NL8103606A - Werkwijze voor het bepalen van met tumoren geassocieerde glucosidische bindingen en werkwijze voor de diagnose van kanker. - Google Patents

Description

V - \ - I Werkwijze voor het bepalen van met tumoren geassocieerde | glucosidische bindingen en werkwijze voor de diagnose van ! kanker.

i i

Deze uitvinding betreft een werkwijze voor het in lichaamsvloeistoffen van zoogdieren bepalen van met tumoren geassocieerde glucosidische bindingen (hierna afgekort ! tot TAG), waaronder glucoproteïnen, glucopetiden, glucolipiden | 5 en/of suikers die eindstandig galactose-((31 -> 3 of $1 ->4)- N-acetylglucosamine of galactose-(81 -#· 3 of 81 -4)-N- | acetylgalactosamine die sterk toenemen met de voortwoekering j van ongedifferentieerde cellen, in het bijzonder kankercellen, j ; en betreft ook een werkwijze voor de diagnose van kanker door | 10 het bepalen van de bovengenoemde TAG.

I Als methode voor de diagnose van kanker is voorgesteld bepaalde glucoproteïnen te bepalen die men specifiek vindt in patiënten die aan kanker lijden. Deze methode berust bijvoorbeeld in hoofdzaak hierop dat het eiwit-deel van j 15 de glucoproteïnen antigeen werkt, en er is een methode voor de ! diagnose van primaire leverkanker bekend waarbij men het j αΐ-fetoproteïne meet, en ook een methode voor de diagnose van \ i kanker van het maagdarmkanaal, vooral kanker in het rectum, door het CEA te meten (zie blz. 235-250 in "Igaku No Ayumi" 20 ("Progress in Medicine") Vol. 106 (1978)). Maar deze diagnosemethoden zijn betrekkelijk beperkt in hun toepasbaarheid, en er bestaat behoefte aan een algemene diagnose voor zeer uiteenlopende soorten kanker.

Tot dusver waren geen methoden voor de diag-25 nose van kanker bekend op basis van de specifieke glucosidische i bindingen die met het voorkomen van tumoren geassocieerd worden. :

Nu werd echter gevonden dat de lichaamsvloeistof van een patiënt met kanker stoffen met voor tumoren specifieke glucosidische bindingen bevat die geproduceerd wor-30 den door ongedifferentieerde cellen (voornamelijk kankercellen) en aan de lichaamsvloeistof afgegeven, en deze glucosiden onder- 81 0 3 6 0 6 - 2 -

scheiden zich duidelijk van andere glucosiden door structuur I

i van de suiker-keten, lengte van die keten en aard van de samen- j stellende suikers. Bij uitputtend speurwerk werd gevonden dat j deze TAG optreden in glucoproteïnen, glucopeptiden, gluco- i 5 lipiden en/of suikers mét eindstandige galactose-(βΐ -> 3 of βΐ -> 4)-N-acetylglucosamine of galactose(f31 -:> 3 of 01 -> 4)-N-acetylgalactosamine, en dat materiaal met deze TAG specifiek met lectine combineert en dat de aanwezigheid of afwezigheid van kankercellen, mate van voortwoekering, welzijn 10 of afsterven der cellen en dergelijke nagegaan kan worden door lichaamsvloeistoffen met lectine te laten reageren, waardoor men kanker kan herkennen. Deze uitvinding is op die vondsten gebaseerd.

De uitvinding verschaft dus een werkwijze j 15 voor het bepalen van TAG volgens een competitieve methode of een sandwich-methode, en ook een werkwijze voor de diagnose van kanker door het meten van het gehalte aan TAG.

In de hierbij behorende tekeningen geeft figuur 1 een standaardkromme verkregen bij de competitieve j l I 20 methode volgens de uitvinding en figuur 2 een ijkkromme voor deze

! I

j competitieve methode, laten figuren 3 en 4 de TAG-gehalten van j ! gezonde personen en van kankerpatiënten zien, bepaald met de methode volgens de uitvinding, tonen figuren 5 en 6 de ijk- j krommen voor de sandwich-methode en de competitieve methode vol- ! 25 gens deze uitvinding, en laten figuren 7a, 7b, 7c en 7d ons TAG-! gehalten, bepaald met de methode van deze uitvinding, zien, ; 7a die van gezonde personen, 7b en 7c die van patiënten met ! kanker en 7d die van patiënten die aan andere kwalen dan aan kan-! ker lijden (ook geen zwangere vrouwen).

| 30 Het oogmerk van deze uitvinding kan op een i van de volgende wijzen bereikt worden: (1) Men laat de te onderzoeken lichaamsvloeistof in competitie met een bekende hoeveelheid onoplosbaar gemaakt TAG of TAG-achtig materiaal reageren met een bepaalde hoeveelheid lectine 35 dat op een of andere wij ze gemerkt is (hierna "gemerkt lectine" genoemd), waarna men het onoplosbare TAG of TAG-achtige mate- 8103606 - 3 - riaal met daaraan gemerkt lectine scheidt van niet gebonden lec-tine, en men het merk in een van beide fracties meet, (2) men laat het te onderzoeken materiaal in competitie met een j bekende hoeveelheid TAG of TAG-achtige materiaal, dat op een of 5 andere wij ze gemerkt is, (hierna "gemerkt TAG of TAG-achtig materiaal" genoemd) reageren met een bepaalde hoeveelheid lectine of onoplosbaar gemaakt lectine, waarna men het aan lectine gebonden gemerkte TAG of TAG-achtige materiaal scheidt van het j ! niet gebonden TAG of TAG-achtige materiaal, en men het merk 10 in een van beide fracties meet, en j (3) men laat het te onderzoeken materiaal reageren met onoplos- | baar gemaakt lectine, en daarna dit onoplosbare TAG-lectine- j complex met een bepaalde hoeveelheid gemerkt lectine, waarna j men complex gebonden gemerkt lectine en niet gebonden gemerkt j 15 lectine van elkaar scheidt, en men het merk in een van beide | i i

fracties meet. I

Deze bepalingsmethode kan toegepast worden j op zeer uiteenlopende lichaamsvloeistoffen, waaronder bloed, j i weefselvocht, lymphe, thorax-vocht, buikvocht, amnionvocht, j i 20 maagsap, urine, pancreassap, cerebrospinale vloeistof en i speeksel. De bepaling in bloed zal hieronder van het meeste belang blijken te zijn. De te gebruiken hoeveelheid lichaamsvloeistof varieert in het algemeen van 1 tot 10 ml, en ligt het meest tussen 2 en 5 ml. De lichaamsvloeistof kan zo nodig eerst 25 gezuiverd worden om er de materialen met glucosidische bindingen, zoals glucoproteïnen, glucopeptiden, glucolipiden en/of sacchariden, uit af te zonderen.

Voor dit afzonderen of opsterken gebruikt men bekende methoden zoals uitzouten, neerslaan, extractie, 30 centrifugeren, dialyse, het doorlopen van molecuulzeven, inactiveren van enzymen, of een combinatie daarvan. Meer in het i | bijzonder verkrijgt men zo'n fractie door het toevoegen van I sulfosalicylzuur, trichloorazijnzuur of zinksulfaat aan serum of plasma, of door het verhitten van serum of plasma en het af-35 filtreren van het aldus ontstane neerslag (albumine, immuno-globuline, enz.), of door het uitvoeren van dialyse.

8103606 - 4 -

Bij de bepalingsmethode volgens deze uitvinding kan men lichaamsvloeistoffen zoals die opgevangen worden, behalve bloed, direct als te onderzoeken materiaal dienen. Maar om te voorkomen dat deze monsters bederven en versterkt met 5 lectine reageren kunnen aan de monsters beschermende eiwitten j met lagere suikers, zoals runder-serumalbumine, toegevoegd wor- j den. Verder kan in sommige gevallen het toevoegen van een geschikte hoeveelheid beschermend eiwit aan een monster waaruit j albumine, immunoglobuline e.d. verwijderd is goede resultaten 10 geven. En bloedmonsters worden op de bekende wijze in serum- monsters omgezet, waarbij men als anti-coagulans heparine, EDTA,j j citroenzuur of iets dergelijks toevoegt; bij voorkeur gebruikt men een met heparine behandeld monster. Indien een hoog TAG-j gehalte verwacht wordt, zoals bij ascites, kunnen de monsters 15 desgewenst met een geschikte buffer verdund worden. j

Als lectine dat men bij de werkwijze volgens de uitvinding gebruikt kan men met name die noemen die specifiek met galactose-(βΐ -> 3 of βΐ -> 4)-N-acetyl- glucosamine of galactose-(βΐ -> 3 of βΐ -^ 4)-N-acetyl-

! 20 galactosamine combineren / zie J. Biol. Chem. 250, (1975), I

8518-8523; Biochem. Biophys. Res. Comm. 62 (1975), 144; j ! Z. Immuniatsforch. 138 (1969), 423-433; Br. J. Exp. Pathol. 27_, \ (1946), 228-236; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, No. 5, j (1978), 2215-2219; Biochemistry -_13, (1974), 196-204; Carbo- j 25 hydrate Research, 5J_ (1976), 107—118_7 zoals de lectines uit j aardnoten of castorbonen (Ricinus communis), enz. j

Voor het merken van het lectine kunnen divert se enzymen, fluorescerende stoffen en radioactieve stoffen die- j nen. Deze enzymen omvatten glucoamylase, glucose-oxydase, | !" 30 peroxydase, alkalische fosfatase, β-galactosidase en actieve I fragmenten van het hemóctapeptide, enz.; fluorescerende stoffen > zijn o.a. fluoresceïne, fluoresceïne-isothiocyanaat, rhodamine, ; dansylchloride (dat is 5-dimethylamino-1-nafthaleensulfonyl- 1 chloride), enz.; radioactieve materialen zijn bijvoorbeeld 35 radioactief jodium ( JJ, J, enz.), radioactief tritium, enz.

8103606 - 5 - j In deze beschrijving worden met "TAG-achtig ! materiaal" galactose-(βΐ -> 3 of βΐ -> 4)-N-acetylglucos-

.... I

amine en galactose-(f31 -> 3 of (31 -—4)-N-acetylgalactos- j amine bedoeld, en de suiker-derivaten die eindstandig derge-5 lijke groepen bevatten. Als dergelijke suiker-derivaten kunnen bijvoorbeeld de glucoproteïnen uit menselijk maagsap en de glucoproteïnen, verkregen door het verwijderen van eindstandig | glucose uit gesulfateerde glucoproteïnen van de varkensmaagwand j genoemd worden, alsmede de'lgG-glucoproteïnen uit mensen en run- 10 deren en de asialo-derivaten daarvan, het asialo-derivaat van het glucoproteïne uit varkensthyroglobuline met B glucosidische I bindingen, het glucoproteïne van het β-deel van ovomucoïde, j l j ! het glycoproteïne B-l van menselijk IgE en het asialo-derivaat daarvan, de asialo-derivaten van glucoproteïnen B-2 en B-3 van J 15 menselijk IgE, van glucoproteïnen II-A, II-B en II-C van mense- j lijk IgA}, van menselijk transferrine-glucoproteïne, van runder- | foet-glucoproteïne, van het glucoproteïne dat deelneemt in de i opname van asialo-glucoproteïne in de protoplasma-membranen van de konijnenlever, van het zure glucoproteïne öj uit de mens, 20 van glucofoline, van het glucoproteïne of glucopeptide van het T-antigeen e.d. zoals beschreven in "Biochemical Data Book I" (verzameld door de Japanse Chemische Vereniging en gepubliceerd ; door Tokyo Kagaku Dojin (nov. 26, 1979), blz. 503-510), en van de glucolipiden uit runderërythrocyten, beschreven in de zojuist 25 genoemde verzameling, blz, 840-841, alsmede de gesulfateerde ! glucoproteïnen uit varkensmaagslijmvlies. Hieronder gaat de j i voorkeur uit naar de asialo-derivaten van glucoproteïnen uit i de runder-foeten en van het menselijke zure otj-glucoproteïne, en naar de gesulfateerde glucoproteïnen uit maagslijmvlies van 30 mens of varken.

Onoplosbaar gemaakt TAG.of TAG-achtig materiaal en.onoplosbaar gemaakt lectine worden bereid door respec-! tievelijk TAG, TAG-achtig materiaal of lectine te laten reageren met een onoplosbare drager. Als zo'n onoplosbare drager kunnen ; 35 bijvoorbeeld genoemd worden cellulosepoeder, Sephadex,

Sepharose, polystyreen, filtreerpapier, carboxymethylcellulose, ionenwisselaar, dextran, plastic foelie of buis, nylon, glas- 8103606 - 6 -

......................................................................................... ' ...... " " ............................................. I

parels, zijde, aminemethylvinylether-maleïnezuur-copolymeer, amino-zuur-copolymeren, etheen-maleïnezuur-copolymeren, enz.

Het onoplosbaar maken kan gebeuren door het slaan van covalente bindingen (bijvoorbeeld met diazo-groepen), door het maken van 5 peptide-bindingen (m.b.v. zuuramide-derivaten, kunsthars-carbon-| zuurchloriden, kunsthars-diïmiden, maleïnezuuranhydride-deriva- ten, isocyanaat-derivaten, broomcyaan-geactiveerde polysaccha-riden, cellulosecarbonaat, of een of andere condensatiemiddel, enz.) of door alkylering of door middel van een verknoper zoals 10 glutaaraldehyde, hexamethyleenisocyanaat, enz., of door een binding m.b.v. de Ugi-reactie e.d., of met ionenkrachten aan een ionenwisselaar, en door fysieke absorptie aan poreus glas in j ! de vorm van glasparels. Hieronder gaat de voorkeur uit naar het I gebruik van met broomcyaan geactiveerde polysacchariden of naar 15 de toepassing van verknopingsmiddelen, In het eerste geval laat i ! men het TAG, het TAG-achtige materiaal of het lectine 2 tot 4 uur bij 0 tot 40°C (bij voorkeur bij 20 tot 30°C) in een geschikt oplosmiddel reageren met een 10- tot 1000-voudige hoeveelheid j met broomcyaan geactiveerde drager.

20 Ook kan men onoplosbaar gemaakt TAG, TAG- achtigmateriaal of lectine verkrijgen met een door bestraling geïnduceerde polymerisatie. Men maakt dan een waterige dispersie van een po lymeriseerbaar monomeer aan die TAG of TAG-achtig materiaal bevat en bestraalt dit met deze ioniserende straling, 25 waardoor dat monomeer gaat polymeriseren. Voor het aanmaken van j de waterige dispersie wordt een hydrofoob polymeriseerbaar mono-; meer (A) in 0,1-5 gew.% waterige oplossing van een in water j oplosbaar polymeer (B) gedispergeerd. Of een mengsel van een hydrofoob polymeriseerbaar monomeer (A) en een hydrofiel poly- : | 30 meriseerbaar monomeer (C) wordt in 3-20 gew.% waterige zout oplossing gedispergeerd, of een hydrofoob polymeriseerbaar mono- j j meer (A) wordt gedispergeerd in een. waterige oplossing van 0,01- ; 5 gew.% oppervlak-actiêvê stof (D). Als de aldus aangemaakte dispersie met licht of met ioniserende straling bestraald wordt 35 wordt het daarin aanwezige polymeriseerbare monomeer gepolymeri-seerd tot een matrix voor het TAG of aanverwant materiaal. Desge- 8103606 - 7 - wenst kan dit tot vellen of deeltjes gevormd worden. |

Als voorbeelden van hydrofobe polymeriseer-bare monomeren (A) kunnen genoemd worden glycidylmethacrylaat, ethyleendimethacrylaat, diéthyleenglycoldimethacrylaat, tri-5 ethyleenglycoldimethacrylaat, trimethylolpropaantrimethacrylaat, polyethyleenglycol-200-dimêthacrylaat, dipropyleenglycoldimetha-crylaat, butyleen-1,4-dimethacrylaat, hexyleen-l, 6-dimethacry-laat, methoxyethoxyethylmêthacrylaat, methylmethacrylaat, ethylmethacrylaat, butylmethacrylaat en de overeenkomstige 10 acrylaten. In het algemeen kan hier elk in water onoplosbaar j monomeer gebruikt worden dat zich door bestraling met licht of andere straling laat polymeriseren.

Voorbeelden van in water oplosbare polymeren (B) zijn polyvinylpyrrolidon, polymethacrylzuur, poly- j 15 acrylzuur, polyvinylalkohol, hydroxypropylcellulose, arabische | gom, enz.

Voorbeelden van hydrofiele polymeriseerbare | - i | monomeren (G) zijn 2-hydroxyêthylmethacrylaat, methoxytetra- | i i ethyleenglycolmethacrylaat, methoxypolyethyleenglyco1-400- | 20 methacrylaat, methoxypolyethyleenglycol-1000-methacrylaat, polyethyleenglycol-400-dimethacrylaat, polyethyleenglycol-600-dimethacrylaat en de overeenkomstige acrylaten, alsmede metha-crylzuur, acrylamide, N-vinyl-2-pyrrolidon, enz. In het algemeen is ieder in water oplosbaar monomeer dat door bestraling ! 25 tot polymerisatie gebracht kan worden geschikt, ongeacht de j soort. ;

Als voorbeelden van oppervlak-actieve stof (D) kan men noemen natriumlaurylsulfaat, kaliumoleaat, natrium-oleaat, sorbitanmonolauraat, sorbitanmonostearaat, sorbitan-30 monoöleaat, propyleenglycolmonolauraat, oliezuur, natriumdodecyl-j benzeensulfonaat, enz. Maar iedere oppervlak-actieve stof die ! het polymeriseerbare monomeer of de TAG of het TAG-achtige ma- ! teriaal in de micellen kan houden, ongeacht de soort.

Radioactief gemerkte TAG, TAG-achtig mate- 35 riaal en lectine kunnen bereid worden door in TAG, TAG-achtig ma-' .... 125 teriaal of lectine een radioactief jodiumatoom zoals J of 8103606 - 8 - ............ ..............j 31 J in te voeren. Dit laatste gebeurt gewoonlijk door een gewone jodering, bijvoorbeeld een oxydatieve jodering met behulp ί van chlooramine T (zie Nature 194 (1962) 495 en Biochem. J. 89, (1963) 114). Een dergelijke jodering gebeurt in een geschikt 5 oplosmiddel (bijvoorbeeld een buffer-oplossing met pH 6-8, bij voorkeur 0,2 M fosfaatbuffer met pH = 7, in ongeveer 5 tot j 60 seconden bij kamertemperatuur in aanwezigheid van chlooramine T. Per nanomol tyrosine in TAG e.d. gebruikt men bij voorkeur 1 tot 5 mCi radioactief jodium en 10 tot 100 nanomol chlooramine 10 T. Het aldus gemerkte TAG e.d. wordt op gebruikelijke wijze ge-j isoleerd en bewaard, zonodig in gevriesdroogde vorm.

Met enzym gemerkt TAG, TAG-achtig materiaal i of lectine kan bereid worden met bekende koppelingstechnieken, i. bijvoorbeeld zoals beschreven door B.F. Erlanger et al; Acta ; 15 Endocrinol. Suppl. 168 (1972) 206 en M.H. Karol et al; Proc.

Nat. Acad. Sci. USA, .57 (1967) 713. Het TAG e.d. laat men 2 tot 5 uur bij kamertemperatuur in een buffer met pH tussen 4 en 6 (bijv. 1 mM acetaat-buffer met pH = 4,4) met een oxydatiemiddel j zoals NaJO^ reageren, en daarna met een reductiemiddel zoals 20 NaBH^ e.d. Per mol TAG e.d. gebruikt men 1 tot 3 mol enzym, 100 tot 300 mol oxydatiemiddel en 1 tot 2 mol reductiemiddel.

Met fluorescerend materiaal gemerkte TAG, TAG-achtig materiaal en lectine worden bereid door TAG e.d. i | 0,5 tot 3 uur bij een temperatuur tussen 0 en kamertemperatuur ! j 25 (bij voorkeur bij kamertemperatuur) reageren met een bekende j fluorescerende stof zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) j of tetramethylrhodamine-isothiocyanaat (RITC), zoals voor anti- i lichamen beschreven in "Ikagaku Jikkenho Koza, No. 4", blz.

| 263-270. Van het fluorescerende materiaal gebruikt men bij | 30 voorkeur 1 dl per 50 din TAG e.d.

De bepalingsmethode volgens de uitvinding door competitie of met een sandwich-methode ai hierna beschreven worden.

Bij beide methoden gebeuren de reacties in 35 een geschikt oplosmiddel bij 45°C of lager, bij voorkeur tussen 8103606 V- - 9 - 4° en 40°C en het beste tussen 20° en 40°C. Als oplosmiddel komen die in aanmerking die de reactie van TAG of TAG-achtig materiaal met lectine niet ongunstig beïnvloeden, zoals water en ί buffer-oplossingen met pH tussen 6 en 7,8 (bijvoorbeeld 0,1 tot ( | 5 0,3 M tris-HCl-buffer net pH van ongeveer 7,5 en 0,1 M fosfaat- buffer met pH van ongeveer 7,4. De reactie duurt 5 tot 40 uur, meestal tussen 15 en 25 uur.

Het afscheiden van aan lectine gebonden ! TAG of TAG-achtig materiaal van het lectine dat niet gebonden 10 is kan op bekende wijze gebeuren. Waar onoplosbaar gemaakte j ! TAG, TAG-achtig materiaal of lectine gebruikt wordt is schei- j i den van vaste stof van vloeistof (door centrifugeren, filtreren j of afschenken) al voldoende, en in andere gevallen kan men chro-j matografie, elektroforese, uitzouten, fractioneren, dialyse, \ 15 gelfiltratie, absorptie en enige combinatie daarvan) toepassen of een scheiding;met behulp van agar-gel, agarosegel of poly-acrylamide-gel (zie Japanse octrooiaanvrage 151263/80).

Het merk van het aldus afgescheiden produkt j wordt dan gemeten met een methode die aangepast is aan de aard \

\ 20 van het merk. Als dat een enzym is neemt men een geschikt sub- I

straat voor dat enzym, zodat men het na afloop colorimetrisch, j door emissie-analyse of door fluorescentie-analyse kan meten, | waarbij desgewenst een kleurstof, fluorescerende stof of kleurstof gebruikt is. Als het merk een fluorescerende stof 25 of een radioactief materiaal is meet men natuurlijk de fluores- j centie of de radioactiviteit. Aldus vindt men hoeveel gebonden of juist niet gebonden TAG, TAG-achtig materiaal of lectine ; er was. i ! Zoals hierboven reeds beschreven maakt deze j | 30 uitvinding het mogelijk met gemak TAG in lichaamsvloeistoffen j te bepalen. En hieruit kan men het optreden van kanker vaststellen, in elke fase, vanaf het begin tot aan het eindstadium. Deze werkwijze is vooral nuttig voor het herkennen van kanker in een vroeg stadium. Daar bovendien bij deze werkwijze gluco-35 sidisehe bindingen bepaald worden heeft deze diagnose een veel bredere toepassing dan de gebruikelijke methoden met antilichamen 8103606 - 10 - (tegen α-fetoproteïne, CEA, enz.) waarmee men in wezen het eiwit-; gedeelte bepaalt. Aldus kan men nu ook kanker van maag, borst, j dikke darm, rectum, eierstokken, mond, tong, strottehoofd, j prostaat, baarmoeder en maag alsmede liposarcomen, kwaadaardige 5 melanomen en primaire sarcomen, enz., genezen.

Verder wordt de werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt doordat hij zeer specifiek voor kanker is ! • · · 1 en geen kruisreactie met de determinanten van hierop gelijkende j ; stoffen in lichaamsvloeistoffen geeft, bijvoorbeeld van patiënten j 10 die aan andere kwalen lijden zoals maagontsteking, maagzweren, darmzweren, darmontsteking, pancreasinfectie, suikerziekte, niefaandoening, nierstenen, urineblaasstenen en galblaasstenen, j collageen-ziekte, vallende ziekte, angina pectoris, hartzwakte, I hartinfarct, te hoge bloeddruk, arthritis, depressies, aller-j 15 gische ontstekingen, roodvonk, longontsteking, bronchitis, I asthma, acute leveraanval, chronische leveraanval, enz.

Verder maakt deze werkwijze het mogelijk \ galactose-(01 -^ 3 of $1 ->· 4)-N-acetylglucosamine en galactose-(βΐ -—> 3 of $1 -> 4)-N-acetylgalactosamine te | 20 bepalen alsmede suikers en suiker-derivaten (glucoproteïnen, glucopeptiden, glucolipiden, glucoterpeen, glucosteroïden, enz.) die deze eindstandige groepen hebben. j

De uitvinding wordt nu nader toegelicht aan j de hand van de volgende, niet beperkende voorbeelden van bevoor-25 keurde uitvoeringsvormen van deze uitvinding.

Voorbeeld I

(i) Activering van peroxydase • · '

Aan 5 mg peroxydase uit rammenas in 1 ml j ! : j waterige 0,3 M NaHC00-oplossing werd 0,1 ml 0,1 M fluordinitro- i i O \ ! 30 benzeen in ethanol toegevoegd, en na 1 uur zachtjes roeren op j kamertemperatuur 0,1 ml 0,06 M NaJO^-oplossing. Na nog 30 minu- ! ten roeren op kamertemperatuur werd 1 ml 0,16 M ethaandiol aan dit mengsel toegevoegd, en het geheel werd 1 uur zachtjes op ! kamertemperatuur geroerd. Daarna werd de oplossing een dag en I 35 een nacht bij 4°C gedialyseerd tegen 0,01 M koolzuur-bicarbo-naat-buffer met pH = 9,5.

8103606 - 11 - (ii) Het merken van lectine met peroxydase

In 3 ml van de bij (i) verkregen oplossing werd 5 mg aardnoten-lectine opgelost, en na 2-3 uur reactie op kamertemperatuur onder zacht roeren werd hieraan 5 mg 5 NaBH^ toegevoegd. Na 3 uur staan op 4°C werd de oplossing een dag en een nacht gedialyseerd tegen 0,1 M tris-HCl-buffer met pH = 7,4, waarna over een kolom Sephadex G 150 gechromatogra-feerd werd (elutie met 0,1 M tris-HCl-buffer met pH = 7,4.

Van elke fractie werden de optische dichtheden bij 280 nm en 10 403 nm gemeten, en fracties die pieken hiervan hadden werden verzameld.

(ii') Bereiding van gezuiverd lectine-peroxydase

Van het bij (ii) verkregen lectine-peroxydase werd 20 ml op een kolom galactose-agarose (agalactopyranosyl-15 agarose van de firma P.L. Lab. in de VS) gebracht, en dit werd met 200 ml fysiologische zout-oplossing uitgewassen. De kolom werd geëlueerd met 0,2 M NaCl-oplossing die 0,5 M lactose bevatte, en de eerste 10 ml-fractie met absorptiepieken bij j 280 en 403 nm werden opgevangen en een etmaal lang gedialyseerd '

20 tegen fysiologische zout-oplossing, waardoor men een gezuiverde I

i oplossing van lectine-peroxydase kreeg. Het eiwit-gehalte hier- j i van werd volgens Lowry bepaald (zie O.H. Lowry et al in j J. Biol. Chem. 193 (1951) 265); er was ongeveer 1 g. De ge- j

• I

zuiverde lectine-peroxydase-combinatie werd gevriesdroogd. j 25 (iii) Bereiding van onoplosbaar gemaakt lectine ! ------------- |

In 3 liter 0,001 N zoutzuur werd 15 g met j I j i broomcyaan geactiveerde agarose gesuspendeerd en na 30 minu- j J ten staan werd de vaste stof afgefiltreerd en op het glasfilter : | met 1 liter 0,1 M NaHCO^-oplossing uitgewassen (pH = 8,5).

; 30 Aldus werd in totaal 50 ml geactiveerde agarose verkregen.

Deze werd gesuspendeerd in 200 ml 0,1 M NaHCO^-oplossing en | 5 ml 0,01 M fosfaat-buffer met pH = 7,7, waarin 50 mg aard noten-lectine werd toegevoegd. Na 2 uur staan op kamertemperatuur onder zo nu en dan roeren werd het reactiemengsel ge-35 filtreerd en de vaste stof op het glasfilter uitgewassen en daarna toegevoegd aan 200 ml 1M monoethanolamine-oplossing met 8103606 - 12 - pH = 8,5. Na 2 uur reageren op kamertemperatuur werd weer gefil- i treerd en werd de vaste stof op het glasfilter met 1 liter ! 0,1 M azijnzuur-opbssing en met 1 liter 0,1 M boorzuur-oplossing (die beiden ook 0,5 M NaCl bevatten) uitgewassen; deze dubbele 5 uitwassing werd nog twee keer herhaald. !

(iv) Bereiding van TAG-achtig materiaal I

In 100 ml 0,05 M fosfaat-buffer met pH = 7,0 werd 1 g gesulfateerd glucoproteïne uit het maagslijm van varkens (hierna afgekort tot GP-VMS) opgenomen, en met 1 N I 10 NaOH werd de pH op 11 bij gesteld. Na 30 minuten roeren op kamer-! temperatuur werd het mengsel 10 minuten op 3000 rpm gecentri-

| fugeerd, en in de bovenstaande vloeistof werd de pH met 1 N

HC1 weer op 7,0 gebracht, waarna opnieuw 30 minuten op 3000 rpm j gecentrifugeerd werd. De bovenstaande vloeistof hiervan werd 15 een nacht tegen 10 liter 0,03 N fosfaat-buffer met pH = 7,0 ge-dalyseerd, wat zuiver TAG-achtig materiaal gaf.

(ivr) Andere bereiding van TAG-achtig materiaal

In 1 liter gedestilleerd water werd 100 g ruw PG-VMS opgenomèn, en na een nacht staan werd dit mengsel j 20 overnacht tegen gedestilleerd water gedialyseerd. Vervolgens werd de vloeistof 1 uur op 100.000 g gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof wérd gevriesdroogd, wat 5,5 g zuiver GP-VMS gaf.

i (v) Bereiding van gemerkt TAG i 25 (a) Merken met enzym (GP-VMS-peroxydase) |

In 1 ml gedestilleerd water werd 4 mg j i (0,01 yim) peroxydase uit rammenas opgelost, en hieraan werd | 0,2 ml 0,1 M NaJO^ toegevoegd. Na 20 minuten roeren op kamer- j temperatuur werd deze oplossing een dag en een nacht gedialy-i 30 seerd tegen 1 M acetaatbuffer met pH = 4,4, om niet omgezet NaJO^; te verwijderen. Aan de gedialyseerde vloeistof werd ongeveer 60 ƒ11 0,2 M NaHCO^-oplossing met pH = 9,5 toegevoegd, om de pH van het geheel op 9,0 te brengen. Aan deze oplossing werd direct j 0,6 ml GP-VMS (10 mg/ml in 0,01 M bicarbonaat-buffer met pH = 35 9,5) toegevoegd. Na 2 uur roeren op kamertemperatuur werd 0,1 ml Na BH^-oplossing van 4 mg/ml in gedestilleerd water toêgevoegd.

8103606 - 13 -

Na 2 uur staan op 4°C werd deze oplossing een dag en een nacht j tegen 0,01 M fosfaat-buffer met pH = 7,5 gedialyseerd, en ver- | volgens gezuiverd met behulp van een kolom van 150 cm x 1,5 cm j Sephadex G-200. De dóórkomende vloeistof werd in 5 ml porties j i 5 opgevangen, waarvan de optische dichtheden bij 280 en 403 nm gemeten werden. De fracties die dit vertoonden bevatten gezui- j verd GP-VMS-peroxydase.

(b) Merken met een isotoop (^^J-GP-VMS) j

In 50 jll 0,2 M fosfaat-buffer met pH = 7,0 ! 10 werd 10 ug GP-VMS opgelost en hieraan werd 10 ul NaJ-oplossing '125 met 1 mCi aan J toegevoegd en vervolgens 100 jil fosfaat- buffer die per ml 0,5 mg chlooramine T bevatte. Na 30 seconden j ; mengen op kamertemperatuur werd ook nog 100 ul 0,2 M fosfaat- i i ' l | buffer met daarin 100 jxg Na2S20,_ toegevoegd, en vervolgens | 15 1 mg Na^^J. Het aldus gemaakte 125 J-GP-VMS werd over een | kolom Sephadex G-50 van 1 x 30 cm gezuiverd; het had een radio- ! activiteit van 1-2 ^ïCi/^tg.

(vi) Bepalingsmethode i

Van het in (v) verkregen 125 J GP-VMS ! 20 werd 0,1 ml (100 ng met 0,17 ƒ1 Ci, wat overeenkomt met 240.000 | tellingen per minuut) in een glazen buis van 10 x 75 mm gemengd

met 0,1 ml van het in (iv) verkregen standaard GP-VMS (met respectievelijk 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5 en 10 yug/ml), 0,1 ml oplossing met 10 yag/ml aardnoten-lectine en 0,2 ml 0,05 M

25 fosfaat-buffer, die bovendien 0,15 M NaCl, 0,1 % runder-serum- j albumine en 0,02 % NaN,, bevatte. Na 1 uur incubatie op 25°C j ^ i werd 0,1 ml 10-voudig verdund konijnenserum tegen aardnoten- j I lectine (gemaakt door E.Y. Laboratory) gemaakt. Na nog eens

| 1 uur incubatie op 25°C werd het mengsel 30 minuten bij 4°C

30 op 3000 rpm gecentrifugeerd. De radioactiviteit van het neer slag werd geteld, waaruit de standaardkromme van figuur 1 getekend kon worden. Zoals uit de verkregen resultaten blijkt : werd gewoonlijk 20-25 % gebonden en werd 50 % remming bereikt bij een concentratie van 0,6 ^g/ml.

35 (vii) Bereiding van onoplosbaar gemaakt TAG-achtig materiaal

In 100 ml 0,01 M fosfaat-buffer met pH - 8103606 * - 14 - i > ! 7,0 werd overmaat GP-VMS gesuspendeerd. Hieraan werd 0,01 N j ! i | NaOH toegevoegd zodat de pH op 11 kwam, waarna 20 minuten op | 3000 rpm gecentrifugeerd werd. Aan de.heldere vloeistof werd druppelsgewijs 0,03 N HCl toegevoegd zodat de pH op 7,0 kwam, ! • * ' 5 en opnieuw werd 20 minuten op 3000 rpm gecentrifugeerd. De ] bovenstaande vloeistof werd tegen 0,01 N fosfaat-buffer met pH = j 7,0 gedialyseerd. In deze GP-VMS-oplossing bleek het hexose- i i gehalte (bepaald met de fenol-zwavelzuur-methode en met glucose als standaard) 5-7 mg/ml te bedragen en het eiwit-gehalte j i 10 (met runder-serumalbumine als standaard) 1-2 mg/ml.

Deze oplossing werd 2:1 met hydroxyethyl-methacrylaat gemengd, en dit mengsel werd in een reageerbuis van 1 x 15-20 cm geplaatst, snel tot -70°C afgekoeld en ge- g vriesdroogd. Vervolgens werd het bestraald met 1 x 10 rad aan 15 gamma-straling, waardoor het monomeer polymeriseerde. Het ver- j

S " I

j kregen staafje polymeer werd tot coupes van 10 yrni dikte ver- | | sneden. j I (viii) Bereiding van onoplosbaar gemaakt TAG-achtig materiaal |

In 3 liter 0,001 N zoutzuur werd 15 g met 20 broomcyaan geactiveerde Sépharose 4B (van de firma Pharmacia AB) gesuspendeerd, en na 30 minuten staan werd dit afgefiltreerd en op het filter uitgewassen met 1 liter 0,1 M NaHCO^-oplossing (pH = 8,5). Daarna werd het neerslag gesuspendeerd in 200 ml 0,1 M NaHCO^-oplossing en 5 ml 0,01 M fosfaat-buffer (met pH = 25 7,7) die 50 mg GP-VMS bevatte. Men liet 2 uur bij kamertempe ratuur reageren onder zo nu en dan roeren.

Na afloop van de reactie werd de vaste stof op een glasfilter verzameld en uitgewassen en daarna gesuspen- ! | deerd in een 1 M monoethanolamine-oplossing (pH = 8,5), waarmee

i 30 men het 2 uur liet reageren. Daarna werd de vaste stof opnieuw j gefiltreerd en op het filter uitgewassen met 1 liter 0,1 M

I acetaat-buffer en 1 liter 0,1 M boorzuur-oplossing (die beide | 0,5 M NaCl bevatten); deze dubbele uitwas-sing werd nog tweemaal herhaald. ' 35 (viii1) Andere bereiding van onoplosbaar gemaakt TAG-achtig materiaal 8103606 - 15 - ♦ 4 I 10.000 polystyreenparels met een doorsnede ; | van 6,4 mm (gemaakt door de firma Precision Plastic Co., Ltd. j 1 j | in de V.S.) werden uitgewassen met een verdunde oplossing van j synthetische zeep (1,5 ml/1 mamalemon gemaakt door de firma j 5 Lion Co. Ltd.) en daarna met gedestilleerd water. Vervolgens \ liet men ze 3 dagen in 0,5 M NaOH staan, waarna ze opnieuw ' j grondig met water uitgewassen werden totdat de pH ongeveer 6 was.1

Deze uitgewassen 10.000 parels werden gesuspendeerd in 2,5 liter ; 35 % GP-VMS-oplossing in 0,05 M acetaat-buffer met pH = 4,5, | 10 en na 24 uur roeren met 10 rpm werden ze afgefiltreerd en met i i 4x8 liter gedestilleerd: water uitgewassen. Daarna werden de ; parels gesuspendeerd in 2,5 liter 1 % glutaaraldehyde in 0,05 M acetaat-buffer met pH = 7, en na 2 uur roeren op 10 rpm werden j ze weer afgefiltreerd en op dezelfde wijze met water uitgewassen.; 15 Daarna werden de 10.000 parels gesuspendeerd in 2,5 liter 1 M glycine in 0,05 M acetaat-buffer met pH = 7,0, en na 2 uur roeren op 10 rpm werden ze op dezelfde wijze afgefiltreerd en met gedestilleerd water uitgewassen. Daarna werden ze overnacht j bij 37°C gedroogd. Het êiwit-gehalte van deze parels werd be- j | 20 paald met de Orcinol-zwavêlzuur-methode (beschreven door j M. Schonenberger et al in Z. Physiol. Chem. 309 (1957) 145) en | bleek 2,7 _+ 0,2 jxg GP-VMS te bedragen. j (ix) Bereiding der proefmonsters

Van een aantal patiënten met kanker en met 25 andere ziekten, zwangere vrouwen en geheel gezonde personen werd 5 ml bloed afgetapt met behulp van een met 500 eenheden

heparine behandelde injectienaald. Deze monsters werden 10 minuten op 2000 rpm gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistoffen werden voor de bepalingen bewaard. I

30 Voorbeeld II

Bepaling óp basis van concurrentie

Een coupe onoplosbaar gemaakt TAG-achtig materiaal (zoals bereid volgens voorbeeld I (vii)) werd geplaatst in een mengsel van 50 jil volgens voorbeeld I (ii) be-35 reide oplossing van aardnoten-lectine-peroxydase-combinatie en 200 ^il behandeld bloedmonster (volgens voorbeeld I (ix) verkregen), 8103606 - 16 - en 20 uur bij 25°C geïncubeerd. Daarna werd de coupe met een j runder-serumalbumine-oplossing uitgewassen en geplaatst in een mengsel van 2,0 ml waterige zout-oplossing en 0,5 ml peroxydase-oplossing. Na 1 uur incubatie op 25°C werd hieraan 1,0 ml 5 3N zoutzuur toegevoegd en werd de absorptie bij 492 nm gemeten.

Deze bepaling werd uitgevoerd op alle verkregen bloedmonsters. | Tevens werd de bepaling uitgevoerd op een aantal oplossingen j met diverse, bekende concentraties aan GP-VMS, wat een ijk- I | kromme gaf die in figuur 2 weergegeven is.

i 10 De uitkomsten van de bepalingen aan de echte j bloedmonsters zijn weergegeven in figuren 3 en 4, waaruit men | ziet dat er een duidelijk verschil in TAG-gehalte is tussen gezonde mensen en patiënten die aan kanker lijden. !

Voorbeeld m ] 15 Bepaling 'mét éên ' SandWiCh-miéthóde

Van de in voorbeeld I (iii) verkregen aard-noten-lectine-agarose-combinatie werd 200 yug gemengd met 100 ƒ11 0,05 M fosfaat-buffer met pH = 7,0 waarin 1 tot 10 yig/ml GP-VMS opgelost was, en na 1 uur roeren op 25°C werd de vaste stof 20 afgefiltreerd en driemaal uitgewassen met 0,05 M fosfaat-buffer met pH = 7,0. Toen werden hieraan 6 jig van het in voorbeeld I (ii) verkregen, met peroxydase gemerkte aardnoten-lectine en | 100 ƒ11 0,05 M fosfaat-buffer met pH = 7,0 toegevoegd. Na 1 uur incubatie op 25°C onder roeren werd 10 minuten op 3000 rpm ge- j i 25 centrifugeerd, en een.neerslag werd driemaal met 0,05 M fosfaat- | buffer uitgewassen, waarna de absorptie bij 492 nm gemeten werd. j |

De uitkomsten van deze bepaling op een aantal oplossingen van j bekende sterkte is weergegeven in figuur 5.

' Voorbeeld IV

30 Bepaling op basis van concurrentie

Van volgens voorbeeld I (ix) verkregen bloed-; i ; i monsters werden porties van 100 ƒ11 in reageerbuizen gemengd met 500 ƒ11 0,3 M tris-HCl-buffér met pH = 7,4 die ook 0,22 % gelatine, 0,005 M CaC^ en 0,005 M MgC^ bevatten. Aan elk monster 35 werd ëën met GP-VMS behandelde polystyreenparel en 100 ƒ11 van het volgens voorbeeld I (ii) bereide, met peroxydase gemerkte lectine 81 0 3 6 0 6 * - 17 - ! (met een concentratie van 1 mg/1) toegevoegd. Na omroeren wer- j den de mengsels 24 uur géïncubeerd. Daarna werden de bovenstaande; vloeistoffen afgezogen en werden de parels uitgewassen met 2 ml j fysiologische zout-oplossing, die opnieuw met een fijn buisje af-j 5 gezogen werden. Dit uitwassen werd driemaal herhaald. j

In 20 ml 0,2 M Mcllevein-buffer met pH = i

5,8 werd 60 mg o-fenyleendiamine opgelost en hieraan werd I

toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,02 vol.%. j

In een reageerbuis werden 2 ml fysiologi- j 10 sche zout-oplossing, 500 ƒ11 van het zojuist beschreven kleur- | reagens en een uitgewassen polystyreenparel gebracht, en deze | combinatie werd 30 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd. Daar-! na werd de enzymatische reactie gestopt door 1 ml 3 N HC1 toe ! te voegen. De optische dichtheid van het reactiemengsel bij 492 15 nm werd gemeten, en dit gebeurde ook met parels die in contact j

gestaan hadden met oplossingen van bekende sterkte, wat een ijk- j kromme gaf die in figuur 6 weergegeven is. Van de echter mon- j ; sters konden nu de TAG-gehalten gevonden worden, en deze uit- I

I komsten zijn weergegeven in figuren 7a, 7b, 7c en 7d. j 20 | j i I \ ! ! 8103606

Claims (9)

1. Werkwijze voor het bepalen van met tumoren geassocieerde glucosidische bindingen (TAG), met het kenmerk, dat men de te onderzoeken lichaamsvloeistof en een 5 bepaalde hoeveelheid onoplosbaar gemaakte TAG of TAG-achtig materiaal laat reageren met een bepaalde hoeveelheid gemerkt lec- j i tine, men de aan het gemerkte lectine gebonden onoplosbaar gemaakte TAG of TAG-achtige materiaal scheidt van het niet ge- j bonden lectine, en dat men in beide fracties of in één daarvan j 10 het merk meet. j

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het j | kenmerk, dat het TAG-achtige materiaal galactose-(βΐ -^ 3 | of βΐ -4)-N-acetylglucosamine of galactose-((31 -> 3 of j βΐ -^ 4)-N-acétylgalactosamine is, of een suiker-derivaat 15 dat deze als eindstandige groepen bevat. I

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, i ! met hét kenmerk, dat het lectine gemerkt was met een enzym, een fluorescerende stof of een radioactieve stof.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1, 2 j 20 of 3, met het kenmerk, dat in het onoplosbare TAG-achtige mate- | I riaal de TAG-achtige stoffen gebonden zijn aan een polymeer ont- i I een _ j staan door bestraling van! waterige dispersie van hydroxyethyl- methacrylaat die ook gesulfateerd glucoproteïne uit varkens-maagslijm bevat, en dat het lectine met peroxydase gemerkt was.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1, 2 of 3, mét hét kenmerk, dat in het onoplosbaar gemaakte TAG- j | achtige materiaal het TAG-achtige materiaal gebonden was aan gesulfateerd glucoproteïne uit varkensmaagslijm dat zelf gebonden zit aan polystyreenparels, en dat het lectine met per- ; ! 30 oxydase gemerkt was.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1 t/m 5,'mét hét kenmerk, dat de bepaling op basis van competitie gebeurt door de te meten lichaamsvloeistof samen met een bepaalde hoeveelheid gemerkte TAG of TAG-achtig materiaal te laten ; 35 reageren met een bepaalde hoeveelheid lectine of onoplosbaar ge- j maakt lectine, de gemerkte TAG of het gemetkte TAG-achtige ma- 8103606 ψ - 19 - j teriaal dat aan dit lectine gebonden wordt te scheiden van niet- j gebonden gemerkte TAG- of TAG-achtige materiaal, en tenslotte in tenminste éën van deze fracties de radioactiviteit te meten.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 5. t/m 5, met het kenmerk, dat de bepaling een sandwichmethode is,| doordat men de te onderzoeken lichaamsvloeistof laat reageren j met onoplosbaar gemaakt lectine, waarna men het aldus ontstane onoplosbare TAG-lectine-complex met een bekende hoeveelheid j gemerkt lectine laat reageren, men het aan dit complex gebonden j 10 lectine scheidt van het niet gebonden lectine, en men in tenmin- j ste ëën van deze fracties het merk meer. j

8. Werkwijze in hoofdzaak volgens beschrijving i en/of voorbeelden.

9. Werkwijze voor de diagnose van kanker, I J5 met het kenmerk, dat men op een wijze volgens een der vooraf- j gaande conclusies in te onderzoeken lichaamsvloeistof het gehalteJ ! aan met tumoren geassocieerde glucosidische bindingen meet, en men dit gehalte vergelijkt met dat van een gezond persoon. j ! 20 i | j | ] ; j 81 0 3 6 0 6