JPS6116945B2 - - Google Patents

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JPS6116945B2
JPS6116945B2 JP55104786A JP10478680A JPS6116945B2 JP S6116945 B2 JPS6116945 B2 JP S6116945B2 JP 55104786 A JP55104786 A JP 55104786A JP 10478680 A JP10478680 A JP 10478680A JP S6116945 B2 JPS6116945 B2 JP S6116945B2
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NIPPON KOTAI KENKYUSHO KK
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Priority to CH4939/81A priority patent/CH658132A5/de
Priority to FR8114853A priority patent/FR2487984B1/fr
Priority to ES504989A priority patent/ES8302315A1/es
Priority to US06/288,445 priority patent/US4571382A/en
Priority to GB8123381A priority patent/GB2083623B/en
Priority to NL8103606A priority patent/NL8103606A/nl
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Publication of JPS6116945B2 publication Critical patent/JPS6116945B2/ja
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y10S436/813—Cancer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/827—Lectins

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は哺乳動物の体液中の癌関連糖側鎖物
質、すなわち、未分化細胞、特に腫瘍や癌細胞の
増殖に伴つて増加するガラクトース−（β１→３
又はβ１→４）−Ｎ−アセチルグルコサミン又は
ガラクトース−（β１→３又はβ１→４）−Ｎ−ア
セチルガラクトサミン側鎖〔以下、これらの側鎖
を「TAG」と称する〕を末端に有する糖蛋白、
糖ペプタイド、糖脂質又は（及び）糖を含む癌関
連糖側鎖物質〔以下、「TAG物質」と称する〕の
TAGの定量する方法に関する。
従来、癌を診断する方法として、癌患者におい
て特異的に産生される特異糖蛋白を測定する方法
が行なわれている。この方法は主としてその蛋白
部の抗原性を利用する方法で、例えばα１−フエ
トプロテインの測定による原発生肝癌の診断、あ
るいはCEAの測定による消化器系、特に直腸癌
の診断等が知られている〔医学のあゆみ；106
巻、５号、第５土曜特集、235〜250頁（1978
年）〕。しかし、これらの方法は癌の種類が比較的
限られている欠点があり、広範な種類の癌の診断
法が望まれている。
ところで、これまで、癌関連糖側鎖の糖残基結
合特異性を利用する癌の診断法については、未だ
知られていない。
本発明者は、癌患者の体液中には、未分化細胞
（主として癌細胞）によつて産生され体液中に放
出されるTAG物質が存在するこを、しかもこれ
は分化細胞（主として正常細胞）によつて産生さ
れ体液中に放出される糖構造とはその糖鎖部分の
構造、長さ、構成糖残基にかなりの違いを有して
いることに着目し、鋭意研究を重ねた結果、この
TAG物質はガラクトース−（β１→３又はβ１→
４）−Ｎ−アセチルグルコサミン末端又はガラク
トース−（β１→３又はβ１→４）−Ｎ−アセチル
ガラクトサミン末端をする糖蛋白、糖ペプタイ
ド、糖脂質又は（及び）種類を含み、このTAG
はレクチンと特異的に結合すること、従つて体液
中のTAG物質のTAGをレクチンと反応せしめて
これを測定することにより癌細胞の有無、増殖度
合、消長等を知り、これによつて癌を診断するこ
とができることを見出し、本発明を完成した。
従つて、本発明は体液中のTAG物質のTAGを
競合法又はサンドイツチ法で測定する方法を提供
するものである。
本発明の目的は次に示す何れかの方法によつて
達成される。
測定しようとする体液中のTAG物質（以
下、測定物質と称する）と、ガラクトース−
（β１→３又はβ１→４）−Ｎ−アセチルグルコ
サミン、ガラクトース（β１→３又はβ１→
４）−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びTAGを
末端に有する糖誘導体から選ばれるTAG様物
質の不溶化物の一定量とを、標識剤で標識され
たレクチン（以下、標識レクチンと称する）の
一定量と競合反応させ、次いで不溶化TAG様
物質と標識レクチンとの結合体及び非結合標識
レクチンを分離し、その何れか一方の標識剤活
性を測定して測定物質を定量する。
測定物質と一定量の標識剤で標識された
TAG様物質（以下、標識TAG様物質と称す
る）を、一定量のレクチン又は不溶化されたレ
クチン（以下、不溶化レクチンと称する）と競
合反応させ、次いで標識TAG様物質とレクチ
ン又は不溶化レクチンとの結合体及び非結合標
識TAG様物質を分離し、その何れか一方の標
識剤活性を測定して測定物質を定量する。
測定物質と不溶化レクチンとを反応させて
TAG物質−不溶化レクチン複合体を形成さ
せ、この複合体に標識レクチンの一定量を反応
させ、次いで複合体と標識レクチンの結合体及
び非結合標識レクチンを分離し、その何れか一
方の標識剤活性を測定して測定物質を定量す
る。
本発明で使用される体液としては各種の体液が
使用でき、例えば血液、細胞組織液、リンパ液、
胸水、腹水、羊水、胃液、尿、膵液、髄液、唾液
等が挙げられる。就中特に血液を血清また血漿と
して使用するのが好ましい。定量に用いられる体
液の量は１〜10ml程度好ましくは２〜５ml程度採
取すればよい。この体液は、更に精製して、糖蛋
白、糖ペプチド、糖脂質又は（及び）糖類等の糖
側鎖を含んだ物質を分離して使用してもよい。
体液から糖側鎖を多く含んだ物質を得る方法と
しては、既に公知の糖側鎖の抽出又は分離手段、
例えば塩析、沈澱、抽出、遠心分離、透析、分子
篩法、酵素の失格あるいはこれらを適宜組合せる
方法が使用される。更に詳細には、例えば血清又
は血漿にスルホサリチル酸、トリクロロ酢酸、硫
酸亜鉛を添加するか、加熱後沈澱物を去する方
法によつてアルブミン、免疫グロブリン等を除去
し、次いでこれを透析することによつて当該分画
を調製する。
本発明の定量法において、採取された体液のう
ち、血液以外のものはそのまま被検試料（以下
「試料」と略記）として用いることができるが、
試料が変性することを防止し、かつレクチンとの
反応を促進させるために、保護蛋白として、牛血
清アルブミン（BSA）等の低級糖含有物をもつ
た蛋白を加えてもよい。更に試料からアルブミン
や免疫グロブリン等を除去した後、適当量の保護
蛋白を加えるのがよい結果を与える場合がある。
また特に、血液の場合は公知の血清採取法によつ
て得られた血清、あるいはヘパリン、EDTA、ク
エン酸等の抗凝固剤を用いる血漿採取法によつて
得られた血漿を試料として用いることができる
が、特にヘパリンを抗凝固剤として用いて採取調
製した血漿を試料とするのが好ましい。また、上
記試料は、腹水症等のTAGレベルが相対的に高
い場合には、必要ならば適当な緩衝液で希釈して
もよい。
また、本発明で使用されるレクチンは、ガラク
トース−（β１→３又はβ１→４）−Ｎ−アセチル
グルコサミン又はガラクトース−（β１→３又は
β１→４）−Ｎ−アセチルガラクトサミンと特異
的に結合するもの〔J.B.C.250，8518〜8523
（1975）：Biochem.Biophys Res.Comm.62，144
（1975）；Z.Immunitaetsforch.138，423〜433
（1969）；Br.J.Exp.Pathol.27，228〜236
（1946）；Proc.Natl.Acad.Sci USA，75，No.５，
2215〜2219（1978）；Biochbmistry13，196〜
204（1974）；Carbohydrate Reseach，51，107
〜118（1976）、例えばピーナツツレクチン、ひま
の実（Ricinus Communis）レクチン等が挙げら
れる。
レクチン標識物質としては、各種酵素、各種螢
光物質及び各種放射性物質等を挙げることができ
る。酵素としては、例えばグルコアミラーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、パーオシダーゼ、アルカ
リホスフアターゼ、β−ガラクトオキシダーゼ又
はヘムオクタペプチド等の酵素の活性フラグメン
ト等が；螢公物質としては、例えばフルオレセイ
ン、フルオレセインスイソチオシアネート、ロー
ダミン、ダンシルクロライド（すなわち、５−ジ
メチルアミノ−１−ナフタレンスルフオニルクロ
ライド等）等が；放射性物質としては、例えば12
５Ｉ、131Ｉ等の放射性ヨウ素、放射性トリチウム等
が挙げられる。
本発明において、TAG様物質とは、ガラクト
ース−（β１→３又はβ１→４）−Ｎ−アセチルグ
ルコサミン、ガラクトース−（β１→３又はβ１
→４）−Ｎ−アセチルガラクトサミン又は該糖鎖
を末端に有する糖誘導体を指称する。この糖誘導
体中にはTAG物質も含まれる。このような糖誘
導体としては、例えば「生化学データブツク
」、日本化学会編、東京化学同人発行、1979年
11月26日発行、第503〜510頁に記載のヒト胃ムチ
ンの糖蛋白、ブタ胃粘膜の硫酸化糖蛋白の末端フ
コースを除去した糖蛋白、ヒトIgGの糖蛋白又は
そのアシアロ誘導体、ウシIgGの糖蛋白、ブタチ
ログロブリン糖鎖Ｂの糖蛋白のアシアロ誘導体、
オボムコイドのβ−サブユニツトの糖蛋白、ヒト
IgEの糖蛋白Ｂ−１又はそのアシアロ誘導体、ヒ
トIgEの糖蛋白Ｂ−２，Ｂ−３及びヒトIgA1の糖
蛋白−Ｃのアシアロ誘導体、ヒトIgA1の糖蛋
白−Ｂ、−Ａのアシアロ誘導体、ヒトトラン
スフエリンの糖蛋白のアシアロ誘導体、牛フエツ
インの糖蛋白のアシアロ誘導体、ウサギ肝細胞原
形質膜のアシアロ糖蛋白のとり込みに関与する糖
蛋白の脱アシアロ体、ヒト赤血球膜の糖蛋白のア
シアロ誘導体、ブタ胃粘膜硫酸化糖蛋白、ヒトα
１酸性糖蛋白のアシアロ誘導体、グリコフオリン
のアシアロ誘導体、、Ｔ−抗原等の糖蛋白又は糖
ペプチド；及び同文献の第840〜841頁に記載のア
シアロGM1＝AM1、牛の赤血球等の糖脂質が挙げ
られる。就中、牛フエツインの糖蛋白のアシアロ
誘導体、ブタ胃粘膜の硫酸化糖蛋白、ヒト胃粘膜
硫酸化糖蛋白又はヒトα１酸性糖蛋白のアシアロ
誘導体が好ましい。
不溶化TAG様物質及び不溶化レクチンは、
TAG様物質又はレクチンに不溶性担体を化学的
又は物理的に反応させることにより製造される。
不溶性担体としては、セルロース粉末、セフアデ
ツクス、セフアロース、ポリスチレン、紙、カ
ルボキシメチルセルローズ、イオン交換樹脂、デ
キストラン、プラスチツクフイルム、プラスチツ
クチユーブ、ナイロン、ガラスビーズ、絹、ポリ
アミン−メチルビニルエーテル−マレイン酸共重
合体、アミノ酸共重合物、エチレン−マレイン酸
共重合物等が挙げられる。不溶化は、共有結合法
としてのジアゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導体
法、カルボキシクロリド樹脂法、カルボジイミド
樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナー
ト誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロ
ースカルボナート誘導体法、縮合試薬を使用する
方法）、アルキル化法、架橋試薬による担体結合
法（架橋試薬としてグルタルアルデヒド、ヘキサ
メチレンイソシアナート等を用いる）、Ugi反応
による担体結合法等の化学的反応；あるいはイオ
ン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法；
ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用い
る物理的吸着法によつて行われる。この中で、共
有結合法の臭化シアン活性化多糖体法及び架橋試
薬による担体結合法が好ましい。臭化シアン活性
化多糖体法によれば、TAG様物質に対して臭化
シアン活性化担体10〜1000倍量を用いて、適当な
溶媒中０〜40℃、好ましくは20〜30℃で２〜４時
間反応させることによつて不溶化TAG様物質、
不溶化レクチンを得ることができる。
また、不溶化TAG様物質は、放射性重合法に
よつても製造することができる。すなわち、
TAG様物質を含む重合性単量体の水性分散液を
調製し、これに光又は電離性放射線を照射して該
単量体を重合してATG様物質の重合体マトリツ
クスを調製する。そして、この水性分散液を調製
する手段として、疎水性の重合性単量体〔Ａ〕を
水溶性重合体〔Ｂ〕０，１〜５重量％の水溶液に
分散させる、あるいは疎水性の重合性単量体
〔Ａ〕と親水性の重合性単量体〔Ｃ〕との混合物
を３〜20重量％の食塩水溶液に分散させる、ある
いは疎水性の重合性単量体〔Ａ〕を界面活性剤
〔Ｄ〕0.01〜５重量％含む水溶液に分散させる。
このようにして得られた分散液に光または電離性
放射線を照射する時、分散質として存在する重合
性単量体は重合してTAG様物質の重合マトリツ
クスを形成する。必要ならば適当な手段で、シー
ト状又は粒状に形成することができる。ここで疎
水性の重合性単量体〔Ａ〕の具体例としては、グ
リシジルメタクリレート、エチレングリコールメ
タクリレート、ジエチレングリコールメタクリレ
ート、トリエチレングリコールジメタクリレー
ト、トリメチロールプロパントリメタクリレー
ト、ポリエチレングリコール200ジメタクリレー
ト、ジプロピレングリコールジメタクリレート、
１，４−ブチレングリコールジメタクリレート、
１，６−ヘキサングリコールジメタクリレート、
メトキシジエチレングリコールジメタクリレー
ト、メチルメタクリレート、エチルメタクリレー
ト、ブチルメタクリレートもしくはそれらのアク
リレートがある。一般的には水に不溶の単量体で
光もしくは放射線照射によつて重合する物質であ
ればその種類は問わない。
親水性の重合性単量体〔Ｃ〕の具体例としては
２−ヒドロキシエチルメタクリレート、メトキシ
テトラエチレングリコールメタクリレート、メト
キシポリエチレングリコール400メタクリレー
ト、メトキシポリエチレングリコール1000メタク
リレート、ポリエチレングリコール400ジメタク
リレート、ポリエチレングリコール600ジメタク
リレート、メタクリル酸、アクリルアミド、Ｎ−
ビニル−２−ピロリドンもしくはそれらのアクリ
レートがある。一般的には水に可溶な単量体で、
かつ光もしくは放射線照射によつて重合する物質
であればその種類は問わない。
水溶性の重合物〔Ｂ〕の具体例としては、ポリ
ビニルピロリドン、ポリメタクリル酸、ポリアク
リル酸、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロ
ピルセルロース、アラビアゴム、などを例示する
ことができる。
界面活性剤〔Ｄ〕の具体例としてはラウリル硫
酸ソーダ、オレイン酸カリ、オレイン酸ソーダ、
ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステ
アレート、ソルビタンモノオレエート、プロピレ
ングリコールモノラウレート、オレイン酸、ドデ
シルベンゼンスルフオン酸ソーダ塩などを例示す
ることができる。しかし、それらのミセルの中に
重合性単量体もしくは重合性単量体中に溶解して
いTAG様物質がとりこまれるならば、その種類
は全く問わない。
放射性物質標識TAG様物質及び同標識レクチ
ンは、上記TAG様物質に例えば125Ｉ，131Ｉ等の放
射性ヨードを導入することによつて製造される。
放射性ヨードの導入は、通常のヨード化法、例え
ばクロラミンＴを用いる酸化的ヨード化法
〔Nature194，495頁（1962）、Biochem.J.89，114
頁（1963）〕によつて行われる。すなわち、適当
な溶媒、例えばPH６〜８の緩衝液、好ましくは
0.2Mリン酸緩衝液（PH７）中で、クロラミンＴ
の存在下、室温付近にて５〜60秒行われる。使用
される放射性ヨード及びクロラミンＴは、上記
TAG様物質に含まれるチロシン分子１ナノモル
に対し、夫々１〜５ミリキユーリー、10〜100ナ
ノモルが好ましい。このようにして標識された標
識TAG様物質は通常の方法で単離精製し、必要
ならば凍結乾燥して保存しておく。
酵素標識TAG様物質及び同標識レクチンは通
常のカツプリング法、例えばB.F.ERLANGERら
〔Acta.Endocrinol.Suppl.168，206（1972）〕及び
M.H.KAROLら〔Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A，
57，713（1967）〕の公知の方法によつて製造され
る。すなわち、TAG様物質と酵素をNaIO4等の酸
化剤の存在下、PH４〜６の緩衝液、例えば1mM
酢酸緩衝液（PH4.4）中で、室温付近で２〜５時
間反応させ、次いでNaBH4で還元することによ
つて行われる。酵素はTAG様物質１モルに対し
て１〜３モル量用いる。酸化剤はTAG様物質の
100〜300倍モル、還元剤は酸化剤の１〜２倍モル
が好ましい。
螢光物質標識TAG様物質及び同標識レクチン
は、公知の螢光物質、例えばフルオレツセインイ
ソチオシアネート（FITC）、テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネート（RITC）等を、PH６
〜８の水又は生理食塩水中、０〜室温、好ましく
は室温にて、TAG様物質と0.5〜３時間反応させ
る（螢光抗体法、医化学実験法講座、No.４，263
〜270頁。使用する螢光物質の量はTAG様物質等
の1/50重量が好ましい。
次に、本発明の競合法及びサンドイツチ法によ
る測定法を説明する。
両方法ともに、反応は適当な溶媒中、45℃以
下、好ましくは４〜40℃、更に好ましくは20〜40
℃の温度で行われる。該溶媒としては、TAG様
物質とレクチンの反応に悪影響を与えないもの、
例えば水、生理食塩水、0.1M〜0.3Mトリス−塩
酸緩衝液（PH≒7.5）、0.1Mリン酸衝液（PH≒
7.4）等のPHが６〜7.8の緩衝液が好ましい。反応
時間は５〜40時間、好ましくは15〜25時間で行わ
れる。
反応によつて生成したTAG様物質−レクチン
結合体と未反応レクチン又はTAG様物質との分
離は自体公知の方法によつて行われる。すなわ
ち、不溶化TAG様物質、不溶化レクチンを使用
したときは、固相と液相を分離（遠心分離、
別、デカンテーシヨン）すればよく、他の場合に
は、クロマト法、電気泳動法、塩析法、分画法、
透析法、ゲルロ過法、吸着法等、もしくはこれら
の方法を組合せた方法、あるいは寒天ゲル、アガ
ロースゲル又はポリアクリルアミドゲルを用いる
分離法（本発明者；特願昭54−59388号）も利用
できる。
斯くして分離されたものの標識剤活性は、その
標識剤の種類によつて適宜選択される。例えば酵
素の場合には、比色分析系、発光分析系あるいは
螢光分析系の適当な酵素基質を選び、必要ならば
色素、発光剤又は発色剤を用いて酵素活性を測定
することにより、また標識剤が螢光物質であれば
その螢光強度を、放射性物質であればその放射線
を測定することにより、反応又は未反応のTAG
様物質又はレクチン量を測定し、これから測定物
質量を求めることができる。
叙上の如く本発明によれば体液中のTAG物質
を有利に定量できる。そしてこのTAG物質を知
ることにより初期から末期の何れの癌も診断する
ことができ、特に癌の早期発見に極めて有用であ
る。さらに本発明方法は糖側鎖を測定しているの
で、従来の主として蛋白部分を測定した抗体利用
系（α１−フエトプロテイン、CEA等）より広
い範囲で、何れの癌、例えば胃癌、乳癌、結腸
癌、直腸癌、卵巣癌、口腔癌、舌癌、喉頭癌、前
立腺癌、脂肪肉種、悪性黒色腫、子宮癌、胃原発
肉腫等の癌の診断法にも利用できる。
更にまた、本発明によれば、ガラクトース−
（β１→３又はβ１→４）−Ｎ−アセチルグルコサ
ミン又はガラクトース−（β１→３又はβ１→
４）−Ｎ−アセチルガラクトサミン及び該糖鎖を
末端に有する糖類、糖ペプタイド、糖蛋白、糖脂
質、糖テルペン、糖ステロイド等の糖誘導体を定
量することもできる。
以下実施例を挙げて説明する。
実施例 １ (i) ペルオキシダーゼの活性化： ペルオキシダーゼ（西洋わさび）５mgを
0.3M炭酸水素ナトリウム水溶液１mlに溶解し
た。これに0.1Mフルオロジニトロベンゼンエ
タノール溶液0.1mlを加え、室温で１時間静か
に撹拌後、0.06MNaIO4溶液１mlを加え室温で
30分間静かに撹拌した。更に0.16Mエチレング
リコール１mlを加え室温で１時間静かに撹拌し
た。次いで0.01M炭酸−炭酸水素ナトリウム緩
衝液（PH9.5）を用いて４℃で一昼夜透析し
た。
(ii) レクチンのペルオキシダーゼ標識法（レクチ
ン−ペルオキシダーゼ）： ピーナツツレクチン５mgを(i)で得た活性化
ペルオキシダーゼ３mlに溶かし、静かに撹拌
しながら室温で２〜３時間反応させた。これ
にNaBH45mgを加え、４℃で３時間反応させ
た。次いでこの溶液を0.1Mトリス−塩酸緩
衝液（PH7.4）に対して一昼夜透析し、セフ
アデツクスG150ゲルカラムクロマトグラフ
イー（溶出液：0.1Mトリス−塩酸緩衝液、
PH7.4）でゲルロ過を行つた。各分画を
OD280、CD403で測定し、OD280とOD403の重
なるピークを集めた。
で得たレクチン−ペルオキシダーゼ20ml
をガラクトース−アガロース（AGALACTO
RYRANOSYL AGAROSE；P.L.Lab.
USA）に付し、生理食塩水200mlで洗浄し
た。0.5Mのラクトースを含む0.2M食塩水に
て溶出し、OD280とOD408の重なる最初の10
mlを集めた。この分画を生理食塩水に対して
一昼夜透析して精製レクチン−ペルオキシダ
ーゼを得た。蛋白量をLowry法〔J.
Biological Chem.Vol 193，265頁（1951）〕
で測定したところ約１mgであつた。これは凍
結乾燥した。
(iii) 不溶化レクチン製造法（PNA−アガロース
の製造法）： CNBr−活性化アガロース15ｇを３の
0.001N塩酸に懸濁し、30分間静置した後ガラ
スフイルター上で、0.1M炭酸水素ナトリウム
（PH8.5）１で洗浄した。全体で約50mlの容量
の活性化アガロースが得られた。これを0.1M
炭酸水素ナトリウム（PH8.5）200mlに懸濁し、
ピーナツレクチン（以下PNAと略称する）50
mgを含む0.01Mリン酸塩緩衝液（PH7.7）５ml
を加え、室温で時々撹拌しながら２時間反応さ
せた。反応後、反応液をガラスフイルター上で
洗浄し、反応物を１モルのモノエタノールアミ
ン溶液2000ml（PH8.5）に加え、室温にて２時
間反応した。次いで、ガラスフイルター上で洗
浄した。洗浄法としては、0.1M酢酸緩衝液
（0.5MNaClを含む）１と0.1Mホウ酸緩衝液
（0.5MNaClを含む）１で交互に３回洗浄し
た。
(iv) TAG様物質の製造法： 0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.0）100mlにブ
タ胃粘膜硫酸化糖蛋白（以下PGMと略称す
る）１ｇを懸濁し、1N NaOH水溶液を滴下
してPH11に調整した。室温で30分間撹拌後、
3000rpmで10分間遠心分離し、上澄を1N
HCl溶液でPH7.0に調整し、再び3000rpmで10
分間遠心分離した。上澄を0.01Mリン酸塩緩
衝液（PH7.0）10に対して終夜透析して精
製TAG様物質（精製PGM）を得た。
粗PGM100ｇを蒸留水１中に加え、一夜
放置した。これを蒸留水に対して一夜透析し
た後、遠心分離（100000ｇ×１時間）し、上
澄をとり、凍結乾燥して精製PGM約55ｇを
得た。
(v) 標識TAG様物質の製造法： (a) 酵素による標識（PGM−ペルオキシダー
ゼ） ４mgのワサビのペルオキシダーゼ
（HRPO）（0.1μＭ）を蒸留水１mlに溶解し
た。これに0.1M NaIO40.2mlを加えて室温に
て20分間撹拌し、1mM酢酸緩衝液（PH4.4）
に対して一昼夜透析して未反応のNaIO4を除
去した。この透析反応液に0.2M炭水素塩緩
衝液（PH9.5）を約60μ程度加えたPH9.0に
調整した。次いで、ただちに0.01M炭酸水素
塩緩衝液（PH9.5）に溶解したPGM（10mg／
ml）0.6mlを加えて室温で２時間混合し、４
mg／mlのNaBH4蒸留水溶液0.11ml加え、４℃
で２時間静置した。更に0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.2）に対して一昼夜透析後、セフアデツ
スＧ−200（1.5×150cm）にて溶出して精製
PGM−ペルオキシダーゼ（PGM−POX）を
得た。ゲル溶出液は各々５mlずつ集め、各溶
出液はOD280、OD403で吸収を測定した。
(b) アイソトープによる標識（125I−PGM）：
125IでクロラミンＴを用いる酸化的ヨード化
法にてPGMを標識する。
PGM10μｇを0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）
50μに溶解し、これに１ミリキユーリーの
Na125I（無担体：N.E.N）10μとクロラミ
ンT50μｇ／100μ0.2Mリン酸塩緩衝液を
加え、室温で30秒間混合後、Na2S2O5100μ
ｇ／100μ0.2Mリン酸塩緩衝液を加え混合
し、次いでNa125Iを１mg加えて混合した。更
に得られた125I−PGMをセフアデツクスＧ−
50（１×30cm）にて精製した。このようにし
て調製された125I−PGMはほぼ１〜２μCi／
μｇの放射性を有していた。
(vi) 定量法 (vi) 10×75mmのガラス管を用いて、重量％(v)で得
られた125I−PGM（100ng0.17μCi〓2.4×
105cpm）0.1ml、前記(iv)で得られた精製標準
PGM（0.1μｇ／ml、0.2μｇ／ml、0.5μｇ／
ml、１μｇ／ml、2.5μｇ／ml、５μｇ／ml、
10μｇ／ml）0.1ml、PNA（10μｇ／ml）0.1ml
および0.05Mリン酸緩衝液（0.15M NaCl、0.1
％BSA、0.02％NN3）0.2mlを混合し、25℃で１
時間インキユベートした。反応終了後、PNA
に結合した125I−PGMとPNAに結合していない
125I−PGMに抗PNA家兎血清（E.Y.labaratory
社製：10倍希釈液）0.1mlを加えて25℃で１時
間インキユベートした後４℃、3000rpmで30分
間遠心分離した。沈渣（PNAに結合した125I−
PGM）のカウントを計測して標準曲線を作成
した（第１図）。この結果から明らかな様に、
通常％Bound（B/T）は通常20〜25％で、50％
阻害率は0.6μｇ／mlであつた。
(vii) 不溶化TAG様物質の調製： 過剰量のPGMを0.01Mリン酸塩緩衝液（PH
7.0）100mlに加えて、懸濁液を調製した。この
ものに0.01N NAOH溶液を加えてPHを約11に
調製し、300rpmで20分間遠心分離し上澄を回
収した。この上澄に0.03N HClを滴下してPHを
7.0に調整し、再び3000rpmで20分間遠心を行
なつた。上澄を0.01Mリン酸塩緩衝液（PH
7.0）に対して透析したものをPGM溶液とし
た。このものの糖及び蛋白含量は、糖について
はフエノール硫酸法でグルコースを標準として
ヘキソースが５〜７mg／ml、蛋白はBSAを標
準として測定した結果１〜２mg／mlであり、以
下の放射線重合（RIP）に供する。
放射線重合は単量体としてヒドロキシエチル
メタクリレート（HEMA）と上記PGM溶液を
33：67の割合で混合し、１cm×15〜20cmのガラ
ス管に入れ、急速に−70℃以下に凍結した。次
いで１×106radのγ線照射を行ない単量体を重
合した。各々固定化されたPGM材料はこの重
合体の棒を10μｍずつ切つて１枚ずつのデイス
クとした。
(viii) 不溶化TAG様物質の製造法： CNBr−活性化セフアロース4B（フアリマ
レア社製）15ｇ（乾燥重量）を３の
0.001N塩酸に懸濁し、30分間静置後ガラス
フイルター上で0.1M炭酸水素ナトリウム
（PH8.5）１で洗浄すると、約50ml容量の活
性化セフアロースが得られた。これを0.1M
炭酸水素ナトリウム（PH8.5）200mlに懸濁
し、PGM50mgを含む0.01Mリン酸塩緩衝液
（PH7.7）５mlを加えて、室温で時々撹拌しな
がら２時間反応させた。反応終了後、反応液
をガラスフイルター上で洗浄し、反応物を
1Mのモノエタールアミン溶液（PH8.5）200
mlに加え、室温にて２時間反応した。次いで
ガラスフイルター上で洗浄した。洗浄法とし
ては0.1M酢酸緩衝液（0.5M NaClを含む）
１と0.1Mホウ酸緩衝液（0.5M NaClを含
む）１で交互に３回行う。
ポリスチレンビーズ（直径6.4mm；
Precision Plastic Co.Ltd.USA）１万個を希
釈したママレモン〔ライオン(株)、原液1.5
ml／１蒸留水）でよく洗浄し、更に蒸留水
で洗浄した。次いでこれを0.5M苛性ソーダ
水溶液中に３日間浸漬した後、洗液がPH約６
になるまで蒸留水で洗浄した。10N−苛性ソ
ーダ水溶液でPH4.5に調整した50mM−酢酸
緩衝液の35w／ｖ％PGM溶液2.5に上で洗
浄したビーズ１万個を加え、約10rpmで24時
間撹拌した。ビーズを取し、これを蒸留水
でよく洗浄した（８×４）。これをグルタ
ルアルデヒド1v／ｖ％の50mM−リン酸ナト
リウム緩衝液（PH７）2.5に加え、10rpm
で２時間撹拌した。ビーズを取し、前記を
同様にして蒸留水でよく洗浄した。このビー
ズ１万個を1M−グリシンの50mM−リン酸
ナトリウム緩衝液（PH2.0）2.5に加え、
10rpmで２時間撹拌した。ビーズを取し、
蒸留水でよく洗浄し、37℃で一夜乾燥して
PGM−ビーズを得た。このビーズの表面糖
をOrcinol−硫酸法〔M.Sch¨ｏnendergerら：
Z.Physiol.Chem.309，145（1957）〕で測定し
たところ、2.7±0.2μgPGM／ビーズであつ
た。
(ix) 被検試料の調製： 担癌患者25例、他の疾病患者２例及び健康
人23例より、ヘパリン（500単位）処理した
注射器で５mlの血液を採取し、2000rpmで10
分間遠心分離後、その上清をとり被検試料と
した。
と同様にして、健康人及び担癌患者より
被検試料を得た。
実施例 ２ 競合法を用いる方法： デイスク（前記(vii)で調製した不溶化TAG様物
質）１枚をPNAの結合したペルオキシダーゼ
（前記(ii)ので調製して標識レクチン）50μ及
び試料（前記(ix)の被検試料）200μに入れ、25
℃で20時間インキユベートした。そのデイスクを
PBSで洗浄し食塩水2.0mlに入れ、ペルオキシダ
ーゼ物質0.5mlを添加して25℃で１時間インキユ
ベートした。次いで3N塩酸1.0mlを添加し、
492nmで吸光度を測定した。同時に前記試料を各
種濃度の標準物質（PGM）に変えて吸光度を測
定して検量線を作成した（第２図）。更にこの検
量線を使用して前記(ix)で得た被検試料中のTAG
を求めた結果を第３図及び第４図に示す。
第３図及び第４図から明らかなように健康人と
各種担癌患者のTAGレベルに顕著な差が見られ
た。
実施例 ３ サンドイツチ法を用いる方法： １μｇ／ml〜10μｇ／mlのPGMを溶解した
0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.0）100μに前記(iii)
で調製したPNA−アガロース200μｇを加え、25
℃で撹拌下、１時間インキユベートした。次いで
0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.0）で３回洗浄後、
実施例１(ii)ので得たペルオキシダーゼで標識し
たPNA6μｇ及び0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.0）
100μを加え、撹拌しながら25℃で１時間イン
キユベートした。3000rpmで10分間遠心分離した
後、沈渣を回収し、0.05Mリン酸塩緩衝液（PH
7.0）で３回洗浄し、492nmで吸光度を測定し
た。その結果を第５図に示す。
実施例 ４ 競合法を用いる方法： 試料（前記(ix)のの被検試料）100μを試験
管にとり、最終濃度0.22w／ｖ％ゼラチン、5mM
−CaCl2、5mM−MgCl2の0.3Mトリス−塩酸緩衝
液（PH7.4）500μを加える。これにPGM−ビ
ーズ（前記(viii)ので調製した不溶化TAG様物
質）１個を加え、更にレクチン−ペルオキシダー
ゼ（前記(ii)ので調製した凍結乾燥標識レクチン
１ml／上記トリス−塩酸緩衝液１）100μを
加え、撹拌した後25℃で24時間インキユベートし
た。アスピレーターで反応液を吸引除去し、生理
食塩水２mlを加え、ビーズを洗浄し、洗浄液を吸
引除去した。この操作を３回操り返した。
ｏ−フエニレジアミン60mgに0.2M−マクレビ
ン緩衝液（PH5.8）20mlを加えて溶解し、更に最
終濃度0.02v／ｖ％のH2O2を加えて撹拌して、発
色試薬を調製した。
試験管に生理食塩水２ml及び上記発色試薬500
μを加え、次いで上記ビーズを入れて、室温で
30分間インキユベートした。3N−塩酸１mlを加
えて酵素反応を停止させ、492nmで吸光度を測定
した。
同様にして、前記試薬の代りに各種濃度の標準
物質（PGM）を用いて吸光度を測定して検量線
を作成した（第６図）。
この検量線を使用して、(ix)で得た試料中の
TAGを測定した結果は第７図のとおりである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の競合法による標準曲線、第２
図は競合法の検量線、第３図は同法により測定し
た健康人のTAG量、第４図は同法により測定し
た癌患者のTAG量、第５図はサンドイツチ法の
検量線、第６図はポリスチレンビーズを用いる競
合法による標準曲線、第７図は同法により測定し
た(a)健康人及び(b)癌患者のTAG量を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 測定しようとする体液中のガラクトース（β
    １→３又はβ１→４）−Ｎ−アセチルグルコサミ
    ン又はガラクトース（β１→３又はβ１→４）−
    Ｎ−アセチルガラクトサミン側鎖〔以下、これら
    の側鎖をTAGと称する〕を末端に有する糖蛋
    白、糖ペプタイド、糖脂質又は（及び）糖を含む
    癌関連糖側鎖物質と、ガラクトース（−β１→３
    又はβ１→４）−Ｎ−アセチルグルコサミン、ガ
    ラクトース（β１→３又はβ１→４）−Ｎ−アセ
    チルガラクトサミン及びTAGを末端に有する糖
    誘導体から選ばれるTAG様物質の不溶化物の一
    定量とを、標識レクチンの一定量と競合反応さ
    せ、次いで不溶化TAG様物質と標識レクチンと
    の結合体及び非結合レクチンを分離し、その何れ
    か一方の標識剤活性を測定することを特徴とする
    癌関連糖側鎖の定量法。 ２ 標識レクチンが、酵素、螢光物質又は放射性
    物質で標識したレクチンである特許請求の範囲第
    １項記載の定量法。 ３ 体液が、血液、細胞組織液、リンパ液、胸
    水、腹水、羊水、胃液、尿、膵液、髄液又は唾液
    である特許請求の範囲第１項記載の定量法。 ４ 測定しようとする体液中のガラクトース（β
    １→３又はβ１→４）−Ｎ−アセチルグルコサミ
    ン又はガラクトース（β１→３又はβ１→４）−
    Ｎ−アセチルガラクトサミン側鎖〔以下、これら
    の側鎖をTAGと称する〕を末端に有する糖蛋
    白、糖ペプタイド、糖脂質又は（及び）糖を含む
    癌関連糖側鎖物質と、標識したガラクトース−
    （β１→３又はβ１→４）−Ｎ−アセチルグルコサ
    ミン、ガラクトース（β１→３又はβ１→４）−
    Ｎ−アセチルガラクトサミン及びTAGを末端に
    有する糖誘導体から選ばれる標識TAG様物質の
    一定量を、一定量のレクチン又は不溶化レクチン
    と競合反応させ、次いで標識TAG様物質とレク
    チン又は不溶化レクチンとの結合体及び非結合標
    識TAG様物質を分離し、その何れか一方の標識
    剤活性を測定することを特徴とする癌関連糖側鎖
    の定量法。 ５ 標識TAG様物質が、酵素、螢光物質又は放
    射性物質で標識したものである特許請求の範囲第
    ４項記載の定量法。 ６ 体液が、血液、細胞組織液、リンパ液、胸
    水、腹水、羊水、胃液、尿、膵液、髄液又は唾液
    である特許請求の範囲第４項記載の定量法。 ７ 測定しようとする体液中のガラクトース（β
    １→３又はβ１→４）−Ｎ−アセチルグルコサミ
    ン又はガラクトース（β１→３又はβ１→４）−
    Ｎ−アセチルガラクトサミン側鎖〔以下、これら
    の側鎖をTAGと称する〕を末端に有する糖蛋
    白、糖ペプタイド、糖脂質又は（及び）糖を含む
    癌関連糖側鎖物質〔以下、TAG物質と称する〕
    と不溶化レクチンとを反応させてTAG物質−不
    溶化レクチン複合体を形成させ、この複合体に標
    識レクチンの一定量を反応させ、次いで複合体と
    標識レクチンの結合体及び非結合標識レクチンを
    分離し、その何れか一方の標識剤活性を測定する
    ことを特徴とする癌関連糖側鎖の定量法。 ８ 標識レクチンが、酵素、螢光物質又は放射性
    物質で標識したレクチンである特許請求の範囲第
    ７項記載の定量法。 ９ 体液が、血液、細胞組織液、リンパ液、胸
    水、腹水、羊水、胃液、尿、膵液、髄液又は唾液
    である特許請求の範囲第７項記載の定量法。
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