Ｆ１が両親媒性のマトリックスと共に広げられ
、この際好ましくはディスク凝集体（Ｊｌ集体）をつく
る染料Ｆ、が用いられている上記第１項記載のバイオセ
ンサー ６、染料Ｆ、はＬＢ膜の外側の２枚の層の少なくとも一
つに存在する上記第１項記載のバイオセンサ１、レセプ
ター分子は、好ましくはスペーサー分子を介して最も外
側のＬＢ膜に共有結合している上記第１項記載のバイオ
センサー ８　レセプター分子は疎水性の膜の固定部位を介して最
も外側の膜の上に固定されている上記第１項記載のバイ
オセンサー ９、蛍光染料で標識を付けられているか自身で蛍光を発
するリガンドが、レセプター分子の結合部位に結合して
いるか、或いは蛍光物質で標識を付けられていない検体
が最初レセプター分子の結合部位に結合した、蛍光物質
で標識を付けられたりガントを競合的に移動させる上記
第１項記載のバイオセンサー １０、蛍光染料Ｆ２で標識を付けられ、選択的にレセプ
ターと検体との錯体に結合するか、或いはサンドウィッ
チ検定法におけるレセプターとは異なった検体の分子区
域に結合する第２のレセプター分子が検体溶液に加えら
れている上記第１項記載のバイオセンサー

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）固体の支持体、 （ｂ）（ａ）に取り付けられた単一層または多層のラン
    グミヤ・プロジェット（ＬＢ）膜、 （ｃ）該ＬＢ膜の外側の４層の中の少なくとも一つに存
    在する少なくとも１種の蛍光染料Ｆ＿１、（ｄ）該ＬＢ
    膜の最も外側の層の中または上に結合または存在する特
    殊な相互作用をなし得る分子（レセプター）、 （ｅ）励起バンドがエネルギー伝達を行い得るほど十分
    にＦ＿１の発光バンドと重なっている動き得る蛍光染料
    Ｆ＿２から成り、 （ｅ１）該蛍光染料Ｆ＿２は、最初はＬＢ膜と結合して
    いないリガンドと共有結合し、該リガンドがレセプター
    と結合することができるか、或いは （ｅ２）該蛍光染料Ｆ＿２は、最初はＬＢ膜と結合して
    いない他のレセプターと共有結合し、該レセプターが第
    １のレセプターおよび最初はＬＢ膜と結合していないリ
    ガンドから成る錯体と結合することができることを特徴
    とする蛍光エネルギー伝達に基づく光学的バイオセンサ
    ー。
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