WO1984000421A1

WO1984000421A1 - Method for assaying tumor-associated antigen-specific immune complex

Info

Publication number: WO1984000421A1
Application number: PCT/JP1983/000228
Authority: WO
Inventors: Masaru Ishii; Shugo Akazawa
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1982-07-16
Filing date: 1983-07-14
Publication date: 1984-02-02
Also published as: GB8403775D0; GB2133146B; DE3367281D1; SE467987B; EP0100914A1; CH662427A5; SE8401424D0; EP0100914B1; JPS5915858A; SE8401424L; GB2133146A

Description

明賴龕

鼷瘦函連抗 !！特異的免疫複合体の SI定法技術分

本発頃は讓塞豳連抗原に特異的な免疫複合体の新しい澳定方法に aする。

生体内においてある抗原に対し抗体が産生されるとこの抗原と抗体とが結合して免疫複合体（ iiiune coi lex 、以下「 I C J とする）が形成されることが知られている。かかる I Cの形成は自己免疫疾患をはじめ、饑染症、愚性腫麵等の種々の疾患において晃ぃ出されている。該

I Cの存在は所鬵免疫複合体病を惹起する。該 I C殊に各種疾 «患者の血液中に溶存する可溶性 I Cの検出、濺定によれば各種疾患の解明、因の解析や諺断、更には予後の判定等ができることから、上記 I Cの検出酒定法が従来より種々提案されている。該方法としては倒えば超違心等の物理化学的方法の他、補体を利用する方法、抗免疫グロブリン法、細跑を用いる方法等の免疫生物学的方法が知られている。しかしながら従来公知の血液中の可溶性 I Cの検出法は、特定の病変で原因抗原が既知の «合を除いて、いずれも抗原非特異的方法にすぎない。卸ち従来より I Cを構成する抗原は多種多様であることが知られており、しかも一般にかかる抗原は抗体におおわれており、これを特異

OMPI 的に検出することは困難であるとされている。従って従来法は専ら上 E抗顯を検出するかわりに該抗ほと »合した抗体搠ぇぱ免疫グロプリン量を测定し、これを試料中の I C 量としている。従ってかかる方法では酒定される I C量はその構成要素である抗 11には穽特異的であり、また酒定系内で弒料中に本来存在する免疫グロプリンが非特異的に » 集し、該凝集 I J3 Gが上記囊定すぺき I C量に ¾箅され、かかる凝集 13 G量自体弒料及ぴ澜定条件により大きくぱらつき、しかも該集 10 <3と 1 0との靈 ¾法もまた現在全く見い出されていないのが現状である。

また癌における I Cが痛の進行度すなわち転移とよく平行することが報告されている（ T heof i lopoulos, A . Ν ·, et ai , J . I iiunol . , 1 1 9 : 65 7 ( 1 9 7 7 ) 〕。しかしながら、上記した従来法により測定された I Cが癌特異的な抗原と抗体との複合体であるかどうかは全く明確ではない。特に、発癌 fi体においては、しばしば正常賴胞

• 組織の物質とも反応する抗体の産生が Β伴されてくる、いわゆる非特異的反応が自己抗体として共存してくる場合が少くない。したがって、この様な悪性疾患における I C の翻定法においては、該 I Cの構成要素である抗原を頃らかにしなければ癌疾患の病体、特異性等を的確に把提することはできない。

本発明者らは、上記現状に鑑み、患者の体液中に存在する特定の臛癱興連抗簾に特異的な免疫複合体を特異的に灘定できる抗原特異的 I C¾定技術を確立することを目的として鋭意硏究を璽ねてきた。その結果、患者の体液中には、腫瘦翻連抗原（鼸瘦マーカー〉である倒えば B F P ( 塩基性フエ卜プロテイン、 basic fetoprotein ) 、 A F P

( <¾ 一フエ卜プロテイン）、 T A G ( Sfi閡連糖健鎖、

tu黼 or associated g I yco I i nkage^ 特翻 ffi 5 7 一

2 9 9 4 9号、周 5 7 — 2 9 9 5 0号及び同 5 7 —

2 9 9 5 号公報参照〉及び C E A ( 癌胎児性抗原、

care i noe讓 bryon i c ant i gen ) 等を抗原とする補体 ft合性の I Cが存在することを見い出した。またかかる I Cが不溶化抗補体と桔合した形態で、標識化されたある種の物質と特異的に桔合することができるか或いは、上記特定の

I Cのみを特異的に不溶化及ぴ欏識化することができ、かくして得られる不溶化標識反応物もしくは未反応標識物質の標識活性を ¾定することによって、上記目的に合致する方法が ¾立されるという新しい知見を得た。本発阁はこれらの知見により完成されたものである。

発明の鬨示

すなわち、本発钥は、

( 1 ) 体液中に免疫複合休として存在する補体結合性の臛瘦豳連抗原一抗体複合体と、不溶化抗補体又は該複合体を構成する鼸痕驟連抗原もしくその抗体のいずれかと ft

特異的に結合する不溶化された物質とを反応させて、免疫複合体ー不溶化抗補体祐合体又は免疫複合体ー不溶化物質 «合体を形成させ、

( 2 ) 次いで得られた免疫複合体ー不溶化抗補体培合体

5 と、該桔合体を構成する腫痛翻連抗尿もしくはその抗体のいすれかと特異的に結合する標識化された物質の一定量とを反応させるか、又は得られた免疫複合体ー不溶化物質 β合体と、一定量の標識化された抗補体、抗抗体ちしくはプロテイン Α とを反応させ、

lo ( 3 ) 得られた反応物と、未反応の上 S標識化された物質又は上記標識化された抗補休、抗抗体ちしくはプロテイン A とを分雌し、

( 4 ) 分難された上 S反応物又は未反応物のいすれかの標識活性を測定する

i s ことを特徴とする腫鑫 a連抗原特異的免疫複合体の a定法を提供するものである。

本発困方法は、従来知られておらず、むしろその ¾定は困難であるとされていた鼸瘦圉連抗原に特異的な I cの定技術を提供するものであり、本発頃方法によれば、比較 2° 的容易な操作で上記特定の i cを特異的に酒定することができる。従って本発明方法は鼸癱の解明、驂断、予後の判定等病理学上及び B床上非常に有用である。

以下本発頃方法を顯次詳述する。

鶴本発頃のひとつの方法によれば、体液中に I C ( 免疫褸合体）として存在する補体格合性の腫瘺興邃抗 S—抗体複合体と、不溶化抗補休とを反応させて I Cー不溶化抗補体钴合体を形成させ、次いで該桔合体の I Cを溝成する腫攝抗原もしくはその抗体のいずれかと特異的に結合する標識化された物質の一定量を上記 I Cー不溶化抗補体結合体と反応させ、反応物を未反応の上記標識化された物質から分艫し、そのいずれかの檩識活性を湖定する。より詳しくは、まず体液中に I Cとして存在する補体結合性の鍾瘦関連抗原一抗体複合体と不溶化抗補体とを反応させて I C ー不溶化抗補体結合体を形成させる。ここで用いられ本発 ¾に従い濺定される体液中の I Cは、 B F P、 A F P、 C E A及び T A Gから選択されたいすれかの臛痛瘸連抗原を抗原とするものであり、特に B F P又は T A Gを該抗原とするものが好適である。上記 B F Pをその構成抗原とする I C、 A F Pをその構成抗原とする I C及び T A Gを構成抗原とする I Cは、本発明方法によりはじめて検出されたものであり、従来かかる I Cが体液中に存在することは知られていない。上記各 I Cはいずれあ補体桔合性卸ち補体系を活性化する能力を有しており、体液中では該補体と桔合した形想で即ち抗原一抗体一補体複合体の形想で存在している。従って本発明ではこの I Cの補体結合性を利用して該 I Cと不溶化抗補体とを結合させる。

Ο ΡΙ S ここで、 ¾定に供される検体としての被検試料としては各種の体液倒えば血液、リンパ液、腹水、胸水、髓液等があげられ、これらは a定を所望する患者より常法 aりに採取すればよく、倒えば血液を検体とする場合は、血清または血漿として使用するのが好ましく、血清又は血 »は、常法の搮作法で ¾理されたものでよい。通常検体量は

0 . 0 1 〜 1 . 0 *2程度、好ましくは、 0 . 1 〜 0 .

程度使用すればよい。

不溶化抗補体としては、すでに市贩のものをあるいは常法に従い、不溶性支持体に抗補体を化学的または物理的に反応させることにより製造されたものをいずれも使 ¾することができる。該抗補体としては補体に対する抗体であればよく、傍えば、ヒ卜補体成分の C 1 q 、 C 3 等に対する抗体等が特になく用いられ、市蔽のものを、あるいは常法に従って得た抗補体等を使用すればよい。

不溶性支持体としては、セルロース粉末、セフアデックス、セファロース、ポリスチレン、滅羝、カルポキシメチルセルロース、イオン交換稱盥、デキス卜ラン、プラスチックフィルム、プラスチヅクチューブ、ナイロン、ガラスビーズ、親、ポリアミンーメチルビニルエーテル一マレイン截共重合体、アミノ酸共重合物、エチレン一マレイン難共重合物等が挙げられる。不溶化は、共有結合法としてのジァゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導体法、カルボキシク

OMPI IPO 口リド樹歯法、カルポジイミド樹蹬法、無水マレイン酸 » 導体法、イソシアナ卜 SI導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロース力ルポナー卜誘導体法、縮合試薬を使用する方法〉、アルキル化法、架樓試薬による担体转合法 ( 架橋試薬としてグルタルアルデヒド、へキサメチレンィソシアナ一卜等を用いる）、 U fli反応による担休桔合法等の化学的反応：あるいはイオン交換樹鹿のような担体を用いるイオン結合法：ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用いる物理的吸着法によって行なわれる。

本発明の上記 I Cと不溶化抗補体との桔合反応は、例えば上記 I Cを含有する検体を 0. 2〜 0. 程度の緩衡液中で不溶化抗補体と反応させることにより実旃される。該反応は約 4〜 3 7で程度で 0. 5〜 48時面程度で行なうことができる。上 Eにおいて g衡液としては、特に制 S はなく、通常 P H 7. 0〜 8. 0程度の弱アルカリ性緩衝液ぇぱ 0. 5 Mリン酸埴緩衝液、卜リス，坦接緩衝液、ホウ酸緩衝液等を挙げることができ、通常の添加剤、伢ぇば牛血清アルブミン（ B S A ) 等の保護蛋白、チメロザール等の防腐剤及び N a C 2 等を添加してちかまわない。

かくして I Cー不溶化抗補体桔合体を形成できる。本発明では次いで、該桔合体を生理食坦水等で十分に洗浄後、該結合体 I Cを構成する腫瘦翻連抗原もしくはその抗体と特異的に桔合する標識化された物質の一定量を上記結合体と反応させる。ここで腫集 a連抗原と特異的に結合する標識化された質としては、定すべき上 s i cを構成する麓痛 s連抗原に応じてその抗体例えば B F pの場合は抗 B

F Pを、 A F Pの場合は抗 A F Pを、 C E Aの場合は抗 C E Aを、また T A Gの場合は抗 T A Gを常法に従い標識剤と反応させることにより讕 Sされる。また T A Gの場合は、上記標識化された％質として各種レクチンを標識剤と反応させたものを用いることちできる。上 Sにおいてレクチンとしては倒えば、末端ガラク卜ースと特異的に結合するもの〔 j . B . C . 2 5 0. 8 5 1 8〜 8 5 2 3 ( 1 9 7 5 ) ： B i ochei. B i op ys. R es. C o黼隱.6 2 , 1 4 4

( 1 9 7 5 ) ； Z . I 霞 aun aetsf orch , 3 8 , 4 23 〜 4 3 3 ( 1 9 6 9 ) ： B r.J . E xp. P athol., 2 7 , 2 2 8〜 2 3 6 ( 1 9 4 6 ) ； P roc . N at!. A cad.S oi. U S A ., 7 5 , N o.5 , 2 2 1 5〜 2 2 1 9 ( 1 9 7 8 ) ； B i ochei i stry 1 3 , 1 9 6〜 2 0 4 ( 1 9 7 4 ) ；

C arbohydrate R eseach, 5 1 , 1 0 7〜 1 1 8

( 1 9 7 6 ) 〕、例えばピーナツレクチン（以下「 P N A J という）、ひまの実（ R icinus C oaiuris ) レクチン等；末媚 N—ァセチルガラク卜サミンと特異的に結合するもの倒えばドリコスマメレクチン、ォサゲオレンジレクチン、ヒリックスボマティアレクチン、リママメレクチン、ダイズレクチン、パゥヒ二アマメレクチン等：または末端 L一フコースと特異的に結合するもの钥ぇぱミヤコグサレクチン（ L otus tet raoono I obus ) C B rt. J . E np. P athi, 3 4 , 9 4 ( 1 9 5 3 ) 、ハリエニシダマメレクチン

( U lex europeus) C B oyd. W . C . and S harp I e i gh. E . B lood, 9L, 1 9 5 ( 1 9 5 4 ) 〕等を示することができる。

また、上 S鼸瘦関邃抗原の抗体と特異的に結合する標識化された物質としては、該繡瘦驟連抗原自身 E ち B F P、 A F P、 T A G及び C E Aを常法に従い標識剤と反応させることにより a製される。上記、各抗体、抗原及びレクチンとしては、それぞれ市班のあのを、あるいは、常法に従つて製造されたものを使用すればよい（石并勝他、最新医学、第 3 6巻、第 5号、 P 8 6 0〜 8 6 6 ( 1 9 8 1 ) 参照〕。

上記鼸連抗原もしくはその抗体と特異的に結合する標識化された物賢を得るための標識剤としても特に鲥限されず、通常の酵素標識剤倒えばグルコアミラーゼ、ダルコースォキシダーゼ、パー才キシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、 jS— ガラク卜シダーゼ又はへム才クタペプチド等の酵素の活性フラグメント等及び放射性標識剤倒えば

1^{2 5} I 、 ^{1 3 1} I 等の放射性ヨウ素、卜リチウム、放射性リチウム等が挙げられる。これ等標識剤を用いた上記標識化された物質の譏製法としては、伢えば、酵素で標識化された物質の場合は、通常の蛋白質の架楊剤として知られるグルタルアルデヒドを用いる結合法や、特にグルコースォキシダーゼ又はパー才キシダーゼを使用する場合にはそれらの糖鎖にヨウ素 K法によりアルデヒドを導入後、被標識物質のァミノ基と結合させる方法（ Method in E n- zyiology, Voし 3 7 , p 1 3 3〜 1 3 6 ( 1 9 7 5 ) 〕及び抗体を F ( ab' ) — S Hに調製した後マレイミド基を導入して標識剤と桔合させる方法〔 J our nal of

B ioche黼 istry , V 0 1.7 9 , p 2 3 3〜 2 3 6

( 1 9 7 6 ) 及び周 V oし 6 2 , P 2 8 5〜 2 9 2

( 1 9 7 6 ) 〕等を挙げることができる。また、 ^{1 2 5} I ^{1 3 1} I 等を導入する場合は、拥えば常法のクロラミン T 法による標識化法によることができる（ N ature 9 4 , P 4 9 5 ( 1 9 6 2 ) , B iochei. J . 8 9 , Ρ 1 1 4

( 1 9 6 3 ) 〕。

更に本発明に用いる上 S標識化された物質は、 Sに市 ¾ されており、本発明ではかかる市 ¾品を用いることもできる。

本発明の上記 I Cー不溶化抗補体結合体と上記標識化された物質との反応は、前記検体と不溶化抗補体との反応と同様にして行なうことができる。

本発明では、次いで上記により得られる標識化された物質により標識化された反応物と、未反応の標識化された物

ΟΜΡΙ 質とを分離し、そのいずれかの標識活性を酒定する。上記分離は通常の手段によりぇぱ、反応液を吸引除去後、生理食坦水等による 3回以上の洗浄操作等により容易に行なわれる。また分離された各物質の標識活性の測定は、用いた標識剤に応じて、伢えば酵素標識剤を用いる場合には、これを該酵素の基質に作用させ、その基質分解物の酵素活性を常法に従いぇぱ吸光度測定により、また放射性標識剤を用いる場合には、その放射維をカウン卜することにより行なわれる。上記において未反応の樣識化された物質の標識活性を湖定した場合、反応物即ち SI定すべき物質の該活性は、用いた標識化された物質の当初の標識活性から未反応の標識化された物質の標識活性を差引くことにより容易に算出できる。

かくして本発明のひとつの方法によれぱ被検試料中の特定の I C、倒えば B F Pを構成抗原とする I C、 A F Pを構成抗原とする I C、 C E Aを構成抗原とする I C又は T A Gを構成抗原とする I Cのいずれかのみを容易に特異的に澜定することができる。

また本発明の第 2の方法は、体液中に I Cとして存在する補体桔合性の臛痛 15連抗原 -抗体禊合体と該 I Cを構成する B F P、 A F P、 T A G及び C E Aからなる群から選ばれた鼸痛 5連抗原もしくはその抗体のいずれかと特異的に結合する不溶化された物質とを反応させて I Cー不溶化 »質接合休を形成させ、次いで該結合休の補体もしくは抗体と反応性を有する一定量の標識化された抗補体、抗抗体もしくはプロテイン Aを上 S結合体と反応させ、得られる反応物と未反応の標識化された抗補体、抗抗体もしくはプ口ティン Aとを分離し、そのいずれかの標識活性を ¾定することにより実施され、これによつてち上記第 1 の方法と同様に本発明所期の目的を達成できる。即ちこの第 2の方法ではまず上 £第 1 の方法と周一の特定の I Cを含有する被検試料を、該 I Cを構成する臛痛連抗澳もしくはその抗体のいすれかと特異的に結合する不溶化された物質と反応させる。ここで用いられる上 I Cを構成する腫集 a連抗原と特異的に結合する不溶化された物質としては、上記した抗 B F P、抗 A F P、抗 C E A、抗 T A G、又は各種レクチンを通常の不溶性支持体上に固定したものが使用できる。ま.た、上 S I Cを構成する抗体と特異的に桔合する不溶化された物質としては、上 SB F P、 A F P , T A G , 又は C E Aを通常の不溶性支持体上に固定したものが使用できる。該支持体としては前記 ¾示したものがいずれも使用できる。また、上 S抗 B F P、抗 A F P、抗 TA G、抗

C E A、各種レクチン、 B F P、 A F P、 T A G又は G E Aを不溶性支持体上に固定する方法は公知方法で行なうことができ、倒えぱ上記した不溶化抗補体の形成法と周様にして行なわれる。

OMPI また上記被検試料と不溶化された物質との反応は、前記、検体と不溶化抗補体との反応と周様にして実施される。かくしてこの第 2 の方法によれば被検試料中に存在する特定の I Cのみを選択的に不溶化固体として分取できる。

本発明の第 2 の方法では次いで上記により分取された特定の I C ー不溶化物質桔合体に標識化された抗補体、抗抗体あしくはプロテイン Aを反応させる。ここで用いられる標戮抗補体又は標識抗抗体は、上記不溶化された I C の補体又は抗体と免疫反応する抗補体又は抗抗体を通常の標識剤により欏 ¾することにより得られる。上 S抗補体及び欏滅剤としては前記第 1 の方法に用いるそれらと周様のものでよい。抗抗休としては抗体に対する抗体であれば特に曝定はなく、倒えばヒト由来の検体を酒定する榻合には、抗ヒ卜免疫グロプリン G等を使用すればよい。標識化手段も同様に通常憤用される方法によることができる。また上記においては攞識抗補体または標織抗抗体に代えて、同様にして標識化されたプロテイン A を用いるこもできる。該プ口ティン A としては、倒えば E . Y . ラボラトリー社より市 ¾の ¾のを用いることができる。

上記本発明の標識抗補体、標識抗抗体又は標識プロティン A と I C ー不溶化物質結合体との反応は、例えば前記した検体と不溶化抗補体との反応と同様の条件下に行なうことがでさる。 1*

かくして得られる標識化された反応物及び未反応標讒％質（標識抗補体又は標 ¾抗抗体もしくは標識プロテイン A ) の分鍾、及びそれらの各標識活性の獮定は、前 S第 1 の方法と岡様にして行なわれ、これにより被検試料中の特定の I Cのみを特異的に検出、 ¾定することができる。

かくして本兗明によれば体液中の特定の腫塞 §8連抗原の I Cを定量でき、これにより初期から末期に里る痛の診断、特に癌の早期発見が可瘻である。更に本発明は上の通り体液中に I Cの形想で存在する特定の臛簾 S速抗原を特異的に ¾定するものであり、従来知られている遊鍾形 «の上 S抗原の ¾定技術では検知できない鼸塞疾患や自己免疫疾患等の診断やこれ等疾患の解析、解明等にも有用である。

本発明の一実旌 «様によれば、本発困方法は、次の釦くして実旃される。 BPち、

( ) 体液中に免疫複合体として存在する補体結合性の腫钃函速抗原一抗体複合体と、不溶化抗補体又は該複合体を構成する T A Gもしくはその抗体のいずれかと特異的に桔合する不溶化された物質とを反応させて、免疫複合体ー不溶化抗補体結合体又は免疫複合体ー不溶化物質結合体を形成させ、

( 2 ) 次いで得られた免疫複合休ー不溶化抗補休結合体と、該結合体を構成する T A Gもしくはその抗体のいずれかと特異的に桔合する標識化された物質の一定量とを反応させるか、又は得られた免疫複合体ー不溶化物質結合体と、一定量の標識化された抗補体、抗抗体もしくはプロテイン Aとを反応させ、

( 3 ) 得られた反応物と、未反応の上 £標識化された物

質又は上記標識化された抗補体、抗抗体もしくはプロテイン A とを分離し、

( 4 ) 分離された上記反応物又は未反応物のいずれかの

標識活性を測定する方法である。

より詳しくは、上記（ 1 ) の工程で用いる、 T A Gに特異的に铕合する不溶化物質としては、末端ガラク卜ースと特異的に結合する不溶化レクチンを使用でき、これを免疫複合体と反応させる。次いで得られる免疫複合体ー不溶化レクチン結合体を、酵素で標識化された抗 C 1 q 抗体、抗

C 3抗体又はプロテイン A と反応させる。

また、本発明の他の実施羝様によれば、本発明方法は次のごとくして実旃される。即ち、

( 1 ) 体液中に免疫複合体として存在する補体結合性の

腫痛翔連抗原一抗体複合体と、不溶化抗補体又は該複合体を構成する B F Pもしくはその抗体のいずれかと特異的に桔合する不溶化された ¾質とを反応させて、免疫複合体ー不溶化抗補体結合体又は免疫複合体ー不溶化物質 ft合体を形成させ、

( 2 ) 次いで得られた免疫複合体ー不溶化抗補体結合体

O PrIi

WIPO一と、該結合体を構成する B F Pもしくはその抗体のいすれかと特異的に ¾6合する標識化された物質の一定量とを反応させるか、又は得られた免疫複合体ー不溶化物質 « 合体と、一定量の標識化された抗補体、抗抗体もしくはプロテイン Aとを反応させ、

( 3 ) 得られた反応物と、未反応の上 S欐戮化された物質又は上記標識化された抗補体、抗抗体もしくはプロテイン Aとを分艫し、

( 4 ) 分離された上 S反応物又は未反応物のいずれかの標 »活性を酒定する方法である。

特に、上記（ 1 》の工程で用いる不溶化抗補体としては、不溶化された抗 C 3抗体又は抗 C 1 q 抗体が使用でき、これを免疫複合体と反応させる。次いで、得られる免疫複合体ー不溶化抗補体桔合体を、酵素で標識化された抗一 B F P抗体と反応させる。

以下本発明を参考倒及び実旃倒により更に詳述する。

参考例 1 C 3— セファロース 4 Bの S造

奥化シアン（ C N B r ) 一活性化セファロース 4 B ( フアルマシア社） 1 53 ( 乾燥重量）を 1 0 _ ³ N H C δ 水溶液 1 . 5 S に加え、莹 Sにて 1 5分園放匿後ガラスフィルター上で H C S 水溶液を除去する。 0. 1 Μ重炭菌 S 緩衝液（ Ρ Η 8 . 0 〉にて洗浄後、これを 0. 重炭酸燻緩衝液（ Ρ Η 8 . 0 ) 2 0 0 Wに加え、次いでヒ卜

O PI

レ ^WIPO C 3 ( B ioche醮 ical J ourna I ( E no I and ) , V ol.

9 3 ( 3 ) P 9 6 3〜 9 7 0 ( 1 9 8 1 ) 〕 1 00 を加え、室 Sにて 2時髑、時々捷拌しながら反応させた。ガラスフィルターで濾過後、これを 1 Mモノエタノールアミン水溶液（ P H 8 . 0 ) 2 00 iSに加え、室 Sで 2時翻放匿する。ガラスフィルターで ¾遢後、 0. 5 M N a C 2 を含有する 0. 1 M R酸緩衝液（ P H 4 . 0 ) 2 2 、次いで 0. 5 M N a C e のホウ酸堪緩衝液（ P H 8. 0 ) 2 β で十分に洗浄する。この洗净操作を、洗净液の 2 8 0 η醺での光学密度（ O D ₂ β ο ) が 0. 0 0 2以下になるまで行ない、かくして、ヒ卜 C 3 — おファロース 4 Βを得る。このものは、 0. 296 B S A及び 0. 2 6 N a N a を含有する 0. 0 5 Mリン酸緩衝液中にて 4で下に使用時まで保存じた。

参考例 2

① 抗 . C 3血清の製造

ヒ卜 C 3 ( 上記参考例 1 に周じ） 1 0 iiJを生理食塩水

Ί 0 «に溶解し、この 1 ιδとフロインド完全アジュパン卜 ( C oaplete F reund ， s adjuvant ) 1 ·2を混合し、これを家兎に 0. 2 WZ頭皮下注射する。 2週囿後、更にその 1 ヶ月後に周量を投与し、最終免疫から 1 週閩後に採血して抗ヒ卜 C 3血澝を得る。

② 抗 C 3抗体の F ( ab' ) ₂ 分画（ F ( ab' ) ₂ — 抗

Ο Π 1β

C 3 〕の製造

上 S①で得た抗 C 3血清 1 018と 0. 996 N a C β 2 0 ■8を混合し、飽和硫 8アンモニゥム 1 を徐々に滴下し速心分戴（ 3 000 rp黼、 5分）して得た沈渣を P B S ( P hosphate buf f f ered sal ine) にて透析して得たァーグロプリン分画を、前参考傍 1 で得た C 3—セファロース 4 Bのァフィ二ティーク口マトカラムに付し、 0. 1 4 M N a C S の 0. 0 5 Mリン纖堪緩衝液（ P H 7. 4 ) で洗浄後、 0. 5 M N a C 2 の 0. 1 M酢酸水溶液で溶出して、精製抗 C 3抗体を得る。これをペプシン ¾理（ 4 纖 JJぺプシン、 3 7で 2 4時翻）後セフアデックス G— 1 5 0 ( フアルマシア社）のカラムクロマ卜に付し、

0. 5 N a G S の 0. 1 Mホウ酸塩 S衝液（ P H « 8 . 0 ) で溶出して F ( ab' ) ₂ —抗 C 3分画を得る。参考 ¾ 3 酵素標識抗体の S造〔アルカリフォスファタ一ゼ標識 F < ab' ) ₂ —抗 B F P

前 S参考 2 と岡攆にして F ( ab' ) ₂ ー抗 B F Pを得る。この 1 O agとアルカリフォスターゼ（ typeH、牛腸ァルカリフォスターゼ結 S : シグマ ♦ ケミカル社） 1 0 Μを 0. 5 M N a C S の 0. 1 Μリン黢坦緩簧液（ Ρ Η = 7. 5 ) 1 0 ¾に加え、 2 596ダルタルアルデヒド溶液 0. 5 ¾を徐々に滴下し、室滇で 2時闐混合する。グリシン 5 JJ を如え、通到のグルタルアルデヒドをプロックし生理食坦水にて透析する。濃縮後セファロース 6 B ( フアルマシア社）にてゲル ¾aし活性の isい s分を集めプールしてアルカリフォスファターゼ標識 F ( ab' ) ₂ ー抗 B F P とする。

参考例 4 不溶化 F ( ab' ) ₂ — C 3の製造

前記参考 {¾ 2で得た F ( ab' 〉 ₂ —抗 C 3を 0. 1 M 卜リス ffl菌緩衝液（ ph- 8 . 0 ) にて、 2 5 ^ g / に漏整する。マイクロタイタープレー卜（ポリ S化ビニール性、

U —プレー卜、クック ♦ エンジニアリング社製）の各ゥェルに上 S溶液 1 5 0 jW S づっを注入し、 3 7で 1 時圃インキュベー卜、ついで 4で 2 0時圃静鼸する。ゥエル内溶液を除去後、生理食堪水で 3回洗淨して不溶化 F ( ab' ) a ー抗 C 3を得る。各ゥエルは卜リス坦酸緩衝液で満たしてシールして 4で下に保存し、使用時に緩衝液を除去する。

参考例 5 不溶化レクチン（ P N A— ビーズ）の製造

ポリスチレンビーズ（ P recision p lastic C o.

L td. U . S . A . 0 6. 4 a黼）を N a O H水溶液及び 1 N H C δ 水溶液で交互に 3回づっ洗净後蒸留水で

Ρ Ηが杓 7になるまで洗浄する。 Ρ Ν Α ( ピーナツレクチン、 Ε . Υ ラポラトリー社 ¾ ) 1 0 0 £! afiの 0. 1 Μリン酸 «緩衝液 1 2 0 afiに上記ビーズ 1 0 0 0滔を加え

4でで 2 4時園放置後ビーズを ¾取水洗し、次いで 0. 2

%ゼラチン 0. 1 Mリン戮堪緩衝液 2 0 0 ιΰに入れ 4で 2

ΟΜΡΙ

、 > 葡 4時闥放匿する。ビーズを濾取水洗して不溶化 P N Aを得る。この P N A—ビーズは 0. 05 Mリン讓 g靄液

( 0. 4 N a C G 、 0. 2 %ゼラチン、 0. 0 196 N a N 3 , P H - 7.4) 中に保存される。

參考钥 6 検体の Si韉

健常人及び各種癌及びその他の患者より 218血液を採取後 38固させ、遠心分鱸（ 2000 rpii 、 1 0分）して被検血清を得る。へパリン（ 500単位） ¾理した注射器で採血し、周様に遠心分艫して被検血獎を得る。

実旅钢 1

前 S畚考钥 4で得た F { ab' ) ₂ ー抗 C 3を不溶化したマイクロタイタープレー卜の各ゥエルに、前 S参考倒 6で得た被検血清 0. 1 Λ2を注入し、 3 7で 2時園インキュべ一卜する。反応液を吸引除去後生理食埴水で 3回洗浄する次いで前記參考 3で得た標識 F ( ab' ) ₂ —抗 B F P 0. 1 ιδ·を注入し、 3 7で 2時園インキュベートする。反応液を吸引除去後生理食坦水で 3回洗浄する。これに基質液（ ρ —二卜口フエ二ルリン菌 5010/ 1 00 ^0. 1 ジエタノールァミン水溶液（ ρ Η - 1 0 ) ) 0. を注入し 3 7で "1 時面インキュベー卜後 1 N N a O H水溶液 0. 1 Wを添加して反応を停止させる。

反応液を、幅 1 ■鑿のセルを使用して分光光度計で 405 π画の波 δで吸光度をを测定した。結果を第 1 図に示す。 31

第 1図において Iは健常人 1 9名から成る群（コン卜口ール群〉、 IIは発性肝 » ®者 1 6名から成る群、 ΠΙは胃癌患者 1 9名から成る群及び IVは肝炎患者 1 8名から成る群をそれぞれ示す。また該図中吸光度 0. 250以上の各プロッ卜は各吸光度を付して表記した。

該図より、癌の診断ができる。尚同時に遊鐘の B F Pが高値に翻定される肝炎の患者について周様に湖定した結果肝炎の增悪期には B F Pを構成抗原とする I Cが低く、同回復期には B F Pを構成抗原とする I Cが高儘に ¾定されることが判った。再生肝細腱から産生される B F Pは、癌細 ¾由来のものと周等であることが推察されると共に、本発頃方法によれば肝炎の B床的鑑別に有周であることが判る。

実施倒 2

前記参考倒 6で得た被検血淸又は血漿の 0. 1 BSに前 S 参考例 5で得た P N A—ビーズ 1 個及び 0. 2 %ゼラチン 0. 1 5 M N a C δ , 5 a Mo C δ ₂ 5 a

C a C e 2 及び 0. 0 1 %チメロザールを含有する

0. 05 M卜リス一緩衝液（ P H = 7. 4 ) 0. 5 wを加え、 25で 5時園インキュベートする。ビーズを生理食燻水で 3回洗淨後パー才キシダーゼ標識プロテイン A ( 4000倍希积 E . Y . ラポラ卜リー社） 0. 1 afiと、 0. 2 %ゼラチン、 0. 1 5 M N a C <2 及び 0. 0 1 96 チメロザールを含有する 0. 0 5 M 卜リス一 H C S 緩衝液

( H - 7 . 4 ) 0. との混液に加え 2 5で 1 6時園インキュベー卜する。ビーズを生理食埴水で 3回洗浄後、これに 0. 0 3 % H ₂ 0₂ の 0. 2 Mクェン S— リン餞堪緩暫液（ H =» 5 . 0 ) 0. 5 Λ及び 4騸 $)Ζ ·5オル卜フェニレンジァミンの生理食堪水 1 . を如え室温で 1 0 分インキュベートする。坦酸水溶液 2 . を加え反応を停止して 4 9 2 ηιの波長で吸光度を测定する。桔果を第 2図に示す。

第 2図において Vは健常人 2 6名から成る群（コン卜口ール群〉及び ¾は癌患者 3 2名から成る患者群を示す。該図より癌の診断が可瘇であることが判る。

実旃 3

前記參考 β| 6で得た被検血清又は血漿の 0. 1 «に前記参考 «15で得た Ρ Ν Α—ビーズ 1 S及び 0. 1 5

N a C S 、 0. 296ゼラチン、 0 . 0 1 96チメロザール、

5黼 M M g C 2 ₂ 及び 5 a M C a C e ₂ を含有する

0. 0 5 M 卜リス一 H C S 緩衝液（ p H 7 . 4 ) 0. 5 Βδを加え、 2 5で 5時面インキュベートする。ビーズを生理食埸水で 3回洗净後、パー才キシダーゼ標識ャギ抗ヒ卜 C 3抗体（ Ε . Υ . ラポラトリー社 S : X 1 0 ) 0. ifi と、 0. 1 5 Μ N a C 2 、 0. 2 %ゼラチン及び

0. 0 1 %チメロザールを含有-する 0. 0 5 M 卜リス一

OMPI WIPO H C S 緩衝液（ ί> H - 7 . 4 ) 0. との混液に加え

2 5で 1 6時圃インキュぺー卜する。ビーズを生理食埴水で 3回洗挣後、これに 0 · 0 3 6 H 2 02 の 0 * 2 Mクェン酸ーリン讓坦 8T衝液（ P H - 5 . 0 ) 0. 5 *2及び 4霞 JJ

オル卜フエ二レンジァミンの生理食堪水 1 · を加え、室 aで 3 0分インキュベー卜する。 1 Ν »酸水溶液

2 . 0 ιίを加え反応を停止して、 4 9 2 naの波長で吸光度を濺定した。結果を第 3図に示す。

第 3図において VIは健常人 1 9名から成る群（コント口ール群）及び VIは癦患者 2 7名から成る癌患者群を夫々示す。該図より癌の診断が可能であることが判る。

OMPI

Claims

讅求の範囲

< 1 ) 体液中に免疫複合体として存在する補体結合性

の羅塞 85適抗原一抗体複合体と、不溶化抗補体又は該複合体を構成する坦基性フエ卜プロテイン（ B F P ) な一フエ卜プロテイン（ A F P ) 、癌 S速糖 «鎮（ T

A G ) 及び癌胎児性抗原（ C E A ) から成る群より選ばれた腫瘦親速抗原あしくはその抗体のいずれかと特異的に «合する不溶化された物質とを反応させて、免疫複合体ー不溶化抗補体結合体又は免疫複合体ー不溶化物質桔合体を形成させ、

( 2 ) 次いで得られた免疫複合体ー不溶化抗褸体結合

体と、該桔合体を構崁する B F P、 A F P、 T A G及び C E Aからなる群より選ばれた腫瘦两連抗原もしくはその抗体のいずれかと特異的に桔合する標識化された物の一定量とを反応させるか、又は得られた免疫複合体ー不溶化物質桔合体と、一定量の標識化された抗補体、抗抗体あしくはプロテイン Aとを反応させ、

( 3 ) 得られた反応物と、未反応の上標識化された物質又は上 £標識化された抗補体、抗抗体もしくはプロティン Aとを分離し、

( 4 ) 分離された上記反応物又は未反応 ¾のいずれかの標識活性を酒定する

ことを特微とする腫痕閤連抗原特異的免疫複合体を測定

Ο ΡΙ する方法。

② （ 1 ) 体液中に免疫複合体として存在する補休結合性

の鼸惠颼速抗原一抗体複合体と、不溶化抗補体とを反応させて、免疫複合体ー不溶化抗補体結合体を形成させる工程、及び

( 2 ) 該免疫複合体 -不溶化抗補体桔合体と、該結合体を構成する鼸瘦两連抗原又はその抗体のいすれかと特異的に結合する標識化された物質の一定量とを反応させる工程

を包含する請求の範囲第 1項の方法。

③ 結合体を、標識化された抗ー B F P、標識化された抗

一 A F P、標識化された抗ー T A G、標識化された抗ー

C E A、末纜ガラク卜ースと特異的に桔合する標織化されたレクチン、末端 N—ァセチルガラク卜サミンと特異的に結合する標識化されたレクチン及び末端 L一フコースと特異的に結合する標識化されたレクチンからなる群より選ばれた、鼸瘦 ¾連抗原に特異的に桔合する標識化された物質と反応させる S求の範囲第 2項の方法。

④ 結合体を、標識化された B F P、欏識化された A F P 標 ¾化された T A G及び標識化された C E Aからなる群より選ばれた、該桔合体を構成する抗体に特異的に結合する標 »化された物質と反応させる講求の範囲第 2項の

¾ ¾ o

OMPI

、 0 ⑤ 不溶化抗補体が、補体成分である C 1 q 又は C 3に対する不溶化された抗体である請求の範囲第 2項、第 3項又は第 4項の方法。

® ( 1 ) 体液中に免疫複合体として存在する補体結合性の腫観 a邃抗原一抗体複合体と、該複合体を籌成する

B F P、 A F P、 T A G及び C E Aからなる群より選ばれた鼴蹇 §8連抗原又はその抗体のいずれかと特異的に結合する不溶化された物質とを反応させて、免疫複合体ー不溶化物質結合体を形成させる工程、及び

( 2 ) 該免疫複合体ー不溶化物質糖合体と、一定量の標識化された抗補体、抗抗体又はプロテイン Aとを反応させる工程

を包含する讅求の範囲第 1 項の方法。

Φ 免疫複合体を、不溶化抗ー B F P、不溶化抗ー A F P 不溶化抗ー T A G、不溶化抗ー C E A、末 ¾ガラク卜一スと特異的に桔合する不溶化レクチン、末端 N—ァセチルガラク卜サミンと特異的に結合する不溶化レクチン及ぴ末端 Lーフコースと特異的に結合する不溶化レクチンからなる群より選ばれた、臘婁現連抗原に特異的に結合する不溶化された物質と反応させる講求の範囲第 6項の

® 免疫複合体を、不溶化 B F P、不溶化 A F P、不溶化 TA G及び不溶化 C E Aからなる群より選ばれた、該複合体を構成する抗体に特異的に桔合する不溶化された物質と反応させる請求の範囲第 6項の方法。

⑨ 該複合体を構成する抗体に特異的に結合する不溶化された物質が、不溶化 T A Gである講求の «囲第 8項の方法。

® 標識化された抗補体が、補体成分である C 1 q 又は C 3に対する標識化された抗体である諺求の範囲第 6項乃至第 9項のいずれかに記載の方法。

⑪ （ 1 ) 体液中に免疫複合体として存在する補体桔合性の鼸篡 §8連抗原一抗体複合体と、不溶化抗補休又は該複合体を構成する T A Gもしくは T A Gに対する抗体のいずれかと特異的に結合する不溶化された物質とを反応させて、免疫複合体ー不溶化抗補体桔合体又は免疫複合体 -不溶化物質結合体を形成させる工程、及び .( 2 ) 次いで得られた免疫複合体ー不溶化抗補体掊合钵と、該結合係を構成する T A Gもしくは T A Gに対する抗体のいずれかと特異的に桔合する標識化された物質の一定量とを反応させるか、又は得られた免疫複合体ー不溶化物質桔合体と、一定量の標識化された抗補体、抗抗体もしくはプロテイン Aとを反応させるェ程

を包含する讅求の範囲第 1 項の方法。

® 複合体を構成する T A Gに特異的に結合する標識化された物質が、標識化された抗ー T A G、末端ガラク卜一スに特異的に桔合する標識化されたレクチン、末纏 N— ァセチルガラク卜サミンに特異的に結合する様識化されたレクチン、又は末端 Lーフコースに特異的に桔合する標識化されたレクチンである鳙求の範囲第 1 1項の方法 @ 複合体を構成する T A Gに対する抗体に特異的に桔合

する標識化された物質が、標識化された TA Gである請求の範囲第 1 1 項の方法。

® ( ) 体液中に免疫複合体として存在する補体桔合性

の履 ¾ 逢抗原一抗体複合体と、該複合体を籌成する

T A Gまたは T A Gに対する抗体のいずれかと特異的に桔合する不溶化された物質とを反応させて、免疫複合体ー不溶化物質結合体を形成させる工程、及び

( 2 ) 該免疫複合体ー不溶化物質桔合体と、一定量の標識化された抗補体、抗抗体またはプロテイン Aとを反応させる工程

を包含する請求の範囲第 6項の方法。

免疫複合体を、不溶化抗ー T A G、未爆ガラク卜ースに特異的に桔合する不溶化レクチン、末端 N—ァセチルガラク卜サミンと特異的に桔合する不溶化レクチン及び末端しーフコースに特異的に結合する不溶化レクチンからなる群より選ばれた、 T A Gに特異的に桔合する不溶化物質と反応させる S求の範囲第 1 4項の方法。

WIPO ® 免疫複合体と、末端ガラク卜ースに特異的に結合する不溶化レクチンとを反応させ、得られる免疫複合体ー不溶化レクチン結合体と酵素で標識化された抗 C 1 q 抗体抗 C 3抗体もしくはプロテイン Aとを反応させる講求の範囲第 1 5項の方法。

⑰ 免疫複合体と不溶化ピーナツレクチンとを反応させ、得られる免疫複合体ー不溶化ピーナツレクチン結合体とパーォキシダーゼ標識プロテイン Aとを反応させる菌求の範囲第 1 6項の方法。

@ 免疫複合体と不溶化されたピーナツレクチンとを反応させ、得られる免疫複合体ー不溶化ピーナツレクチン結合体とパー才キシダーゼ標識抗 C 3抗体とを反応させる猜求の範囲第 1 6項の方法。

® ( 1 ) 体液中に免疫複合体として存在する補体桔合性の S¾驟連抗原一抗体複合体と、不溶化抗補体又は該複合体を構成する B F Pもしくは B F Pに対する抗体のいずれかと特異的に桔合する不溶化された物質とを反応させて、免疫複合体ー不溶化抗補体結合体又は免疫複合体ー不溶化物質結合体を形成させる工程、及び ( 2〉次いで得られた免疫複合体ー不溶化抗補体桔合体と、該結合体を構成する B F Pもしくは B F Pに対する抗体のいずれかと特異的に桔合する標識化された物質の一定量とを反応させるか、又は得られた免疫複合体ー不溶化物質結合体と、一定量の標識化された抗補体、抗抗体もしくはプロテイン Aとを反応させるェ €

を包含する讒求の範囲第 1 項の方法。

® 免疫複合体と不溶化抗 C 3抗体とを反応させ、得られ

る免疫複合体ー不溶化抗 C 3抗体結合体とアルカリフォスターゼで標識化された抗 B F P抗体とを反応させる講求の範囲第 1 9項の方法。

® ( ) 体液中に免疫複合体として存在する補体結合性

の鼸塞 S連抗原一抗体複合体と、不溶化抗補体又は該複合体を構成する堪基性フエ卜プロテイン（ B F P ) α—フエ卜プロテイン（ A F P ) 及び癌 S連糖 «!鎖

( T A G ) から成る群より選ばれた鼸瘦園連抗原もしくはその抗体のいずれかと特異的に結合する不溶化された物質とを反応させて、免疫複合体ー不溶化抗補体桔合体又は免疫複合体ー不溶化物質桔合体を形成させる工程、及び

( 2 ) 次いで得られた免疫複合体ー不溶化抗補体結合体と、該桔合体を構成する B F P、 A F P及び T A G からなる群より選ばれた腫痛 §5連抗原もしくはその抗体のいずれかと特異的に桔合する標識化された ¾質の一定量とを反応させるか、又は得られた免疫複合体一不溶化物質 β合体と、一定量の標識化された抗補体、

ΟΜΡΙ 画 1

31

抗抗体もしくはプロテイン Aとを反応させる工程

を包含する講求の籍闥第 1 項の方法。

OMPI