JPH0792458B2 - 糖鎖特異抗体アツセイプレ−ト及びその製造方法 - Google Patents
糖鎖特異抗体アツセイプレ−ト及びその製造方法Info
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- JPH0792458B2 JPH0792458B2 JP61057772A JP5777286A JPH0792458B2 JP H0792458 B2 JPH0792458 B2 JP H0792458B2 JP 61057772 A JP61057772 A JP 61057772A JP 5777286 A JP5777286 A JP 5777286A JP H0792458 B2 JPH0792458 B2 JP H0792458B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、複合糖質糖鎖に特異的な抗体を検出検定する
ためのアッセイプレートに関し、このプレートを利用す
ることによって糖鎖特異的単クローン抗体を産生するハ
イブリドーマを効率的に作製することができる。
ためのアッセイプレートに関し、このプレートを利用す
ることによって糖鎖特異的単クローン抗体を産生するハ
イブリドーマを効率的に作製することができる。
自然界に広く存在する糖タンパク質、糖脂質、ムコ多糖
などの複合糖質の糖鎖を認識する特異的な抗体の作製に
ついては多くの試みがなされてきたが、一般には作製し
難いとされている。
などの複合糖質の糖鎖を認識する特異的な抗体の作製に
ついては多くの試みがなされてきたが、一般には作製し
難いとされている。
現在作製されているもののほとんどは、Ａ、Ｂ、Ｈ、Le
a、Leb、Ｉ等のごとき各種の血液型活性物質に対するも
ので、これらはそれなりに価値あるものではあるが、例
えば細胞のガン性変化を認識し得るようなものは少な
い。ガン化に伴って細胞表面の複合糖質糖鎖に変化が起
こることが予測されており、その変化が多様であること
から、多数の糖鎖特異的抗体の作製が強く要望されてい
る。この要望に応えるため、従来は、細胞またはそれを
ホルムアルデヒドなどで処理したもの、あるいは細胞か
ら調製した複合糖質標品を、単独またはアジュバントと
共に血流、腹腔、皮下、皮内等に投与して生物を免疫
し、血清中の抗体と、免疫に用いた細胞またはその修飾
物との結合力を指標として血中抗体価を検定するのが通
常であった。
a、Leb、Ｉ等のごとき各種の血液型活性物質に対するも
ので、これらはそれなりに価値あるものではあるが、例
えば細胞のガン性変化を認識し得るようなものは少な
い。ガン化に伴って細胞表面の複合糖質糖鎖に変化が起
こることが予測されており、その変化が多様であること
から、多数の糖鎖特異的抗体の作製が強く要望されてい
る。この要望に応えるため、従来は、細胞またはそれを
ホルムアルデヒドなどで処理したもの、あるいは細胞か
ら調製した複合糖質標品を、単独またはアジュバントと
共に血流、腹腔、皮下、皮内等に投与して生物を免疫
し、血清中の抗体と、免疫に用いた細胞またはその修飾
物との結合力を指標として血中抗体価を検定するのが通
常であった。
上述のような検定法を用いる場合、血中の抗体のほとん
どが細胞表面のタンパク質成分に特異的であるため、こ
れらの抗体の中から糖鎖に対する抗体を選択することは
事実上不可能であった。
どが細胞表面のタンパク質成分に特異的であるため、こ
れらの抗体の中から糖鎖に対する抗体を選択することは
事実上不可能であった。
本発明の目的は、血中の多種の抗体の中から糖鎖に特異
的なものの力価のみを検定しうるアッセイプレートを提
供し、これを基にして糖鎖特異的抗体を産生するクロー
ンの分離を可能にしようとするものである。
的なものの力価のみを検定しうるアッセイプレートを提
供し、これを基にして糖鎖特異的抗体を産生するクロー
ンの分離を可能にしようとするものである。
本発明は、ムチン型糖ペプチド、アルキレンジアルデヒ
ドと、塩基性ポリペプチド又は塩基性合成ポリマーと、
の存在下に固相化せしめてなる糖鎖特異抗体アッセイプ
レート、並びに、その製造法を提供するものである。な
お、本発明において、糖ペプチドには糖タンパク質も包
含される。
ドと、塩基性ポリペプチド又は塩基性合成ポリマーと、
の存在下に固相化せしめてなる糖鎖特異抗体アッセイプ
レート、並びに、その製造法を提供するものである。な
お、本発明において、糖ペプチドには糖タンパク質も包
含される。
本発明に係るアッセイプレートを調製するには、細胞ま
たはそれに由来する生物標品、単離した糖タンパク質よ
り、プロテアーゼ等による消化等を徹底的に行なって、
ペプチド部分を出来得る限り除去して糖ペプチドを調製
した後、これを抗原抗体反応のアッセイ用プレート上に
固相化吸着させる。
たはそれに由来する生物標品、単離した糖タンパク質よ
り、プロテアーゼ等による消化等を徹底的に行なって、
ペプチド部分を出来得る限り除去して糖ペプチドを調製
した後、これを抗原抗体反応のアッセイ用プレート上に
固相化吸着させる。
本発明に係るアッセイプレートを用いることによって糖
鎖特異的抗体を検出および力価検定し、抗体産生ハイブ
リドーマを選択し、糖鎖特異的抗体を産生するクローン
を単離することが可能となる。
鎖特異的抗体を検出および力価検定し、抗体産生ハイブ
リドーマを選択し、糖鎖特異的抗体を産生するクローン
を単離することが可能となる。
糖鎖特異的抗体を検出および力価検定するには、まず、
糖鎖を糖ペプチドの形で調製し、これを吸着させたプレ
ートに、検定すべき、例えば血清または細胞培養液を加
え、さらに一次抗体に対する二次抗体またはプロテイン
Ａ（例えば、当井化学社製）を加え、これに予め結合さ
せてある放射標識または、容易に活性測定可能な酵素を
指標として測定するものである。
糖鎖を糖ペプチドの形で調製し、これを吸着させたプレ
ートに、検定すべき、例えば血清または細胞培養液を加
え、さらに一次抗体に対する二次抗体またはプロテイン
Ａ（例えば、当井化学社製）を加え、これに予め結合さ
せてある放射標識または、容易に活性測定可能な酵素を
指標として測定するものである。
本発明では糖ペプチドの起源として、ガン細胞および各
種のムチン型糖タンパク質を用いているが、この方法は
当然他のいかなる動植物細胞、微生物細胞、さらには各
種の単離した糖タンパク質にも適用し得るものである。
種のムチン型糖タンパク質を用いているが、この方法は
当然他のいかなる動植物細胞、微生物細胞、さらには各
種の単離した糖タンパク質にも適用し得るものである。
糖ペプチドの調製には、ストレプトマイセス・グリセウ
ス（Streptomyces griseus）より分離した非特異的プロ
ティナーゼ（proteinase）である、例えばプロナーゼＰ
（Pronase P:科研製薬製品）またはこれと同等のタンパ
ク質分解酵素を用いうるが、その分解は可能な限りのア
ミノ酸を除去する徹底的な分解が必要である。
ス（Streptomyces griseus）より分離した非特異的プロ
ティナーゼ（proteinase）である、例えばプロナーゼＰ
（Pronase P:科研製薬製品）またはこれと同等のタンパ
ク質分解酵素を用いうるが、その分解は可能な限りのア
ミノ酸を除去する徹底的な分解が必要である。
糖ペプチドの分画に用いるセファデックスＧ−25（ファ
ルマシア社製）は、通常粒子サイズのもの、あるいは
「ファイン」と呼ばれるもののいずれをも用いることが
できる。勿論、これと同等の効果を有する、例えば米国
バイオラッド社製のバイオーゲルＰ−４またＰ−６の使
用も可能である。セファデックスＧ−50についてはバイ
オーゲルＰ−６またはＰ−10も同等に使用できる。カラ
ムのサイズは試料量に応じて適宜定め、例えば試料量が
10ml程度であれば1.3×60cmのカラムが適当である。
ルマシア社製）は、通常粒子サイズのもの、あるいは
「ファイン」と呼ばれるもののいずれをも用いることが
できる。勿論、これと同等の効果を有する、例えば米国
バイオラッド社製のバイオーゲルＰ−４またＰ−６の使
用も可能である。セファデックスＧ−50についてはバイ
オーゲルＰ−６またはＰ−10も同等に使用できる。カラ
ムのサイズは試料量に応じて適宜定め、例えば試料量が
10ml程度であれば1.3×60cmのカラムが適当である。
オルシノールー硫酸反応は糖ペプチドの一般的な糖成分
である中性糖（ガラクトース、マンノースなど）の定量
に用いる簡便な方法であるが、比較的少量の細胞を出発
材料とする場合は、培養の際、放射標識をもつ単糖（通
常3H-または14C-グルコサミン）を加えた培地を用いて
糖ペプチドの糖鎖部分を代謝的に標識しておき、カラム
からの溶出画分をモニターする方法もある。
である中性糖（ガラクトース、マンノースなど）の定量
に用いる簡便な方法であるが、比較的少量の細胞を出発
材料とする場合は、培養の際、放射標識をもつ単糖（通
常3H-または14C-グルコサミン）を加えた培地を用いて
糖ペプチドの糖鎖部分を代謝的に標識しておき、カラム
からの溶出画分をモニターする方法もある。
セファデックスＧ−50による分画によって得られる２つ
の画分は抗体力価の検定に用いるだけの抗原としては、
それ以上の分画精製は必要ないが、抗原決定基の決定に
用いる場合にはさらにセファデックスＧ−200または他
の同等のゲル濾過効果を有する手段により精製すること
が望ましい。ムチン型糖ペプチドに混入したムコ多糖体
は検出用プレートを製造するためには何らの支障も無
い。
の画分は抗体力価の検定に用いるだけの抗原としては、
それ以上の分画精製は必要ないが、抗原決定基の決定に
用いる場合にはさらにセファデックスＧ−200または他
の同等のゲル濾過効果を有する手段により精製すること
が望ましい。ムチン型糖ペプチドに混入したムコ多糖体
は検出用プレートを製造するためには何らの支障も無
い。
固相化用プレートとしては、合成樹脂、セルロース類、
ガラス、木片、繊維、紙などを使用することができる。
合成樹脂とは、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、
ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、ポリ
ビニルアルコール、ポリエステル、ポリアミド、ポリウ
レタン、ポリエーテル、ナイロンなど、及びこれらにア
ミノ基、カルボキシル基等の官能基を付与せしめたもの
例示することができる。また、セルロース類とは、セル
ロース、酢酸セルロース、エチルセルロース、硝酸セル
ロースなどを意味する。就中ポリ塩化ビニル製ミクロタ
イタープレート〔例えば、コースター2595（米国コース
ター社製）〕の使用が便利である。
ガラス、木片、繊維、紙などを使用することができる。
合成樹脂とは、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、
ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、ポリ
ビニルアルコール、ポリエステル、ポリアミド、ポリウ
レタン、ポリエーテル、ナイロンなど、及びこれらにア
ミノ基、カルボキシル基等の官能基を付与せしめたもの
例示することができる。また、セルロース類とは、セル
ロース、酢酸セルロース、エチルセルロース、硝酸セル
ロースなどを意味する。就中ポリ塩化ビニル製ミクロタ
イタープレート〔例えば、コースター2595（米国コース
ター社製）〕の使用が便利である。
ムチン型糖ペプチドのプレートへの吸着は、アルキレン
ジアルデヒドと、塩基性ポリマーすなわち塩基性ポリペ
プチドもしくは塩基性合成ポリマーと、を介して行な
う。アルキレンジアルデヒドとしては、一般式 OHC(CH2)nCHO （但し、式中ｎは１〜８の整数を表わす。）で表わされ
るアルデヒドが好ましい。とりわけ、ｎが２〜５のジア
ルデヒド、特に、グルタルアルデヒドが好ましく用いら
れる。塩基性ポリペプチドとしては、特にポリリジンが
好ましく用いられ、塩基性合成ポリマーとはビニルピリ
ジンポリマー、ビニルアミンポリマーなど、ポリマー鎖
上にアミノ基またはイミノ基を有するポリマーを意味す
る。
ジアルデヒドと、塩基性ポリマーすなわち塩基性ポリペ
プチドもしくは塩基性合成ポリマーと、を介して行な
う。アルキレンジアルデヒドとしては、一般式 OHC(CH2)nCHO （但し、式中ｎは１〜８の整数を表わす。）で表わされ
るアルデヒドが好ましい。とりわけ、ｎが２〜５のジア
ルデヒド、特に、グルタルアルデヒドが好ましく用いら
れる。塩基性ポリペプチドとしては、特にポリリジンが
好ましく用いられ、塩基性合成ポリマーとはビニルピリ
ジンポリマー、ビニルアミンポリマーなど、ポリマー鎖
上にアミノ基またはイミノ基を有するポリマーを意味す
る。
上記固相化剤の中、グルタルアルデヒドとポリリジンを
用いる吸着法は、従来は細胞をプレートに吸着させるた
めに用いられているが（例えば、R.S.Metzgarら、Proc.
Natl.Acad.Sci.,81,5242〜5246（1984））、これを糖ペ
プチドに対して用いたのは本発明が最初であり、この点
が本発明の特徴の一つである。この吸着反応においては
糖ペプチドのアミノ基とポリリジンのアミノ基の間にグ
ルタルアルデヒドがシッフ塩基形成による架橋を形成す
るものと推定され、この結合は、還元剤、例えば水素化
ホウ素ナトリウム（NaBH4）等による還元によって、よ
り安定な結合に変更できるが、中性付近の操作において
は特に還元安定の必要は無い。
用いる吸着法は、従来は細胞をプレートに吸着させるた
めに用いられているが（例えば、R.S.Metzgarら、Proc.
Natl.Acad.Sci.,81,5242〜5246（1984））、これを糖ペ
プチドに対して用いたのは本発明が最初であり、この点
が本発明の特徴の一つである。この吸着反応においては
糖ペプチドのアミノ基とポリリジンのアミノ基の間にグ
ルタルアルデヒドがシッフ塩基形成による架橋を形成す
るものと推定され、この結合は、還元剤、例えば水素化
ホウ素ナトリウム（NaBH4）等による還元によって、よ
り安定な結合に変更できるが、中性付近の操作において
は特に還元安定の必要は無い。
以下、本発明を参考例及び実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
参考例１ （がん細胞よりの糖ペプチドの調製） ヒト腸がん株化細胞（SW1116,LS180,HCT8など、いずれ
もATCCより入手）を10％子牛胎児血清を含むダルベッコ
の培地で培養した。収穫した細胞は、リン酸緩衝食塩水
（以下PBSと略記する；食塩137mM、塩化カリウム2.7m
M、リン酸−水素ナトリウム8.1mM、リン酸二水素カリウ
ム1.5mM、塩化カルシウム1.0mM、塩化マグネシウム0.5m
M、pH7.4）で繰返し洗浄したのち、１％トライトンＸ−
100（ロームアンドハース社製）を含むPBSを加えて、氷
冷下に撹拌し、遠心分離により上清を得、この上清を透
析の後、凍結乾燥した。これをクロロホルム／メタノー
ル（2:1、容量比）で充分に脱脂し、0.01Mの酢酸カルシ
ウムを含む酢酸緩衝液に懸濁して、プロナーゼＰ（科研
製薬社製品）を1/50（乾燥物に対する重量比）加え、37
℃で３日間放置してタンパク質分解を行った。この間、
防腐のために少量のトルエンを加えた。
もATCCより入手）を10％子牛胎児血清を含むダルベッコ
の培地で培養した。収穫した細胞は、リン酸緩衝食塩水
（以下PBSと略記する；食塩137mM、塩化カリウム2.7m
M、リン酸−水素ナトリウム8.1mM、リン酸二水素カリウ
ム1.5mM、塩化カルシウム1.0mM、塩化マグネシウム0.5m
M、pH7.4）で繰返し洗浄したのち、１％トライトンＸ−
100（ロームアンドハース社製）を含むPBSを加えて、氷
冷下に撹拌し、遠心分離により上清を得、この上清を透
析の後、凍結乾燥した。これをクロロホルム／メタノー
ル（2:1、容量比）で充分に脱脂し、0.01Mの酢酸カルシ
ウムを含む酢酸緩衝液に懸濁して、プロナーゼＰ（科研
製薬社製品）を1/50（乾燥物に対する重量比）加え、37
℃で３日間放置してタンパク質分解を行った。この間、
防腐のために少量のトルエンを加えた。
ほぼ透明となった可溶化消化液に等容の10％トリクロロ
酢酸を加えて生じた不溶物を遠心分離して除いた。上清
の糖ペプチド溶液からトリクロロ酢酸を除去するため
に、等容のエチルエーテルを加えてよく混和し、遠心分
離してエーテル層を除いた。このエーテル抽出を約３回
繰返し、水層のpHが約５になったことを確かめたのち、
予め0.5Mピリジン−酢酸緩衝液（pH5.0）で平衡化した
セファデックスＧ−25を充填したカラム（1.5×60cm）
に注入し、同じ緩衝液により展開して流出液をフラクシ
ョンコレクターにより採取し、オルシノールー硫酸に陽
性の画分を集めて凍結乾燥した。これを0.5Mピリジンー
酢酸緩衝液（pH5.0）に溶解ののち、セファデックスＧ
−50を用いて同様にゲル濾過し、セファデックスＧ−50
を用いて同様にゲル濾過し、フラクションコレクターで
5mlずつの画分に分けた（第１図）。この分画によって
Ｇ−50を素通りした画分（Ｇ−50−Ｉ）と遅れて溶出さ
れる画分（Ｇ−50−II）が得られ、前者には通常ムチン
型（Ｏ−グリコシド型）糖タンパク質由来の糖ペプチ
ド、後者は血清型（Ｎ−グリコシド型）糖タンパク質由
来の糖ペプチドが含まれる。すなわち、第１図は、上記
のことを、フラクション番号（横軸）と〔14C-〕グルコ
サミン放射活性（dpm×10-3/20μｌ、縦軸）との関係で
示したグラフである。
酢酸を加えて生じた不溶物を遠心分離して除いた。上清
の糖ペプチド溶液からトリクロロ酢酸を除去するため
に、等容のエチルエーテルを加えてよく混和し、遠心分
離してエーテル層を除いた。このエーテル抽出を約３回
繰返し、水層のpHが約５になったことを確かめたのち、
予め0.5Mピリジン−酢酸緩衝液（pH5.0）で平衡化した
セファデックスＧ−25を充填したカラム（1.5×60cm）
に注入し、同じ緩衝液により展開して流出液をフラクシ
ョンコレクターにより採取し、オルシノールー硫酸に陽
性の画分を集めて凍結乾燥した。これを0.5Mピリジンー
酢酸緩衝液（pH5.0）に溶解ののち、セファデックスＧ
−50を用いて同様にゲル濾過し、セファデックスＧ−50
を用いて同様にゲル濾過し、フラクションコレクターで
5mlずつの画分に分けた（第１図）。この分画によって
Ｇ−50を素通りした画分（Ｇ−50−Ｉ）と遅れて溶出さ
れる画分（Ｇ−50−II）が得られ、前者には通常ムチン
型（Ｏ−グリコシド型）糖タンパク質由来の糖ペプチ
ド、後者は血清型（Ｎ−グリコシド型）糖タンパク質由
来の糖ペプチドが含まれる。すなわち、第１図は、上記
のことを、フラクション番号（横軸）と〔14C-〕グルコ
サミン放射活性（dpm×10-3/20μｌ、縦軸）との関係で
示したグラフである。
フラクション番号20〜29までの画分を集め凍結乾燥し、
これをセファデックスＧ−200を用いてゲル濾過するこ
とによって血清型糖ペプチドを含まないムチン型糖ペプ
チドを得た。
これをセファデックスＧ−200を用いてゲル濾過するこ
とによって血清型糖ペプチドを含まないムチン型糖ペプ
チドを得た。
参考例２ （顎下腺よりのムチン型糖タンパク質の調製） ウシ、ブタ、ヒツジ等の顎下腺よりのムチン型糖タンパ
ク質の調製は文献記載の方法によって行なった。
ク質の調製は文献記載の方法によって行なった。
ウシ、ヒツジの場合は、G.Tettamantiら、Arch.Bioche
m.Biophys.,124,41〜50,1968、ブタの場合はM.De Saleg
uiら、Arch.Biochem.Biophys.,129,49〜56,1969,にそれ
ぞれ依拠した。
m.Biophys.,124,41〜50,1968、ブタの場合はM.De Saleg
uiら、Arch.Biochem.Biophys.,129,49〜56,1969,にそれ
ぞれ依拠した。
これらの糖タンパク質よりプロナーゼ消化によって糖ペ
プチドを調製することができるが、後述のプレートへの
吸着には糖ペプチドとする必要がなく、糖タンパク質そ
のままの方が好ましい。
プチドを調製することができるが、後述のプレートへの
吸着には糖ペプチドとする必要がなく、糖タンパク質そ
のままの方が好ましい。
実施例１ （ムチン型糖ペプチドまたは糖タンパク質のプレートへ
の吸着） 細胞由来のムチン型糖ペプチドのプレートへの吸着は次
のようにして行なう。
の吸着） 細胞由来のムチン型糖ペプチドのプレートへの吸着は次
のようにして行なう。
ムチン型糖ペプチド1mgを水1mlに溶かす。吸着のための
試薬として以下の溶液を用意する。
試薬として以下の溶液を用意する。
0.9％食塩および0.02％のアジ化ナトリウムを含むPBS、
0.25％グルタルアルデヒドを含むPBS、1mlPBS当り0.25m
gのポリリジン（シグマ社製P1274、平均分子量90,000）
を含む溶液である。プレートへの吸着には、ムチン型糖
ペプチド溶液100μｌ、PBS1.9ml、グルタルアルデヒド
溶液33μｌを混じ、ポリ塩化ビニル製ウエル数96のミク
ロタイタープレートの１ウエル当り、この混合液を20μ
ｌ分注し、室温で約１時間放置する。
0.25％グルタルアルデヒドを含むPBS、1mlPBS当り0.25m
gのポリリジン（シグマ社製P1274、平均分子量90,000）
を含む溶液である。プレートへの吸着には、ムチン型糖
ペプチド溶液100μｌ、PBS1.9ml、グルタルアルデヒド
溶液33μｌを混じ、ポリ塩化ビニル製ウエル数96のミク
ロタイタープレートの１ウエル当り、この混合液を20μ
ｌ分注し、室温で約１時間放置する。
次いで、ポリリジン溶液を１ウエル当り10μｌずつ注入
し、プレートを適宜振とうしてウエル内溶液を素早く混
合したのち、４℃で２日間放置する。この方法により糖
ペプチドの約50％がプレートに吸着される。
し、プレートを適宜振とうしてウエル内溶液を素早く混
合したのち、４℃で２日間放置する。この方法により糖
ペプチドの約50％がプレートに吸着される。
ムチン型糖タンパク質のプレートへの吸着にはウシ、ブ
タ、ヒツジ等の顎下腺より調製したムチン型糖タンパク
質を水1mlの濃度で溶かした溶液を用いる以外は、細胞
由来のムチン型糖ペプチドに対して用いたと同じ条件を
用いる。
タ、ヒツジ等の顎下腺より調製したムチン型糖タンパク
質を水1mlの濃度で溶かした溶液を用いる以外は、細胞
由来のムチン型糖ペプチドに対して用いたと同じ条件を
用いる。
なお、ムチン型糖タンパク質の場合には、グルタルアル
デヒドを用いずに、ポリリジンのみを吸着助剤として用
いても、また、さらに吸着助剤を全く用いない場合で
も、プレートへのかなりの吸着が見られるが、グルタル
アルデヒドとポリリジンを用いた場合に吸着の割合は最
高となる。
デヒドを用いずに、ポリリジンのみを吸着助剤として用
いても、また、さらに吸着助剤を全く用いない場合で
も、プレートへのかなりの吸着が見られるが、グルタル
アルデヒドとポリリジンを用いた場合に吸着の割合は最
高となる。
参考例３ （血清型糖ペプチドのプレートへの吸着） 細胞由来、あるいは他の生物材料に由来する血清型糖タ
ンパク質より調製した糖ペプチドのプレートへの吸着は
以下の様にして行なう。
ンパク質より調製した糖ペプチドのプレートへの吸着は
以下の様にして行なう。
すなわち、血清型糖ペプチドのプレートへの吸着には、
糖ペプチドに脂溶性を持たせることが必要である。この
脂溶性付与のために、高級脂肪酸、例えば、ラウリン
酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラ
キジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの飽和脂肪
酸、またはオレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラ
キドン酸などの不飽和脂肪酸を結合せしめる。
糖ペプチドに脂溶性を持たせることが必要である。この
脂溶性付与のために、高級脂肪酸、例えば、ラウリン
酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラ
キジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの飽和脂肪
酸、またはオレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラ
キドン酸などの不飽和脂肪酸を結合せしめる。
これらの脂肪酸を糖ペプチドに結合せしめるには、通常
のカルボン酸によるアシル化法、例えば、ジシクロカル
ボジイミド（DCC）などの縮合剤を用いる方法、酸無水
物による方法、酸ハロゲン化物による方法、活性エステ
ル法などを適用すればよい。
のカルボン酸によるアシル化法、例えば、ジシクロカル
ボジイミド（DCC）などの縮合剤を用いる方法、酸無水
物による方法、酸ハロゲン化物による方法、活性エステ
ル法などを適用すればよい。
この様にして得られる脂溶性糖ペプチドをプレートに吸
着させるには、糖ペプチドを適当な溶媒、例えばピリジ
ン、ジメチルホルムアミドなどに溶解し、要すれば水を
加えて得られる溶液で上記のプレートを処理すればよ
い。糖ペプチドを吸着したプレートは、要すれば減圧下
に、五酸化リン、酸化カルシウムなどの乾燥剤の存在下
に乾燥すればよい。
着させるには、糖ペプチドを適当な溶媒、例えばピリジ
ン、ジメチルホルムアミドなどに溶解し、要すれば水を
加えて得られる溶液で上記のプレートを処理すればよ
い。糖ペプチドを吸着したプレートは、要すれば減圧下
に、五酸化リン、酸化カルシウムなどの乾燥剤の存在下
に乾燥すればよい。
具体例は次のとおりである。
血清型糖ペプチド2.5mgを80μｌの水に溶解し、これに2
00μｌのピリジンを加え、次いでパルミチン酸無水物9.
915mgをピリジン1mlに溶かした溶液を加えて撹拌し、37
℃で６時間反応させる。反応液をロータリーエバポレー
ターで乾固し、エーテルで洗浄ののち再び乾固してパル
ミトイル化糖ペプチド（以下、pal/GPと略記する）の乾
燥物を得る。糖ペプチドとして2.5mg相当のpal−GPを2.
04mlの98％ピリジンに溶解し、水1.837mlを加えたのち
ミクロタイタープレートに１ウエル当り20μｌを分注す
る。プレートはデシケーター中五酸化リンの存在下で乾
固したのち、１％牛血清アルブミン（１％BSA）を含むP
BS 150μｌで３回洗浄して、付着しなかった糖ペプチド
を除去し、再び乾固する。この方法により糖ペプチドの
約10％がプレートに吸着される。
00μｌのピリジンを加え、次いでパルミチン酸無水物9.
915mgをピリジン1mlに溶かした溶液を加えて撹拌し、37
℃で６時間反応させる。反応液をロータリーエバポレー
ターで乾固し、エーテルで洗浄ののち再び乾固してパル
ミトイル化糖ペプチド（以下、pal/GPと略記する）の乾
燥物を得る。糖ペプチドとして2.5mg相当のpal−GPを2.
04mlの98％ピリジンに溶解し、水1.837mlを加えたのち
ミクロタイタープレートに１ウエル当り20μｌを分注す
る。プレートはデシケーター中五酸化リンの存在下で乾
固したのち、１％牛血清アルブミン（１％BSA）を含むP
BS 150μｌで３回洗浄して、付着しなかった糖ペプチド
を除去し、再び乾固する。この方法により糖ペプチドの
約10％がプレートに吸着される。
参考例４ （糖鎖特異的抗体の検出及び力価検定） 細胞、あるいは糖タンパク質標品をマウス等に投与する
ことによって作製された免疫血清を0.1％BSA、0.02％ア
ジ化ナトリウムを含むPBS溶液で希釈し、その20μｌ
を、糖ペプチドを吸着させたプレートに加えて４℃で一
夜放置した。次いで１％BSAを含むPBSで洗浄したのち、
125Iで標識した125I−プロテインＡ（10万cpm）のPBS溶
液50μｌを加えて２時間室温に放置した。次いで、PBS1
50μｌを用いた洗浄を繰返し、洗浄液の放射性が消失し
たのち、プレートのカウントを測定した。
ことによって作製された免疫血清を0.1％BSA、0.02％ア
ジ化ナトリウムを含むPBS溶液で希釈し、その20μｌ
を、糖ペプチドを吸着させたプレートに加えて４℃で一
夜放置した。次いで１％BSAを含むPBSで洗浄したのち、
125Iで標識した125I−プロテインＡ（10万cpm）のPBS溶
液50μｌを加えて２時間室温に放置した。次いで、PBS1
50μｌを用いた洗浄を繰返し、洗浄液の放射性が消失し
たのち、プレートのカウントを測定した。
以上詳細に説明したように、本発明により作製した固相
化糖ペプチド（または糖タンパク質）を使用することに
よって、糖鎖特異的抗体の検定が可能となり、このこと
によって糖鎖特異的抗体を産生するハイブリドーマの作
製も可能になった。
化糖ペプチド（または糖タンパク質）を使用することに
よって、糖鎖特異的抗体の検定が可能となり、このこと
によって糖鎖特異的抗体を産生するハイブリドーマの作
製も可能になった。
第１図は本発明で使用する糖ペプチドの分離結果をフラ
クション番号と〔14C〕グルコサミン放射活性との関係
で示したグラフである。
クション番号と〔14C〕グルコサミン放射活性との関係
で示したグラフである。
Claims (9)
- 【請求項１】ムチン型糖ペプチドを、アルキレンジアル
デヒドと、塩基性ポリペプチド又は塩基性合成ポリマー
と、の存在下に固相化せしめてなることを特徴とする糖
鎖特異抗体アッセイプレート。 - 【請求項２】アルキレンジアルデヒドが OHC(CH2)nCHO 〔但し、式中ｎは１〜８の整数を表わす。〕 で表わされることを特徴とする特許請求の範囲（１）記
載の糖鎖特異抗体アッセイプレート。 - 【請求項３】アルキレンジアルデヒドがグルタルアルデ
ヒドであることを特徴とする特許請求の範囲（１）記載
の糖鎖特異抗体アッセイプレート。 - 【請求項４】塩基性ポリペプチドがポリリジンであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲（１）記載の糖鎖特異抗
体アッセイプレート。 - 【請求項５】アルキレンジアルデヒドと、塩基性ポリペ
プチド又は塩基性合成ポリマーと、の存在下において、
ムチン型糖ペプチドを固相化用プレートに固相化せしめ
ることを特徴とする糖鎖特異抗体アッセイプレートの製
造法。 - 【請求項６】アルキレンジアルデヒドが OHC(CH2)nCHO 〔但し、式中ｎは１〜８の整数を表わす。〕 で表わされることを特徴とする特許請求の範囲（５）記
載の糖鎖特異抗体アッセイプレートの製造法。 - 【請求項７】アルキレンジアルデヒドがグルタルアルデ
ヒドであることを特徴とする特許請求の範囲（５）記載
の糖鎖特異抗体アッセイプレートの製造法。 - 【請求項８】塩基性ポリペプチドがポリリジンであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲（５）記載の糖鎖特異抗
体アッセイプレートの製造法。 - 【請求項９】固相化用プレートが合成樹脂、セルロース
類、ガラス、木片、繊維または紙であることを特徴とす
る特許請求の範囲（５）記載の糖鎖特異抗体アッセイプ
レートの製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61057772A JPH0792458B2 (ja) | 1986-03-14 | 1986-03-14 | 糖鎖特異抗体アツセイプレ−ト及びその製造方法 |
| US07/025,103 US4851357A (en) | 1986-03-14 | 1987-03-12 | Plates for assay of sugar chaindirected antibody and production thereof |
| EP87302239A EP0242057B1 (en) | 1986-03-14 | 1987-03-16 | Plates for assay of sugar chain-directed antibody and production thereof |
| ES87302239T ES2023893B3 (es) | 1986-03-14 | 1987-03-16 | Lamina para el tratamiento de un anticuerpo de cadena dirigida de azucar y produccion del mismo. |
| DE8787302239T DE3772088D1 (de) | 1986-03-14 | 1987-03-16 | Platten zur bestimmung von antikoerper gegen zuckerketten und deren herstellung. |
| AT87302239T ATE66301T1 (de) | 1986-03-14 | 1987-03-16 | Platten zur bestimmung von antikoerper gegen zuckerketten und deren herstellung. |
| GR91401093T GR3002481T3 (en) | 1986-03-14 | 1991-08-16 | Plates for assay of sugar chain-directed antibody and production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61057772A JPH0792458B2 (ja) | 1986-03-14 | 1986-03-14 | 糖鎖特異抗体アツセイプレ−ト及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62212568A JPS62212568A (ja) | 1987-09-18 |
| JPH0792458B2 true JPH0792458B2 (ja) | 1995-10-09 |
Family
ID=13065160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61057772A Expired - Lifetime JPH0792458B2 (ja) | 1986-03-14 | 1986-03-14 | 糖鎖特異抗体アツセイプレ−ト及びその製造方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4851357A (ja) |
| EP (1) | EP0242057B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0792458B2 (ja) |
| AT (1) | ATE66301T1 (ja) |
| DE (1) | DE3772088D1 (ja) |
| ES (1) | ES2023893B3 (ja) |
| GR (1) | GR3002481T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5075218A (en) * | 1987-12-29 | 1991-12-24 | Biomira, Inc. | Screening for antibodies which bind carbohydrate epitopes of tumor-associated antigens, and uses thereof |
| WO1990012892A1 (en) * | 1989-04-14 | 1990-11-01 | The Regents Of The University Of California | Human intestinal mucin |
| AU6406390A (en) * | 1989-08-24 | 1991-04-03 | Ramsey Foundation | Method and apparatus for the measurement of organic antigens |
| US5731157A (en) * | 1993-12-30 | 1998-03-24 | The Procter And Gamble Company | Two-site allergen immunoassay |
| US6418340B1 (en) * | 1999-08-20 | 2002-07-09 | Cardiac Pacemakers, Inc. | Method and system for identifying and displaying groups of cardiac arrhythmic episodes |
| AU2003203034A1 (en) * | 2002-01-14 | 2003-07-30 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Mucin immobilized chromatography |
| JPWO2004058687A1 (ja) | 2002-12-26 | 2006-04-27 | 塩野義製薬株式会社 | 糖鎖捕捉分子を用いた糖鎖精製濃縮法および糖鎖構造解析法 |
| JP2006055141A (ja) * | 2004-08-24 | 2006-03-02 | Tokai Univ | 糖鎖構造に特異的な抗体の同定方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4067959A (en) * | 1976-05-10 | 1978-01-10 | International Diagnostic Technology, Inc. | Indirect solid surface test for antigens or antibodies |
| US4075194A (en) * | 1976-12-09 | 1978-02-21 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Novel synthetic undecapeptide and clinical assay |
| US4493793A (en) * | 1978-12-26 | 1985-01-15 | E-Y Laboratories | Soluble immunoassay reagent comprising lectin covalently bonded to reactive component |
| US4410634A (en) * | 1979-10-26 | 1983-10-18 | Dynasciences Corporation | Method of passively adsorbing immuno-reactive haptens to solid phases |
| JPS56163456A (en) * | 1980-05-21 | 1981-12-16 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | Preparation of antigen |
| JPS5729949A (en) * | 1980-07-30 | 1982-02-18 | Nippon Koutai Kenkyusho:Kk | Determination of sugar branch related to cancer and diagnostic technique of cancer |
| IT1218348B (it) * | 1983-05-13 | 1990-04-12 | Farmaceutico Lofarma S A S Ora | Metodo per legare in modo stabile antigenti e allergeni a supporti solidi |
| US4607009A (en) * | 1983-09-16 | 1986-08-19 | The Wistar Institute | Lewis blood group phenotype assay |
| US4623629A (en) * | 1983-10-31 | 1986-11-18 | Daniel Kerschensteiner | Solid-phase immunoassay support and method of use thereof |
| US4675287A (en) * | 1984-07-26 | 1987-06-23 | Scripps Clinic And Research Foundation | Monoclonal antibody directed to human ganglioside GD2 |
| JP2519038B2 (ja) * | 1986-07-29 | 1996-07-31 | 郁男 山科 | 単クロ―ン抗体及びその製造方法 |
| US5073493A (en) * | 1987-05-29 | 1991-12-17 | Ikuo Yamashina | Monoclonal antibody nky13 |
-
1986
- 1986-03-14 JP JP61057772A patent/JPH0792458B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-03-12 US US07/025,103 patent/US4851357A/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-16 AT AT87302239T patent/ATE66301T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-03-16 ES ES87302239T patent/ES2023893B3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-16 DE DE8787302239T patent/DE3772088D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-16 EP EP87302239A patent/EP0242057B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-08-16 GR GR91401093T patent/GR3002481T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62212568A (ja) | 1987-09-18 |
| ES2023893B3 (es) | 1992-02-16 |
| EP0242057A1 (en) | 1987-10-21 |
| DE3772088D1 (de) | 1991-09-19 |
| ATE66301T1 (de) | 1991-08-15 |
| US4851357A (en) | 1989-07-25 |
| GR3002481T3 (en) | 1992-12-30 |
| EP0242057B1 (en) | 1991-08-14 |
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