JP2951398B2 - 生体活性物質測定用試薬、その製法及び測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は、免疫測定法による生体活性物質の測定に使
用できる試薬、その製法及びこれら試薬を用いる生体活
性物質の測定方法に関する。

［背景技術］ 従来、医療診断、臨床検査などの研究分野において極
微量成分を検出する方法として、種々の免疫測定法が知
られており、これに関しては色素で標識された試薬、測
定方法、あるいは装置などについて様々な技術が提案さ
れている。

１）標識試薬 標識試薬には、従来、放射性同位元素、発光剤、酵素
で標識された抗原、抗体などが開発されてきた。

この中で、最も感度が高いものは、放射性同位元素で
標識されたものであるが、取り扱いが容易でない。また
酵素で標識されたものは、一部の物質に対してのみ有効
である。このため、発光剤標識試薬の高感度化が望まれ
ている。

このような、発光免疫測定法に使用できる高感度試薬
として特開昭58−61468号には、複数個のルミネセント
が結合した有機高分子化合物と抗体又は抗原のいずれか
と結合した免疫試薬及びそれを用いた免疫定量法が、ま
た米国特許4166105号には、多官能性ポリマー骨格分子
アナライト体と特異的に反応可能な第一反応体（抗体）
で、多数の蛍光染料分子が結合したアナライト体の検出
試薬がそれぞれ提案されている。しかしながら、これら
の試薬は、結合させることができる色素の量が充分では
ないため、長波長で励起される感度の低い色素を用いた
場合には、検出感度が実用的でないという問題がある。

また、特開昭60−252265号には、発光剤が結合した水
溶性有機高分子化合物をアビジンに結合させ、これを用
いた生物学的に活性な物質の測定方法が開示されてい
る。しかしながら、この試薬及び方法は、抗体あるいは
抗原を分子量の小さいビオチンを介してアビジンに結合
させているため、抗体あるいは抗原のまわりに多量のビ
オチンが結合し、免疫活性を減退させる可能性があり、
これを防ぐ処理を講ずる必要があること、また、水溶性
高分子をアビジンに結合させるのは立体障害により結合
させにくいという問題がある。

２）発光免疫分析用光ファイバー 発光免疫分析では、光ファイバーを利用して蛍光色素
（発光剤）を励起したり、蛍光を伝播する方法が有効で
あり、種々の技術が開示されている。

光ファイバーをセンサーとして使用するためには、抗
原、抗体を光ファイバーに固定化する必要があり、この
ための技術として、セロファンなどの膜に抗原、抗体な
どを固定化させる膜固定化法、アクリルアミドゲルなど
の空隙に抗原、抗体などを封じ込める包括法などがある
が、前者は、光散乱による感度低下が、後者は、応答性
が悪いという問題があった。このため、光ファイバーに
直接抗原、抗体などを共有結合させる方法として、Anal
itical Chemistry Vol.59 No.8 p1226〜1230（1987）に
は、石英製光ファイバーの表面のシラノール基にシラン
カップリング剤である（３−グリシドキシプロピル）ト
リメトキシシラン（GOPS）を反応させ、次いでこれをHI
O₂で処理して、石英製光ファイバーの表面にホルミル基
を導入し、このホルミル基に蛋白質のアミノ基を反応さ
せて固定化する方法が開示されている。しかしながら、
この方法は、石英ファイバーにのみ有効な方法であり、
樹脂製光ファイバーには使用できない。樹脂製光ファイ
バーは、値段も安価で、研磨加工しやすく、柔軟であ
り、取り扱いやすいため、樹脂製ファイバーに抗原や抗
体などの蛋白質を結合させる方法が望まれている。

また、光ファイバーを用いた装置としては、特開昭59
−501873号（米国特許4582809）に免疫検定方法及び方
法が、また特開昭62−123358号、特開昭62−501102号
（スイス特許出願5306/84−５号）に光ファイバー型免
疫センサーがそれぞれ提案されている。しかしながら、
これらの明細書には、抗原、抗体の高感度標識を行うた
めの技術は何ら記載されておらず、このため、抗原とし
て、Hgランプ、XeランプやArレーザで励起するような感
度の高い蛍光色素を用いた場合にしか利用できず、ま
た、装置が大型で、高価なものになるという問題があ
る。

３）測定方法 発光剤を使用した免疫測定の方法も種々提案され、例
えば、特開昭60−24450号には、ビオチン−アジビン結
合により免疫複合体に結合した発光剤結合アビジンの発
光反応による発光量を測定する生物学的に活性な物質の
測定方法が提案されている。この方法は発光剤と抗体又
は抗原の間にアビジン−ビオチン結合を介しているが、
他の有機高分子化合物を介していないため、結合できる
色素量が少なく、低感度の色素を使用できないという問
題がある。また、ビオチン−アビジン結合を用いた試薬
としては、特開昭58−30667号（スイス特許出願6989/81
−01号）に標識化された免疫活性物質が提案されてい
る。しかし、この技術は免疫物質が酵素で標識させてお
り、酵素活性を測定するための処理が面倒であるという
問題がある。

［発明の開示］ 本発明者は、鋭意研究した結果、生体活性物質の濃度
を測定する方法において、測定感度をさらに向上させる
ためには、蛋白分子１個あたりの蛍光色素の結合量を増
やす必要があり、このために、生体活性物質を反応活性
基を多数有する化合物に結合させ、各反応活性基に蛍光
色素が多数結合した化合物を結合させることに想達し
た。また、蛍光色素の発する光を効率良く集光し、測定
できるような光ファイバーからなる検出部と、これを具
備する装置、及びこれら試薬と装置を使用した測定方法
の開発に成功した。

（生体活性物質測定試薬） 本発明の生体活性物質測定試薬は、蛍光標識体が複数
の反応活性基を有する化合物に結合し、該複数の反応活
性基を有する化合物の反応活性基には、複数の蛍光色素
で修飾された化合物が結合していることを特徴としてい
る。

本発明で述べるところの蛍光色素とは、光にて励起さ
れる色素を指し、化学発光や生物発光する蛍光色素を意
味しない。前記光は、レーザ光などのコヒーレント光が
望ましい。

前記生体活性物質測定試薬は、複数の反応活性基を有
する化合物の反応活性基の大部分に、複数の蛍光色素で
修飾された化合物が結合した該複数の反応活性基を有す
る化合物を、生体活性物質と結合させることにより、生
体活性物質当りの蛍光色素の結合量を増やすことによ
り、検出感度を飛躍的に向上させるものである。

前記反応活性基としては、アミノ基、チオール基、ヒ
ドロキシル基、カルボキシル基、ホルミル基などが挙げ
られるが、特にアミノ基が望ましい。この理由は、アミ
ノ基は比較的反応活性が高く、生成した結合が安定なた
めである。

また、前記反応活性基は、１分子あたり20〜100000個
存在していることが望ましい。この理由は、20個より少
ない場合は、検出感度の向上が期待できず、100000個よ
り多い場合、このような高分子を溶媒に溶解させること
が困難なためである。前記反応活性基は、１分子当り30
00〜6000個存在していることがより好ましく、4000〜50
00個が好適である。

前記複数の反応活性基を有する化合物は、アミノグル
カンあるいはポリアミノペプチドなどの化合物であるこ
とが望ましい。この理由は、これらの化合物には4000〜
5000個のアミノ基が存在しているためである。

前記アミノグルカンとしては、キトサン、ポリガラク
トサミン、ポリノイラミン酸などを用いることができる
が、キトサンを用いることが好適である。

また、前記ポリアミノペプチドとは、アミノ基を２つ
以上有するアミノ酸がペプチド結合により重合したもの
であって、ポリリジンなどが挙げられる。

本発明で使用する蛍光色素で修飾される化合物は、分
子量1000程度の準高分子（semi−hight molecule）以上
の分子量をもつ天然高分子化合物であることが望まし
い。

天然高分子化合物は比較的容易に入手できるアビジ
ン、プロテインＡ、抗体、ホルモン、ホルモンレセプタ
ーなどが望ましい。

前記複数の反応活性基を有する化合物と生体活性物質
との結合、及び複数の反応活性基を有する化合物の反応
活性基と複数の蛍光色素で修飾された化合物との結合
は、適当な架橋剤を用いることができる。

また、前記化合物は、該化合物と特異的に結合する物
質を介して、前記複数の反応活性基を有する化合物に結
合されていることが好ましい。

例えば、前記化合物が、アビジン、プロテインＡ、抗
体、ホルモン又はホルモンレセプターである場合、それ
ぞれビオチン、抗体、プロテインＡ、ホルモンレセプタ
ー、ホルモンを介して前記複数の反応活性基を有する化
合物と結合し、特に「アビジン−ビオチン」の組合せが
好適である。

前記「アビジン−ビオチン」の組合せを用いた場合
は、アビジンの表面に多数存在するアミノ基に蛍光色素
を結合させる。

また、前記「プロテインＡ−抗体」なる組合せを用い
た場合は、蛍光色素をプロテインＡ、抗体、いずれに結
合させてもよい。

前記アビジンは、分子量約68000の塩基性のアルブミ
ン様の結晶蛋白であって、ビオチンに対して選択的に非
常に高い親和性を持っている。またアビジンは、熱、p
H、化学修飾などに対して安定である上、等電点が10で
あることから、分子表面に多くのアミノ基をもつので、
アビジンは蛍光色素で修飾するのに適する。

アビジンのアミノ基の数は36個で、そのうちビオチン
との結合に寄与するものもあるので、アビジン１分子あ
たり２〜10個の蛍光色素を結合させることが望ましい。

さらに前記修飾アビジンで、ビオチン−複数の反応活
性基を有する化合物−生体活性物質複合体を標識するこ
とにより、本発明の生体活性物質測定試薬が得られる。

また、前記プロテインＡは、黄色ぶどう球菌の細胞壁
の５％を占める分子量42000の蛋白であり、免疫グロブ
リン（抗体蛋白）と高い親和性をもつため、蛍光色素で
修飾されたプロテインＡで、抗体蛋白−複数の反応活性
基を有する化合物−生体活性物質複合体を標識すること
により、本発明の生体活性物質測定試薬が得られる。

前記プロテインＡと抗体は、いずれも被測定物質であ
る生体活性物質と反応しないことが必要である。

このように、複数の蛍光色素で修飾された化合物を結
合させることにより、一つの反応活性基に複数の蛍光色
素を結合させることができ、感度を飛躍的に向上させる
ことができる。

本発明においては、蛍光色素の励起を光により行うこ
とが必要である。

この理由は、光により励起することにより、従来技術
である放射性同位元素による免疫測定（ラジオイムノア
ッセイ）に比べ、遥かに安全な測定ができ、また、化学
発光や生物発光における面倒な発光処理を省略でき、よ
り短時間で精度が高く、再現性のよい測定を実現できる
からである。

前記光は、レーザ光あるいはLED光（発光ダイオー
ド）であることが望ましく、該レーザ光はHe−Neレー
ザ、あるいは半導体レーザであることが望ましい。この
理由は、上記レーザは、XeランプやArレーザに比べ、小
型で、値段も安価なためである。上記半導体レーザを使
用する場合は、SHG素子（第２高調波発生素子；光の波
長を1/2にする素子）と組み合わせることにより、短波
長領域のレーザ光を発信できる。

本発明に使用される蛍光色素は、200〜800nmの光にて
励起されることが望ましい。

この理由は、上記波長より短い波長の場合は、エネル
ギーが高すぎるため化学結合を破壊してしまい、該範囲
より長い波長の場合は、量子収率が低すぎて実用的でな
いからである。

前記蛍光色素としては、ウンベリファロンなどのクマ
リン誘導体、多環芳香族誘導体、ローダミンイソチオシ
アネート、フルオレセインイソチオシナネート、シアニ
ン色素、フィコビリタンパク、ダンシル誘導体、ｏ−フ
タルアルデヒドなどが使用できるが、特にシアニン色素
が好適である。

シアニン色素は、アゾニウムイオンを含む複素環をメ
チン鎖で結合した構造、 例えば、 （式中、Ｙ及びＹ′は、Ｏ、Ｓ、Se、−NH−又は−CH＝
CH−を表し、Ｒ及びＲ′は、メチル、エチル、プロピル
のようなアルキル基または、カルボキシエチルのような
カルボキシアルキル基を表し、Ｘは、ハロゲン原子を表
し、ｎは０〜３の自然数）で表されるものを指す。

これらのシアニン色素は、He−Neレーザ（633nm）
や、現在受信している最も短い波長の半導体レーザ（63
8nm）で励起することができる。

従って、ArレーザやXeランプを用いる場合や、高価な
SHG素子と組み合わせた半導体レーザを使用する場合に
比べて、小型化、低コスト化を図ることができる。

前記シアニン色素としては、特に式（１）で示される
シアニン色素が好適に用いられる。

式中、ｎは０、１、２又は３を表す。特に好ましく
は、ｎは２である。

蛍光色素による標識は、生物活性を有するものが対象
となるため、できるだけ温和な条件で反応が短時間のう
ちに終結し、かつ副反応が起こらないで反応活性基と結
合しうるものであることが必要である。そのために官能
基として共役系外にカルボキシル基をもつ上記式（１）
で示されるカルボシアニン系の色素が好適に使用され
る。

また、前記シアニン色素として、次に示すものも使用
できる。

本発明で使用される生体活性物質は、糖類や蛋白質な
どがあるが、特に蛋白質が望ましい。

前記蛋白質からなる生体活性物質としては、抗原、抗
体、酵素、ハプテン又は酵素阻害剤であることが望まし
い。

本発明の生体活性物質測定試薬は、測定の際に、光フ
ァイバーに結合されて、励起されることが望ましい。

（樹脂製光ファイバー） 本発明の樹脂製光ファイバーは、前記生体活性物質測
定試薬を特異的に結合する物質を共有結合させることの
できる反応活性基を、コア表面に有する樹脂製光ファイ
バーが必要である。

前記光ファイバーが樹脂製である理由は、樹脂製光フ
ァイバーは、価格が安く、ガラス製光ファイバーに比べ
て研磨加工がしやすく、コア径を大きくできるので多く
の光量を伝送でき、かつコア径を大きくしてもフレキシ
ビリティーが保てる特徴がある。特にポリメタクリル酸
メチル製の光ファイバーの場合、560〜560nm付近の波長
領域の伝送性に優れているからである。

前記反応活性基の密度は、1.0×10¹⁶〜6.0×10¹³個/c
m²であることが望ましい。この理由は、前記範囲より密
度が低い場合、樹脂製光ファイバー表面の反応活性基の
絶対数が少なくなり、測定感度が低下するため実用的で
はなく、また、前記範囲より高い場合、蛍光色素が発す
る蛍光の光ファイバーへの透過率が非常に悪くなるため
である。（第７図参照：ポリメタクリル酸メチルの場
合） さらに前記反応活性基の密度は3.0×10¹²〜4.0×10¹³
個/cm²であることが好ましく、1.5×10¹³〜3.5×10¹³個
/cm²であることが好適である。この理由は、前記範囲よ
り密度が高い場合は、反応活性基間の距離が短くなるた
め、前記生体活性物質測定試薬の立体障害のため、再現
性が低下し始めるからである。

前記樹脂製光ファイバーを構成する樹脂は、生体活性
物質を吸収しない材質で透光性のよいものが必要であ
り、例えば、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル、
ポリエステル、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコ
ール、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネー
ト、あるいはこれらの共重合体などが使用できる。

前記樹脂製光ファイバーは、架橋剤と反応するような
構造を有している樹脂を主成分としていることが望まし
い。この理由は、光ファイバーの表面に反応活性基を導
入するための架橋剤を反応させやすいからである。

前記架橋剤と反応するような構造としては、エステル
結合、アミド結合、エステル基、カルボキシル基、ホル
ミル基、アミノ基、ヒドロキシル基、エポキシ基、チオ
ール基などが望ましいが、エステル結合あるいはエステ
ル基などのエステル構造が好適である。

前記架橋剤と反応するような構造あるいは官能基を有
する透光性樹脂としては、ポリアクリル酸エステルある
いはポリエステルなどが好ましい。

前記アクリル酸エステルポリマーは、アクリル酸樹脂
の内、エステル構造を有するものであって、例えばアク
リル酸、メタクリル酸などのエステル誘導体の重合体か
らなる合成樹脂であり、具体的には、アクリル酸メチ
ル、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチルなどの重合
体である。また、前記アクリル酸エステルポリマーの
内、本発明において特に好適に用いられるものは、ポリ
メタクリル酸メチルである。ポリメタクリル酸メチルは
他の樹脂に比べ、透光性がよいからである。

ところで、樹脂製光ファイバーの表面に、蛋白質を結
合させる技術は、特開昭59−501873号（米国特許458280
9号）に、ナイロン製光ファイバーの表面に、架橋剤を
用いて抗原、抗体を結合させた例が記載されている。ま
た、光ファイバーではないが、特開昭56−129841号に
は、ポリメタクリル酸メチルやナイロンの吸光度測定セ
ルの表面に蛋白質を結合させる技術が記載されている。

しかしながら、前者の技術は、透光性が低いナイロン
製光ファイバーを使用しており、本発明者らが試したと
ころ、ナイロンファイバーの伝播損失が大きく、本発明
者らが意図するところの高感度測定は困難であった。

また、後者の技術は、吸高度測定セルに蛋白質を結合
させるもので、光ファイバーに固定化するための技術で
はない。

本発明において用いられる樹脂製光ファイバーは、例
えば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリ
ル酸メチルなどのモノマーとスチレンなどのモノマーと
の共重合体であってもよい。

前記光ファイバー表面の反応活性基としては、ホルミ
ル基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、エ
ポキシ基、チオール基、イソシアナート基、イソチオシ
アナート基などが挙げられるが、ホルミル基が好適であ
る。この理由は、本発明のファイバーに共有結合される
物質は、生体活性物質であり、その活性を低下させない
温和な反応条件が必要であるが、ホルミル基は前記生体
活性物質、特に蛋白質のアミノ基と容易に反応するから
である。

本発明の樹脂製光ファイバーの製造方法を以下に説明
する。

樹脂製光ファイバーの樹脂が架橋剤と反応する構造を
有していない場合は、樹脂に官能基を導入し、架橋剤と
反応する構造を有している場合には、該構造部に適当な
架橋剤を反応させることにより官能基を導入する。

前記架橋剤には、多官能性化合物を用いることが望ま
しく、例えば、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデ
ヒド、アジポアルデヒドなどのジアルデヒド、N,N′−
エチレンビスマレイミド、N,N′−ｏ−フェニレンジマ
レイミド、ビスジアゾベンゼン、あるいはヘキサメチレ
ンジイソシアナートなどのジイソシアナート又はジイソ
チオシナートなどが用いられる。

前記架橋剤を用いた具体的な導入法としては、例え
ば、ポリスチレン製光ファイバーにホルミル基を導入す
る場合、側鎖であるベンゼン環をニトロ化し、次いで還
元を行い、これをアミノ基とした後、グルタルアルデヒ
ドを反応させることによりホルミル基を導入できる。

本発明において、最も好適な生体活性物質測定用樹脂
製光ファイバーは、エステル構造を有する樹脂を主成分
とする樹脂製光ファイバーのコア表面にホルミル基を持
った形態である。

前記生体活性物質測定用樹脂製光ファイバーは、樹脂
製光ファイバーの露出したコア表面に、多官能性化合物
として、ホルミル基を有する求核試薬を反応させて、コ
ア表面にホルミル基を導入することにより製造される。

前記ホルミル基を有する求核試薬として、式（２）で
表される試薬が好適である。

式 （式中R¹およびR²は、それぞれ水素原子、アルキル基又
はホルミル基を表し、ｎは０〜５の整数を表す） 前記式（２）で表される試薬としては、グルタルアル
デヒド、スクシンアルデヒドが挙げられる。

式（２）の試薬は、次の反応式に示すように樹脂（下
記反応式では、ポリメタクリル酸メチル）のエステル基
に求核的に反応する。

前記架橋剤を反応させる場合、光ファイバーのクラッ
ド層を剥離してコア表面を露出させることが望ましい。

この理由は、通常光ファイバーの直径は1mmで、コア
断面の直径は0.97mm位（断面積は0.739mm²）しかないの
で、活性基を多く導入するためには、クラッド層を剥離
してコア表面積を増やす必要があるためである。

前記光ファイバーの端面は、研磨しておくことが望ま
しい。前記研磨は、アルコールを潤滑材とすることが好
ましい。

前記ホルミル基を有する求核試薬は、KOHなどの塩
基、エタノールなどのアルコール系有機溶媒、NiSO₄の
ようなNi塩のエタノール溶液、およびホルミル基を有す
る求核試薬を添加溶解させて調製することが望ましい。

前記KOHなどの塩基の濃度は、50〜100mMが好ましい。

前記Ni塩を加える理由は、Ni塩は反応を促進させると
同時に、ホルミル基の酸化やOH基の付加を防止するから
である。

前記反応試薬に前記樹脂製光ファイバーのコア部分を
浸漬して、エステル構造に反応させるが、反応温度は適
宜調節することが望ましい。

前記反応処理後、水で洗浄し、HClなどの酸に浸漬す
ると、アセタール化したアルコールが脱離して、ホルミ
ル基が結合した樹脂製光ファイバーが得られる。（下記
反応式参照） （測定用検出部） 本発明の生体活性物質測定用の検出部は、前記樹脂製
光ファイバーの反応活性基に被測定物質と特異的に結合
する物質を共有結合させることが必要である。

前記被測定物質と特異的に結合する物質は、蛋白質で
あることが望ましく、抗原、抗体、酵素、ハプテン、酵
素阻害物などが考えられる。

前記樹脂製光ファイバーの反応活性基が、ホルミル基
の場合、被測定物質と特異的に結合する物質を反応させ
た後、固定化処理を行うことが望ましい。この理由は、
固定化処理を行わない場合、被測定物質と特異的に結合
する物質が可逆反応で離脱しやすいからである。

前記固定化処理は、前記被測定物質と特異的に結合す
る物質として蛋白質を選んだ場合について、以下に説明
する。

まず、ホルミル基を導入した樹脂製光ファイバーを蛋
白溶液中に浸漬すると、ホルミル基が蛋白質のアミノ基
と反応して結合部位はイミノ基となる。これを水で洗浄
後、適当な濃度の還元剤、例えばNaBH₄などで処理する
ことにより、イミノ基が還元されて不活性化し、蛋白質
が固定化される。

（下記反応式参照。樹脂はポリメタクリル酸メチル） 本発明の検出部は、第１図に示すようにフローセル５
にて覆われていてもよく、第３図に示すような対向型で
もよく、また、第２図に示すような先端にミラー12のつ
いた反射型でもよい。

前記対向型の場合は、励起光は先端に対向する側から
入射され、蛍光は検出部が取りつけられている光ファイ
バー３を伝播する。一方、反射型は、励起光は検出部が
取りつけられている光ファイバー３を伝播して入射さ
れ、励起光は、先端のミラー12にて反射され、前記光フ
ァイバー３を伝播する。

（生体活性物質測定試薬の製造方法） 本発明の生体活性物質測定用試薬は、種々の有機化学
反応にて製造されるが、本発明の複数の蛍光色素で修飾
された蛋白質を製造するには、蛍光色素と蛋白質とを反
応させて、反応生成物から溶媒を除去した残留物をpHが
２〜７の緩衝液に懸濁させ、未反応色素を分離除去する
ものである。

前記pHが２〜７の緩衝液では、蛍光色素で標識された
蛋白質は溶解するが、未反応の蛍光色素は溶解しないた
め、容易に分離できるからである。

前記緩衝液のpHが２以下の場合は、蛋白質は加水分解
を起こしてしまい、またpHが７以上の場合は、蛍光色素
が溶解してしまうためである。

前記緩衝液のpHは、4.9〜7.0であることが望ましく、
特にシアニン色素で修飾されたアビジンを製造する場合
には、6.5±0.5が好適である。

前記蛍光色素は、塩基性緩衝液に良好な溶解性を示す
酸性蛍光色素であることが望ましい。

前記蛍光色素は、レーザ光で励起されるものであるこ
とが望ましい。

前記蛍光色素としては、前記シアニン色素、フルオレ
セインイソチオシアネートなどが用いられる。

本発明の蛋白質は、種々の蛋白質、例えばネオカルチ
ノスタン、酵素、ホルモンなどが考えられるが、塩基性
蛋白質（PI≧７なる蛋白質）であることが望ましい。こ
の理由は、前記塩基性蛋白質は、疎水性の蛍光色素が結
合していても、前記pHが２〜７の緩衝液中で良好な溶解
性を示すからである。

前記塩基性蛋白質としては、アビジンが好適である。

前記蛍光色素と蛋白質との反応は、ジシクロヘキシル
カルボジイミド、ジ−ｐ−トルオイルカルボジイミドの
ようなカルボジイミド試薬を用いることにより、蛋白質
のアミノ基と蛍光色素の反応活性基とを縮合させる。

反応溶媒は、蛍光色素及び蛋白質を溶解させるもので
あればよく、例えばメタノール、エタノール、メチルア
ミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミ
ンのような有機溶媒又は塩基性水溶液のような溶媒中で
行う。

反応が進みすぎて蛋白質のOH基やSH基と蛍光色素が反
応を起こし、蛋白質の持つ反応特異性（抗原抗体反応
や、蛋白質がアビジンの場合にビオチンに対する反応
性）が失活してしまわないように、必要により酢酸など
を用いて反応を停止させる。

反応終了後、溶媒を減圧下に留去して取り除き乾固さ
せ、pHが２〜７の緩衝液に溶解させる。

未反応の蛍光色素は溶解しないので、適当な分離手段
により、蛍光色素を容易に分離できる。

未反応色素の分離手段としては、遠心分離を行い、上
澄み液をガラスウールを充填した管に通すことにより、
除去できる。

次に、本発明の生体活性物質測定試薬のうち、特異的
に結合する２種類の化合物、化合物Ａと化合物Ｂを含
み、生体活性物質が複数の反応活性基を有する化合物に
結合し、該複数の反応活性基を有する化合物の反応活性
基には化合物Ｂが結合し、該化合物Ｂには複数の蛍光色
素で修飾された化合物Ａが結合したもの（簡略化の為、
以後、蛍光色素−化合物Ａ−化合物Ｂ−複数の反応活性
基を有する化合物−生体活性物質という）は、以下の方
法で製造することが望ましい。

すなわち、化合物Ｂを複数の反応活性基を有する化合
物の大部分の反応活性基に反応させ、複数の反応活性基
を有する化合物を化合物Ｂで修飾した後、生体活性物質
を反応させ、化合物Ｂ−複数の反応活性基を有する化合
物−生体活性物質複合体とした後、蛍光色素で修飾され
た化合物Ａを反応させて、蛍光色素−化合物Ａ−化合物
Ｂ−複数の反応活性基を有する化合物−生体活性物質複
合体を製造する。

上記製造方法が望ましい理由は、反応順序を変えた場
合、副反応がおき、収率が低下してしまうからである。

上記製造方法において、化合物Ａと化合物Ｂの組み合
わせは、蛋白質と該蛋白質と特異的に結合する化合物で
あることが望ましく、具体的には、アビジンとビオチ
ン、プロテインＡと抗体、抗体とプロテインＡなどが好
ましく、特にアビジンとビオチンの組み合わせが最適で
ある。

これらの反応をより具体的に説明する。

複数の反応活性基を有する化合物、例えばキトサン
（Ｉ）は分子中に多数のアミノ基を有しており、キトサ
ン（Ｉ）にビオチン（II）を塩基性溶液中、水溶性カル
ボジイミド（CHMC）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの
ような脱水剤の存在下で反応させると、大部分のキトサ
ンのアミノ基にビオチンが酸アミド結合してビオチン化
キトサン（III）を得る。このビオチン化キトサン（II
I）に生体活性物質である蛋白質を上記と同様の脱水剤
を用いて反応させ、キトサン（Ｉ）の残余の遊離アミノ
基に蛋白質が結合したビオチン化キトサン（IV）を得
る。

一方、蛍光色素で修飾したアビジン（Ｖ）は、蛍光色
素、例えばシアニン色素のカルボキシル基と蛋白質であ
るアビジンのアミノ基とを上記と同様の方法で反応させ
て得ることができる。

次に、上記蛋白質が結合したビオチン化キトサン（I
V）に上記蛍光色素で修飾したアビジン（Ｖ）を反応さ
せると、アビジンはビオチンと選択的に非常に高い親和
力を持って結合し、本発明の蛍光標識蛋白（VI）を得る
ことができる。

上記シアニン色素のカルボキシル基は、アビジンのア
ミノ基と有機溶媒中で、例えばジシクロヘキシルカルボ
ジイミドのような脱水縮合剤を用いて、常法により容易
に縮合させてアミド結合させることができる。シアニン
色素とアビジンとの反応終了後、未反応物はなるべく除
去することが好ましく、例えば透析法、遠心分離法、ゲ
ル過法又は過材を用いる過法などによって除くこ
とができる。

なお、キトサンにビオチンを結合させて形成される酸
アミド結合は、pH6で励起波長225.5nmのとき、450nm、3
00nm及び490nmの各付近に特徴的な蛍光ピークをもつ。

そして、458nmと300nmの蛍光強度の差と酸アミド結合
の濃度間とは、直線関係があるので、この特性を利用し
てキトサンの検量線を作成し、ビオチン化量を酸アミド
結合量から推定できる。

（生体活性物質の測定法） 本発明の生体活性物質測定用試薬を使用した測定方法
について説明する。

本発明の生体活性物質測定用試薬を使用した測定方法
は、次のような方法で行われる。

１）蛍光色素−アビジン−ビオチン−被測定物質又は被
測定物質と特異的に反応する物質からなる複合体を、光
ファイバー上の被測定物質と特異的に結合する物質又は
被測定物質と、特異的に反応させた後、光にて励起し、
蛍光を測定することを特徴とする測定方法。

２）ビオチンが結合した被測定物質又は被測定物質と特
異的に反応する物質を、光ファイバー上の被測定物質と
特異的に結合する物質又は被測定物質と、特異的に反応
させた後、蛍光色素で修飾されたアビジンを反応させ、
光ファイバー上にアビジン−ビオチン結合により複合体
を形成させた後、光にて励起し、蛍光を測定することを
特徴とする測定方法。

３）被測定物質又は被測定物質と特異的に反応する物質
が、複数の反応活性基を有する化合物に結合し、該複数
の反応活性基を有する化合物の反応活性基には、複数の
蛍光色素で修飾された化合物が結合している試薬を、光
ファイバー上の被測定物質と特異的に結合する物質又は
被測定物質と、特異的に反応させた後、光にて励起し、
蛍光を測定することを特徴とする測定方法。

４）互いに特異的に結合する２種類の物質を化合物Ａ、
化合物Ｂとするとき、被測定物質あるいは被測定物質と
特異的に反応する物質が、複数の反応活性基を有する化
合物に結合し、該反応活性基には化合物Ｂが結合してい
る試薬を、光ファイバー上の被測定物質と特異的に結合
する物質又は被測定物質と特異的に反応させた後、蛍光
色素で修飾された化合物Ａを反応させ、光ファイバー上
に化合物Ａ−化合物Ｂの結合により、複合体を形成させ
た後、蛍光色素を光にて励起し、蛍光を測定することを
特徴とする測定方法。

前記測定方法１）について説明する。

前記測定方法１）では、蛍光色素−アビジン−ビオチ
ン−被測定物質又は被測定物質と特異的に結合する物質
からなる複合体を試薬として用いることが必要である。

前記試薬を使用する理由は、蛍光色素で直接被測定物
質又は被測定物質と特異的に反応する物質を標識とする
と、蛍光色素の結合量は限られ、また蛍光色素の結合に
よって被測定物質又は被測定物質と特異的に反応する物
質の結合活性部位が損傷する恐れがある。

このため、前記アビジン−ビオチンを介することによ
り、結合活性部位を損傷することなく、多くの蛍光色素
を結合させることができる。

前記試薬は、光ファイバー上の被測定物質と特異的に
結合する物質又は被測定物質と特異的に反応させた後、
光にて励起させる。

光ファイバー上で励起させるのは、光ファイバーによ
り、励起光と蛍光を伝播でき、効率的な測定が可能であ
るからである。

前記蛍光色素は、シアニン色素であることが望まし
い。

この理由は、シアニン色素は、He−Neレーザ（633n
m）や半導体レーザ（638nm）で励起することができ、装
置の小型化や低コスト化が可能である。

前記シアニン色素をアビジンに結合させるには、でき
るだけ温和な条件で反応が短時間のうちに終結し、かつ
副反応が起こらないで反応活性基と結合しうるものであ
ることが必要であり、そのために官能基として、共役系
外にカルボキシル基をもつ下記式で示されるカルボシア
ニン系の色素が好適に使用される。

（式中、ｎは０、１、２又は３を表す） シアニン色素で修飾されたアビジンを得るには、シア
ニン色素のカルボキシル基と蛋白質のアミノ基を有機溶
媒中で、カルボジイミドのような脱水縮合剤の存在化で
アミド結合を形成させることにより得られる。この際、
未反応の色素は分離する。

本発明において使用される光源は、レーザ光あるいは
LED光であることが望ましい。

前記測定方法は、競合法とサンドイッチ法に大別され
る。

前記競合法は、被測定試料と、蛍光色素−アビジン−
ビオチン−被測定物質からなる濃度既知の試薬を混合
し、そこに、被測定物質と特異的に結合する物質が固定
化された光ファイバーを浸漬し、特異的に反応させた
後、光にて励起し、蛍光を測定する方法である。前記競
合法の場合、光ファイバーには、被測定試料と、蛍光色
素−アビジン−ビオチン−被測定物質からなる試薬が、
それぞれの濃度比に従って結合する。

従って、被測定試料の濃度が高ければ、蛍光色素−ア
ビジン−ビオチン−被測定物質からなる試薬の結合量が
相対的に減り、蛍光強度は低下し、濃度−蛍光強度の検
量線の傾きは負になる。

前記サンドイッチ法は、被測定試料に、被測定物質と
特異的に結合する物質が固定化された光ファイバーを入
れる。前記光ファイバーには、その濃度に従って被測定
物質が結合される。該被測定物質が結合された光ファイ
バーを、蛍光色素−アビジン−ビオチン−被測定物質と
特異的に結合する物質からなる試薬の溶液に浸漬する。
前記光ファイバーには、蛍光色素−アビジン−ビオチン
−被測定物質と特異的に結合する物質からなる試薬が結
合する。

前記サンドイッチ法においては、光ファイバーには、
測定試料と同じ数の蛍光色素−アビジン−ビオチン−被
測定物質と特異的に結合する物質からなる試薬が結合す
る。

従って、被測定試料の濃度が高ければ、蛍光色素−ア
ビジン−ビオチン−被測定物質と特異的に結合する物質
からなる試薬の結合量が増え、蛍光強度は増加し、濃度
−蛍光強度の検量線の傾きは正になる。

次いで測定方法２）について説明する。

前記測定方法２）は、基本的には、測定方法１）と同
様の効果を有するが、この方法では、初めにビオチンが
結合した被測定物質又は被測定物質と特異的に反応する
物質を、光ファイバー上の被測定物質と特異的に結合す
る物質又は被測定物質と、特異的に反応させた後、蛍光
色素で修飾されたアビジンを反応させることが必要であ
る。

この理由は、蛍光色素で修飾されたアビジンを最後に
結合させるため、蛍光色素の加水分解や酸化に伴う蛍光
強度の低下を防止でき、再現性の高い測定を行うことが
できるからである。

前記蛍光色素は、シアニン色素であることが望まし
い。

本発明において使用される光源は、レーザ光あるいは
LED光であることが望ましい。

前記測定方法は、競合法とサンドイッチ法に大別され
る。

前記競合法は、被測定試料と、ビオチン−被測定物質
からなる濃度既知の試薬を混合し、そこに被測定物質と
特異的に結合する物質が固定化された光ファイバーを入
れ、特異的に反応させた後、蛍光色素で修飾されたアビ
ジンを結合させ、光にて励起、測定する方法である。前
記競合法の場合、光ファイバーには、被測定試料と、蛍
光色素−アビジン−ビオチン−被測定物質からなる試薬
が、それぞれの濃度比に従って結合する。

従って、被測定試料の濃度が高ければ、蛍光色素−ア
ビジン−ビオチン−被測定物質からなる試薬の結合量が
相対的に減り、蛍光強度は低下し、濃度−蛍光強度の検
量線の傾きは負になる。

前記サンドイッチ法は、被測定試料に、被測定物質と
特異的に結合する物質が固定化された光ファイバーを入
れる。前記光ファイバーには、その濃度に従って、被測
定物質が結合される。該被測定物質が結合された光ファ
イバーを、ビオチン−被測定物質と特異的に結合する物
質からなる試薬の溶液に浸漬する。前記ファイバーに
は、ビオチン−被測定物質と特異的に結合する物質から
なる試薬が結合する。前記ビオチン−被測定物質と特異
的に結合する物質からなる試薬が結合した光ファイバー
に、蛍光色素で修飾されたアビジンを結合させる。

前記サンドイッチ法においては、光ファイバーには、
測定試料と同じ数の蛍光色素−アビジン−ビオチン−被
測定物質と特異的に結合する物質が結合する。

従って、被測定試料の濃度が高ければ、蛍光色素−ア
ビジン−ビオチン−被測定物質と特異的に結合する物質
の結合量が増え、蛍光強度は増加し、濃度−蛍光強度の
検量線の傾きは正になる。

次いで測定方法３）について説明する。

前記測定方法３）は、被測定物質又は被測定物質と特
異的に反応する物質が、複数の反応活性基を有する化合
物に結合し、該複数の反応活性基を有する化合物の反応
活性基には、複数の蛍光色素で修飾された化合物が結合
している試薬を使用することが必要である。

前記試薬を使用することにより、生体活性物質当りの
蛍光色素の結合量を増やすことができ、検出感度を飛躍
的に向上させることができる。

前記蛍光色素は、シアニン色素であることが望まし
い。

また、前記複数の蛍光色素で修飾された化合物はアビ
ジンであることが好ましく、ビオチンを介して複数の反
応活性基を有する化合物の反応活性基に結合しているこ
とが望ましい。

また、前記複数の反応活性基を有する化合物は、アミ
ノグルカンから選ばれることが望ましく、特にキトサン
が好適である。

また、前記蛍光色素を励起するための光源は、レーザ
光あるいはLED光であることが望ましい。

前記測定方法は、競合法とサンドイッチ法に大別され
る。

前記競合法は、被測定試料と、被測定物質が複数の反
応活性基を有する化合物に結合し、該複数の反応活性基
を有する化合物の反応活性基には、複数の蛍光色素で修
飾された化合物が結合している試薬を混合し、そこに、
被測定物質と特異的に結合する物質が固定化された光フ
ァイバーを浸漬し、特異的に反応させた後、光にて励起
し、蛍光を測定する方法である。前記競合法の場合、光
ファイバーには、被測定試料と、前記試薬とが、それぞ
れの濃度比に従って結合する。

従って、被測定試料の濃度が高ければ、前記試薬の結
合量が相対的に減り、蛍光強度は低下し、濃度−蛍光強
度の検量線の傾きは負になる。

前記サンドイッチ法は、被測定試料に、被測定物質と
特異的に結合する物質が固定化された光ファイバーを入
れる。前記光ファイバーには、その濃度に従って被測定
物質が結合する。該被測定物質を結合した光ファイバー
を、被測定物質と特異的に結合する物質が複数の反応活
性基を有する化合物に結合し、該複数の反応活性基を有
する化合物の反応活性基には、複数の蛍光色素で修飾さ
れた化合物が結合している試薬の溶液に入れる。

前記サンドイッチ法においては、光ファイバーには、
測定試料と同じ数の測定試薬が結合する。

従って、被測定試料の濃度が高めれば、測定試薬の結
合量が増え、蛍光強度は増加し、濃度−蛍光強度の検量
線の傾きは正になる。

次いで測定方法４）について説明する。

前記測定方法は、互いに特異的に結合する２種類の物
質を化合物Ａ、化合物Ｂとするとき、最初に、被測定物
質又は被測定物質と特異的に反応する物質が、複数の反
応活性基を有する化合物に結合し、該反応活性基には化
合物Ｂが結合している試薬を、光ファイバー上の被測定
物質と特異的に結合する物質又は被測定物質と、特異的
に反応させた後、蛍光色素で修飾された化合物Ａを反応
させることが必要である。

このような方法を用いることにより、被測定物質当り
の蛍光色素量を増やすことができ、なお且つ、蛍光色素
の加水分解や酸化に伴い蛍光強度の低下を防止でき、再
現性の高い測定を行うことができるからである。

前記蛍光色素は、シアニン色素であることが望まし
い。

また、前記化合物Ａ、化合物Ｂはそれぞれ、アビジン
−ビオチン、プロテインＡ−抗体、抗体−プロテインＡ
の組合せが望ましく、特にアビジン−ビオチンの組合せ
が好適である。

前記化合物Ａ、化合物Ｂとして用いられる抗体は、被
測定物質と特異反応をおこさないものであることが必要
である。

また、前記複数の反応活性基を有する化合物は、アミ
ノグルカンから選ばれることが好ましく、特にキトサン
が好適である。

また、前記蛍光色素を励起するための光源は、レーザ
光あるいはLED光であることが望ましい。

前記測定方法は、競合法とサンドイッチ法に大別され
る。

前記競合法は、被測定物質と、被測定物質が複数の反
応活性基を有する化合物に結合し、該反応活性基には化
合物Ｂが結合している濃度既知の試薬を混合し、そこ
に、被測定物質と特異的に結合する物質が固定化された
光ファイバーを浸漬し、特異的に反応させた後、蛍光色
素で修飾された化合物Ａを結合させ、光にて励起し、蛍
光を測定する方法である。前記競合法の場合、光ファイ
バーには、被測定試料と前記試薬とが、それぞれの濃度
比に従って結合する。

従って、被測定物試料の濃度が高ければ、試薬の結合
量が相対的に減り、蛍光強度は低下し、濃度−蛍光強度
の検量線の傾きは負になる。

前記サンドイッチ法は、被測定試料に、被測定物質と
特異的に結合する物質が固定化された光ファイバーを浸
漬する。前記光ファイバーには、その濃度に従って被測
定物質が結合する。該被測定物質を結合した光ファイバ
ーを、被測定物質と特異的に結合する物質が複数の反応
活性基を有する化合物に結合し、該反応活性基には化合
物Ｂが結合している試薬の溶液に入れる。前記ファイバ
ーには試薬が結合する。前記被測定物質と特異的に結合
する物質が複数の反応活性基を有する化合物に結合し、
該反応活性基には化合物Ｂが結合している試薬が結合し
た光ファイバーに、蛍光色素で修飾された化合物Ａを結
合させる。

前記サンドイッチ法においては、光ファイバーには、
測定試料と同じ数の試薬が結合する。

従って、被測定試料の濃度が高ければ、試薬の結合量
が増え、蛍光強度は増加し、濃度−蛍光強度の検量線の
傾きは正になる。

（生体活性物質測定装置） 次に装置について説明する。

本発明の装置は、生体活性物質が、複数の反応活性基
を有する化合物に結合し、該複数の反応活性基を有する
化合物の反応活性基には、複数の蛍光色素で修飾された
化合物が結合している前記生体活性物質測定試薬を利用
して生体活性物質を測定するための装置である。

本発明の装置は、少なくとも以下の構成、即ち、小型
光源及び励起光又は蛍光を伝播するための光ファイバー
と、その一方の端面のコア表面を露出させ、その表面に
被測定物質と特異的に結合する物資を固定化した検出
部；検出部で励起された蛍光のみを取り出す機構；並び
に検出部で励起された蛍光の強度を測定するためのフォ
トカウンターからなることを特徴とする。

前記光ファイバーを使用する理由は、光ファイバーに
よって、励起光と蛍光を伝播でき、光損失がなく、効率
の良い測定ができる。

前記光ファイバーは、樹脂製であることが望ましい。
この理由は、樹脂の方が低価格であり、使用しやすいか
らである。

前記樹脂性ファイバーは、架橋剤と反応する構造を有
することが望ましい。この理由は、架橋剤を介すること
により、生体活性物質を共有結合させ、検出部を形成で
きるからである。

前記架橋剤と反応する構造はエステル構造であること
が望ましい。

前記樹脂としては、ポリメタクリル酸メチルなどの
（メタ）アクリル酸エステル樹脂又はポリエステル樹脂
が好適である。

さらに、本発明の検出部には、生体活性物質が複数の
反応活性基を有する化合物に結合し、該複数の反応活性
基を有する化合物の反応活性基には、複数の蛍光色素で
修飾された化合物が結合している生体活性物質測定試薬
が、測定の際に結合されることが必要である。

このような試薬が結合することにより、高感度測定が
可能である。

前記蛍光色素は、シアニン色素であることが望まし
い。この理由は、前記シアニン色素は、He−Neレーザ光
（630nm）や現在発信している最も短波長の半導体レー
ザ（638nm）で励起できるため、大型で高価なXeランプ
やArレーザ又は、高価なSHG素子（光の波長を1/2にする
素子）を使用する必要もないため、安価で小型の装置を
得ることができるからである。

前記検出部は、励起光又は蛍光を伝播する光ファイバ
ーから連結器により、脱着可能であることが望ましい。

前記連結器としては、第３図のようなガイドレールタ
イプが好適である。

本発明の装置の光源は、小型、低価格のものであるこ
とが必要で、He−Neレーザ、半導体レーザ、半導体レー
ザとSHG素子を組み合わせたレーザ、又はLED（発光ダイ
オード）であることが望ましい。

前記蛍光のみを取り出す機構は、ハーフミラーやフィ
ルターなどが考えられるが、フィルターであることが望
ましい。

この理由は、ハーフミラーを用いた場合、光学系を配
置するためのスペースが必要で、小型化しにくいからで
ある。前記ハーフミラーは検出部が反射型の場合に、ま
た前記フィルターは検出部が対向型の場合に主に使用さ
れている。

このため、前記検出部は、対向型であることが好まし
い。

［発明を実施するための最良の形態］ 次に、本発明の実施例を示す。

実施例１ （１）100μの水に3mgのNa₂CO₃と4mgのビオチンを溶
かした。

（２）ついで、1.8μＭのキトサン溶液の2mに前記
（１）で得られた溶液を添加した。

（３）水100μを添加した後、50mgのCHMC（水溶液カ
ルボジイミド）を添加した。さらに撹拌しながら、５時
間〜一晩室温で反応させた。

（４）酢酸を３滴滴下して、反応を停止させた。

（５）ついで、Na₂CO₃0.3g/m及びNaCl 0.3g/mの混
合液4mを加えて、ビオチン化キトサンを沈澱させた。

（６）遠心分離器で沈澱を回収した後、0.3g/mのNaCl
と0.1g/mNa₂CO₃緩衝液で沈澱を洗浄した。

（７）前記（６）で得られた沈澱を10mの10mMのカリ
ウム−リン酸緩衝液（pH＝７）で一晩、４℃で透析して
ビオチン化キトサンを得た。

（８）前記ビオチン化キトサンの懸濁液に抗IgG（抗体
Ｙ）溶液と、CHMCを添加して、４℃で１夜反応させた。
反応終了後、12時間透析を行い、さらに、陰イオン交換
カラムを用いて未反応物を除去し、抗体が結合したビオ
チン化キトサンを得た。

（９）アビジン1mg及びトリエチルアミン0.2mを1m
のエタノールに溶解させた。次いで、2mgのNK1160（日
本感光色素研究所製；前記式（１）においてｎ＝２のシ
アニン色素）を加えて充分に溶解させ、溶液を作成し
た。さらに前記溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド
14mgを加えて、室温で４時間反応させた。

（10）反応終了後、エバポレータでエタノールとトリエ
チルアミンを減圧除去した。

（11）前記（10）の工程で生じた残留物を、0.01M酢酸
緩衝液（pH＝6.5）2mに懸濁した後、遠心分離器を用
いて5000rpmで10分間遠心分離を行って、上澄みを採取
し、再度遠心分離にかけてNK1160で修飾されたアビジン
の溶液を得た。

（12）ポリメタクリル酸メチルを主成分とする直径1mm
の樹脂製光ファイバー（三菱レイヨン製、商品名：エス
カ）の先端を酢酸エチルに浸して拭きとり、クラッド層
を1cm剥離し、水洗した。ついで、光ファイバーの端面
をエタノールを潤滑剤としてポリシングフィルムで研磨
した。

（13）0.5mの水に10mgのNiSO₄を溶解させ、次いでエ
タノール2.5mを加えた。この時、白色沈澱が生ずるた
め、これを3000rpmで遠心分離して上澄液を採取し、こ
れのNi−エタノール溶液とした。

50mM水酸化カリウム−エタノール溶液0.4mにNi−エ
タノール溶液0.1mを加え、さらに50％グルタルアルデ
ヒドを50μ添加し反応溶液とした。

（14）前記（13）で調製した反応溶液に前記（12）の樹
脂製光ファイバーを50℃で10分間浸漬した後水洗した。

（15）対で、20mMの塩酸溶液に５〜10分浸漬した後、水
で洗浄し、樹脂製光ファイバーのコア部分表面にホルミ
ル基を導入した。

第６図（ｂ）には上記方法にて、光ファイバーの表面
にホルミル基を導入した場合の、処理温度と、固定可能
な酵素（蛋白質）量との関係、及び第６図（ａ）には処
理温度とファイバーの光伝送率との関係を示す。

また、ホルミル基のファイバー表面上の密度と、光伝
送減少率の関係を第７図に示す。

ポリメタクリル酸メチル製光ファイバーは、熱処理す
ると光伝送率が向上するが、反応温度が高くなると、結
合するホルミル基の密度が増えるため、光伝送率が低下
する。このため、第６図（ａ）に示すように、最も好適
な温度は、50℃付近となる。

（16）バチルス属16−3F株が産生する耐熱性α−アミラ
ーゼに対するモノクローナル抗体であるマウスIgG抗原
４ 1mgをりん酸緩衝生理食塩水（pH＝7.5）に溶かし
た。この溶液に樹脂製光ファイバーを４℃で12時間浸漬
した。

（17）樹脂製光ファイバーを溶液から取り出し、水で洗
浄した後、１％NaBH₄水溶液に15分間浸漬した後、水で
洗浄してマウスIgG抗原４を固定化し、抗原固定化セン
サーとした。

（18）上記のようにして製造した樹脂製光ファイバーを
検出部とした。

（19）濃度既知の抗マウスIgG（Ｙ）溶液を（18）で作
成した検出部５に浸漬した後、リン酸緩衝生理食塩水を
通して洗浄した。

（20）次に、前記（８）で得た抗体が結合したビオチン
化キトサン溶液に検出部５を浸漬した後、リン酸緩衝生
理食塩水を通して洗浄した。

（21）次に、前記（11）で得られたNK1160で修飾された
アビジン溶液を検出部５に浸漬した後、リン酸緩衝生理
食塩水を通して洗浄した。

（22）次に、第４図に示す本発明の装置にてHe−Neレー
ザ光学系で蛍光を分光光度計８を用いて測定した。

（23）抗マウスIgG（Ｙ）の濃度を変え、前記（18）〜
（22）と同様の測定を繰り返し、抗マウスIgG（Ｙ）の
濃度と蛍光強度の関係を調べ検量線を作成した。これ
を、第８図の（ａ）に示す。また、センサーの応答性を
第９図に示す。

検量線から、検出限界を測定し、これを第１表に示し
た。

実施例２ （１）実施例１の（１）〜（18）と同様の方法により抗
体が結合したビオチン化キトサン溶液、NK1160で修飾さ
れたアビジン溶液、抗原固定化センサー及び検出部を作
成した。

（２）濃度既知の抗マウスIgG（Ｙ）溶液と前記（１）
で作成した抗体が結合したビオチン化キトサン溶液を1:
1の割合で混合し、第１図に示すフローセル５に通した
後、リン酸緩衝生理食塩水を通して洗浄した。

（３）次に前記（１）で作成したNK1160で修飾されたア
ビジン溶液をフローセル５に通した後、リン酸緩衝生理
食塩水を通して洗浄した。

（４）次に、前記実施例１の（22）及び（23）と同様の
方法にて抗マウスIgG（Ｙ）の濃度と蛍光強度の関係を
調べ、検量線を作成した。検量線を第８図（ｂ）に示
す。

検量線から検出限界を測定し、これを第１表に示し
た。

実施例３ （１）100μの水に3mgのNa₂CO₃と4mgの抗体蛋白を溶
かした。

（２）次いで、1.8μＭのβ−1,4−ポリガラクトサミン
溶液の2mに前記（１）で得た溶液を添加した。

（３）水100μを添加した後、50mgのCHMC（水溶液カ
ルボジイミド）を添加した。さらに撹拌しながら一晩４
℃で反応させた。

（４）次いでNa₂CO₃0.3g/m及びNaCl 0.3g/mの混合
液4mを加えて抗体蛋白が結合したβ−1,4−ポリガラ
クトサミンを沈澱させた。

（５）遠心分離機で沈澱を回収した後、0.3g/mのNaCl
と0.1g/mのNa₂CO₃緩衝液で沈澱を洗浄した。

（６）前記（５）で得られた沈澱を10mの10mMのカリ
ウム−リン酸緩衝液（pH＝７）に懸濁し、１晩４℃で透
析して、抗体蛋白が結合したβ−1,4−ポリガラクトサ
ミンを得た。

（７）前記抗体蛋白結合β−1,4−ポリガラクトサミン
懸濁液に、抗マウスIgG（Ｙ）溶液と、CHMCを添加し
て、４℃で１夜反応させた。反応終了後、12時間透析を
行い、さらに、陰イオン交換カラムを用いて未反応物を
除去し、抗体蛋白結合β−1,4−ポリガラクトサミンを
得た。

（８）プロテインA1mg及びトリエチルアミン0.2mを1m
のエタノールに溶解させた。次いで、2mgのNK1160
（日本感光色素研究所製）を加え、充分に溶解させ、溶
液を作成した。さらに前記溶液にジシクロヘキシルカル
ボジイミド14mgを加えて、室温で４時間反応させた。

（９）反応終了後、エバポレータで溶媒を除去した。

（10）前記（９）の工程で生じた残留物を、0.01M酢酸
緩衝液（pH＝6.5）2mに懸濁した後、遠心分離機を用
いて5000rpmで10分間分離を行って、上澄みを採取し、
再度遠心分離にかけてNK1160で修飾されたプロテインＡ
の溶液を得た。

（11）前記（８）で得た抗体蛋白結合β−1,4−ポリガ
ラクトサミンと、前記NK1160で修飾されたプロテインＡ
とを、リン酸緩衝生理食塩水中４℃で反応させ、シアニ
ン色素−プロテインＡ−抗体蛋白−β−1,4−ポリガラ
クトサミン−抗体 の複合体溶液を得た。

（12）実施例１の（13）においてグルタルアルデヒドの
代わりに、スクシンジアルデヒドを用い、ポリメタクリ
ル酸メチル製光ファイバーの代わりに、ポリエステルを
含有する光ファイバーを使用し、実施例１の（12）〜
（18）と同様の方法にて第１図に示す検出部を作成し
た。

（13）濃度既知の抗マウスIgG（Ｙ）溶液と、前記（1
2）で得たシアニン色素−プロテインＡ−抗体蛋白−β
−1,4−ポリガラクトサミン−抗体 の複合体溶液を1:1の割合で混合し、第１図に示すフロ
ーセル５を通し、次いでリン酸緩衝生理食塩水を通して
洗浄した後、第５図に示す本発明の装置にてHe−Neレー
ザ光学系で蛍光を分光蛍光光度計８で測定した。抗マウ
スIgG（Ｙ）の濃度を変え、同様の測定を繰り返して抗
マウスIgG（Ｙ）の濃度と蛍光強度の関係を調べ、検量
線を作成した。検量線から検出限界を測定し、これを第
１表に示した。

実施例４ （１）実施例１の（１）〜（８）と同様の方法にて抗体
が結合したビオチン化キトサン溶液を作成した。

（２）アビジン1mg及びフルオレセインイソチオシアナ
ート1.8mgを、0.5M炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（pH＝9.0）からなる塩基性溶媒5mに溶解さ
せ、４℃で光を遮断して撹拌を続け、20時間反応させ
た。

（３）次いで反応液は、エバポレーターを用いて減圧下
で溶媒を留去した。

（４）この残留物、0.05Mのリン酸緩衝液（pH＝4.0）の
5mに懸濁させた。

（５）5000rpmで10分間遠心分離を行い、未反応色素を
除去して上澄みを採取した。

（６）上記（３）及び（４）の操作をさらに２回繰り返
し、さらに得られた上澄みをガラスウールを充填した管
に通して未反応色素を除去し、フルオレセインイソチオ
シアナートで修飾されたアビジンを得た。

（７）実施例１の（12）〜（18）と同様の方法にて抗原
固定化センサー及び検出部を作成した。

（８）濃度既知の抗マウスIgG（Ｙ）溶液を第１図に示
すフローセル５に通した後、リン酸緩衝生理食塩水を通
して洗浄した。

（９）次に、（１）で得た抗体が結合したビオチン化キ
トサン溶液をフローセル５に通した後、リン酸緩衝生理
食塩水を通して洗浄した。

（10）次に、（６）で得たフルオレセインイソチオシア
ナートで修飾されたアビジンの溶液をフローセル５に流
した後、リン酸緩衝生理食塩水を通して洗浄した。

（11）次に、第４図に示す本発明の装置にて半導体レー
ザと薄膜導波路型SHG素子を組み合わせたレーザ光学系
（波長490nm）と分光光度計８を用いて蛍光を測定し
た。

（12）抗マウスIgG（Ｙ）の濃度を変え、前記（８）〜
（11）と同様の測定を繰り返し、抗IgG（Ｙ）の濃度と
蛍光強度の関係を調べ検量線を作成した。

検量線から検出限界を測定し、これを第１表に示し
た。

実施例５ 本発明は、基本的には、実施例１と同様であるが、
（11）の処理を行った後、0.17g/mの飽和硫酸ナトリ
ウム（溶媒:10mMカリウムリン酸緩衝液、pH＝７）4m
を加え、2000rpmで10分遠心分離し、４℃で１時間放置
した。

得られた沈澱を10mMカリウムリン酸緩衝液に懸濁し
た。

遠心分離で硫酸ナトリウム結晶を除去し、上澄液を透
析して濃縮して使用した。

検量線から検出限界を測定し、これを第１表に示し
た。

実施例６ 実施例１の（１）で得た溶液にさらに、50mgのCHMCを
加えて溶かし、12℃で２時間放置し、この溶液を用い
て、実施例１の（２）以降の処理を行った。検量線から
検出限界を測定し、これを第１表に示した。

実施例７ 本実施例は、実施例１のキトサンの代わりに、ポリリ
ジンを使用した。反応条件は実施例１の条件に準ずる。
検量線から検出限界を測定し、これを第１表に示した。

実施例８ （１）実施例１の（９）〜（11）の処理で、得られたNK
1160で修飾されたアビジンの溶液を得た。

（２）実施例１の検出部をマウスIgG（抗原）溶液に４
℃で12時間浸漬した。

（３）ついで、洗浄して、１％のNaBH₄で処理して、抗
原を固定化した。

（４）濃度既知の抗マウスIgG溶液に検出部を浸漬、リ
ン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。

（５）ビオチン化された抗体溶液に検出部を浸漬し、洗
浄した。

（６）ついで、（１）の溶液に検出部を浸し、洗浄して
から第１図の装置で測定した。

（７）このような操作を繰り返し、第６図（ｃ）の検量
線を作成し、これから検出限界を測定し、これを第１表
に示した。

実施例９ 実施例７の（１）の溶液と、ビオチン化抗体を反応さ
せて検出試薬を作成し、この試薬と、濃度既知の抗マウ
スIgG溶液を1:1の割合で混合し、実施例７の検出部を浸
漬し、測定を行い検量線を作成し、これから検出限界を
測定し、これを第１表に示した。

実施例10 （１）実施例１の（９）〜（11）の処理を施し、NK1160
で修飾されたアビジンの溶液を得た。

（２）前記（１）の溶液と、実施例１の（８）と同様に
して得られた抗IgG結合のキトサン溶液を混合して、グ
ルタルアルデヒドを加え、カルボジイミドの存在下、50
℃で加温することにより、アビジンのアミノ基のキトサ
ンのアミノ基をグルタルアルデヒドで架橋して、NK1160
−アビジン−（グルタルアルデヒド）−キトサン−抗Ig
Gの溶液を得た。

（３）ポリスチレン製光ファイバーに、塩化アルミニウ
ムの存在下、ギ酸無水物を反応させ、ポリスチレンのフ
ェニル基にホルミル基を導入し、次いで、1,6−ヘキサ
ンジアミンをカルボジイミドの存在下にて反応させた
後、１％のNaHB₄で還元した。

次いで、マウスIgGをカルボジイミドの存在下で脱水
縮合させ、検出部５を作成した。

（４）前記（２）の溶液と、前記（３）の検出部を用い
て、実施例２と同様に、競合法にて測定した。

検量線から検出限界を測定し、これを第１表に示し
た。

実施例11 本発明の装置の実施例を第１図から第５図に示す。

第１図は、光ファイバー１の表層部のクラッド層２を
排除し、露出したコア部表面３に抗原４を結合させると
ともに、前記コア表面部３をフローセル５で囲んだ構造
を有する検出部である。

第２図は、反射型の検出部であり、先端にミラー12が
設けられている。

第３図は、対向型蛍光検出器の構造を示したものであ
る。蛍光検出部（センシングチップ）９が光軸合わせの
ためのガイド11でとめられており、接着されていないの
で蛍光検出部９を自由に着脱でき、実用上非常に都合が
よい。この蛍光検出部９は、測定の度に交換することか
ら、コスト面から考えて、樹脂製光ファイバーであるこ
とが望ましい。前記樹脂製光ファイバーには、種々の方
法にて反応活性基を導入する。前記樹脂製光ファイバー
は、ポリアクリル酸エステルなどのエステル構造を持つ
ものが好ましく、前記蛍光検出部を樹脂製光ファイバー
で作成する場合には、このエステル基に＞CH−CHO構造
をもつ化合物を塩基性条件下で反応させ、ホルミル基を
導入し、このホルミル基に抗原あるいは抗体などの蛋白
質を結合させる。

励起光は、検出面に対向しているファイバーから放射
される。

第４図に示す装置では、プレート側10から蛍光検出部
９へレーザ光が入射し、入射光と蛍光が光軸合わせのた
めのガイド11を有するプラスチックファイバーへ入射
し、フィルター７にて、蛍光のみが取り出され、分光光
度計８で測定が行われる。

第５図は、フローセル型の検出器を用いた場合の装置
を示す。

［産業上の利用可能性］ 本発明の生体活性物質測定試薬は、医療診断において
血液又は体液中に極微量含まれている抗原、抗体、酵素
などの生体活性物質の免疫測定法を用いることができ、
生体活性物質１個当たりの蛍光色素量が多いため、検出
感度を大幅に向上させることができる。

また、本発明の生体活性物質測定用光ファイバーは、
小型、低価格、高感度を実現できる。

これら、生体活性物質測定試薬と装置を使用した本発
明の測定方法により、短時間で、簡便な測定を実現でき
るため、医療分野における疾病診断などに利用できる。

［図面の簡単な説明］ 第１〜３図は蛍光標識法による蛍光検出部を示す。

第４、５図はHe−Neレーザ又は半導体レーザを使用す
る蛍光測定系を示す。

第１〜３図中、実線の矢印はレーザ光、点線の矢印は
蛍光を示す。

第６図（ａ）は、処理温度とポリメタクリル酸メチル
製光ファイバーの光伝送率の関係を示す。

第６図（ｂ）は、処理温度と結合可能な酵素量との関
係を示す。（ａ）及び（ｂ）図の横軸は処理温度（ｃ
゜）、（ａ）図の縦軸はファイバーの光伝送率（％）、
（ｂ）図の縦軸は面積当りの酵素固定化量（μg/c
m²）、（ｃ）図の横軸はビオチン化抗マイス抗体濃度
（mg/m），縦軸はカウント数を示す。

第６図（ｃ）は、ビオチン化抗マウス抗体濃度と蛍光
強度の検量線を示す。

第７図はポリメタクリル酸メチル製光ファイバーの光
伝送率とホルミル基の密度の関係を示す。横軸はホルミ
ル基の数（個/cm²）、縦軸はファイバーの光伝送減少率
（％）を示す。

第８図（ａ）はサンドイッチ法、（ｂ）は競合法の検
量線を示す。横軸は抗マウスIgG（mg/m）、縦軸はカ
ウント数を示す。

第９図は、センサーの応答性を示す。横軸は抗マウス
IgG（10^-3mg/m）への浸漬時間（分）、縦軸はカウン
ト数を示す。

１は光ファイバー、２はクラッド層、３はコア表面、
４は抗原、５はフローセル、 は本発明の蛍光標識抗体、Ｙは試料中の抗体、６はHe−
Neレーザ発生装置又は半導体レーザとSHG素子を組み合
わせたレーザ発生装置、７はフィルター、８は分光蛍光
光度計、９はセンシングチップ、10はプレート、11は光
軸合わせのためのガイドレール、12はミラー、13はハー
フミラー。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 特願平1−314404 (32)優先日 平１(1989)12月５日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 前置審査 (56)参考文献 特開 昭64−47952（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−81560（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−169500（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−289001（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−88155（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/532 - 33/535 G01N 33/548

Claims (19)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生体活性物質が、アミノグルカンに結合
   し、該アミノグリカンのアミノ基には、複数の蛍光色素
   で修飾されたアビジンが結合していることを特徴とする
   生体活性物質測定試薬。
2. 【請求項２】前記アビジンが、ビオチンを介して該アミ
   ノグルカンのアミノ基に結合している、請求項１に記載
   の試薬。
3. 【請求項３】前記アミノグルカンが、キトサンである、
   請求項１又は２に記載の試薬。
4. 【請求項４】前記蛍光色素が、レーザ光により励起され
   る色素である、請求項１又は２に記載の試薬。
5. 【請求項５】前記蛍光色素が、200nm〜800nmのレーザ光
   で励起される蛍光色素である、請求項１又は２に記載の
   試薬。
6. 【請求項６】前記蛍光色素が、クマリン誘導体、多環芳
   香族誘導体、ダンシル誘導体、フィコビリタンパク、ロ
   ーダミン、フルオレセイン又はｏ−フタルアルデヒドで
   ある、請求項１又は２に記載の試薬。
7. 【請求項７】前記蛍光色素が、シアニン色素である、請
   求項１又は２に記載の試薬。
8. 【請求項８】前記シアニン色素が、 式 （式中、ｎは０、１、２又は３を表す） で表される色素である、請求項７に記載の試薬。
9. 【請求項９】前記生体活性物質が、蛋白質である、請求
   項１又は２に記載の試薬。
10. 【請求項１０】前記生体活性物質が、抗原、抗体、酵
    素、ハプテン又は酵素阻害剤である、請求項１又は２に
    記載の試薬。
11. 【請求項１１】ビオチンをアミノグルカンのアミノ基に
    反応させた後、生体活性物質を反応させ、ビオチン−ア
    ミノグルカン−生体活性物質の複合体とした後、複数の
    蛍光色素で修飾されたアビジンを反応させることを特徴
    とする、蛍光色素−アビジン−ビオチン−アミノグルカ
    ン−生体活性物質の複合体である生体活性物質測定試薬
    の製造方法。
12. 【請求項１２】前記蛍光色素が、レーザ光により励起さ
    れる色素である、請求項11に記載の製造方法。
13. 【請求項１３】前記蛍光色素が、シアニン色素又はフル
    オレセインである、請求項11に記載の製造方法。
14. 【請求項１４】被測定物質又は被測定物質と特異的に反
    応する物質が、アミノグルカンに結合し、該アミノグル
    カンのアミノ基には、複数の蛍光色素で修飾されたアビ
    ジンが結合している試薬を、光ファイバー上の被測定物
    質と特異的に反応する物質又は被測定物質と特異的に反
    応させた後、光にて励起し、蛍光を測定することを特徴
    とする生体活性物質の測定方法。
15. 【請求項１５】前記アビジンが、ビオチンを介してアミ
    ノグルカンのアミノ基に結合している、請求項14に記載
    の測定方法。
16. 【請求項１６】被測定物質又は被測定物質と特異的に反
    応する物質がアミノグルカンに結合し、該アミノグルカ
    ンのアミノ基にはビオチンが結合している試薬を、光フ
    ァイバー上の被測定物質と特異的に反応する物質又は被
    測定物質と特異的に結合させた後、蛍光色素で修飾され
    たアビジンを反応させ、上記光ファイバー上にアビジン
    −ビオチンの結合により複合体を形成させた後、蛍光色
    素を光にて励起し、蛍光を測定することを特徴とする生
    体活性物質の測定方法。
17. 【請求項１７】前記アミノグルカンが、キトサンであ
    る、請求項14ないし16のいずれか１項に記載の測定方
    法。
18. 【請求項１８】前記蛍光色素が、シアニン色素である、
    請求項14ないし16のいずれか１項に記載の測定方法。
19. 【請求項１９】前記光が、レーザ光である、請求項14な
    いし16のいずれか１項に記載の測定方法。