SE453947B - Forfarande vid diagnosticering av cancer med lektinbindande tumormarkor (tag=tumorassocierad glykobindning) - Google Patents

Description

455 947 gu ningar har hittills varit kända.

Det har visat sig att kroppsvätska från en patient med cancer innehåller TAG, som anges av odifferentierade celler (huvudsakli- gen cancercellerb och frigöres i vätskan och att TAG är av- sevärt olikartad med avseende på sockerkedjestruktur, socker- kedjelängd och slag av konstituerande sockerrester och såsom ett resultat av omfattande undersökningar har det visat sig att detta TAG innehåller glykoproteiner, glykopeptider, glyr kolipider och/eller sockerarter uppvisande galaktos-(BL+ å eller Bl-94)-N-acetylglukosaminändgrupper eller galaktos-(Bla 3 eller ßL+ 4)-N-acetylgalaktosaminändgrupper, att detta TAG specifikt kombineras med lecitin och att närvaro eller från- varo av cancerceller, graden av proliferation, livskraft och sönderfall av cellerna samt liknande kan studeras genom reak- tion av kroppsvätske-TAG med lectin, varigenom man kan diag- nostisera cancer.

Föreliggande uppfinning har åstadkommits på grundval av det ovan angivna.

Ett ändamål med uppfinningen är sålunda att åstadkomma ett förfarande för mätning av TAG-halten i en kroppsvätska enligt ett kompetitivt förfarande eller ett "sandwichförfarande“ samt ett sätt att diagnostisera cancer genom mätning av TAG- halten.

Fig. l visar en standardkurva som erhållits vid det kompeti- tiva förfarandet enligt uppfinningen. Fig. 2 visar en kali- breringskurva för det kompetitiva förfarandet enligt uppfin- ningen. Fig. 3 visar TAG-halter för friska personer mätta enligt det kompetitiva förfarandet enligt uppfinningen. Fig.4 visar TAG-halter hos cancer-patienter mätta enligt det kom- petitiva förfarandet enligt uppfinningen. Fig. 5 visar en _ kalibreringskurva för sandwichförfarandet enligt uppfinning-I en. Fig. 6 visar en kalibreringskurva för det kompetitiva för- farandet enligt uppfinningen. Fig. 7 visar TAG-halter hos 453 947 cancerpatienter mättaenligt det kompetitiva förfarandet en- ligt uppfinningen. Fig. 7a visar TAG-halter hos friska per- soner mätta enligt det kompetitiva förfarandet enligt uppfin- ningen. Fig.7b och 7c visar TAG-halter hos patienter med cancer mätta enligt det kompetitiva förfarandet enligt upp- finningen. Fig. 7d visar TAG-halter hos patienter som lider av olika sjukdomar utöver cancer eller hos havande kvinnor, Det ovan beskrivna ändamålet med uppfinningen kan uppnås en- ligt ett av följande förfaranden: _ (1) kompetitiv reaktion av kroppsvätske-TAG, som skall mätas (nedan betecknat såsom det material som skall mätas) och en bestämd mängd olösliggjord TAG eller TAG-liknande material (nedan betecknat olösliggjort TAG eller olösliggjort TAG-lik- nande material) med en bestämd mängd lectin märkt med ett märkningsmedel (nedan betecknat märkt lectin), separation av det olösliggjorda TAG eller olösliggjorda TAG-liknande materialet som är bundet till det märkta lectinet och icke bundet märkt lectin från varandra samt mätning av märkninge- ' medlets aktivitet i ettdera av dessa; (2) kompetitiv reaktion av i kroppsvätskan föreliggande TAG, som skall mätas, och en bestämd kvantitet TAG eller TAG-lik- nande material märkt med ett_märkningsmedel (nedan betecknat märkt TAG eller märkt TAG-liknande material) med en bestämd mängd lectin eller olösliggjort lectin (nedan betecknat olöslíggjort lectin), separation av märkt TAG eller märkt TAG-liknande mate- rial bundet till Iectin eller olösliggjort lectin och icke bundet märkt TAG eller TAG-liknande material från varandra samt mätning av märkningsmedlets aktivitet i ettdera av dessa; samt (3) reaktion av i kroppsvätskan föreliggande TAG, som skall mätas, med olösliggjort lectin till bildning av ett TAG-o1ös- liggjort lectin-komplex, reaktion av detta komplex med en be- stämd mängd av det märkta lectinet, separation av det komplex som är bundet till det märkta lectinet och icke bundet märkt lectin från varandra samt mätning av märkningsmedelsaktivi- teten i ettdera av dessa. « 453 947 Såsom kroppsvätska för användning enligt uppfinningen kan man använda olíkartade kroppsvätskor, varïbland återfinnas blod, cellvävnadsvätska, lymfvätska, toraxvätska, abdominalvätska, amniotisk vätska, magsaft, urin, pancreasvätska, cerebro- spinalvätska samt saliv. Av dessa föredragas särskilt använd- ning av blod i form av serum eller blodplasma. Den mängd kroppsvätska, som skall användas för bestämningen, varierar från ungefär l till ungefär 10 ml, företrädesvis från 2 till 5 ml. Denna kroppsvätska kan ytterligare renas för isolering av de material som innehåller glykobindningen, såsom glyko- proteiner, glykopeptider, glykolipider och/eller sackarider.

Såsom ett förfarande för framställning av ett material inne- hållande glykobindningen med hög halt från dessa kroppsvätskor användas konventionellt kända metoder för extraktion eller separation av glykobindning, t.ex. utsaltning, fällning, extraktion, centrifugering, dialys, molekylsiktmetoder, in- aktivering av enzym eller en kombination därav. Närmare bes- tämt kan en sådan fraktion framställas på så sätt att man tillsätter sulfosalicylsyra, trikloroättiksyra eller zink- sulfat till serum eller plasma eller genom upphettning av serum eller plasma, avfiltrering av den så bildade fällning- en för avlägsnande av albumin, immunoglobulin etc. samt genom att utföra dialys.

Vid bestämningsförfarandet enligt uppfinningen kan man använ- da prov av kroppsvätska, som tillvaratagits, bortsett från blod, i förefintlig form såsom testprov (nedan betecknade "prov"). För att förhindra prov från att denatureras och för att påskynda reaktionen med lectin kan man emellertid tillsätta proteiner med låg sockerhalt, såsom nötkreaturserum- albumin (BSA) eller liknande såsom skyddsproteiner. Tillsats av en lämplig mängd skyddsprotein till ett prov varifrån akmmn, immunoglobulin eller liknande avlägsnats ger vidare goda resultat i vissa fall. Vid ett blodprov kan serum erhållet enligt ett känt serumtillvaratagningsförfarande eller plasma erhållet enligt ett plasmatillvaratagningsförfarande med an- 453 947 5 vändning av en antikoagulant såsom heparin, EDTA, citronsyra eller liknande kan man anvärfia så erhâllen vätska såsom ett prov, varvid serumprovet tillvaratagits och framställts med användning av heparin såsom ett antikoaguleringsmedel sär- skilt föredrages. När TAG-halten är relativt hög såsom vid ascites kan prov eventuellt utspädas med lämplig buffertlös- ning.

Såsom det lectin, som skall användas enligt uppfinningen, kan exempelvis xämnas de som kan specifikt kombineras med: galaktos-(Bl+ 3 eller BL» 4)-N-acetylglukosamin eller galaktos-(Blå 3 eller Bl-Y4)-N-acetylgalaktosamin [J.B.C., 250, 8518-8523 (l975§; Biochem. Biophys. Res. Comm., 62, 144 (1975), Z. Immunitaetsforch, 138, 423-433 (l969); Br. J. Exp. Pathol., 27, 228-236 (l946); Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, 75, nr. 5, 2215-2219 (l978); Biochemistry, 13, 196-204 (l974); Carbohydrate Research, 51, 107-118 (l976)], såsom jordnötslectin, recinoljelectin (Ricinus communis) etc.

Såsom märkningsmaterial för märkning av lectin och TAG eller TAG-liknande material kan man exempelvis använda olika enzym- er, olika fluorescerande material samt olika radioaktiva ma- terial etc. Sådana enzymer innefattar exempelvis glukoamylas, glukosoxidas, peroxidas, alkaliskt fosfatas, B-galaktosidas samt aktiva fragment av hemoktapeptid etc., fluorescerande material innefattande exempelvis fluorescein, fluoresceiniso- tiocyanat, rodamin, dansylklorid (dvs. 5-dimetylamino-l- -naftalensulfonylklorid) etc., samt radioaktiva material exempelvis innefattande radioaktivt jod (t.ex. l25J, 1313 etc.), radioaktivt tritium etc.

I föreliggande sammanhang betecknar "TAG-liknande material" galaktos-(BL+ 3 eller Bl+ 4)-N-acetylglukosamin,galaktos- -(Bl-#3 eller Bl->4)-N-acetylgalaktosamin samt sockerderivat innehållande sådana glykobindningar i ändställning. Såsom sådana sockerarter kan exempelvis de följande anges: glvko- protein från gastrisk mucin, glykoprotein erhållet genom av- 453 947 lägsning av terminal fukos från sulfaterat glykoprotein från magsäckslemhinna från svin, humant IgG-glykoprotein eller asialoderivat därav, IgG-glykoprotein från nötkreatur, asia- loderivat av glykoprotein av tyroglobulinglykobindningar B från svin, glykoprotein från ovomucoid B-subenhet, glyko- protein B-1 från humant IgE eller asialoderivatet därav, asialoderivat av glykoprotein B-2 eller B-3 från humant IgE och asialoderivat av glykoprotein II-C från.hunant IgA , asialoderivat av glykoprotein II-B eller II-A från humant_ .

IgAl, asialoderivat av humant transferringlykoprotein, asia- loderivat av fetuint glykoprotein från nötkreatur, deasialo- derivat av glykoprotein som deltar i upptagningen av asialo- glykoprotein från protoplasmamembran från kaninlevercell, sulfaterat glykoprotein av magslemhinna från svin, asialode- rivat av humant al surt glykoprotein, asialoderivat av glykofolin, glykoprotein eller glykopeptid av T-antigen eller liknande, vilka beskrivas i "Biochemical Data Book I" (sam- manställd av Japanese Chemical Society och publicerad av Tokyo Kagaku Dojin, nov. 26, l979), sid. 503-510; samt asialo GMl=AMl och glykolipider av erytrocyter från nötkrea- tur beskrivna i samma litteraturställe, sid. 840-841. Av dessa föredragas asialoderivaten av fetuinglykoprotein från nöt- kreatur, sulfaterat glykoprotein från magsäcksslemhinna från svin, sulfaterat glykoprotein från magslemhinna hos människa samt asialoderivat av humant al surt glykoprotein.

Olösliggjort TAG, olösliggjorda TAG-liknande material och olösliggjort lectin framställas genom kemisk eller fysika- lisk reaktion av TAG, TAG-lüuænde material eller lectin med en olöslig bärare. Såsan sådan olöslig bärare kan man exempel- vis använda cellulosapulver, Sephadex(R) (R), , Sepharose polystyren, filtrerpapper, karboximetylcellulosa, jonbytar- harts, dextran, plastfilm, plaströr, nylon, glaspärlor, silke, polyamin-metylvinyleter-maleinsyra-sampolymer, amino- syrasampolymer, etylen-maleinsyra-sampolymer etc. Olösliggö- randet kan åstadkommas medelst ett kovalent bindningsbildande förfarande [t.ex. ett diazofërfarande, ett peptidfërfarande 453 947 u o (t.ex.ettsyraamidderivatförfarande, ett karboxykloridharts- förfarande, ett karbodíimidhartsförfarande, ett maleinsyraan- hydridderivatförfarande, ett isooyanatderivatförfarande, ett cyanogenbromid-aktiverat polysackaridförfarande, ett cellu- losakarbonatderivatförfarande, ett förfarande med användning av ett kondensationsmedel etc.), ett alkyleringsförfarande, ett bärar-bindningsförfarande med användning av ett tvär- bindande medel såsom glutaraldehyd, hexametylenisocyanat etc], ett bärarbindningsförfarande enligt Ugi-reaktion samt lik- _ nande; ett jonbindningsfërfarande med användning av sådan: bärare som jonbytarharts; samt ett fysikaliskt absorptions- förfarande med användning av poröst glas såsom glaspärlor såsom bärare. Av dessa föredragas det cyanogenbromidaktivera- de polysackaridförfarandet för det kovalenta bindningsbildan- de förfarandet och det bärarbindande förfarandet med använd- ning av ett tvärbindningsmedel. Enligt det cyanogenbromid- aktiverade polysackaridförfarandet kan olösliggjort TAG, olösliggjort TAG-liknande material eller olösliggjord lectin erhållas genom reaktion av TAG, etc., med en 10- till 1.000- -faldig mängd cyanogenbromid-aktiverad bärare i ett lämpligt lösningsmedel vid o :in 4o°c, företrädesvis via 2o-3o°c, i 2-4 timmar.

Vidare kan olösliggjord TAG etc. framställas enligt ett strål- ningsinducerat polymerisationsförfarande. Detta innebär att en dispersion i vatten av en polymeriserbar monomer innehål- lande TAG eller TAG-liknande material framställes oçh be- strâlas med ljus eller joniserande strålning för polymerisa- tion av monomeren. Sâson medel att framställa dispersionen i vatten dispergeras en hydrofob polymeriserbar monomer [A] i 0,1 till 5 viktprocent vattenlösning av vattenlöslig polymer {B]. Alternativt dispergeras hydrofil polymeriserbar moncner [C] eller en blandning av bydrofob polymeriserbar monomer [A] och hydrofil polymeriserbar monomer [C] i 3 till 20 viktpro- cent saltlösning i vatten eller hydrofob polymeriserbar mono- mer [A] dispergeras i en vattenlösning innehållande 0,01 till 5 viktprocent surfaktant [D]. När den så erhållna dispersionen 453 947 bestrålas med ljus eller joniserande strålning polymeriseras den däri såsom dispers fas förefintliga polymeriserbara mono- meren till bildning av en polymer matrix för TAG eller liknan- de. Om så önskas kan denna formas till ark eller partiklar.

Såsom specifika exempel på den hydrofoba polymeriserbara monomeren [A] kan anges glycidylmetakrylat, etylenglykoldi- metakrylat, dietylenglykoldimetakrylat, trietylenglykcldimet- akrylat, trimetylpropantrimetakrylat, polyetylenglykol-200-_ -dimetakrylat, dipropylenglykoldimetakrylat, 1,4-butylen-1 glykoldimetakrylat, 1,6-hexanglykoldimetakrylat, metoxidi- etylenglykoldimetakrylat, metylmetakrylat, etyhnetakrylat, bu- tylmetakrylat samt motsvarande akrylater därav. Helt allmänt kan man använda varje vattenolöslig monomer, som kan polyme- riseras genom bestrâlning med ljus eller annan strålning oavsett dess art.

Såsom specifika exempel på den hydrofila polymeriserbara monomeren [C] kan anges 2-hydroxietyhnetakrylat, metoxitetra- etylenglykolmetakrylat, metoxipolyetylenglykol-400-metakrylat, metoxipolyetylenglykol-1000-metakrylat, polyetylenglykol-400- -dimetakrylat, polyetylenglykol-600-dimetakrylat samt mot- svarande akrylater därav och metakrylsyra, akrylamid, N-vinyl- -2-pyrrolidon etc. Helt allmänt kan man använda varje vatten- löslig monomer, som kan polymeriseras genom bestrålning med ljus eller annan strålning oavsett dess art.

Såsom specifika exempel på den vattenlösliga polymeren [B] kan anges polyvinylpyrrolidon, polymetakrylsyra, polyakryl- syra, polyvinylalkohol, hydroxipropylcellulosa, gummi ara- bikum etc.

Såsom specifika exempel på surfaktanten [D] kan anges natriun- laurylsulfat, kaliumoleat, natriumoleat, sorbitanmonolaurat, sorbitanmonostearat, sorbitanmonooleat, propylenglykohnono- laurat, oljesyra, natriumdodecylbensensulfonat etc. Emellertid kan man använda_varje surfaktant som kan bibehålla den poly- 453 947 f u meriserbara monomeren eller TAG eller TAG-liknande material löst i den polymeriserbara monomeren inom micellen därav oavsett arten därav.

TAG märkt med radioaktivt material, TAG-liknande material märkt med radioaktivt material och lectin märkt med radioak- tivt material kan framställas genmn införande av en radioak- tiv jodatom såsom IZSJ eller l3lJ i TAG, TAG-liknande material eller lectin. Införande av radioaktivt jod utföres genom ett vanligt joderingsförfarande, exempelvis ett oxidativt jodê-f ringsförfarande med användning av kloramin T [Nature, 194, sid. 495 (l962); Biochem. J., 89, sid. ll4 (l963)]. Sådan jodering genomföres i ett lämpligt lösningsmedel [t.ex. buf- ferfilösning vid pH 6-8, företrädesvis 0,2M fosfatbuffertlös- ning vid pH 7] vid ungefär rumstemperatur i 5-60 sekunder i närvaro av kloramin T. Radioaktivt jod och kloramin T användas företrädesvis i mängder om l-5 mCi resp. 10-100 nano mol per nano mol tyrosin i TAG eller liknande. Det så märkta TAG eller liknande isoleras och separeras på konventionellt sätt och lagras om så erfordras i lyofiliserad form.

Enzymmärkt TAG, enzymmärkt TAG-liknande material och enzym- märkt lectin kan framställas enligt ett känt kopplingsfërfa- rande {t.ex. B.F. Erlanger et al., Acta. Endocrinol. Suppl., 168, 206 (1972) och M_E. Karol et al., Proc. Nat. Acad. Sci.

USA, 57, 713 (l967)]. Därvid bringas TAG eller det liknande materialet att reagera med enzym i en buffertlösning vid pH 4-6 (t.ex. l mM acetatbuffertlösning (pH 4,4)) vid rums- temperatur i 2-5 timmar i närvaro av ett oxidationsmedel såsom NaJO4 åtföljt av reduktion med NaBH4 eller liknande.

Enzym användes i en mängd av l-3 mol per mol TAG eller lik- nande. Det oxiderande medlet användes i en mängd av 100-300 mol per mol TAG eller liknande och reduktionsmedlet i en mängd av l-2 mol.

TAG, TAG-liknande material och lectin, märkt med fluoresce- rande material, framställes på så sätt att man bringar TAG 453 947 go 10 eller liknande att reagera med ett känt fluorescerande mate- rial såsom fluoresceinisotiocyanat (FÉTC) eller tetrametyl- rodaminisotiocyanat (RITC) i vatten eller en fysiologisk saltlösning med pH 6-8 vid 0°C till rumstemperatur, företrä- desvis vid rumstemperatur, under 0,5-3 timar (fluorescerande antikroppsförfarande: "Ikagaku Jikkenho Koza, No. 4", sid. 263-270). Det fluorescerande materialet användes företrädes- vis i en mängd av l/50 av TAG eller liknande.

Bestämningsförfarandet enligt uppfinningen enligt det kompe- titiva förfarandet eller sandwichförfarandet beskrives nedan.

Vid de tvâ förfarandena utföras reaktionerna i ett lämpligt lösningsmedel vid 4500 eller därunder, företrädesvis 4-40°C, mer föredraget vid 20-40°C. Såsom sådana lösningsmedel före- dragas de som inte ogynnsamt påverkar reaktionen mellan TAG eller TAG-liknande material med lectin, t.ex. vatten och buffertlösningar vid pH 6-7,8 (t.ex. 0,1-0,3M tris-klorväte- syrabuffertlösning (pä ungefär 7,5), O,lM fosfatbuffertlös- ning (pH ungefär 7,4) etc.). Reaktionerna utföres under 5-40 timmar, företrädesvis vid 15-25 timmar.

Separation av TAG (eller TAG-liknande material) bundet till leotin och ickebundet lectin eller ToG (eller TAG-liknande material) från varandra kan utföras på känt sätt. När olös- liggjort TAG (eller TAG-liknande material) eller olöslíggjort lectin användes är därvid enkel separation av fast fas från vätskefas tillräcklig (genom centrifugering, filtrering eller dekantering) och i andra fall kan man använda kromatografi, elektrofores, utsaltning, fraktionerifg, dialys, gelfiltrer- ing, adsorption eller kombinationer därav, eller ett separa- tionsförfarande med användning av agargel, agarosgel eller polyakrylamidgel (japanska patentansökan (OPI) nr. 151263/80) (uttrycket “OPI“ användes i föreliggande sæmnanhang såsom avseende en publicerad, icke granskad japansk patentansökning). 453 947 ll Märkninganedelsaktivitet för den så separerade produkten be- stämmes genom utval av en lämplig metod beroende på märknings~ medlets slag. Med enzym utväljes exempelvis ett lämpligt enzymsubstrat för kolorimetrisk analys, emissicnsanalys eller fluorescensanalys och eventuellt användes ett färgämne, ett luminöst medel eller ett färgmedel f är att mäta enzymaktivi- teten eller, när fluoresceringsmedlet eller ett radioaktivt material användes såsom märknirgsmedel, mätes intensiteten fluorescensen eller radioaktiviteten. Sålunda kan man bestäm- ma reagerat eller icke reagerat TAG, TAG-liknande material' eller lektin, och på denna grund karxman.beräkna kvantiteten av materialet i fråga.

Såsom beskrivits ovan möjliggör föeliggande uppfinning att på ett fördelaktigt sätt bestämma TAG i en kroppsvätska. Vi- dare kan man på basis av den så bestämda TAG-mängden diag- nostisera cancer vid varje stadium från tidigt stadiu till slutstadiet. Detta förfarande är särskilt användbart för upp- täckt av cancer i ett tidigt stadium. Emedan glykobindningen bestämmes enligt uppfinningen kan vidare denna diagnostise- ringsmetod användas för ett bredare omfång av cancertyper än de konventionella förfaranden, som utnyttjar antikroppar (Q-fetoproteixy CEA, etc.) vilka huvudsakligen bestämmer proteindelen, t.ex. magcancer, bröstcancer, carcinom i colon, rektal cancer, äggstockscancer, muncancer, tungcancer, strup- cancer, prostatacancer, liposarcom, malignt melanom, livmoder- carner, primärt magsarcom etc.

Förfarandet enligt uppfinningen utmärkes vidare därav, att det är höggradigt specifikt för cancrar och korsreagerar inte med determinanter i liknande substanser i kropp:ätskor från havande kvinnor och hos patienter, som lider av andra sjuk- domar än cancer, såsom gastrit, gastrisk ulcer, duodenal ulcer, colit, pancreatit, diabetes mellitus, nefritis, cysti- tis, ureteral sten, cholecystit, gallsten, collagensjukdomar, cerebro malaoia, apoplexi, angina pectoris, hjärtsvikt, myocardial infarkt, hypertension, arterit, depression, aller- 453 947 12 gisk coryza, purpura, pneumoni, pulmonär pneumatos, bronchit, asthma, akut hepatit, kronisk hepatit, etc.

Uppfinningen möjliggör vidare bestämning av galaktos-(ßlaß eller ßlfä4)-N-acetylglukosamin eller galaktos-(ßL+'3 eller Bl-94)-N-acetylgalaktosamin eller sockerarter eller socker- derivat (t.ex. glykoproteinter, glykopeptider, glykolipider, 'glykoterpen, glykostcroider etc.) som uppvisar denna glyko- bindning i ändställning.

Uppfinningen beskrives närmare medelst följande icke begrän- sande exempel, som avser föredragna utföringsformer av upp- finningen.

EXEMPEL l (i) Aktivering av peroxidas: 5 mg peroxidas (fràn pepparrot) löstes i l ml 0,3M vatten- lösning av natriumvätekarbonat. 0,1 ml av en 0,lM fluorodi- nitrobensenlösning i etanol sattes till den erhållna lösning- en, varefter omrördes försiktigt i l timme vid rumstempera- tur och tillsattes 0,l ml 0,06M NaJO,-lösning, med efterföl- jande försiktig omrörning i 30 minuter vid rumstemperatur.

Därefter sattes 1 ml 0,l6M etylenglykol till reaktionsbland- ningen och den erhållna lösningen omrördes försiktigt vid rumstemperatur i l timme. Därefter dialyserades lösningen gentemot 0,0lM kolsyra/natriumvätekarbonatbuffertlösning (pH 9,5) vid 4°C under en dag och en natt. (ii) Förfarande för märkning av lectin med peroxidas (lectin-peroxidas): 5 mg jordnötsleéitin löstes i 3 ml aktiverad peroxidas, som erhållits under (i) ovan, och omrördes försiktigt vid rums- temperatur i 2-3 timmar för reaktion. 5 mg NaBH4 tillsattes och fick reagera vid 4°C i 3 timmar. Därefter dialyserades denna lösning gentemot 0,lM trisklorvätesyrabuffertlösning (pH 7,4) under en dag och en natt och underkastades kolonn- II kromatografi med "Sephadex G 150 (elueringsmedel: 0,lM tris-klorvätesyrabuffertlösning; pH 7,4) för att genomföra 453 947 v s 13 gelfiltrering. Varje fraktion mättes vid 0D280 och OD403 och fraktioner med toppar för 0D280 och 0D403 tillvaratogs. (ii') Förfarande för framställning av renad lectinperoxidas: 20 ml lectinperoxidas, som erhållits enligt (ii) ovan, påför~ des galaktosagaros (AGALACTOPYRANOSYL AGAROSE(R) framställd av P.L.LaB. USA) och tvättades med 200 ml fysiologisk salt- lösning. Kolonnen eluerades med O,2M NaCl-lösning innehållan- de 0,5M laktos och den första 10 ml fraktionen som hade top- par för OD28O och OD4Û3 tillvaratogs och dialyserades gent- emot fysiologisk saltlösning under en dag och en natt för erhållning av renat lectinperoxidas. Produktens proteinhalt, som bestämdes enligt Lowrys metod (Lowry 0.H., et al, J. Biol.

Chem., 193, sid. 265 (1951)) var ungefär l g. Den renade lectinperoxidasen lyofiliserades. (iii) Förfarande för framställning av olösliggjord lectin (Förfarande för framställning av PNA-agaros): 15 g CNBr-aktiverad agaros suspenderades i 3 liter 0,00lN klorvätesyra och efter förvaring i 30 minuter tvättades den med l liter O,lM natriumvätekarbonat (pH 8,5) på ett glas- filter. På så sätt erhölls totalt ungefär 50 ml aktiverad agaros. Denna suspenderades i 200 ml O,lM natriumvätekarbonat (pH 8,5) och 5 ml av en 0,0lM fosfatbuffertlösning (pH 7,7) innehållande 50 mg jordnötslectin (nedan förkortat PNA) tillsattes och fick reagera vid rumstemperatur i 2 timmar under omröring då och då. Efter fullbordad reaktion tvättades reaktionslösningen på ett glasfilter och reaktionsprodukten sattes till 200 ml lM monoetanolaminlösning (pH 8,5) och fick reagera i 2 timmar vid rumstemperatur. Därefter tvättades reaktionsprodukten på ett glasfilter med l liter av en O,lM ättiksyrabuffertlösning (innehållande 0,5M NaCl) och l liter av en O,lM borsyrabuffertlösning (innehållande O,5M NaCl) alternerande tre gånger. 453 947 14 (iv) Förfarande för framställning av TAG-liknande material: 1 g sulfaterat glykoprotein av gastrisk slemhinna från svin (nedan förkortat PGM) suspenderades i 100 ml av en 0,05M fosfatbuffertlösning (pH 7,0) och lN NaOH i vattenlösning sattes droppvis därtill för inställning av pH på ll. Efter omröring i 30 minuter vid rumstemperatur centrifugerades blandningen i 10 minuter vid 3000 varv per minut och den överflytande vätskan inställdes på pH 7,0 med lN HCl, var- efter åter centrifugerades i 10 minuter vid 3000 varv per minut. Den överflytande vätskan dialyserades mot 10 literz" av en 0,0lM fosfatbuffertlösning (pH 7,0) över natten för erhållning av renat TAG-liknande material (rent PGM). (iv') Förfarande för framställning TAG-liknande material: Alternativt sattes rå PGM (100 g) till 1 liter destillerat vatten och fick stå över natten. Efter det att blandningen dialyserats gentemot destillerat vatten över natten centri- fugerades den (l00.000 g x l timme). Den överflytande vätskan tillvaratogs därefter och lyofiliserades för erhållning av ungefär 5,5 g renat PGM. (v) Förfarande för framställning av märkt TAG: (a) Märkning med ett enzym (PGM-peroxidas): 4 mg peroxidas från pepparrot (HRPO) (0,l)nn) löstes i l ml destillerat vatten. Därtill sattes 0,2 ml 0,lM NaJO4 och efteromrörningvid rumstemperatur i 20 minuter dialyserades lösningen gentemot l millimol ättiksyrabuffertlösning (pH 4,4) under en dag och en natt för avlägsning av icke reagerat NaJ0¿ Till denna dialyserade reaktionslösning sattes ungefär 60lpl av en 0,2M vätekarbonatbuffertlösning (pH 9,5) för inställ- ning av pH i lösningen pä 9,0. Till denna lösning sattes därefter omedelbart 0,6 ml PGM (10 mg/ml) löst i en 0,0lM vätekarbonatbuffertlösning (pH 9,5) och blandades i 2 timmar vid rumstemperatur och därtill sattes 0,1 ml av en 4 mg/ml NaBH4 4°C i 2 timmar. Vidare dialyserades denna lösning gentemot -lösning i destillerat vatten åtföljt av förvaring vid en 0,0lM fosfatbuffertlösning (pH 7,5) under en dag och en 453 947 15 natt och därefter renades med användning av Sephadex G-200(R) (1,5 x 150 cm) för erhâllning av ren ÉGM-peroxidas (PGM-POX).

Geleluanten tillvaratogs i 5 ml portioner, vars absorption bestämdes vid OD och OD 280 403' (b) Märkning med isetep (l25J-PsM)= Pen märkes med l25J enligt ett oxiaativt jeaineringeförfe- rande med användning av kloramin T. 10/pg PGM löstes i 50/pl av enlgš2M fosfatbuffertlösning_ (pH 7,0) och 10 )1l av 1 mCi Na J (bärarfri: N.E.N.) och 50/pg/100/pl kloramin T-lösning i en 0,2M fosfatbuffertlös- ning sattes därtill och efter blandning vid rumstemperatur i 30 sekunder tillsattes lO0JPg/l00lyl av en Na2S2O5-lösning i en 0,2M fosfatbuffertlösning. Därefter inblandades 1 mg Nalzs 125J-PGM renades på Sephadex G-50 l25J-PGM hade en radioaktivitet J. Den så erhållna (R) (lx30 cm). Den så framställda av ungefär 1-2 2101/ )1g. (vi) Bestämningsförfarande: 0,1 ml l25J-PGM (100 ng 0,17/pCi motsvarande ungefär 2,4xl0 cpm) erhållen enligt (v), 0,1 ml av ren standard PGM (0,1 )1g/m1, 0,2}1g/ml, 0,5 jag/ml, lfg/ml, 2,5)1g/m1, Sklg/ml, lülpg/ml) som erhållits under (iv), 0,1 ml PNA (10/pg/ml) och 0,2 ml av en 0,05M fosforsyrabuffertlösning (0,l5M NaCl; 0,l% BSA : 0,02% NaN ) blandades 1 ett 10 x 75 mm glas- rör och inkuberades vid 25äC i 1 timme. Efter fullfordad reak- tion tillsattes 0,l ml anti-PNA kaninserum (framställt av E.Y. Laboratory; 10 gånger utspädd lösning) till l25J-PGM bunden till PNA och l25J-PGM icke bunden till PNA och efter inkubering vid ZSOC i 1 timme centrifugerades reaktionslös- 5 ningen vid 4°C i 30 minuter vid 3000 varv per minut. Fällning- 125J-Pen bundet till PNA) räknades för erhâllning av en standardkurva (fig. 1). Av de så erhållna ens radioaktivitet ( resultaten framgår klart att % bundet (B/T) vanligen var 20-25% och 50% inhibering erhölls vid en koncentration av 0,6 fg/ml. 453 947 n 16 (vii) Framställning av olösliggjort TAG-liknande material: En överskottsmängd PGM sattes till l00 ml av en 0,0lM fosfatbuffertlösning (pH 7,0) för framställning av en suspen- sion. En 0,0lN NaOH-lösning sattes därtill för inställning av pH i suspensionen på ungefär ll, âtföljt av centrifuge- ring vid 3000 varv per minut i 20 minuter för tillvaratag- ning av den överflytande vätskan. Till denna sattes droppvis 0,02N HCl för inställning av pH på 7,0 och centrifugering utfördes åter vid 3000 varv per minut i 20 minuter. Den ;_' överflytande vätskan dialyserades mot 0,0lM fosfatbuffert- lösning (pH 7,0) för framställning av en PGM-lösning. Med avseende på sockerhalten och proteinhalten i lösningen be- stämdes hexoshalten till 5-7 mg/ml enligt en fenol-svavelsyra- -metod med användning av glukos såsom standard, och protein- halten bestämdes till 1-2 mg/ml med användning av BSA såsom standard. PGM-lösningen underkastades följande strâlnings- inducerade polymerisation.

Den strâlningsinducerade polymerisationen utfördes på följan- de sätt. Hydroxietylmetakrylat (HEMA) (användes som monomer) blandades med den ovan beskrivna PGM-lösningen i ett bland- ningsförhållande av 33:67 och den erhållna blandningen in- fördes i ett l cm x 15-20 cm glasrör och lyofiliserades hastigt till ~70°C eller lägre. Därefter bestrålades med l x 106 rad gammastrâlar för polymerisation av polymeren.

Vart och ett av de sålunda fixerade PGM-materialen bereddes genom skivning av polymerstaven till en tjocklek av l0)nn för framställning av skivor. (viii) Framställning av olösliggjort TAG-liknande material: (R) (framställd av 15 g (torrvikt) CNBr-aktiverad Sepharos 4B Pharmacia AB) suspenderades i 3 liter 0,00lN klorvätesyra och efter förvaring i 30 minuter tvättades med l liter 0,lM natriumvätekarbonat (pH 8,5) på ett glasfilter för erhâllning av ungefär 50 ml aktiverad Sepharose(R) i 200 ml 0,lM natriumvätekarbonat (pH 8,5) och 5 ml av en . Detta suspenderades 453 947 » u 17 0,0lM fosfatbuffertlösning (pH 7,7) innehållande 50 mg PGM sattes därtill âtföljt av reaktion vid.rumstemperatur i 2 timmar under omrörning då och då.

Efter fullbordad reaktion tvättades reaktionslösningen på ett glasfilter och reaktionsprodukten sattes till 200 ml av en lM monoetanolaminlösning (pH 8,5) åtföljt av reaktion vid rums~ temperatur i 2 timmar. Därefter tvättades reaktionslösningen på ett glasfilter med l liter av en O,lM ättiksyrabuffertlös- ning (innehållande 0,5M NaCl) och l liter av en O,lM bor- ; syrabuffertlösning (innehållande O,5M NaCl) alternerande tre gånger. (viii') Förfarande för framställning av olösliggjord TAG- -liknande material (framställning av PGM-pärlor) 10.000 polystyrenpärlor med en diameter av 6,4 mm, framställ- da av Precision Plastic Co., Ltd., U.S.A., tvättades med en utspädd lösning av syntetisk tvål (mamalemon(R), tillverkad av Lion Co., Ltd.) vid en koncentration av 1,5 ml/l liter destillerat vatten och därefter med destillerat vatten. Efter doppning i O,5M Na0H i vattenlösning i 3 dagar tvättades sedan pärlorna noggrant tills tvättvattnets pH blev ungefär 6. De sålunda tvättade 10.000 pärlorna infördes i 2,5 liter 35 procentig (vikt/volym) PGM-lösning i 50 millimol ättiksyra- buffert inställd på 4,5 med l0N NaOH, roterades vid ungefär 10 varv per minut i 24 timmar, filtrerades och tvättades med 8 liter destillerat vatten 4 gånger. Därefter infördes pär- lorna i 2,5 liter glutaraldehydlösning med den slutliga koncentrationen 1% (volym/volym) i 50 millimol natriumfosfat- buffert (pH 7) roterades vid 10 varv per minut i 2 timmar, filtrerades och tvättades med destillerat vatten på samma sätt som ovan beskrivits. De så behandlade 10.000 pärlorna infördes i 2,5 liter lM glycinlösning i 50 millimol natriumfosfatbuf- fert (pH 7,0), roterades vid 10 varv per minut i 2 timmar, filtrerades och tvättades med destillerat vatten på samma sätt som ovan beskrivits åtföljt av torkning vid 37°C över natten för erhållning av PGM-pärlor. Ytarean för pärlorna bestämdes 455 947 n 18 enligt Orcinol-HZSO4-metoden (M. Schönenberger, et al., Z.Physiol. Chem., 309, 145 (1957)) och det erhållna resulta- tet var 2,7 t 0,2 ng PGM/pärla. (ix) Framställning av testprov: 5 ml blod tillvaratogs från var och en av patienter med cancer, patienter med andra sjukdomar, havande kvinnor och friska personer med användning av heparinbehandlad spruta (500 enheter) och centrifugerades i 10 minuter vid 2000 varv per minut och den överflytande vätskan tillvaratogs för I framställning av testprov.

EXEMPEL 2 Kompetítivt förfarande: En skiva av en disk (olösliggjort TAG-liknande material framställd enligt (vii)) infördes i 504yl PNA-bunden peroxi- das (märkt lectin framställd enligt (ii)) och 200lpl av testprovet (testprovet framställt enligt (ix)) och inkubera- des vid 25°C i 20 timmar. Därefter tvättades disken med PBS och infördes i 2,0 ml av en saltlösning i vatten och 0,5 ml av ett peroxidasmaterial sattes därtill âtföljt av inku- bering via 25°c 1 1 timme. Därefter tillsattes 1,0 ml 3N klorvätesyra och absorbansen mättes vid 492 nm. Vid samma tidpunkt mättes absorbansen på samma sätt bortsett från för- ändring av provet till olika koncentrationer av ett standard- material (PGM) för framställning av en kalibreringskurva (fig. 2). Dessutom bestämdes TAG i de enligt (ix) erhållna testproven med användning av kalibreringskurvan. De så er- hållna resultaten visas i fig. 3 och fig. 4.

Såsom klart framgår från fig. 3 och fig. 4 förefanns en dis- tinkt skillnad med avseende på TAG-halt mellan friska perso- ner och patienter som led av olika typer av cancer.

EXEMPEL 3 Sandwichförfarande: 200lpg PNA~agaros framställd enligt (iii) sattes till l00lpl 453 947 19 av en 0,05M fosfatbuffertlösning (pH 7,0) innehållande löst 1-1o yg/mi PGM och inkubering utfördes vid zs°c 1 1 timme under omrörning. Efter tvättning av reaktionslösningen tre gånger med en 0,05M fosfatbuffertlösning (pH 7,0) tillsattes 6 /pg PNA-märkt med peroxidas erhâllen enligt exempel l (ii) och l00lpl av en 0,05M fosfatbuffertlösning (pH 7,0) åtföljt av inkubering vid 25°C i l timme under omrörning.

Efter centrifugering vid 3000 varv per minut 1 l0 minuter tillvaratogs fällningen och tvättades tre gånger med en 0¿0§M fosfatbuffertlösning (pH 7,0) och absorbansen mättes vid 4§2 nm. De så erhållna resultaten visas i fig. 5.

EXEMPEL 4 Kompetitivt förfarande: _ 100/pl av ett prov (det testprov som erhölls enligt förfaran- det (ix) ovan) infördes i ett provrör, vartill 500/pl 0,3M tris-HCl-buffert (pH 7,4) innehållande en slutlig halt motsva- rande 0,22% (vikt/volym) gelatin, 5 millimol CaCl2 och 5 mil- limol MgCl2. En PGM-pärla (olösliggjort TAG-liknande material framställd enligt förfarandet (viii')) och 100/pl lectin peroxidas (det-lyofiliserade märkta lectinet som framställts enligt förfarandet (ii') ovan vid en koncentration av l mg/l av den ovan beskrivna tris-HCl-bufferten) sattes till provet och efter omrörning inkuberades blandningen i 24 timmar. Reak- tionsblandningen avlägsnades med användning av en aspirator och pärlan tvättades med 2 ml fysiologisk saltlösning âtföljt av avlägsning av tvättvätskorna med användning av en aspi- rator. Detta tvättningssteg upprepades tre gånger. 60 mg ortofenylendiamin löstes i 20 ml 0,2M Mcllevein-buffert (pH 5,8) och H2O2 sattes till den erhållna lösningen till en slutlig koncentration av 0,02 % (volym/volym) och blandning- en omrördes till bildning av ett färgande medel.

I ett provrör infördes 2 ml fysiologisk saltlösning och 500 /pl av det färgande medlet såväl som den tvättade pärlan åt- följt av inkubering vid rumstemperatur i 30 minuter. Därefter 453 947 'a 20 avbröts den enzymatiska reaktionen med l ml 3N HCl. Reaktions- blandningens optimala densitet bestämdes vid 492 nm. Vid sam- ma tidpunkt mättes absorbansen på samma sätt bortsett från förändring av provet till olika koncentrationer av ett stan- darmaterial (PGM) för framställning av en kalibreringskurva (fig. 6). Vidare bestämdes TAG i de enligt (ix) ovan erhållna testproven med användning av kalibreringskurvan. De erhållna resultaten visas i fig. 7a, 7b, 7c och 7d.

Uppfinningen har ovan beskrivits i detalj med hänvisning till specifika utföringsformer därav, men det är uppenbart för en fackman att olikartade förändringar och modifikationer kan göras utan att uppfinningstanken frângås.

Claims (15)

453 947 .il PATENTKRAV
1. l. Förfarande för bestämning av tumörassocierad glykobindning (TAG), dvs. sockerrester med en bindningsspecificitet för jordnötslektin eller ricinbönlektin eller med socker besläkt- tade substanser som innehåller nämnda sockerrester såsom en ändgrupp, k ä n n e t e c k n a t därav, att man bringar i kroppsvätska föreliggande TAG, som skall bestämmas, och en förutbestämd mängd genom kemisk eller fysikalisk bindning till en olöslig bärare olösliggjort TAG eller TAG-liknande mate- rial, avs. gaiakws-(ßi-ya eller ß1->4)-N-acetyigiukosaminf i' galaktos-(ßl->3 eller Bl-)4)-N-acetylgalaktosamin eller ett sockerderivat innehållande nämnda sockerkedja såsom ändgrupp, att under konkurrens reagera med en förutbestämd mängd med ett enzym, ett fluorescerande material eller ett radioaktivt mate- rial märkt jordnötslektin eller ricinbönlektin, att man sepa- rerar nämnda olösliggjorda TAG eller TAG-liknande material, som är bundet till märkt lektin, och icke-bundet lektin från varandra genom centrifugering, filtrering eller dekantering, och att man mäter märkningsmedlets aktivitet i ettdera av des- Sa.
2. 2. Förfarande enligt patentkravet 1; k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda lektín är jordnötslektin.
3. 3. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda kroppsvätska är blod, cellvävnadsvätska, lymfvätska, toraxvätska, abdominalvätska, amníonvätska, mag- saft, urin, pankreassekret, cerebrospinalvätska eller saliv.
4. 4. Förfarande enligt patentkravet 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda kroppsvätska är blodserum eller blodplasma.
5. 5. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda TAG-liknande material är asialoderivat av bovint fetuin-glykoprotein, sulfaterat glykoprotein från svin, humant glykoprotein från magslemhinna eller asialoderivat av humant ml surt glykoprotein. 455 947 u
6. 6. Förfarande för bestämning av tumörassocierad glykobindning (TAG), dvs. sockerrester med en bindningsspecificitet för jordnötslektin eller ricinbönlektin eller med socker besläkta- de substanser som innehåller nämnda sockerrestef såsom en änd- grupp, k ä n n e t e c k n a t därav, att man bringar i kroppsvätska föreliggande TAG, som skall bestämmas, och en förutbestämd mängd med ett enzym, ett fluorescerande material eller ett radioaktivt material märkt TAG eller märkt TAG-lik- nande material, dvs. galaktos-(ßl-)3 eller Bl->4)-N-acetylglu- kosamin, galaktos-(ßl-93 eller ßl1>4)-N-acetylgalaktosamin_ eller ett sockerderivat innehållande nämnda sockerkedja såsom ändgrupp, att under konkurrens reagera med en förutbestämd mängd jordnötslektin eller ricinbönlektin eller genom kemisk eller fysikalisk bindning till en olöslig bärare olösliggjort lektin, att man genom centrifugering, filtrering, dekantering, kromatografi, elektrofores, utsaltning, fraktionering, dialys, adsorption eller användning av gel, separerar märkt TAG eller märkt TAG-liknande material, som är bundet till lektin eller olösliggjort lektin, och icke-bundet märkt TAG eller märkt TAG-liknande material från varandra, och att man mäter märk- ningsmedlets aktivitet i ettdera av dessa.
7. 7. Förfarande enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda lektin är jordnötslektin.
8. 8. Förfarande enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda kroppsvätska är blodserum eller blodplasma.
9. 9- Förfarande enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda TAG~liknande material är asialoderivat av bovint fetuin-glykoprotein, sulfaterat glykoprotein från svin, humant glykoprotein från magslemhinna eller asialoderivat av humant qä surt glykoprotein.
10. 10. Förfarande enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att kroppsvätskan utgöres av blod, cellvävnadsvätska, lymfvätska, toraxvätska, abdominalvätska, amnionvätska, mag- saft, urin, pankreassekret, cerebrospinalvätska eller saliv. 453 947 9.3
11. ll. Förfarande för bestämning av tumörassocierad glykobindning (TAG), dvs. sockerrester med en bíndningsspecificitet för jordnötslektin eller ricinbönlektin eller med socker besläkta- de substanser som innehåller nämnda sockerrester såsom en änd- grupp, k ä n n e t e c k n a t därav, att man bringar i kroppsvätska föreliggande TAG, som skall bestämmas, att rea- gera med ett genom kemisk eller fysikalisk bindning till en olöslig bärare olösliggjort jordnötslektin eller ricinbönlek- tin till bildning av ett komplex av TAG och olösliggjort lek- tin, att man bringar detta komplex att reagera med en förut- bestämd mängd med ett enzym, ett fluorescerande material eller ett radioaktivt material märkt lektin, att man genom centri- fugering, filtrering eller dekantering separerar komplexet bundet till det märkta lektinet och icke-bundet märkt lektin från varandra, och att man mäter märkningsmedlets aktivitet i ettdera av dessa.
12. 12. Förfarande enligt patentkravet ll, k ä n n e t e c k n a t därav, att kroppsvätskan utgöres av blod, cellvävnadsvätska, lymfvätska, toraxvätska, abdominalvätska, amnionvätska, mag- saft, urin, pankreassekret, cerebrospinalvätska eller saliv.
13. 13. Förfarande enligt patentkravet ll, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda lektín är jordnötslektin.
14. 14. Förfarande enligt patentkravet ll, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda kroppsvätska är blodserum eller blodplasma.
15. 15. Metod vid dägnos av cancer, k_ä n n e t e c k n a d därav, att man mäter halten av tumörassocierade glykobindningar i kroppsvätska från en patient enligt den metod som beskrives i något av patentklravetn l, 6 och ll samt jämför den sålunda uppmätta halten med den hos en person med normal hälsa.