JPS5915858A - 腫瘍関連抗原特異的免疫複合体の測定法 - Google Patents
腫瘍関連抗原特異的免疫複合体の測定法Info
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- JPS5915858A JPS5915858A JP12494582A JP12494582A JPS5915858A JP S5915858 A JPS5915858 A JP S5915858A JP 12494582 A JP12494582 A JP 12494582A JP 12494582 A JP12494582 A JP 12494582A JP S5915858 A JPS5915858 A JP S5915858A
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- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は腫瘍関連抗原特異的免疫複合体の新しい測定方
法に関する。
法に関する。
生体内においである抗原に対し抗体が産生されるとこの
抗原と抗体とが結合して免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃ
ｏｍ戸ｌｅｇ、以下「ＩＣ」と略記する）が形成される
ことが知られている。かかるＩＣの形成は自己免疫疾患
をはじめ、感染症、急性腫瘍等の種々の疾患において見
い出されておシ、該ＩＣの存在は所謂免疫複合体病を惹
起し、該ＩＣ殊に各疾、■患者の面府中にｍ存＋ス■溶
悴ＩＣの掩出測定によれｄ各種疾患の解明、病因の解析
や診断、更には予後の判定等ができることから、上記Ｉ
Ｃの検出測定法が従来よシ種々提案されている。該方法
としては例えば超遠心等の物理化学的方法の他、補体を
利用する方法、抗免疫タ０プリシ法、細胞を用いる方法
等の免疫生物学的方法が知られている。しかしながら従
来公知の血液中の可溶性ＩＣの検出法は、特定の病変で
原因抗原が既知の場合を除いて、いずれも抗原非特異的
方法にすぎない。即ち従来よシＩＣを構成する抗原は多
種多様であることが知られており、しかも一般にががる
抗原は抗体におおわれておシ、これを特異的に検出する
ことは因難であるとされている。従って従来法は専ら上
記抗原を検出するかわりに該抗原と結合した抗体例えば
免疫り０プリシ量を測定し、これを試料中のＩＣ量とし
ている。従ってかがる方法では測定されるＩＣ量は、そ
の構成要素である抗原には非特異的であり、また測定糸
内で試料３− 中に本来存在する免疫夕０づリシが非特異的に凝集し、
該凝集１ｆＧ が上記測定すべきＩＣ量に加算され、か
かる凝集ＩｆＧ 量自体試料及び測定条件によシ大きく
ばらつき、しかも該凝集ＩグＧ とＩＣとの鑑別法も亦
現在全く見い出されていないのが現状である。
抗原と抗体とが結合して免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃ
ｏｍ戸ｌｅｇ、以下「ＩＣ」と略記する）が形成される
ことが知られている。かかるＩＣの形成は自己免疫疾患
をはじめ、感染症、急性腫瘍等の種々の疾患において見
い出されておシ、該ＩＣの存在は所謂免疫複合体病を惹
起し、該ＩＣ殊に各疾、■患者の面府中にｍ存＋ス■溶
悴ＩＣの掩出測定によれｄ各種疾患の解明、病因の解析
や診断、更には予後の判定等ができることから、上記Ｉ
Ｃの検出測定法が従来よシ種々提案されている。該方法
としては例えば超遠心等の物理化学的方法の他、補体を
利用する方法、抗免疫タ０プリシ法、細胞を用いる方法
等の免疫生物学的方法が知られている。しかしながら従
来公知の血液中の可溶性ＩＣの検出法は、特定の病変で
原因抗原が既知の場合を除いて、いずれも抗原非特異的
方法にすぎない。即ち従来よシＩＣを構成する抗原は多
種多様であることが知られており、しかも一般にががる
抗原は抗体におおわれておシ、これを特異的に検出する
ことは因難であるとされている。従って従来法は専ら上
記抗原を検出するかわりに該抗原と結合した抗体例えば
免疫り０プリシ量を測定し、これを試料中のＩＣ量とし
ている。従ってかがる方法では測定されるＩＣ量は、そ
の構成要素である抗原には非特異的であり、また測定糸
内で試料３− 中に本来存在する免疫夕０づリシが非特異的に凝集し、
該凝集１ｆＧ が上記測定すべきＩＣ量に加算され、か
かる凝集ＩｆＧ 量自体試料及び測定条件によシ大きく
ばらつき、しかも該凝集ＩグＧ とＩＣとの鑑別法も亦
現在全く見い出されていないのが現状である。
また癌におけるＩＣが癌の進行度すなわち転移とよく平
行することが報告されている〔Ｔｋｔｏｆｉｌｏｐｏｕ
ｌｏｓ 、 Ａ、Ｎ、、 ｒｉａｌ 、 Ｊ＋Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ。
行することが報告されている〔Ｔｋｔｏｆｉｌｏｐｏｕ
ｌｏｓ 、 Ａ、Ｎ、、 ｒｉａｌ 、 Ｊ＋Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ。
１１９纂６５７（１９７，７））。しかし々から、上記
した従来法によシ測定されたＩＣが癌特異的な抗原と抗
体との複合体であるかどうかは全く明確ではない。特に
、発癌個体においては、しばしは正常細胞・組織の物質
とも反応する抗体の産性が随伴されてくる、いわゆる非
特異的反応が自己抗体として共存してくる場合が少くな
い。したがって、この様な悪性疾患におけるＩＣの測定
法においては、該ＩＣの構成要素である抗原を明らかに
しな４− ければ癌疾患の病態、特異性等を適確に把握することは
できない。
した従来法によシ測定されたＩＣが癌特異的な抗原と抗
体との複合体であるかどうかは全く明確ではない。特に
、発癌個体においては、しばしは正常細胞・組織の物質
とも反応する抗体の産性が随伴されてくる、いわゆる非
特異的反応が自己抗体として共存してくる場合が少くな
い。したがって、この様な悪性疾患におけるＩＣの測定
法においては、該ＩＣの構成要素である抗原を明らかに
しな４− ければ癌疾患の病態、特異性等を適確に把握することは
できない。
本発明者らは、上記現状に鑑み、患者の体液中に存在す
る特定の腫瘍関連抗原にのみ対応する免疫複合体を特異
的に測定できる抗原特異的ＩＣ測定技術を確立すること
を目的として鋭意研究を重ねてきた。その結果、患者の
体液中には、腫瘍関連抗原（腫瘍マーカー）である例え
ｌ、ｆＢＦＰ（塩基性フェトづＯティコ）、ＡＦＰ（α
−フェトづＤティコ）、ＴＡＧ（特開昭５７−２９９４
９号同５７−２９９５０号及び同５７−２９９５１号公
報参照〕及びＣＥＡ（癌胎児性抗原）等を抗原とする補
体結合性のＩＣが存在することを見い出した。またかか
るＩＣが不溶北枕補体と結合した形態で、標識化された
ある種の物質と特異的に結合することができるか或は、
上記特定のＩＣのみを特異的に不溶化及び標識化するこ
とができ、かくして得られる不浴化標織反応物もしくは
未反応標識物質の標識活性を測定することによって、上
記目的に合致する方法が確立きれるという新しい知見を
得だ。
る特定の腫瘍関連抗原にのみ対応する免疫複合体を特異
的に測定できる抗原特異的ＩＣ測定技術を確立すること
を目的として鋭意研究を重ねてきた。その結果、患者の
体液中には、腫瘍関連抗原（腫瘍マーカー）である例え
ｌ、ｆＢＦＰ（塩基性フェトづＯティコ）、ＡＦＰ（α
−フェトづＤティコ）、ＴＡＧ（特開昭５７−２９９４
９号同５７−２９９５０号及び同５７−２９９５１号公
報参照〕及びＣＥＡ（癌胎児性抗原）等を抗原とする補
体結合性のＩＣが存在することを見い出した。またかか
るＩＣが不溶北枕補体と結合した形態で、標識化された
ある種の物質と特異的に結合することができるか或は、
上記特定のＩＣのみを特異的に不溶化及び標識化するこ
とができ、かくして得られる不浴化標織反応物もしくは
未反応標識物質の標識活性を測定することによって、上
記目的に合致する方法が確立きれるという新しい知見を
得だ。
本発明はこれらの知見により完成されたものである。即
ち本発明は、体液中にＩＣ（免疫複合体）として存在す
る補体結合性の腫瘍関連抗原−抗体複合体と、不溶北枕
補体とを反応させてＩＣ−不溶化抗補体結合体を形成さ
せ、次いで該結合体のｌＣを構成する腫瘍関連抗原もし
くけその抗体のいずれかと特異的に結合する標識物質の
一定量を上ｆｌｃ−不溶化抗補体結合体と反応させ、反
応物及び未反応の上記標識物質を分離し、そのいずれか
の標識活性を測定するか或は上記ＩＣと、該ＩＣを構成
する腫瘍関連抗原もしくはその抗体のいずれかと特異的
に結合する不溶化された物質とを反応させてＩＣ−不溶
化物質結合体を形成させ、次いで該結合体の補体もしく
は抗体と反応性を有する一定量の標識化された抗袖体、
抗抗体もしくはプ０テイシＡを上記結合体と反応させ、
得られる反応物と未反応の標識化された抗袖体、抗抗体
もしくはプ０テイシＡとを分離し、そのいずれかの標識
活性を測定することを特徴とする腫瘍関連抗原特異的Ｉ
Ｃの測定法に係る。
ち本発明は、体液中にＩＣ（免疫複合体）として存在す
る補体結合性の腫瘍関連抗原−抗体複合体と、不溶北枕
補体とを反応させてＩＣ−不溶化抗補体結合体を形成さ
せ、次いで該結合体のｌＣを構成する腫瘍関連抗原もし
くけその抗体のいずれかと特異的に結合する標識物質の
一定量を上ｆｌｃ−不溶化抗補体結合体と反応させ、反
応物及び未反応の上記標識物質を分離し、そのいずれか
の標識活性を測定するか或は上記ＩＣと、該ＩＣを構成
する腫瘍関連抗原もしくはその抗体のいずれかと特異的
に結合する不溶化された物質とを反応させてＩＣ−不溶
化物質結合体を形成させ、次いで該結合体の補体もしく
は抗体と反応性を有する一定量の標識化された抗袖体、
抗抗体もしくはプ０テイシＡを上記結合体と反応させ、
得られる反応物と未反応の標識化された抗袖体、抗抗体
もしくはプ０テイシＡとを分離し、そのいずれかの標識
活性を測定することを特徴とする腫瘍関連抗原特異的Ｉ
Ｃの測定法に係る。
本発明方法は、従来知られておらず、むしろその測定は
困難であるとされていた腫瘍関連抗原に特異的なＩＣの
測定技術を提供する亀のであシ、本発明方法によれば、
比較的貿易な操作で上記特定のＩＣを特異的に測定する
ことができる。従って本発明方法は腫瘍の解明、診断、
予後の判定痔病地学上及び臨床上非常に有用である。
困難であるとされていた腫瘍関連抗原に特異的なＩＣの
測定技術を提供する亀のであシ、本発明方法によれば、
比較的貿易な操作で上記特定のＩＣを特異的に測定する
ことができる。従って本発明方法は腫瘍の解明、診断、
予後の判定痔病地学上及び臨床上非常に有用である。
以下本発明方法を順次詳述する。
本発明のひとつの方法においては、まず体液中にＩＣと
して存在する補体結合性の腫瘍関連抗原−抗体複合体と
不溶北枕補体とを反応させてＩＣ−不溶北枕補体結合体
を形成させる。ここで用いられ本発明に従い測定される
体液中のＩＣは、７− ＢＦＰ、ＡＦＰｌＣＥＡ及びＴＡＧがら選択されたいず
れかの腫瘍関連抗原を抗原とするものであり、特にＲＦ
Ｐ又はＴＡＧを該抗原とするものが好Ｊ テｉ ル。上
記ＢＦＰ−ＩＣ及（ｆＡＦＰ−ＩＣは、本発明方法によ
シはじめて検出されたものであシ、従来かかるＩＣが体
液中に存在することは知られていない。上記各ＩＣはい
ずれも補体結合性則ち補体系を活性化する能力を有して
おり、体液中では該補体と結合した形態で即ち抗原−抗
体−補体複合体の形態で存在している。従って本発明で
はこのＩＣの補体結合性を利用して該ＩＣと不溶北枕補
体とを結合させる。
して存在する補体結合性の腫瘍関連抗原−抗体複合体と
不溶北枕補体とを反応させてＩＣ−不溶北枕補体結合体
を形成させる。ここで用いられ本発明に従い測定される
体液中のＩＣは、７− ＢＦＰ、ＡＦＰｌＣＥＡ及びＴＡＧがら選択されたいず
れかの腫瘍関連抗原を抗原とするものであり、特にＲＦ
Ｐ又はＴＡＧを該抗原とするものが好Ｊ テｉ ル。上
記ＢＦＰ−ＩＣ及（ｆＡＦＰ−ＩＣは、本発明方法によ
シはじめて検出されたものであシ、従来かかるＩＣが体
液中に存在することは知られていない。上記各ＩＣはい
ずれも補体結合性則ち補体系を活性化する能力を有して
おり、体液中では該補体と結合した形態で即ち抗原−抗
体−補体複合体の形態で存在している。従って本発明で
はこのＩＣの補体結合性を利用して該ＩＣと不溶北枕補
体とを結合させる。
ここで、測定に供される検体としての被検試料としては
、各種の体液例えば血液、リシパ液、腹水、胸水、髄液
等があけられ、これらは測定を所望する患者より常法通
シに採取すればよく、例えば血液を検体とする場合は、
血清または血漿として使用するのが好ましく、血清又は
血漿は、常法８− の操作法で処理されたものでよい。通常検体量は０．０
１−１．０ ｗｅ程度、好ましくは、０．１−０．３
ｍｌ程度使用すればよい。
、各種の体液例えば血液、リシパ液、腹水、胸水、髄液
等があけられ、これらは測定を所望する患者より常法通
シに採取すればよく、例えば血液を検体とする場合は、
血清または血漿として使用するのが好ましく、血清又は
血漿は、常法８− の操作法で処理されたものでよい。通常検体量は０．０
１−１．０ ｗｅ程度、好ましくは、０．１−０．３
ｍｌ程度使用すればよい。
不溶北枕補体としては、すでに市販のものをあるいは常
法に従い、不溶性支持体に抗袖体を化学的または物理的
に反応させることによシ製造されたものをいずれも使用
することができる。該抗袖体としては例えば、しト補体
成分のＣＩｔｌＳＣ３等に対する抗体であれば特に制限
はなく、市販のものを、あるいは常法に従って得た抗補
体等を使用すればよい。
法に従い、不溶性支持体に抗袖体を化学的または物理的
に反応させることによシ製造されたものをいずれも使用
することができる。該抗袖体としては例えば、しト補体
成分のＣＩｔｌＳＣ３等に対する抗体であれば特に制限
はなく、市販のものを、あるいは常法に従って得た抗補
体等を使用すればよい。
不溶性支持体としては、ｔ Ｊｂ Ｏ−ス粉末、ｔファ
デックス、ｔノア０−ス、ポリスチレシ、沖紙、カルボ
十ジメチルｔル０−ス、イオシ交換樹脂、ヂ十ストラシ
、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ライ
０シ、ガラスじ−ズ、絹、ボリア三シーメチルじニルエ
ーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合物、エチ
レシーマレイシ酸共重合物等が挙げられる。不溶化け、
共有結合法としてのジアジ法、ぺづチド法（酸アミド銹
導体法、カルボ千シク０リド樹脂法、カルボシイミド樹
脂法、無水マレイル酸誘導体法、イソシアす−ト誘導体
法、臭化ジアジ活性化多糖体法、ｔル０−スカルボナー
ト銹導体法、縮合試薬を使用する方法）、アル十ル化法
、架橋試薬にょる担体結合法（架橋試薬としてグルタル
アルデヒド、へ十タメテレシイソシアナート等を用いる
）、Ｕｙｉ反応による担体結合法等の化学的反応；ある
いはイオシ交換樹脂のような担体を用いるイオシ結合法
；ガラスじ−ス吟の多孔性ガラスを担体として用いる物
理的吸着法によって行われる。
デックス、ｔノア０−ス、ポリスチレシ、沖紙、カルボ
十ジメチルｔル０−ス、イオシ交換樹脂、ヂ十ストラシ
、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ライ
０シ、ガラスじ−ズ、絹、ボリア三シーメチルじニルエ
ーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合物、エチ
レシーマレイシ酸共重合物等が挙げられる。不溶化け、
共有結合法としてのジアジ法、ぺづチド法（酸アミド銹
導体法、カルボ千シク０リド樹脂法、カルボシイミド樹
脂法、無水マレイル酸誘導体法、イソシアす−ト誘導体
法、臭化ジアジ活性化多糖体法、ｔル０−スカルボナー
ト銹導体法、縮合試薬を使用する方法）、アル十ル化法
、架橋試薬にょる担体結合法（架橋試薬としてグルタル
アルデヒド、へ十タメテレシイソシアナート等を用いる
）、Ｕｙｉ反応による担体結合法等の化学的反応；ある
いはイオシ交換樹脂のような担体を用いるイオシ結合法
；ガラスじ−ス吟の多孔性ガラスを担体として用いる物
理的吸着法によって行われる。
本発明の上記ＩＣと不溶性支持体との結合反応は、例え
に上記ＩＣを含有する検体を０．２〜０．５ｍｌ程度の
緩衝液中で不溶北枕補体と反応させることにより実施さ
れる。該反応は約４〜３７°Ｃ程度で０．５〜４８時間
程時間計りらとシ充でさ入 ロ記において緩衝液として
は、特に制限はなく、通常／’ Ｈ７，０〜８．０程度
の弱アルカリ性緩衝液例えば０．５Ｍリシ酸塩緩衝液、
トリス・塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を挙げることがで
き、通常の添加剤、例えば牛血溝アルプ三シ（ＢＳΔ）
等の保護蛋白、チメロザール等の防腐剤及びＮａＣ７１
等を添加してもかまわない。
に上記ＩＣを含有する検体を０．２〜０．５ｍｌ程度の
緩衝液中で不溶北枕補体と反応させることにより実施さ
れる。該反応は約４〜３７°Ｃ程度で０．５〜４８時間
程時間計りらとシ充でさ入 ロ記において緩衝液として
は、特に制限はなく、通常／’ Ｈ７，０〜８．０程度
の弱アルカリ性緩衝液例えば０．５Ｍリシ酸塩緩衝液、
トリス・塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を挙げることがで
き、通常の添加剤、例えば牛血溝アルプ三シ（ＢＳΔ）
等の保護蛋白、チメロザール等の防腐剤及びＮａＣ７１
等を添加してもかまわない。
かくしてＩＣ−不溶北枕補体結合体を形成できる。本発
明では次いで、該結合体を生理食塩水醇で十分に洗浄後
、該結合体ＩＣを構成する腫瘍関連抗原もしくはその抗
体も特異的に結合する標識物質の一定量を上記結合体と
反応させる。ここで腫瘍関連抗原と特異的に結合する標
識物質としては、測定すべき上記ＩｃｆＩ−構成する腫
瘍関連抗原に応じてその抗体例えばＲＦＰの場合は抗Ｂ
ＦＰを、ＡＦＰの場合は抗ＡＦＰを、ＣＥＡの場合は抗
ＣＥＡを、またＴＡＧの場合は抗ＴＡＧを常法に従い標
識剤と反応させることにより調製される。
明では次いで、該結合体を生理食塩水醇で十分に洗浄後
、該結合体ＩＣを構成する腫瘍関連抗原もしくはその抗
体も特異的に結合する標識物質の一定量を上記結合体と
反応させる。ここで腫瘍関連抗原と特異的に結合する標
識物質としては、測定すべき上記ＩｃｆＩ−構成する腫
瘍関連抗原に応じてその抗体例えばＲＦＰの場合は抗Ｂ
ＦＰを、ＡＦＰの場合は抗ＡＦＰを、ＣＥＡの場合は抗
ＣＥＡを、またＴＡＧの場合は抗ＴＡＧを常法に従い標
識剤と反応させることにより調製される。
またＴＡＧの場合は、上記標識物質として各種レクチン
を標識剤と反応させたものを用いることもできる。
を標識剤と反応させたものを用いることもできる。
上記においてレクチンとしては例えば、末端カラクトー
スと特異的に結合するもの（Ｊ、Ｂ、Ｃ。
スと特異的に結合するもの（Ｊ、Ｂ、Ｃ。
２５０ 、８５１８−８５２３ （１９７５） ＨＢｉ
ａｃｈｅｎｌ。
ａｃｈｅｎｌ。
Ｂ１０１１１ＦＳ Ｒｔ＃、 ＣＯｍｔｎ、 ６２ 、
１４４（＋ ９７５ ） ｉＺ、Ｉｍｗｓｕｎｉ、ｔａ
ｔｔｓｆｏｒｃｈ 、 ］ ３８ 、４２３−４３３（
１９０９） ＨＢｒ、 Ｊ、Ｅｚｐ、Ｐａ１ｌｒｔｙ１
．２７．２２８−２３６（１９４６） ＨＰｒｏｃ６Ｍ
ａｉｌ、Δｃａｄ、 Ｓｔｉ ＵＳＡ。
１４４（＋ ９７５ ） ｉＺ、Ｉｍｗｓｕｎｉ、ｔａ
ｔｔｓｆｏｒｃｈ 、 ］ ３８ 、４２３−４３３（
１９０９） ＨＢｒ、 Ｊ、Ｅｚｐ、Ｐａ１ｌｒｔｙ１
．２７．２２８−２３６（１９４６） ＨＰｒｏｃ６Ｍ
ａｉｌ、Δｃａｄ、 Ｓｔｉ ＵＳＡ。
７５、應５，２２１５〜２２＋９（１９７８）ｉＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉ ３ 、 ｌ ９６−２０４
（１９７４） ；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｔｘｔ
ａｃｋ、 ５１ 、１Ｑ７−１１８（＋９７６））、例
えはヒーすツッレクチシ、ひまの実（Ｒｉｃｉｎｕｓ
Ｃｏｍｍｕｒｉｓ ） Ｌ、 クチシ等；末端Ｎ−ア
ｔチルガラクトｔＥシと特異的に結合するもの例えばト
リ］スマメレクチシ、オ寸ゲ才しシジレクチシ、しりッ
クスポマテイアレクチシ、リママ１１− るもの例えばミＰコクサレクチシ（Ｌｏｔｕｓｔｔｔｒ
ａｙｏｎａｌａｂｕｓ ） （Ｂｒｔ、 ／、Ｅｎｐ、
Ｐａｔｋｉ 、 ３４゜９４（＋９５３Ｌハリエニシ
タマメレクチシ（Ｕｌｔｘ ｔｕｒａｐｅｕｓ ） （
Ｂｏｙｄ、Ｗ、Ｃ＋ａｎｄＳｋａｒｆｉｌｔｉｙｋ、
Ｅ、Ｂｌｏｏｄ 、９． ］ １９５（１９５４））等
を例示することができる。
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉ ３ 、 ｌ ９６−２０４
（１９７４） ；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｔｘｔ
ａｃｋ、 ５１ 、１Ｑ７−１１８（＋９７６））、例
えはヒーすツッレクチシ、ひまの実（Ｒｉｃｉｎｕｓ
Ｃｏｍｍｕｒｉｓ ） Ｌ、 クチシ等；末端Ｎ−ア
ｔチルガラクトｔＥシと特異的に結合するもの例えばト
リ］スマメレクチシ、オ寸ゲ才しシジレクチシ、しりッ
クスポマテイアレクチシ、リママ１１− るもの例えばミＰコクサレクチシ（Ｌｏｔｕｓｔｔｔｒ
ａｙｏｎａｌａｂｕｓ ） （Ｂｒｔ、 ／、Ｅｎｐ、
Ｐａｔｋｉ 、 ３４゜９４（＋９５３Ｌハリエニシ
タマメレクチシ（Ｕｌｔｘ ｔｕｒａｐｅｕｓ ） （
Ｂｏｙｄ、Ｗ、Ｃ＋ａｎｄＳｋａｒｆｉｌｔｉｙｋ、
Ｅ、Ｂｌｏｏｄ 、９． ］ １９５（１９５４））等
を例示することができる。
又、上記腫瘍関連抗原の抗体と特異的に結合する標識物
質としては、該興瘍関連抗原自身即ちＢＦＰ、ＡＦＰ、
ＴＡＧ及びＣＥＡを常法に従い標識剤へと反応させるこ
とによシ調製される。上記、各抗体、抗原及びレクチン
としては、夫々市販のものを、あるいは、常法に従って
製造されたものを使用すればよい〔石井勝他、最新医学
、第３６巻、第５号、Ｐ８６０〜８６６（１９８＋）参
照〕。
質としては、該興瘍関連抗原自身即ちＢＦＰ、ＡＦＰ、
ＴＡＧ及びＣＥＡを常法に従い標識剤へと反応させるこ
とによシ調製される。上記、各抗体、抗原及びレクチン
としては、夫々市販のものを、あるいは、常法に従って
製造されたものを使用すればよい〔石井勝他、最新医学
、第３６巻、第５号、Ｐ８６０〜８６６（１９８＋）参
照〕。
１２−
結合する標識物質を得るだめの標識剤としても特に制限
されず、通常の酵素標識剤例えばタうコア三ラーゼ、タ
ルコースオ十シ４−１！、バーオ千シターゼ、アルカリ
フオスファターセ、β−ガラクトオ士シターゼ又はヘム
オクタペづチド等の酵素の活性フラクメシト等及び放射
性物質例えば１、 １等の放射性ヨウ素、放射性リチ
ウム等が挙げられる。２等標識剤を用いた上記標識物質
の調製法としては、例えば、酵素標識物質の場合は、通
常の蛋白質の架橋剤として知られるクルタルアルデヒド
を用いる結合法や、特にタルコースオ十ジターぜ又はバ
ーオ千ジターぜを使用する場合にはそれらの糖鎖を過ヨ
ウ素酸法によりアルデヒドを導入後、被標識物質のアミ
ノ基と結合させる方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｘｙ
ｍｏｌｏｑｙ 、 Ｖｏｌ、 ３７ 。
されず、通常の酵素標識剤例えばタうコア三ラーゼ、タ
ルコースオ十シ４−１！、バーオ千シターゼ、アルカリ
フオスファターセ、β−ガラクトオ士シターゼ又はヘム
オクタペづチド等の酵素の活性フラクメシト等及び放射
性物質例えば１、 １等の放射性ヨウ素、放射性リチ
ウム等が挙げられる。２等標識剤を用いた上記標識物質
の調製法としては、例えば、酵素標識物質の場合は、通
常の蛋白質の架橋剤として知られるクルタルアルデヒド
を用いる結合法や、特にタルコースオ十ジターぜ又はバ
ーオ千ジターぜを使用する場合にはそれらの糖鎖を過ヨ
ウ素酸法によりアルデヒドを導入後、被標識物質のアミ
ノ基と結合させる方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｘｙ
ｍｏｌｏｑｙ 、 Ｖｏｌ、 ３７ 。
／１３３−１３６（１９７５））、及び抗体をＦ（ａｈ
）−５Ｈに調整した後マレイミド基を導入して標識Ｖｏ
ｌ、７９．戸２３３−２３６（＋９７６）及び同Ｖｏｌ
。
）−５Ｈに調整した後マレイミド基を導入して標識Ｖｏ
ｌ、７９．戸２３３−２３６（＋９７６）及び同Ｖｏｌ
。
６２，７２８５〜２９２（＋９７６））等を挙げること
が１２５ ｊｊｌ できる。又、 Ｉ、 Ｉ等を導入する場合は、例
えば常法のりＯラミシＴ法による標識化法によることが
できる（ Ｎａｔｕｒｅ ｌ ９４ 、戸４９５（１９
６２）。
が１２５ ｊｊｌ できる。又、 Ｉ、 Ｉ等を導入する場合は、例
えば常法のりＯラミシＴ法による標識化法によることが
できる（ Ｎａｔｕｒｅ ｌ ９４ 、戸４９５（１９
６２）。
Ｂｉｏｃｈｔｎノ、 Ｊ、８９． シピ）１１４（
１９６３） ’：ｌ 。
１９６３） ’：ｌ 。
更に本発明に用いる上記標識物質け、既に市販されてお
シ、本発明ではかかる市販品を用いることもできる。
シ、本発明ではかかる市販品を用いることもできる。
本発明の上記ＩＣ−不溶化状補体結合体と上記標識物質
との反応は、前記検体と不溶性抗補体との反応と同様に
して行なうことができる。
との反応は、前記検体と不溶性抗補体との反応と同様に
して行なうことができる。
本発明では、次いで上記により得られる標識物質により
標識化された反応物と、未反応の標識物質とを分離し、
そのいずれかの標識活性を測定する。」〕紀分離は通常
の手段によシ例えば、反応液を吸引除去後、生理食塩水
等による３回以上の洗浄操作等により容易に行なわれる
。また分離された各物質の標識活性の測定は、用いた標
識剤に応じて、例えば酵素標識剤を用いる場合には、こ
れを該酵素の基質に作用させ、その基質分解物の酵素活
性を常法に従い例えば吸光度測定により、また放射性標
識剤を用いる場合には、その放射能をカウル１−するこ
とによシ行なわれる。上記において未反応標識物質の標
識活性を測定した場合、反応物即ち測定すべき物質の該
活性は、用いた標識物質の当初の標識活性の差として容
易に算出できる。
標識化された反応物と、未反応の標識物質とを分離し、
そのいずれかの標識活性を測定する。」〕紀分離は通常
の手段によシ例えば、反応液を吸引除去後、生理食塩水
等による３回以上の洗浄操作等により容易に行なわれる
。また分離された各物質の標識活性の測定は、用いた標
識剤に応じて、例えば酵素標識剤を用いる場合には、こ
れを該酵素の基質に作用させ、その基質分解物の酵素活
性を常法に従い例えば吸光度測定により、また放射性標
識剤を用いる場合には、その放射能をカウル１−するこ
とによシ行なわれる。上記において未反応標識物質の標
識活性を測定した場合、反応物即ち測定すべき物質の該
活性は、用いた標識物質の当初の標識活性の差として容
易に算出できる。
かくして本発明のひとつの方法によれば被検試料中の特
定のＩＣ例えばＲＦＰ−ＩＣ，ＡＦＰ−ＩＣＳＣＥＡ−
ＩＣ又はＴＡＧ−ＩＣのいずれかのみを容易に特異的に
測定することができる。
定のＩＣ例えばＲＦＰ−ＩＣ，ＡＦＰ−ＩＣＳＣＥＡ−
ＩＣ又はＴＡＧ−ＩＣのいずれかのみを容易に特異的に
測定することができる。
また本発明の第２の方法は以下の如くして実施され、こ
れによっても上記第１の方法と同様に本発明所期の目的
を達成できる。即ちこの第２の方法ではまず上記第１の
方法と同一の特定のＩＣを含有する被検試料を、該ＩＣ
を構成する腫瘍関連抗原もしくはその抗体のいずれかと
特異的に結合する不溶化された物質と反応させる。ここ
で用いられる不溶化された物質としては、上記した抗Ｂ
ＦＰ１抗ＡＦＰ、抗ＣＥΔ、抗ＴＡＧ、各種レクチ１、
ＲＦＰ、ＡＦＰまたはＣＥＡを通常の不溶性支持体例え
ば前記と同様の不溶性支持体上に固定したものを使用で
きる。この固定化法は公知であり、例えば上記した不溶
化状補体結合体の形成法と同様にして行なわれる。
れによっても上記第１の方法と同様に本発明所期の目的
を達成できる。即ちこの第２の方法ではまず上記第１の
方法と同一の特定のＩＣを含有する被検試料を、該ＩＣ
を構成する腫瘍関連抗原もしくはその抗体のいずれかと
特異的に結合する不溶化された物質と反応させる。ここ
で用いられる不溶化された物質としては、上記した抗Ｂ
ＦＰ１抗ＡＦＰ、抗ＣＥΔ、抗ＴＡＧ、各種レクチ１、
ＲＦＰ、ＡＦＰまたはＣＥＡを通常の不溶性支持体例え
ば前記と同様の不溶性支持体上に固定したものを使用で
きる。この固定化法は公知であり、例えば上記した不溶
化状補体結合体の形成法と同様にして行なわれる。
また上記被検試料と不溶化された物質との反応は、前記
、検体と不溶性抗補体との反応と同様にして実施される
。かくしてこの第２の方法によれは被検試料中に存在す
る特定のＩＣのみを選択的に不溶化固体として分取でき
る。
、検体と不溶性抗補体との反応と同様にして実施される
。かくしてこの第２の方法によれは被検試料中に存在す
る特定のＩＣのみを選択的に不溶化固体として分取でき
る。
本発明の第２の方法では次いで上記によシ分取された特
定のＩＣ−不溶化物質結合体に標識化されだ抗補体、抗
抗体もしくはづ０テイシＡを反応きせる。ここで用いら
れる標識抗補体又は標識抗抗体は、上記不溶化されたＩ
Ｃの補体又は抗体と免疫反応する抗補体又は抗抗体を通
常の標識剤によシ標識することにより得られる。上記抗
補体及び標識剤としては前記第１の方法に用いるそれら
と同様のものでよい。抗抗体としては抗体に対する抗体
であれば特に限定はなく、例えはしト出来の検体を測定
する場合には、抗しト免疫りｏｊリシＧ等を使用すれは
よい。標識化手段も同様に通常慣用される方法によるこ
とができる。また上記もできる。該づ０テイシＡとして
は、例えばＥ。
定のＩＣ−不溶化物質結合体に標識化されだ抗補体、抗
抗体もしくはづ０テイシＡを反応きせる。ここで用いら
れる標識抗補体又は標識抗抗体は、上記不溶化されたＩ
Ｃの補体又は抗体と免疫反応する抗補体又は抗抗体を通
常の標識剤によシ標識することにより得られる。上記抗
補体及び標識剤としては前記第１の方法に用いるそれら
と同様のものでよい。抗抗体としては抗体に対する抗体
であれば特に限定はなく、例えはしト出来の検体を測定
する場合には、抗しト免疫りｏｊリシＧ等を使用すれは
よい。標識化手段も同様に通常慣用される方法によるこ
とができる。また上記もできる。該づ０テイシＡとして
は、例えばＥ。
Ｙ、ラボラトリ−社より市販のものを用いることができ
る。
る。
上記本発明の標識抗袖体、標識抗抗体又は標識’ｌｏテ
イシＡとＩＣ−不溶化物質結合体との反応は、例えば前
記した検体と不溶北枕袖体との反応と同様の条件下に行
なうことができる。
イシＡとＩＣ−不溶化物質結合体との反応は、例えば前
記した検体と不溶北枕袖体との反応と同様の条件下に行
なうことができる。
及びそれらの各標識活性の測定は、前記第１の方法と同
様にして行なわれ、これによシ被検試料中の特定のＩＣ
のみを特異的に検出、測定することができる。かくして
本発明によれば体液中の特定の腫瘍関連抗原のＩＣを定
量でき、これによシ初期から末期に亘る癌の診断、特に
癌の早期発見が可能である。更に本発明は上記の通シ体
液中に疾患や自己免疫疾患等の診断や２等疾患の解析、
参考例１ （？３−ｔファ０−ス４Ｂの製造臭化シ
アン（ＣＮＢｒ）−活性化上ファ０−ス４Ｂ（ファルマ
シア社）１５Ｆ（乾燥重量）を１Ｏ−３ＮＨ（４水溶液
１．５Ｅに加え、室温にて１５分間ｔｘｔに加え、次い
でしｌ−Ｃ３（Ｂｉｏｔｋｔｐｎｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ（Ｅｍｙｌａｎｄ ） 、 Ｖｏｌ、 Ｉ ９３
（３） ／９６３−９７０（１９８＋））１００ＩＩｇ
を加え、室温にて２時間、時々攪拌しながら反応させた
。ガラスフィルターで濾過後、これをＩＭｅノエタノー
ルア三シ水溶液（戸＃８．０）２００ｍｌに加え、室温
で２時間放置する。ガラスフィルターで濾過後、Ｑ 、
５ ＭＮａＣ７１を含有する０、１Ｍ酢酸緩衝液ＣＩ’
Ｈ４，０）２１、次イテ０．５ ＭＮｔｌＣｌ のホ
ウ酸塩緩衝Ｍ （／＞ Ｈ８，０）２１で十分に洗浄す
る。この洗浄操作を、洗浄液の０１）２８０ が０．
００２以下になるまで行ない、かくして、しトＣ３−ｔ
ファ０−ス４Ｂを得る。このものは、０．２％ＢＳＡ及
び０．２％Ａ’ａＮ３を含有する０、０５Ｍ リシ酸塩
緩衝液中にて４°Ｃ下に使用時まで保存した。
様にして行なわれ、これによシ被検試料中の特定のＩＣ
のみを特異的に検出、測定することができる。かくして
本発明によれば体液中の特定の腫瘍関連抗原のＩＣを定
量でき、これによシ初期から末期に亘る癌の診断、特に
癌の早期発見が可能である。更に本発明は上記の通シ体
液中に疾患や自己免疫疾患等の診断や２等疾患の解析、
参考例１ （？３−ｔファ０−ス４Ｂの製造臭化シ
アン（ＣＮＢｒ）−活性化上ファ０−ス４Ｂ（ファルマ
シア社）１５Ｆ（乾燥重量）を１Ｏ−３ＮＨ（４水溶液
１．５Ｅに加え、室温にて１５分間ｔｘｔに加え、次い
でしｌ−Ｃ３（Ｂｉｏｔｋｔｐｎｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ（Ｅｍｙｌａｎｄ ） 、 Ｖｏｌ、 Ｉ ９３
（３） ／９６３−９７０（１９８＋））１００ＩＩｇ
を加え、室温にて２時間、時々攪拌しながら反応させた
。ガラスフィルターで濾過後、これをＩＭｅノエタノー
ルア三シ水溶液（戸＃８．０）２００ｍｌに加え、室温
で２時間放置する。ガラスフィルターで濾過後、Ｑ 、
５ ＭＮａＣ７１を含有する０、１Ｍ酢酸緩衝液ＣＩ’
Ｈ４，０）２１、次イテ０．５ ＭＮｔｌＣｌ のホ
ウ酸塩緩衝Ｍ （／＞ Ｈ８，０）２１で十分に洗浄す
る。この洗浄操作を、洗浄液の０１）２８０ が０．
００２以下になるまで行ない、かくして、しトＣ３−ｔ
ファ０−ス４Ｂを得る。このものは、０．２％ＢＳＡ及
び０．２％Ａ’ａＮ３を含有する０、０５Ｍ リシ酸塩
緩衝液中にて４°Ｃ下に使用時まで保存した。
１９−
参考例 ２
■ 抗Ｃ３血清の製造
しトＣ３（上記参考例１に同じ）１０■を生理食塩水１
０鱈ｔｔｃｔａ解し、この１劇ｌとフロイシド完全アジ
□バ＞ ト（Ｃｏｍｆｉｌｔｔｔ Ｅｒｒａｎｄｓ ａ
ｄｊｕｖａｎｔ ）］ ｍｌを混合し、これを家兎に０
．２ｍｌ／頭皮下注射する。２週間後、更にその１ケ月
後に同量を投与し、最終免疫から１週間後に採血して抗
し’ｔ−Ｃ３血清を得る。
０鱈ｔｔｃｔａ解し、この１劇ｌとフロイシド完全アジ
□バ＞ ト（Ｃｏｍｆｉｌｔｔｔ Ｅｒｒａｎｄｓ ａ
ｄｊｕｖａｎｔ ）］ ｍｌを混合し、これを家兎に０
．２ｍｌ／頭皮下注射する。２週間後、更にその１ケ月
後に同量を投与し、最終免疫から１週間後に採血して抗
し’ｔ−Ｃ３血清を得る。
■ 抗Ｃ３抗体（ＤＦ（ｔａｂ’）２分画（／ （ａ
ｂ ）２−抗Ｃ３〕の製造 上記■で得た抗Ｃ３血清１０＋ｌと０．９９６ＮｔｌＣ
１！２０ｍ１を混合し、飽和硫酸アシｔニウム１０厘ｌ
を徐々に滴下し、遠心分ＨＣ３０００ｒｐｎｚ、１５分
）して得た沈渣をＰＢＳにて透析して得たγ−タ０プリ
シ分画を、前記参考例１で得ｆＣＣ３−セファ０−ス４
Ｂのアフィニティー９０マドカラムに付２Ｏ− ＣＩ’Ｈ７，４）で洗浄後、０．５ Ｍ ＮａＣｌ （
７） ０．１ Ｍ酢酸水溶液で溶出して、精製抗Ｃ３抗
体を得る。これをぺづシシ処理（４Ｍｇぺづシシ、３７
℃２４時間）ｆｆｌｔファデックスＧ−１５０（ファル
マシア社）のカラムク０マドに付し、Ｑ、５ Ｍ Ｎａ
Ｃ４の０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（／’／／＝８．０）で
溶出【７てＦ（ａｂ’入−抗Ｃ３分画を得る。
ｂ ）２−抗Ｃ３〕の製造 上記■で得た抗Ｃ３血清１０＋ｌと０．９９６ＮｔｌＣ
１！２０ｍ１を混合し、飽和硫酸アシｔニウム１０厘ｌ
を徐々に滴下し、遠心分ＨＣ３０００ｒｐｎｚ、１５分
）して得た沈渣をＰＢＳにて透析して得たγ−タ０プリ
シ分画を、前記参考例１で得ｆＣＣ３−セファ０−ス４
Ｂのアフィニティー９０マドカラムに付２Ｏ− ＣＩ’Ｈ７，４）で洗浄後、０．５ Ｍ ＮａＣｌ （
７） ０．１ Ｍ酢酸水溶液で溶出して、精製抗Ｃ３抗
体を得る。これをぺづシシ処理（４Ｍｇぺづシシ、３７
℃２４時間）ｆｆｌｔファデックスＧ−１５０（ファル
マシア社）のカラムク０マドに付し、Ｑ、５ Ｍ Ｎａ
Ｃ４の０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（／’／／＝８．０）で
溶出【７てＦ（ａｂ’入−抗Ｃ３分画を得る。
参考例３ 酵素標識抗体の製造〔アルカリフォスフｙ
ｓｔ−ｔ！標識Ｆ（ａ ｂ ）２−抗ＲＦＰ”：Ｊ前記
参考例２と同様にしてＦ（ａｂ’）２−抗ＲＦＰを得る
。このｌＯηとアルカリフォスファターゼ（ｆｏｔ ｎ
、牛腸アルカリフオスファターぜ結晶；シクマ社）ＩＯ
Ｍｇを、Ｑ、５ Ａｆ ＮａＣ４の０．１Ｍリシ酸塩緩
衝液（／’Ｈ＝７．５ ） Ｉ ＣＪｓｔに加え、２５
％タルタルアルデヒド溶液０．５ｗｌを徐々に滴下し、
室温で２時間混合する。クリシシ５ｆを加え、過剰のタ
ルタルアルデヒドをブロックし生理食塩水マシア社）に
てゲル濾過し活性の高い両分を集めプールしてアルカリ
フォスファターゼ標識Ｆ （’ ｂ’ ）２−抗ＲＦＰ
とする。
ｓｔ−ｔ！標識Ｆ（ａ ｂ ）２−抗ＲＦＰ”：Ｊ前記
参考例２と同様にしてＦ（ａｂ’）２−抗ＲＦＰを得る
。このｌＯηとアルカリフォスファターゼ（ｆｏｔ ｎ
、牛腸アルカリフオスファターぜ結晶；シクマ社）ＩＯ
Ｍｇを、Ｑ、５ Ａｆ ＮａＣ４の０．１Ｍリシ酸塩緩
衝液（／’Ｈ＝７．５ ） Ｉ ＣＪｓｔに加え、２５
％タルタルアルデヒド溶液０．５ｗｌを徐々に滴下し、
室温で２時間混合する。クリシシ５ｆを加え、過剰のタ
ルタルアルデヒドをブロックし生理食塩水マシア社）に
てゲル濾過し活性の高い両分を集めプールしてアルカリ
フォスファターゼ標識Ｆ （’ ｂ’ ）２−抗ＲＦＰ
とする。
１１Ｎ３’ｌＪ４ 不溶化Ｆ （ａｂ’）２−抗Ｃ
３の製造前記参考例２で得たＦ（ａ ｂ’）２−抗Ｃ３
を０．ＩＪｆ）ｌス塩Ｍ衝Ｈ（，１１Ｈ＝ ８．０ ）
にて、２５μｙ ／ ｍｌに調整する。マイクロタイタ
ープレート（ポリ塩化じニール製、Ｕ−づし−ト、クッ
ク社製）の各ウェルに上記溶液１５０μＥづつを注入し
、３７℃１時間イシ士ユベート、ついで４℃２０時間静
置する。ウェル内溶液を除去後、生理食塩水で３回洗浄
して不溶化Ｆ （ａｊ”）２−抗Ｃ３を得る。各ウェル
はトリス塩酸緩衝液で満たしてシールして４℃下に保存
し、使用時に緩衝液を除去する。
３の製造前記参考例２で得たＦ（ａ ｂ’）２−抗Ｃ３
を０．ＩＪｆ）ｌス塩Ｍ衝Ｈ（，１１Ｈ＝ ８．０ ）
にて、２５μｙ ／ ｍｌに調整する。マイクロタイタ
ープレート（ポリ塩化じニール製、Ｕ−づし−ト、クッ
ク社製）の各ウェルに上記溶液１５０μＥづつを注入し
、３７℃１時間イシ士ユベート、ついで４℃２０時間静
置する。ウェル内溶液を除去後、生理食塩水で３回洗浄
して不溶化Ｆ （ａｊ”）２−抗Ｃ３を得る。各ウェル
はトリス塩酸緩衝液で満たしてシールして４℃下に保存
し、使用時に緩衝液を除去する。
参考例５ 不溶化レクチル（ＰＮＡ−ヒース）の製造
１１Ｃ１水溶液で交互に３回づつ洗浄後蒸留水でｐＨが
約７になるまで洗浄する。ＰＮＡ（Ｅ、Ｙラボラトリ−
社）１００ｔｔｆ／ｍｌのＬｌ＆リン酸塩緩衝液１２０
＋ｌに上記じ−ズ１０００個を加え４℃で２４時間放置
後じ−ズをｐ取水法し、次いで０．２％ゼラチンの０．
１ Ｍリシ酸塩緩衝液２００１に入れ４℃２４時間放置
する。ビーズを沖取水洗して不溶化ＰＮＡを得る。この
Ｐ、 Ｎ Ａ−ピースハ０．０５． Ｍ ’Ｊ ：／
ｒｅ緩衝液（０，ｌ４ＭＮｄＣ１１，０，２９６’Ｑラ
チｙ、０．０１％ＮａＮ３、ｌ’Ｈ＝７．４）中に保存
される。
約７になるまで洗浄する。ＰＮＡ（Ｅ、Ｙラボラトリ−
社）１００ｔｔｆ／ｍｌのＬｌ＆リン酸塩緩衝液１２０
＋ｌに上記じ−ズ１０００個を加え４℃で２４時間放置
後じ−ズをｐ取水法し、次いで０．２％ゼラチンの０．
１ Ｍリシ酸塩緩衝液２００１に入れ４℃２４時間放置
する。ビーズを沖取水洗して不溶化ＰＮＡを得る。この
Ｐ、 Ｎ Ａ−ピースハ０．０５． Ｍ ’Ｊ ：／
ｒｅ緩衝液（０，ｌ４ＭＮｄＣ１１，０，２９６’Ｑラ
チｙ、０．０１％ＮａＮ３、ｌ’Ｈ＝７．４）中に保存
される。
参考例６ 検体の調製
健常人及び各種癌及びその他の患者よＦ）２ｍｌ血液を
採取後凝固させ、遠心分離（２０００ｒ Ｉｔｎ。
採取後凝固させ、遠心分離（２０００ｒ Ｉｔｎ。
１０分）して被検血清を得る３、ヘバリシ（５００単位
）処理した注射器で採血し、同様に分離して被検血漿を
得る。
）処理した注射器で採血し、同様に分離して被検血漿を
得る。
実施例 １
２３−
前記参考例３で得た／ （ａ ｂ ）２−抗Ｃ３を不溶
化したマイクロタイタープレートの各ウェルに、前記参
考例６で得た被検血清０．１１を注入し、３７℃２時間
イシ＋１ベートする。反応液を吸引除去後生理食塩水で
３回洗浄する。次いで前記参考例３で得た標識Ｆ （ａ
ｂ’） ２−抗ＲＦＰ０．１厘１を注入し、３７°Ｃ
２時間イシ千ユベートする。反応液を吸引除去後生理食
塩水で３回洗浄する。これに基質液（ｔ−二ト０フェニ
ルリン酸５０’／／ ｌ ＯＯｗｌＯ０ＩＭジエタノー
ルアミシ水溶液（／＃＝ＩＯ））０．１ｗｔ１を注入し
３７℃１時間イシ＋１ベート後ｌＡ’ ＮａＯＨ水溶液
０．１ｇｊｔ−添加して反応を停止させる。
化したマイクロタイタープレートの各ウェルに、前記参
考例６で得た被検血清０．１１を注入し、３７℃２時間
イシ＋１ベートする。反応液を吸引除去後生理食塩水で
３回洗浄する。次いで前記参考例３で得た標識Ｆ （ａ
ｂ’） ２−抗ＲＦＰ０．１厘１を注入し、３７°Ｃ
２時間イシ千ユベートする。反応液を吸引除去後生理食
塩水で３回洗浄する。これに基質液（ｔ−二ト０フェニ
ルリン酸５０’／／ ｌ ＯＯｗｌＯ０ＩＭジエタノー
ルアミシ水溶液（／＃＝ＩＯ））０．１ｗｔ１を注入し
３７℃１時間イシ＋１ベート後ｌＡ’ ＮａＯＨ水溶液
０．１ｇｊｔ−添加して反応を停止させる。
反応液を、巾ＩＨのｔルを使用して分光光度計で４０５
ｎＨの波長で吸光度を測定した。結果を第１図に示す。
ｎＨの波長で吸光度を測定した。結果を第１図に示す。
第１図においてＩは健常人１９名から成る群（コシトロ
ール群）、■は原発性肝癌患者１６名２４− から成る群、■は胃癌患者１９名から成る群及び■は肝
炎患者１８名から成る群を夫々示す。また該図中吸光度
０．２５０以上の各′ｊロットは各吸光度を付して表記
した。
ール群）、■は原発性肝癌患者１６名２４− から成る群、■は胃癌患者１９名から成る群及び■は肝
炎患者１８名から成る群を夫々示す。また該図中吸光度
０．２５０以上の各′ｊロットは各吸光度を付して表記
した。
該図より、癌の診断ができる。尚同時に遊離のＲＦＰが
高値に測定される肝炎の患者について同様に測定した結
果、肝炎の増悪期にはＲＦＰ−ＩＣが低く、同回後期に
はＲＦＰ−ＩＣが高値に測定されることが判った。再生
肝細胎から産生されるＲＦＰは、癌細胞由来のものと同
時でおることが推察されると共に、本発明方法によれば
肝炎の臨床的鑑別に有用であることが判る。
高値に測定される肝炎の患者について同様に測定した結
果、肝炎の増悪期にはＲＦＰ−ＩＣが低く、同回後期に
はＲＦＰ−ＩＣが高値に測定されることが判った。再生
肝細胎から産生されるＲＦＰは、癌細胞由来のものと同
時でおることが推察されると共に、本発明方法によれば
肝炎の臨床的鑑別に有用であることが判る。
実施例 ２
前記参考例６で得た被検血清又は血漿のＯ，ｌ５ｇ１に
前記参考例うで得たＰＮＡ−じ−１１個及び０．２％ゼ
ラチン、０．１５４１ ＮａＣ７１、５ｍＭ ＭｇＣ７
１２，５ｒｒｔ Ｍ ＣａＣｌ２及び０．０１％チメＤ
ザールを含有する０、０５ Ｍ ｌ−リス−ＨＣＩＩ
砂［ｉ府（ｐ／／＝ ７４ ）ｎ （ｍｌを加え、２５
℃５時間イｙ十ｌベートする。じ−ズを生理食塩水で３
回洗浄後バーオ千シターゼ標識づＤティ：、Ｊ’（４０
００倍希釈Ｅ、Ｙ、ラボラトリ−社）０−１ｗｌと、０
．２％ゼラチシ、０．１５ ＭＮａＣ４及び０．０１％
チメ０ザールを含有する０、０５Ｍトリス−ＨＣＪｌｉ
衝液（／ Ｈ＝ ７．４ ） Ｏ’、５ｇ／との混液に
加え２５℃１６時間イシ士ユベートする。
前記参考例うで得たＰＮＡ−じ−１１個及び０．２％ゼ
ラチン、０．１５４１ ＮａＣ７１、５ｍＭ ＭｇＣ７
１２，５ｒｒｔ Ｍ ＣａＣｌ２及び０．０１％チメＤ
ザールを含有する０、０５ Ｍ ｌ−リス−ＨＣＩＩ
砂［ｉ府（ｐ／／＝ ７４ ）ｎ （ｍｌを加え、２５
℃５時間イｙ十ｌベートする。じ−ズを生理食塩水で３
回洗浄後バーオ千シターゼ標識づＤティ：、Ｊ’（４０
００倍希釈Ｅ、Ｙ、ラボラトリ−社）０−１ｗｌと、０
．２％ゼラチシ、０．１５ ＭＮａＣ４及び０．０１％
チメ０ザールを含有する０、０５Ｍトリス−ＨＣＪｌｉ
衝液（／ Ｈ＝ ７．４ ） Ｏ’、５ｇ／との混液に
加え２５℃１６時間イシ士ユベートする。
じ−ズを生理食塩水で３回洗浄後、これに０．０３ミシ
の生理食塩水１．Ｏｗｌを加え室温でｌＯ分イシ干ユベ
ートする。ＩＮ塩酸水溶液２．Ｃ）ｓｌを加え反応を停
止して４９２＃Ｆｆｆの波長で吸光度を測定する。
の生理食塩水１．Ｏｗｌを加え室温でｌＯ分イシ干ユベ
ートする。ＩＮ塩酸水溶液２．Ｃ）ｓｌを加え反応を停
止して４９２＃Ｆｆｆの波長で吸光度を測定する。
結果を第２図に示す。
第２図においてＶは健常人２６名から成る群（コシトロ
ール群）及び■は癌患者３２名から成る患者群を示す。
ール群）及び■は癌患者３２名から成る患者群を示す。
読図よシ癌の診断が可能であることが判る。
実施例 ３
前記参考例６で得た被検血清又は血漿の帆１１に前記参
考例うで得たＰＮＡ−ビーズ１個及び０．１５ Ｍ Ｎ
ｔＸＣｌ 、 ０．２％ゼラチシ、 ０．Ｏ１％ｆメ０
ザール、５ｍＭ Ｊ！ｙｃ１２及び５ ｍ Ｍ ＜−’
ａＣ１２を含有する０、０５ Ｍ ）リスーＨＣＩＩ
緩衝液ＣｐＨ−ｒ、４）０．５ｍｌを加え、２５°Ｃ５
時間イシ干ユベートする。ビーズを生理食塩水で３回洗
浄後、バーオ十シＪ−ゼ標識１）４抗し１−Ｃ３抗体（
Ｅ、Ｙ、ラボラ′トリー社製ＨＸＩＯ）０．Ｉｇｔと、
０．１５ Ｍ ＮａＣ１、０，２％ゼラチシ及び０．０
１％チメ０ザールを含有する０、０５ Ｍ トリス−Ｈ
Ｃ１緩衝液（戸Ｈ＝ ７．４ ） ０．５ｍｌとの混液
に加え、２５°０１６時間イシ干ユベーショシする。ビ
ーズを生理食塩水で３回洗浄後、これに０．０３％Ｈ２
Ｏ２００，２Ｍクエシ酸−リシ酸塩緩衝液（戸Ｈ＝ ５
−０ ） ０．５ ｍｌ及び４ｑ／譚１才ルトフエニレ
シジア、ニジの生理食塩水１．Ｏｗｌを加え、室温で３
０分イシ＋１ベートする。ＩＮ硫酸水溶液２．０ｖｘｌ
を加え反応を停止して、４９２ｔｊｍの波長で吸光度を
測定した。結果を第３図に示す。
考例うで得たＰＮＡ−ビーズ１個及び０．１５ Ｍ Ｎ
ｔＸＣｌ 、 ０．２％ゼラチシ、 ０．Ｏ１％ｆメ０
ザール、５ｍＭ Ｊ！ｙｃ１２及び５ ｍ Ｍ ＜−’
ａＣ１２を含有する０、０５ Ｍ ）リスーＨＣＩＩ
緩衝液ＣｐＨ−ｒ、４）０．５ｍｌを加え、２５°Ｃ５
時間イシ干ユベートする。ビーズを生理食塩水で３回洗
浄後、バーオ十シＪ−ゼ標識１）４抗し１−Ｃ３抗体（
Ｅ、Ｙ、ラボラ′トリー社製ＨＸＩＯ）０．Ｉｇｔと、
０．１５ Ｍ ＮａＣ１、０，２％ゼラチシ及び０．０
１％チメ０ザールを含有する０、０５ Ｍ トリス−Ｈ
Ｃ１緩衝液（戸Ｈ＝ ７．４ ） ０．５ｍｌとの混液
に加え、２５°０１６時間イシ干ユベーショシする。ビ
ーズを生理食塩水で３回洗浄後、これに０．０３％Ｈ２
Ｏ２００，２Ｍクエシ酸−リシ酸塩緩衝液（戸Ｈ＝ ５
−０ ） ０．５ ｍｌ及び４ｑ／譚１才ルトフエニレ
シジア、ニジの生理食塩水１．Ｏｗｌを加え、室温で３
０分イシ＋１ベートする。ＩＮ硫酸水溶液２．０ｖｘｌ
を加え反応を停止して、４９２ｔｊｍの波長で吸光度を
測定した。結果を第３図に示す。
第３図において■は健常人１９名から成るコシトロール
群及びＶＷは癌患者２７名から成る癌患者群を夫々示す
。読図より癌の診断が可能であることが判る。
群及びＶＷは癌患者２７名から成る癌患者群を夫々示す
。読図より癌の診断が可能であることが判る。
第１図乃至第３図は、夫々本発明実施例１〜３に従い測
定された健常人及び各種患者における吸光度測定結果を
示す図である。 （以 上） 第 ２ Ｂ”＋ 第 ３ 図 ３３４−
定された健常人及び各種患者における吸光度測定結果を
示す図である。 （以 上） 第 ２ Ｂ”＋ 第 ３ 図 ３３４−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■（１）体液中に免疫複合体として存在する袖体結合性
の腫瘍関連抗原−抗体複合体と、該複合体を構成する腫
瘍関連抗原もしくはその抗体のいずれかと特異的に結合
する不溶化′きれた物質又は不溶化抗補体とを反応させ
て、免疫複合体−不溶化物質結合体又は免疫複合体−不
溶化抗補体結合体を形成させ、 （２）次いで得られる免疫複合体−不溶化物質結合体と
、一定量の標識化された抗補体、抗抗体もしくはづ０デ
イジＡとを反応させるか又は免疫複合体−不浴化抗補体
結合体と、該結合体を構成する腫瘍関連抗原もしくはそ
の抗体のいずれかと特異的に結合する標識化された物質
の一定量とを反応させ、 （３）得られる反応物と、未反応の上記標識化された抗
補体、抗抗体もしくは′ｊＯティシＡまたは上記標識化
された物質とを分離し、 （４）分離された上記反応物又は未反応物のいずれかの
標識活性を測定する ことを特徴とする腫瘍関連抗原特異的免疫複合体の測定
法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12494582A JPS5915858A (ja) | 1982-07-16 | 1982-07-16 | 腫瘍関連抗原特異的免疫複合体の測定法 |
| PCT/JP1983/000228 WO1984000421A1 (en) | 1982-07-16 | 1983-07-14 | Method for assaying tumor-associated antigen-specific immune complex |
| CH138184A CH662427A5 (de) | 1982-07-16 | 1983-07-14 | Verfahren zur bestimmung von tumorantigen spezifischen immunkomplexen. |
| GB08403775A GB2133146B (en) | 1982-07-16 | 1983-07-14 | Method for assaying tumor-associated antigen-specific immune complex |
| EP19830106962 EP0100914B1 (en) | 1982-07-16 | 1983-07-15 | Method of determining immune complexes specific to tumor associated antigen |
| DE8383106962T DE3367281D1 (en) | 1982-07-16 | 1983-07-15 | Method of determining immune complexes specific to tumor associated antigen |
| SE8401424A SE467987B (sv) | 1982-07-16 | 1984-03-14 | Saett att bestaemma maengden av ett tumoerantigen-immunokomplex |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12494582A JPS5915858A (ja) | 1982-07-16 | 1982-07-16 | 腫瘍関連抗原特異的免疫複合体の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5915858A true JPS5915858A (ja) | 1984-01-26 |
Family
ID=14898080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12494582A Pending JPS5915858A (ja) | 1982-07-16 | 1982-07-16 | 腫瘍関連抗原特異的免疫複合体の測定法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0100914B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5915858A (ja) |
| CH (1) | CH662427A5 (ja) |
| DE (1) | DE3367281D1 (ja) |
| GB (1) | GB2133146B (ja) |
| SE (1) | SE467987B (ja) |
| WO (1) | WO1984000421A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE77700T1 (de) * | 1986-03-10 | 1992-07-15 | Imre Corp | Immunkomplextestverfahren. |
| US5179000A (en) * | 1987-07-24 | 1993-01-12 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Method for assaying basic fetoprotein in urine and assay kit therefor |
| US5840317A (en) * | 1989-11-03 | 1998-11-24 | Morton; Donald L. | Composition comprising tumor cell lines containing GD2 ganglioside GM2 ganglioside, M-TAA, and either M-urinary antigen or M-fetal antigen |
| US5882654A (en) * | 1989-11-03 | 1999-03-16 | Morton; Donald L. | Polyvalent melanoma vaccine |
| CA2072620C (en) * | 1989-11-03 | 2007-06-12 | Donald L. Morton | Urinary tumor associated antigen, antigenic subunits uses and methods of detection |
| RO114835B1 (ro) * | 1997-03-17 | 1999-07-30 | Ioan Puşcaş | Metodă rapidă de diagnostic al cancerelor |
| ITPD20030264A1 (it) * | 2003-10-30 | 2005-04-30 | Xeptagen Spa | Metodo di diagnosi altamente specifico per neoplasie |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1590524A (en) * | 1976-11-24 | 1981-06-03 | Nat Res Dev | Assay of immune complexes |
| ES471585A1 (es) * | 1977-07-15 | 1979-01-16 | Behringwerke Ag | Procedimiento para la determinacion de reactivos fc |
| DE2836046A1 (de) * | 1978-08-17 | 1980-02-28 | Behringwerke Ag | Immunologisches bestimmungsverfahren |
| US4342566A (en) * | 1980-02-22 | 1982-08-03 | Scripps Clinic & Research Foundation | Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes |
| CA1166957A (en) * | 1980-05-08 | 1984-05-08 | Barry I. Bluestein | Immunoassay for oncofetal antigen carried by lymphocytes |
| GB2093993A (en) * | 1980-07-25 | 1982-09-08 | Otsuka Pharma Co Ltd | Method for determining tumor-associated glucose side chain method for diagnosing tumors and kit for diagnosing tumors |
| JPS5729949A (en) * | 1980-07-30 | 1982-02-18 | Nippon Koutai Kenkyusho:Kk | Determination of sugar branch related to cancer and diagnostic technique of cancer |
| JPS5729951A (en) * | 1980-07-30 | 1982-02-18 | Nippon Koutai Kenkyusho:Kk | Determintion of sugar side chain related to cancer |
| JPS5729950A (en) * | 1980-07-30 | 1982-02-18 | Nippon Koutai Kenkyusho:Kk | Determination method of sugar side chain related to cancer |
| GB2109932B (en) * | 1980-10-24 | 1984-08-01 | David Parratt | A method of diagnosis |
-
1982
- 1982-07-16 JP JP12494582A patent/JPS5915858A/ja active Pending
-
1983
- 1983-07-14 GB GB08403775A patent/GB2133146B/en not_active Expired
- 1983-07-14 WO PCT/JP1983/000228 patent/WO1984000421A1/ja unknown
- 1983-07-14 CH CH138184A patent/CH662427A5/de not_active IP Right Cessation
- 1983-07-15 EP EP19830106962 patent/EP0100914B1/en not_active Expired
- 1983-07-15 DE DE8383106962T patent/DE3367281D1/de not_active Expired
-
1984
- 1984-03-14 SE SE8401424A patent/SE467987B/sv not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0100914B1 (en) | 1986-10-29 |
| CH662427A5 (de) | 1987-09-30 |
| GB2133146B (en) | 1986-01-08 |
| WO1984000421A1 (en) | 1984-02-02 |
| EP0100914A1 (en) | 1984-02-22 |
| GB2133146A (en) | 1984-07-18 |
| SE8401424D0 (sv) | 1984-03-14 |
| GB8403775D0 (en) | 1984-03-21 |
| SE467987B (sv) | 1992-10-12 |
| SE8401424L (sv) | 1984-03-14 |
| DE3367281D1 (en) | 1986-12-04 |
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