FR2487984A1 - Procede pour la determination des chainons gluco associes aux tumeurs et son application au diagnostic du cancer - Google Patents

Abstract

PROCEDE POUR DETERMINER LA TENEUR EN CHAINONS GLUCO ACCOMPAGNANT LES TUMEURS (TAG) DANS LES LIQUIDES PHYSIOLOGIQUES, ET APPLICATION DE CE PROCEDE AU DIAGNOSTIC DU CANCER. ON FAIT REAGIR CONCURREMMENT LES TAG DU LIQUIDE PHYSIOLOGIQUE SOUMIS A LA MESURE ET UNE QUANTITE DEFINIE DE TAG INSOLUBILISES AVEC UNE QUANTITE DEFINIE DE LECTINE MARQUEE PAR UNE ENZYME, UNE SUBSTANCE FLUORESCENTE OU UNE SUBSTANCE RADIOACTIVE, ON SEPARE LES TAG FIXES A LA LECTINE MARQUEE ET LA LECTINE NON COMBINEE ET ON MESURE L'ACTIVITE DE L'AGENT DE MARQUAGE DANS CHACUNE DES DEUX FRACTIONS. UNE COMPARAISON DU RESULTAT OBTENU AVEC CEUX TROUVES POUR LES SUJETS EN BONNE SANTE PERMET DE DIAGNOSTIQUER LE CANCER.

Description

I La présente invention se rapporte à un procédé pour déterminer les

chaînons gluco associés aux tumeurs (en abrégé ci-après "TAG") dans un liquide physiologique d'un mammifère, à savoir les glucoprotéines, glucopeptides, glucolipides contenant des TAG et/ou des sucres à groupes terminaux galactose-(Pl -- 3

ou P1 -- 4)-N-acétylglucosamine ou galactose-(Pl --' 3 ou P1 --à 4)-

N-acétylgalactosamine dont la proportion augmente avec la proliféra-

tion de cellules indifférenciées, en particulier de cellules tumo-

rales ou de cellules cancéreuses, et son application au diagnostic

du cancer, par détermination des TAG.

On a déjà été amené & exploiter en tant que pro-

cédé pour le diagnostic du cancer la détermination d'une gluco-

protéine spécifique apparaissant sélectivement chez les patients

souffrant de cancer. Ce procédé exploite principalement l'antigé-

nicité de la partie protéine de la glucoprotéine; ainsi, par exemple, on connaît un procédé de daignostic du cancer primaire du foie par mesure de l'al-fétoprotine et un procédé de diagnostic des cancers des organes digestifs, en particulier du cancer du rectum, par mesure du CEA ["Igaku No Ayumi (progress in Medicine)", volume 106, n 5, Fifth Saturday Special Issue, pages 235-250 (1978)]. Toutefois, ces procédés de diagnostic ont des applications relativement limitées et on souhaiterait disposer d'un procédé de

diagnostic s'appliquant à des cancers de type extrêmement variés.

Jusqu'à maintenant, on n'a jamais décrit de procédés de diagnostics du cancer par exploitation de la spécificité de

liaison du reste de sucre de chaînons gluco associés aux tumeurs.

La demanderesse a trouvé que les liquides physiolo-

giques d'un patient souffrant du cancer contenaient des TAC prove-

nant des cellules indifférenciées (principalement des cellules cancéreuses) et libérés dans les liquides, et que les TAG étaient très différents par la structure de la chaîne de sucre, la longueur de la chaîne de sucre et la nature du reste du sucre constituant, et, après des recherches approfondies, elle a trouvé que les TAG

comprenaient des glucoprotéines, des glucopeptides, des gluco-

lipides et/ou des sucres portant des groupes terminaux galactose-

(1 --5 3 ou Pl --e>4)-N-acétylglucosamine ou galactose-(Pl - 3 ou

Pi --e 4)-N-acêtylgalactosamine, que ces TAG se combinaient spécifi-

quement avec la lectine, et qu'on pouvait ftre averti de la présence ou de l'absence de cellules cancéreuses, du degré de prolifération, de

la prospérité et de la dégradation des cellules, et d'événements ana-

logues, en faisant réagir les TAC d'un liquide physiologique avec la

lectine, ce qui permet un diagnostic du cancer.

L'invention est basée sur cette découverte. L'invention a donc en premier lieu pour objet un procédé pour mesurer la concentration des TAG dans un liquide physiologique selon un mode opératoire par compétition ou un mode opératoire par

intercalation, et l'application de ce procédé au diagnostic du cancer.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention

ressortiront plus clairement de la description détaillée donnée ci-

après en référence aux figures des dessins annexés, sur lesquelles

- la figure 1 représente une courbe d'étalonnage obte-

nue par le mode opératoire par compétition selon l'invention; - la figure 2 représente une courbe d'étalonnage pour le mode opératoire par compétition selon l'invention;

- la figure 3 représente les concentrations en TAG trou-

vées chez les individus en bonne santé, la mesure ayant été faite par le mode opératoire par compétition selon l'invention;

- la figure 4 représente les concentrations en TAG trou-

vées chez des patients cancéreux, la mesure ayant été faite par le mode opératoire par compétition selon l'invention; - la figure 5 représente une courbe d'étalonnage pour le mode opératoire par intercalation selon l'invention; - la figure 6 représente une courbe d'étalonnage pour le mode opératoire par compétition selon l'invention; et - la figure 7a représente les concentrations de TAC trouvées chez des individus en bonne santé, la mesure ayant été faite selon le mode opératoire par compétition selon l'invention; - les figures 7b et 7c représentent les concentrations de TAG trouvées chez des patients cancéreux, la mesure ayant été faite selon le mode opératoire par compétition selon l'invention; - la figure 7d représente les concentrations de TAG trouvées chez des patients souffrant de maladies variées autres que

des cancers ou chez des femmes enceintes.

Les buts et avantages de l'invention peuvent Otre atteints dans l'un des procédés ci-après: (1) on fait réagir par compétition les TAG de liquides physiologiques soumis à la mesure (en abrégé ci-après "substance soumise à la

mesure") et une quantité définie de TAG insolubilisés ou d'une subs-

tance analogue à des TAG (en abrégé ci-après "TAG insolubilisés" ou "substance analogue aux TAG insolubilisée") avec une quantité définie de lectine marquée au moyen d'un agent d'identification (en abriégé ci-après "lectine marquée"); on sépare les TAG insolubilisés ou la substance analogue à des TAG insolubilisée fixés à la lectine marquée d'avec la lectine marquée non combinée, et on mesure l'activité'de l'agent d!identification dans chacune des deux fractions; (2) on fait réagir par compétition la substance soumise à la mesure et une quantité définie de TAG ou de substance analogue à des TAG, marqués par un agent d'identification (en abrégé ci-après "TAG

marqués" ou "substance analogue à des TAG marquée") avec une quan-

tité définie de lectine ou de lectine insolubilisée (en abrégé ci-après "lectine insolubilisée"), on sépare les TAG marqués ou la substance analogue aux TAG marquée fixés à la lectine ou à la lectine insolubilisée et les TAG marqués ou la substance analogue aux TAG marquée, non combinés, et on mesure l'activité de l'agent d'identification dans chacune des deux fractions; et (3) on fait réagir la substance soumise à la mesure avec la lectine

insolubilisée de manière à former un complexe lectine-TAG insolu-

bilisds, on fait réagir ce complexe avec une quantité définie de la lectine marquée, on sépare le complexe fixé à la lectine marquée

et la lectine marquée non combinée et on mesure l'agent d'identi-

fication dans chacune des deux fractions.

- Parmi les liquides physiologiques qu'on peut utili-

ser dans l'invention, il en est de nombreux et variés parmi les-

quels le sang, le liquide du tiss7u cellulaire, le liquide de la lymphe, le liquide thoracique, le liquide abdominal, le liquide amniotique, le suc gastrique, l'urine, le suc pancréatique, le liquide cérébrospinal et la salive. On préfère utiliser le sang sous forme de sérum ou de plasma sanguin. La quantité de liquide physiologique à utiliser pour la détermination va d'environ 1 à 10 ml et, de préférence, de 2 à 5 ml. Le liquide physiologique

peut être soumis à une purification permettant d'isoler les subs-

tances contenant des chalnons gluco, comme les glucoprotéines, les

glucopeptides, les glucolipides et/ou les saccharides.

Parmi les modes opératoires permettant d'obtenir une substance contenant les chaînons gluco à haute teneur à partir des liquides physiologiques, on citera des techniques classiques

d'extraction ou de séparation des chaînons gluco, comme le relar-

gage, la précipitation, l'extraction, la centrifugation, la dialyse, l'utilisation de tamis moléculaire, la désactivation d'enzymes ou

une combinaison de ces techniques. Plus précisément, on peut pré-

parer une telle fraction en ajoutant de l'acide sulfosalicylique, de l'acide trichloracétique ou du sulfate de zinc h du sérum ou du

plasma ou en chauffant du sérum ou du plasma, en filtrant le pré-

cipité formé, ce qui permet d'éliminer l'albumine, l'immunoglubu-

line, etc., et en procédant à une dialyse.

Dans le procédé de détermination selon l'invention, les échantillons de liquide physiologique recueillis, à l'exception du sang, peuvent être utilisés tels quels comme échantillons soumis à la mesure (en abrégé ciaprès "échantillon"). Cependant, pour empêcher une dénaturation des échantillons et accélérer la réaction avec la lectine, on peut ajouter à ces échantillons, en tant que protéines protectrices, des protéines h faible teneur en sucre comme la sérum-albumine de bovin ("BSA"). En outre, dans certains cas, l'addition d'une quantité appropriée de protéine

protectrice à un échantillon dont on a éliminé l'albumine, l'immu-

noglobuline et les substances analogues donne de bons résultats.

Dans le cas du sang, on'peut utiliser comme échantillons du sérum obtenu selon un mode opératoire classique de récolte du sérum ou

du plasma obtenu selon une technique classique à l'aide d'un anti-

coagulant tel que l'héparine, V'EDTA, l'acide citrique ou une substance analogue; on préfère l'échantillon de sérum recueilli

et préparé par utilisation de l'héparine comme anticoagulant.

Lorsque la teneur en TAG est relativement forte, comme dans le cas des ascites, on peut diluer les échantillons si on le désire par

une solution tampon appropriée.

Pour ce qui concerne la lectine h utiliser dans l'invention, on citera celles qui sont capables de se combiner

spécifiquement avec la galactose-(Pl -'3 ou Pl -:> 4)-N-acétyl-

glucosamine ou la galactose-(Pl -i 3 ou Pl -9 4)-N-acétylgalacto-

samine [J.B. C. 250, 8518-8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm.,

62, 144 (1975); Z. Immunitaetsforch, 138, 423-433 (1969); Br. J. Exp.

Pathol., 27, 228-236 (1946); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, n 5, 22152219 (1978); Biochemistry, 13, 196-204 (1974); Carbohydrate Research, 51, 107-118 (1976)], par exemple la lectine d'arachide, la lectine de fève de ricin (Ricinus communis), etc. Parmi les substances permettant de marquer la lectine et lesTAG ou les substances analogues auxTAC, on citera des enzymesvarides, des substances fluorescentes variées et des substances radioactives variées, etc.

Parmi ls enzymes, on peut citer par exemple la glucoamylase, la glucose-

oxydase, la peroxydase, la phosphatase alcaline, la P-galactosidase, et le fragment actif de l'hémoctapeptide, etc.; parmi les substances fluorescentes, on peut citer, par exemple, la fluorescéine, la fluorescéine-isothiocyanate,"rhodamine", le chlorure de "dansyle" (c'esta-dire le chlorure de 5-diméthylamino-1-naphtalène-sulfonyle), etc.; parmi les substances radioactives, on peut citer, par exemple,

l'iode radioactif (par exemple 1251, 13, etc.), le tritium radio-

actif, etc. Dans la présente demande, l'expression "substance

analogue aux TAG" désigne la galactose-(Pl -e> 3 ou 1 - -4)-N-

acétylglucosamine, la ga]actose-(Pl -- 3 ou P1 --> 4)-N-acétyl-

galactosamine et des dérivés de sucre contenant un tel chaînon gluco en position terminale. Parmi ces dérivés de sucre, on peut citer, par exemple la glucoprotéine de la mucine gastrique humaine,

la glucoprotéine obtenue par élimination du fucose terminal à par-

tir de la glucoprotéine sulfatée de la membrane muqueuse gastrique du porc, la glucoprotéine IgG humaine ou son dérivé asialo, la glucoprotéine IgG de bovin, le désialo de la glucoprotéine du chaînon gluco B de la thyroglubuline de porc, la glucoprotéine de la P-sous-unité ovomucoide, la glucoprotéine B-1 de l'IgE humaine ou son dérivé asialo, le dérivé asialo de la glucoprotéine B-2 ou B-3 de l'IgE humaine et le dérivé asialo de la glucoprotéine II-C de l'IgAl1 humaine, le dérivé asialo de la glucoprotéine, le dérivé asialo de la glucoprotéine II-B ou II-A de l'IgA1 humaine, le dérivé asiaio de la glucoprotéine de transférine humaine, le dérivé asialo de la glucoprotéine de fétuine de bovin, le dérivé désasialo de la glucoprotéine participant à l'absorption de la glucoprotéine asialo de la membrane protoplasmique de la cellule de foie de lapin, la glucoprotéine sulfatée de la muqueuse gastrique du porc, le dérivé asialo de la glucoprotéine acide al humaine, le dérivé asialo de la glucofoline, la glucoprotéine ou le glucopeptide de l'antigène T, et les substances analogues décrites dans "Biochemical Data Book I" (préparé par la Japanese Chemical Society et publié par Tokyo Kagaku Dojin, 26 novembre 1979), pages 503-510, et l'asialo GMI=AM1 et les glucolipides des érythrocytes de bovins 'décrits dans la même publication, pages 840- 841. Parmi ces substances, on préfère

le dérivé asialo de la glucoprotéine de fétuine de bovin, la gluco-

protéine sulfatée de la muqueuse gastrique du porc, la glucoprotéine sulfatée de la muqueuse gastrique humaine et le dérivé asialo de

la glucoprotéine acide a1 humaine.

Les TAG insolubilisés, les substances analogues aux TAG insolubilisées et la lectine insolubilisée sont préparés en faisant réagir chimiquement ou physiquement les TAG, la substance analogue aux TAG ou la lectine avec un support insoluble. Parmi les supports insolubles, on peut citer la poudre de cellulose, le

Sephadex, le Sepharose, le polystyrène, le papier-filtre, la carboxy-

méthylcellulose, une résine échangeuse d'ions, le dextranne, une pellicule de matière plastique, un tube de matière plastique, du Nylon, des billes de verre, la soie, un copolymère polyamine/oxyde de méthyle et de vinyle/acide maléique, un copolymère d'acides

aminés, un copolymère éthylène/acide maléique, etc. L'insolubili-

sation peut être réalisée par formation de liaisons covalentes [c'est-àdire par le procédé au diazo, un procédé auwpeptides (par exemple un procédé auxdérivé d'amides d'acides, un procédé à la résine carboxychlorure, un procédé à la résine de carbodiimide, un procédé aux dérivés d'anhydride maléique, un procédé aux dérivés d'isocyanate, un procédé auxpolysaccharides activés par du bromure de cyanogène, un procédé aux dérivés de carbonate de cellulose, un procédé dans lequel on utilise un agent de condensation, etc.), un procédé par alkylation, un procédé de fixation sur un support à l'aide d'un agent réticulant tel que l'aldéhyde glutarique,

l'hexaméthylène-isocyanate, etc.], un procédé de fixation sur sup-

port par la réaction de Ugi et des procédés analogues; un procédé par fixation ionique dans lequel on utilise un support tel qu'une résine dchangeuse d'ions; et des procédés par absorption physique dans lesquels on utilise du verre poreux, sous forme par exemple de billes de verre, comme support. Parmi ces procédés, on préfère le procédé aux polysaccharides activés par le bromure de cyanogène

en tant que procédé par formation de liaisons covalentes et le pro-

cédé de fixation sur support à l'aide d'un agent réticulant. Dans le procédé aux polysaccharides activés par le bromure de cyanogène, on peut obtenir les TAG insolubilisés, la substance analogue aux TAG insolubilisée ou la lectine insolubilisée en faisant réagir les TAG, etc., avec une quantité de 10 à 1 000 fois leur poids d'un support activé par le bromure de cyanogène dans un solvant approprié, à une température de O à 40 C, de préférence de 20 à 30 C, pendant 2 à 4 h. On peut également préparer les TAG insolubilisés,

etc., par une technique de polymérisation induite par des radiations.

Ainsi, on prépare une dispersion aqueuse d'un monomère polymérisable contenant les TAG ou une substance analogue aux TAG et on expose à des radiations lumineuses ou à des radiations ionisantes qui

provoquent la polymérisation du monomère. Pour préparer la disper-

sion aqueuse, on disperse un monomère polymérisable hydrophobe[A] dans une solution aqueuse à une concentration de 0,1 à 5% en

poids d'un polymère hydrosoluble fB]. On peut encore dis-

perser un monomère polymérisable hydrophile C ou un mélange

du monomère polymérisable hydrophobe [A] et d'un monomère polymé-

risable hydrophile [C] dans du sérum physiologique, à une concen-

tration de 3 à 20. en poids, ou disperser le monomère polymérisable hydrophobe [A] dans une solution aqueuse contenant 0,01 à 5% en poids d'un agent tensioactif [D]. Lorsqu'on expose la dispersion obtenue à des radiations lumineuses ou ionisantes, le monomère

polymérisable présent dans la phase dispersée polymérise avec forma-

tion d'une gangue polymère pour les TAG ou la substance analogue.

Si on le désire, la masse peut ttre mise sous forme de feuilles ou

de particules.

Comme exemples particuliers des monomères polymé-

risables hydrophobes [A], on peut citer le méthacrylate de glycidyle, le diméthacrylate de l'éthylèneglycol, le diméthacrylate du

diéthylèneglycol, le diméthacrylate du triéthylèneglycol, le tri-

méthacrylate du triméthylolpropane, le diméthacrylate du poly-

éthylèneglycol 200, le diméthacrylate du dipropylêneglycol, le

diméthacrylate du 1,4-butylèneglycol, le diméthacrylate du 1,6-

hexaneglycol, le diméthacrylate du méthoxydiéthylèneglycol, le méthacrylate de méthyle, le méthacrylate d'éthyle, le méthacrylate de butyle et les acrylates correspondants. D'une manière générale, on peut utiliser un quelconque monomère insoluble dans l'eau polymérisable par exposition à la lumière ou à des radiations,

quelle que soit sa nature.

Comme exemples particuliers de monomères polymé-

risables hydrophiles [C], on peut citer le méthacrylate de 2-hydroxy-

éthyle, le méthacrylate du méthoxytétraéthylèneglycol, le métha-

crylate du méthoxypolyéthylèneglycol 400, le méthacrylate du méthoxy-

polyéthylèneglycol 1000, le diméthacrylate du polyéthylèneglycol 400,

le diméthacrylate du polyéthylèneglycol 600 et les acrylates corres-

pondants, ainsi que l'acide méthacrylique, l'acrylamide, la N-vinyl-2pyrrolidone,etc. D'une manière générale, on peut utiliser un quelconque monomère soluble dans l'eau et polymérisable par exposition à la lumière ou à des radiations quelle que soit sa

nature.

Comme exemples particuliers des polymères hydro-

solubles [B], on peut citer la polyvinylpyrrolidone, l'acide polyméthacrylique, l'acide polyacrylique, l'alcool polyvinylique, l'hydroxypropylcellulose, la gomme arabique, etc. Comme exemples particuliers des agents tensioactifs

[D], on peut citer le laurylsulfate de sodium, l'oléate de potas-

sium, l'oléate de sodium, le monolaurate de sorbitanne, le mono-

stéarate de sorbitanne, le monooléate de sorbitanne, le monolaurate de propylèneglycol, l'acide oléique, le dodécylbenzène-sulfonate de sodium, etc. Toutefois, on peut utiliser un agent tensioactif quelconque capable de maintenir le monomère polymérisable ou les TAG ou la substance analogue aux TAG en solution dans le monomère polymérisable à l'intérieur de la micelle de ce dernier quelle que

soit sa nature.

On peut préparer des TAC marqués par une substance radioactive, une substance analogue aux TAG marquée par une substance radioactive et de la lactine marquée par une substance radioactive en introduisant dans les TAG, la substance analogue aux TAG ou la lectine un atome d'iode radioactif tel que 125I ou 13I. L'introduction d'iode radioactif est réalisée par des techniques classiques d'iodation, par exemple un mode opératoire d'iodation oxydante exploitant la chloramine T [Nature 194, page 495 (1962); Biochem. J. 89, page 114 (1963)]. Ainsi, une telle iodation est réalisée dans un solvant approprié [par exemple une solution tampon à pH 6-8, de préférence une solution de tampon phosphaté 0,2 M (pH 7)] au voisinage de la température ambiante, en une durée de 5 à 60 s en présence de chloramine T. L'iode radioactif et la chloramine T sont de préférence utilisés en quantités respectives

de 1 à 5 mCi et 10 à 100 nanomoles par nanomole de tyrosine conte-

nue dans les.TAG o la substance analogue. Les TAG ou la substance

analogue marqués dans ces conditions sont isolés de manière clas-

sique et conservés lorsque c'est nécessaire sous la forme lyophi-

lisée. On peut préparer des TAG marqués par une enzyme, une substance analogue aux TAG marquée par une enzyme et de la lectine marquée par une enzyme selon une technique connue de

couplage r[par exemple B.F. Erlanger et col.; Acta. Endocrinol.

Suppl., 168, 206 (1972) et M.H. Karol et col.; Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 57, 713 (1967)]. Ainsion fait -réagir les TAG ou la substance analogue avec une enzyme, dans une solution tampon à pH 4-6 (par exemple une solution tampon à 1 millimole d'acétate (pH 4,4)) à température ambiante pendant une durée de 2 à 5 h. en présence d'un agent oxydant tel que NaIO4, après quoi on réduit par NaBH4 ou un agent réducteur analogue. L'enzyme est utilisée

en quantité de 1 à 3 moles par mole de TAG ou de substance ana-

logue. L'agent oxydant est utilisé en quantité de 100 à 300 moles par mole de TAG ou de substance analogue et l'agent réducteur

en quantité de 1 à 2 moles.

On peut préparer des TAG marqués par une substance fluorescente, une substance analogue aux TAC marquée par une substance fluorescente et de la lectine marquée par une substance fluorescente, en faisant réagir les TAC ou la substance analogue avec une substance fluorescente connue telle que l'isothiocyanate

de fluorescéine (tFITC") ou l'isothiocyanate de tétraméthylrho-

damine ("RITC") dans l'eau ou du sérum physiologique à pH 6-8, à une température allant de 00C jusqu'à la température ambiante, de préférence à température ambiante, pendant 30 min à 3 h (procédé à l'anticorps fluorescent; "Ikagaku Jikkenho Koza, n0 4",

pages 263-270). La substance fluorescente est de préférence uti-

lisée en quantité de 27% des TAG ou de la substance analogue.

On décrira maintenant en détail le procédé de détermination selon l'invention par le mode opératoire par

compétition ou par le mode opératoire par intercalation.

Dans les deux modes opératoires, les réactions sont effectuées dans un solvant approprié à une température de WC ou au-dessous, de préférence de 4 à 40'C et, mieux encore, de 20 à 40C. Le solvant utilisé ne doit pas gêner la réaction entre les TAG ou la substance analogue aux TAG et la lectine; on peut utiliser l'eau et des solutions tampons à pH 6 à 7,8 (par exemple une solution tampon acide chlorhydrique-Tris 0,1 à 0,3 M, pH environ 7,5, une solution de tampon phosphaté 0,1 à pli environ 7,4, etc.) . Les réactions sont poursuivies pendant 5 à 40 h, et de préférence 15 à 25 h. Pour séparer les TAG (ou la substance analogue aux TAG) fixés sur la lectine et la lectine ou les TAG (ou la substance analogue aux TAG) non combinés, on peut opérer de manière connue en soi. Ainsi, lorsqu'on utilise des TAG (ou une substance analogue aux TAG) insolubilisés ou de la lectine insolubilisée, une simple séparation de la phase solide et de la phase liquide (par centrifugation, filtration ou décantation) est suffisante;

dans d'autres cas, on peut exploiter la chromatographie, l'4lectro-

phorèse, le relargage, le fractionnement, la dialyse, la filtration sur gel, l'absorption ou une combinaison de ces techniques), ou

encore un mode opératoire de séparation exploitant le gel d'agar-

agar, le gel d'agarose ou le gel de polyacrylamide (demande de

brevet japonais publiée sous n0 151263/80).

Pour mesurer l'activité de l'agent d'identifica-

tion (marqueur) dans le produit séparé, on doit choisir un mode opératoire approprié qui est fonction de la nature de l'agent qui a servi à marquer. Ainsi, par exemple, avec une enzyme, on choisit un substrat d'enzyme approprié pour une technique d'analyse par colorimétrie, une technique d'analyse par émission ou une technique d'analyse par fluorescence et, si on le désire, on utilise un colorant ou un agent lumineux pour mesurer l'activité enzymatique; lorsqu'on a utilisé pour mrarquer une substance fluorescente ou une substance radioactive, on mesure l'intensité de fluorescence ou la radioactivité. Ainsi, on peut déterminer les TAG, la substance analogue aux TAG ou la lectine qui ont réagi ou qui n'ont pas

réagi, d'o on peut déduire la quantité de la matière en question.

Comme on l'a montré ci-dessus, l'invention permet de déterminer avantageusement les TAG contenus dans un liquide physiologique. A partir des quantités de TAG ainsi mesurées, on peut diagnostiquer le cancer à un stade quelconque, depuis le stade initial jusqu'au stade final. Le procédé est particulièrement utile pour un diagnostic du cancer au stade initial. En outre, comme le procédé selon l'invention permet de déterminer les chaînons gluco, l'application au diagnostic peut être exploitée pour des types

de cancer beaucoup plus étendus que les procédés classiques uti-

lisant les anticorps (a-fétoprotéine, CEA, etc.) déterminant prin-

cipalement la fraction protéique; ainsi, on peut diagnostiquer le cancer de l'estomac, le cancer du poumon, le carcinome du colon, le cancer du rectum, le cancer de l'ovaire, le cancer de la bouche, le cancer de la langue, le cancer du larynx, le cancer de la prostate, le liposarcome, le mélanome malin, le cancer de l'utérus, le sarcome primaire de l'estomac, etc. En outre, le procédé selon l'invention se caractérise par une haute spécificité à l'égard des cancers, sans interférence avec les déterminants de substances analogues contenues dans les liquides physiologiques de femmes enceintes ou de patients souffrant

de maladies autres que le cancer, comme la gastrite, l'ulcère gas-

trique, l'ulcère du duodénum, la colite, la pancréatite, le diabète

sucré, la néphrite, la cystite, les calculs de l'urètre, la cholé-

cystite, les calculs biliaires, la maladie du collagène, le ramol-

lissement du cerveau, l'd'poplexie, l'angine de poitrine, la défaillance cardiaque, l'infarctus du myocarde, l'hypertension, l'artérite, la dépression, le coryza allergique, le purpura, la pneumonie, la pneumatose pulmonaire, la bronchite, l'asthme, l'hdpatite aigué, l'hépatite chronique, etc.

En outre, l'invention permet de déterminer la galac-

tose-(Pl --> 3 ou P1 --> 4)-N-acétylglucosamine ou la galactose-

(P1 - 3 ou P1 - 4)-N-acétylgalactosamine ou des sucres ou dérivés de sucres (par exemple des glucoprotéines, des glucopeptides, des glucolipides, le glucoterpène, les glucostdrodides, etc.) portant

des chatnons gluco en position terminale.

Les exemples qui suivent illustrent l'invention

sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples, les indica-

tions de parties et de pourcentages s'entendent en poids sauf men-

tion contraire.

EXEMPLE 1

(i) Activation de la peroxydase: On dissout 5 mg de peroxydase (de radis noir) dans 1 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,3 M. On ajoute 0,1 ml d'une solution 0,1 M de fluorodinitrobenzène dans l'éthanol et on agite doucement pendant 1 h à température ambiante; on ajoute alors 0,1 ml de solution 0,06 M de NaIO4 et on agite doucement pendant 30 min à température ambiante. On ajoute au

mélange de réaction 1 ml d'éthylèneglycol 0,16 M et on agite douce-

ment à température ambiante pendant 1 h. On dialyse ensuite la solu- tion contre une solution tampon acide carbonique-bicarbonate de

sodium 0,01 M (pH 9,5) à 4 C pendant un jour et une nuit.-

(ii) Procédé pour marquer la lectine par la peroxydase (lectine-

peroxydase): On dissout 5 mg de lectine d'arachide dans 3 ml de la peroxydase activée obtenue en (i) ci-dessus et on laisse réagir en agitant doucement à température ambiante pendant 2 à 3 h. On ajoute mg de NaBH4 et on laisse réagir pendant 3 h à 4 C. On dialyse

ensuite cette solution contre une solution tampon acide chlorhydrique-

Tris 0,1 M (pH 7,4) pendant un jour et une nuit et on procède à une filtration sur gel sur une colonne chromatographique contenant

du gel de Sephadex G 150 (éluant: solution tampon acide chlot-

hydrique-TrisO,l M, pH 7,4). On soumet chacune des fractions à mesure D0280 et D0403, et on recueile les fractions présentant les pics pour DO280 et DO403 -f (ii') Procédé de préparation de la lectine-peroxydase purifiée: On charge 20 ml de la lectine-peroxydase obtenue en (ii) cidessus sur galactose-agarose (produit du commerce Agalactopyranosyl Agarose de la firme P.L.Lab. Etats-Unis d'Amérique) et on lave avec 200 ml de sérum physiologique. On élue la colonne par une solution de NaCl 0, 2 M contenant du lactose 0,5 M et on recueille la première fraction de 10 ml présentant les pics pour DO280 et D0403; on la dialyse contre du sérum physiologique pendant

un jour et une nuit; on obtient ainsi la lectine-peroxydase puri-

fiée. Le dosage de la protéine contenue dans le produit, effectué par la méthode de Lowry (Lowry O.H. et coll.: J. Biol Chem. 193 page 265 (1951)) indique 1 g environ. La lectine-peroxydase purifiée a été lyophilisée. (iii) Procédé de préparation de la lectine insolubilisée (procédé de préparation de la PNA-agarose): On met en suspension 15 g d'agarose activée par CNBr dans 3 1 d'acide chlorhydrique 0,001 N et, après 30 min de repos, on lave sur filtre de verre par 1 litre de bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 8,5). On obtient ainsi au total environ 50 ml

d'agarose activée. On les met en suspension dans 200 ml de bicar-

bonate de sodium 0,1 M (pH 8,5) et on ajoute 5 ml d'une solution de tampon phosphaté 0,01 M (pH 7,7) contenant 50 mg de lectine d'arachide (en abrégé ci-après PNA); on laisse réagir pendant 2 h à température ambiante en agitant de temps à autre. Lorsque la réaction est terminée, on lave le mélange de réaction sur filtre de verre et on

introduit le produit de reaction dans 200 ml de solution M de mono-

éthanolamine (pH 8,5) et on fait réagir 2 h à température ambiante.

On lave ensuite le produit de réaction sur filtre de verre par 1 litre d'une solution tampon d'acide acétique 0,1 M (contenant 0,5 M de NaCI) et 1 litre d'une solution tampon d'acide borique

0,1 M (contenant 0,5 M de NaCl) alternativement à trois reprises.

(iv) Procédé de préparation de la substance analogues aux TAG: On met en suspension 1 g de glucoprotéine sulfatée de muqueuse gastrique du porc (en abrégé ci-après PGM) dans 100 ml d'une solution de tampon phosphaté 0, 05 M (ph 7,0) et on règle à pH 11 par addition goutte à goutte d'une solution aqueuse de NaOH N. Apres agitation pendant 30 min à température ambiante, on centrifuge

le mélange pendant 10 min à 3000 tr/min et on règle le liquide sur-

nageant à pH 7,0 par HC1 N puis on centrifuge à nouveau pendant min à 3000 tr/min. On dialyse le liquide surnageant contre 10 1 d'une solution de tampon phosphate 0,01 M (pH7,0) pendant une nuit; on obtient ainsi une substance analogue aux TAG purifiée (PGM pure). (iv') Procédé de préparation d'une substance analogue aux TAG: Dans une variante, on ajoute 100 g de PGM brute à I litre d'eau distillée et on laisse reposer une nuit. Après dialyse du mélange contre de l'eau distillée pendant une nuit, on centrifuge

(100 000 g, 1 h). On recueille le liquide surnageant et on le lyophi-

lise; on obtient environ 5,5 g de PGM purifiée.

(v) Procédé de préparation des TAG marqués: (a) Marquage par une enzyme (PGM-peroxydase): On dissout 4 mg de peroxydase de radis noir (HRPO) (0,1 micromole) dans 1 ml d'eau distillée. On ajoute 0,2 ml de NaI04 0,1 M et, après agitation de 20 min à température ambiante, on dialyse la solution contre une solution tampon à 1 millimole d'acide acétique (pH 4,4)pendant un jour et une nuit afin d'éliminer le NaIO4 qui n'a pas réagi. A cette solution de réaction dialysée, on ajoute environ 60pl d'une solution tampon de bicarbonate de

sodium 0,2 M (pH 9,5), afin de régler le pH de la solution à 9,0.

On ajoute immédiatement 0,6 ml de PGM (10 mg/ml) en solution dans une solution tampon au bicarbonate de sodium 0,01 M (pH 9,5), on mélange pendant 2 h à température ambiante, on ajoute 0,1 ml d'une solution de NaBH4 à 4 mg/ml dans l'eau distillée et on laisse

reposer 2 h à 4 C.

On dialyse cette solution contre une solution de tampon phosphaté 0,01 M (pH 7,5) pendant un jour et une nuit et on purifie sur Sephadex G-200 (1, 5 x 150 cm); on obtient ainsi la PGM-peroxydase pure (PGM-POX). L'éluant du gel est recueilli par

portions de 5 ml dont on mesure l'absorption à D0280 et DO403.

(b) Marquage par un isotope (125I-PGM):

On a marqué la PGM par 125I par la technique d'ioda-

tion oxydante à l'aide de la chloramine T. On dissout 10,pg de PGM dans 50/pl d'une solution de tampon phosphaté 0,2 M (pH 7,0) et on ajoute 10pl de 1 m Ci de Nea125I (sans support; N. E. N.) et 50,ug/100pl de solution de chloramine T dans une solution de tampon phosphate 0,2 M; après mélange à température ambiante pendant 30 s, on ajoute 10g/100flOOpl de solution de Na2S205 dans une solution de tampon phosphaté 0,2 M. On ajoute ensuite 1 mg de Na 125I et on mélange. La 125I-PGM ainsi obtenue a été purifiée sur Sephadex G-50 (1 x 30 cm). La 125I-PGM préparée dans ces conditions présente une radioactivité d'environ

1 à 2PCi/Pg.

(vi) Détermination: Dans un tube en verre de 10 x 75 mm, on mélange 0,1I de125 0î,c nio 0,1 ml de 1I-PGM (100 ng 0,17Ci correspondant à environ 2, 4 x 10 cpm) obtenue en (v) ci-dessus, 0,1 ml de la PGM étalon pure (O, lpg/ml, 0,2pg/ml, 0,5pg/ml, lpg/ml, 2,5/pg/ml, 5pg/ml, ug/ml) obtenue en (iv) ci-dessus, 0,1 ml de.PNA (10g/ml) et 0,2 ml d'une solution tampon d'acide phosphorique 0,05 M (0,15 M de NaCI; 0,1%. de BSA: 0,02% de NaN3) et on soumet à incubation de 1 h à 25 C. Lorsque la réaction est terminée, on ajoute 0,1 ml de sérum anti-PNA de lapin (de la firme E. Y. Laboratory: solution

125

diluée dix fois) à la 25I-PGM fixée à la PNA et à la 125I-PGM non fixée à la PNA et, après incubation de 1 h à 25 C, on centrifuge la solution de réaction à 4 C pendant 30 min à 3 000 tr/min. On compte la radioactivité d'un précipité ( 125I -PGM fixée sur PNA) pour établir une courbe étalon (figure 1). I1 résulte clairement

des résultats obtenus que le pourcentage fixé (B/T) est habituelle-

ment de 20 à 25% et qu'il y a une inhibition de 50% à une concentra-

tion de 0,6pg/ml.

(vii) Préparation d'une substance analogue aux TAG insolubilisée: On ajoute un excès de PGM à 100 ml d'une solution de tampon phosphaté 0,01 M (pH 7,0). A la suspension obtenue, on ajoute une solution de NaOH 0,01 N en quantité suffisante pour régler le pH de la suspension à 11 environ, puis on centrifuge à 3000 tr/min pendant 20 min; on recueille le liquide surnageant et on ajoute goutte à goutte iHC1 0,03 N en quantité suffisante pour régler le pH à 7,0; on centrifuge à nouveau à 3000 tr/min pendant 20 min. On dialyse le liquide surnageant contre une solution de tampon phosphaté 0,01 M (pHli 7,0); on prépare ainsi une solution de PGM. Pour ce qui concerne les teneurs en sucre et en protéine de cette solution, la mesure de la teneur en hexose par la méthode au phénol et à l'acide sulfurique donne un résultat de 5 à 7 mg/ml avec le glucose comme étalon; la mesure de la teneur en protéine donne un résultat de 1 à 2 mg/ml avec la BSA comme étalon. La solution de PGM a été soumise à polymérisation induite par radia-

tions comme décrit ci-après.

On a mélangé du méthacrylate d'hydroéthyle monomère

(HEMA) avec la solution de PGM décrite ci-dessus, dans des propor-

tions relatives de 33:67, et on a placé le mélange dans un tube de verre de 1 cmx 15 à 20 cm; on a lyophilisé rapidement à -70 C ou au-dessous. On a ensuite exposé à 10 rad de rayons gamma pour provoquer la polymérisation. Pour chacune des PGM fixée dans ces conditions, on a préparé des disques de 10pm d'épaisseur par

découpage du barreau de polymère.

(viii) Préparation d'une substance analogue auxTAG insolubilisée: On met en suspension 15 g (poids sec) de Sepharose 4B

(de la firme Pharmacia AB) activé par CNBr dans 3 1 d'acide chlor-

hydrique 0,001 N et, après repos de 30 min, on lave par 1 litre de bicarbonate de sodium 0,1 M (pHl 8,5) sur filtre de verre; on obtient ainsi'environ 50 ml de Sepharose activé. On les met en suspension dans 200ml de bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 8,5) et on ajoute ml de solution de tampon phosphaté 0,01 % (pH 7,7) contenant mg de PGM; on fait ensuite réagir à température ambiante pendant

2 h en agitant de temps à autre.

Lorsque la réaction est terminée, on lave la solu-

tion de réaction sur filtre de verre et on introduit le produit de réaction dans 200 ml d'une solution M de monoéthanolamine (pH 8,5) puis on fait réagir à température ambiante pendant 2 h. On lave ensuite la solution de réaction sur filtre de verre par 1 litre d'une solution tampon d'acide acétique 0,1 M (contenant 0,5 M de

NaCl) et 1 litre d'une solution tampon 0,1 M d'acide borique (conte-

nant 0,5 M de NaCl) alternativement à trois reprises.

(viii') Procédé de préparation d'une substance analogue aux TAG insolubilisée (préparation de billes de PGM): On lave 10 000 billes de polystyrène de 6,4 mm de diamètre de la firme Precision Plastic Co., Ltd, Etats-Unis d'Amérique par une solution diluée de détergent synthétique (produit du commerce Mamalemon de la firme Lion Co., Ltd) à une concentration de 1,5 ml/1 d'eau distillée, puis à l'eau distillée. Après avoir plongé les billes pendant 3 jours dans une solution aqueuse de NaOH 0,5.M, on les lave avec soin jusqu'à ce que les lavages pré-

sentent un pH d'environ 6. Les 10 000 billes lavées sont intro-

duites dans 2,5 1 d'une solution de PGM à 350 g/l dans du tampon à 50 millimoles d'acide acétique réglé à pHli 4,5 par NaOH 10 N; on fait tourner à environ 10 tr/min pendant 24 h, on filtre et on lave par 8 1 d'eau distillée à quatre reprises. On introduit ensuite les billes dans 2, 5 1 d'une solution d'aldéhyde glutarique à la concentration finale de 1% en volume dans du tampon à 50 millimoles de phosphate de sodium (pH 7), on fait tourner à 10 tr/min pendant

2 h, on filtre et on lave à l'eau distillée comme décrit ci-dessus.

On introduit les 10 000 billes dans 2,5 1 de solution M de glycine dans du tampon à 50 millimoles de phosphate de sodium (pH 7,0), on fait tourner à 10 tr/min pendant 2 h, on filtre et on lave à l'eau distillée comme décrit ci-dessus, puis on sèche à 37 C pendant

une nuit; on obtient ainsi les billes portant la PGM. La surface spé-

cifique des billes a été mesurée par la méthode à l'orcinol et' à l'acide sulfurique (M. SchBnenberger et coll.: Z. Physiol. Chem. 309, 145

(1957)); le résultat a donné2,7t+0,2pg de PGM par bille.

(ix) Préparation des échantillons:

On recueille 5 ml de sang de chacun de patients can-

céreux, de patients souffrant d'autres maladies, de femmes enceintes et d'individus en bonne santé à l'aide d'une seringue traitée par l'héparine (500 unités) et on centrifuge pendant 10 min à 2000 tr/min,

puis on recueille le liquide surnageant pour préparer les échantil-

*lons.

EXEMPLE 2

Mode opératoire par compétition:

On place un disque (substance analogue aux TAG, inso-

lubilisée, préparée en (vii) ci-dessus dans 50pl de peroxydase fixéesur PNA (lectine marquée préparée en (ii)) et 200/1 de l'échantillon (échantillon préparé en (ix) ci-dessus) et on soumet à incubation de 20 h à 25 C. On lave ensuite le disque par PBS et on place dans 2,0 ml de sérum physiologique; on ajoute 0,5 ml d'une matière à la peroxydase et on soumet à incubation de 1 h à 25 C. On ajoute ensuite 1,0 ml d'acide chlorhydrique 3 N et on mesure l'absorbance à 492 nm. Simultanément, on mesure l'absorbance d'échantillons à des concentrations variées d'une substance étalon (PGM) de manière à établir une courbe d'étalonnage (figure 2). On détermine alors les TAG dans les échantillons préparés en (ix) à l'aide de la courbe d'étalonnage. Les résultats obtenus sont

représentés dans les figures 3 et 4 des dessins annexés.

Ces résultats montrent qu'il y a une différence nette dans les concentrations en TAG entre les personnes en bonne

santé et les patients souffrant de cancers variés.

EXEMPLE 3

Mode opératoire par intercalation: On ajoute 200pg de PNA-agarose préparée en (iii) ci-dessus à 100pi d'une solution de tampon phosphaté 0, 05 M (pH 7XO) contenant en solution 1 à lOpg/ml de PGM et on soumet à incubation de 1 h à 25 C sous agitation. Après lavage de la solution de réaction à trois reprises avec une solution de tampon phosphaté 0,05 M (pH 7,0), on ajoute 6pg de PNA marquée par la peroxydase, telle qu'obtenue dans l'exemple 1, (ii) et 100l1 de solution de tampon phosphaté 0,05 M (pH 7,0) et on

soumet à incubation de 1 h à 25 C sous agitation. Après centrifu-

gation pendant 10 min à 3000 tr/min, on recueille le précipité

et on le lave à trois reprises avec une solution de tampon phos-

phaté 0,05 M (pH 7,0); on mesure l'absorbance à 492 nm. Les 30. résultats obtenus sont représentés graphiquement dans la figure 5

des dessins annexés.

EXEMPLE 4

Mode opératoire par compétition: On place 101ul d'un échantillon (échantillon

obtenu comme décrit en (ix) ci-dessus) dans un tube à. essai conte-

nant 500/1l de tampon HCl-Tris 0,3 M (pH 7,4) auquel on aajouté

2,2 g/l de gélatine, 5 millimoles de CaC12 et 5 millimoles de MgCl2.

2487 984

On ajoute encore une bille à la PGM (substance analogue aux TAG, insolubilisée, préparée comme décrit en (viii') ci-dessus) et

pl de lectine-peroxydase (la lectine marquée lyophilisée pré-

parée comme décrit en (ii') ci-dessus, à une concentration de 1 mg/i du tampon HCl-Tris ci-dessus); après agitation, on soumet le mélange à incubation pendant 24 h. On retire le mélange de

réaction par aspiration et on lave la bille par 2 ml de sérum phy-

siologique, on retire le liquide de lavage par aspiration. On

répète trois fois cette opération de lavage.

On dissout par ailleurs 60 mg d'orthophénylène-

diamine dans 20 ml de tampon Mcllevein 0,2 M (pH 5,8) et on ajoute à la solution H202 à la concentration finale de 0,027. en volume;

l'agitation du mélange donne un colorant.

Dans un tube à essai on place 2 ml de sérum physio-

logique et 500/il du colorant ci-dessus avec la bille lavée et on soumet à incubation de 30 min à température ambiante. On arrête alors la réaction enzymatique par 1 ml d'HCl 3 N. On mesure la densité optique du mélange de réaction à 492 nm. En même temps, on mesure l'absorbance de la même manière sur des échantillons à des concentrations variées d'une substance étalon (PGM) de manière à établir une courbe d'étalonnage (figure 6). On détermine ensuite les TAG dans les échantillons obtenus en (ix) ci-dessus à l'aide de

la courbe d'étalonnage. Les résultats obtenus sont représentés gra-

phiquement dans les figures 7a, 7b, 7c et 7d des dessins annexés.

Il est clair que l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'exemple et que l'homme de l'art peut y apporter des modifications

sans pour autant sortir de son cadre.

2487;84

Claims (5)

REVENDICATIONS -

1 - Procédé pour déterminer les chaînons gluco asso-

ciés aux tumeurs ('"TAG"), caractérisé en ce que l'on fait réagir concurremment les TAG d'un liquide physiologique soumis à la mesure et une quantité définie de TAG insolubilisés ou d'une substance analogue aux TAG, insolubilisée, avec une quantité définie de lectine marquée, on sépare les TAG insolubilisés ou la substance analogue aux TAS, insolubilisée, fixes à la lectine marquée d'avec la lectine non combinée, et on mesure l'activité de l'agent de

marquage dans chacune des deux fractions.

2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance analogue aux TAG est la galactose-(1l - 3

ou P1 -- 4)-N-acétylglucosamine, la galactose-(Pl - 3 ou 51 ->4)-

N-acétylgalactosamine ou un dérivé de sucre contenant ladite chaîne

de sucre en position terminale.

3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lectine est marquée par une enzymie, une substance

fluorescente ou une substance radioactive.

4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide physiologique est le sang, l liquide du tissu cellulaire, le liquide de la lymphe, le liquide thoracique, le liquide abdominal, le liquide amniotique, le suc gastrique, l'urine,

le suc pancréatique, le liquide cérébrospinal ou la salive.

- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance analogue aux TAG servant à préparer ladite substance insolubilisée est choisie dans le groupe tormé par la glucoprotéine de la mucine gastrique humaine, la glucoprotéine

obtenue par élimination du fucose terminal à partir de la glucopro-

téine sulfatée de la membrane muqueuse gastrique du pore, la gluco-

protéine humaine IgG ou son dérivé asialo, la glucoprotéine bovine IgG, le dérivé asialo de la glucoprotéine du chaînon gluco B de de la thyroglubuline du porc, la glucoprotéine de la b-sous-unité ovomucoïde, la glucoprotéine B-1 de l'IgE humaine eu son dérivé asialo, le dérivé asialo de la glucoprotéine B-2 ou B-3 de l'IgE humaine et le dérivé asialo de la glucoproréine II-C de 1I 'IA humaine, le dérivé asialo de la glucoprotéine II-B ou II-A de l'IgAl humaine, le dérivé asialo de la glucoprotéine transférine humaine, le dérivé asialo de la glucoprotéine de fétuine de bovin, le dérivé désasialo de la glucoprotéine participant à l'absorption de l'asialo-glucoprotéine de la membrane protoplasmique de la cellule de foie de lapin, la glucoprotéine sulfatée de la muqueuse gastrique de porc, le dérivé asialo de la glucoprotéine acide ac humaine, le dérivé asialo de la glucofoline, la glucoprotéine de l'antigène T, le gluco peptide de l'antigène T, l'asialo GM =AM1 et les glucolipides des érythrocytes de bovin; la substance servant & marquer la lectine est choisie dans le groupe formé par la glucoamylase, la gluco-oxydase, la peroxydase, la phatase alcaline, la P-galactoxydase, le fragment actif de l'hémoctapeptide, 125I 131I et le tritium radioactif; la lectine est choisie dans le groupe formé par la lectine d'arachide et la lectine de fève de ricin; et le support insoluble des TAG insolubilisés ou de la matière analogue aux TAG, insolubilisée, est choisi dans le groupe formé

par la poudre de cellulose, le Sephadex, le Sepharose, le poly-

styrène, le papier-filtre, la carboxyméthylcellulose, les résines échangeuses d'ions, le dextrane, la pellicule de matière plastique, les tubes de matière plastique, le Nylon, les billes de verre, la soie, un copolymère polyamine-éther méthylvinylique-acide maléique, un copolymère d'acides aminés et un copolymère éthylène-acide maléique.

6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance analogue aux TAG servant à préparer ladite substance insolubilisée est choisie dans le groupe formé par la glucoprotéine de mucine gastrique humaine, la glucoprotéine obtenue par élimination du fucose terminal dans la glucoprotéine sulfatée de la membrane muqueuse gastrique de porc, la glucoprotéine de l'IgG humaine ou son dérivé asialo, la glucoprotéine de l'IgG bovine, le dérivé asialo de la glucoprotéine de chatnon gluco B de la thyroglobuline de porc, la glucoprotéine de la e-sous-unité ovomucoide, la glucoprotéine B-1 de l'IgE humaine ou son dérivé asialo, le dérivé asialo de la glucoprotéine B-2 ou B-3 de l'IgE humaine et le dérivé asialo de la glucoprotéine II-C de l'IgA humaine, le dérivé asialo de la glucoprotéine II-B ou II-A de

de l'IgAl humaine, le dérivé asialo de la glucoprotéine de trans-

férine humaine, le dérivé désasialo de la glucoprotéine partici-

pant à l'absorption de l'asialo glucoprotéine de la membrane proto-

plasmique cellulaire de foie de lapin, la glucoprotéine sulfatée de la muqueuse gastrique de porc, le dérivé asialo de la glucopro-

téine acide a1 hmaine, le dérivé asialo de la glucofoline, la gluco-

protéine de l'antigène T, le glucopeptide de l'antigène T, l'asialo GM1 = AM1 et les glucolipides de l'érythrocyte de bovin; la substance servant à marquer la lectine est choisie dans le groupe formé par la gluco-amylase, la glucose-oxydase, la peroxydase, la phosphatase alcaline, la Pgalactoxydase, le fragment actif de l'hémoctapeptide, 125I, 131I et le tritium radioactif; la lectine est choisie dans le groupe formé par la lectine d'arachide et la lectine de fève de ricin et les TAG insolubilises ou la substance analogue aux TAG insolubilisee consiste en une gangue polymère préparee par irradiation d'une dispersion aqueuse d'un monomère polymérisable conteront les TAG ou la substance analogue aux TAG par des radiations ionisantes provoquant la polymérisatinn dudit monomère, ladite dispersion aqueuse étant choisie dans le groupe formé par une dispersion aqueuse d'un mélange d'un monomère polymérisable hydrophobe (A) et d'un polymère hydrosoluble (B), une

dispersion aqueuse d'un mélange d'un monomère polymérisable hydro-

phobe (A) et d'un monomère polymérisable hydrophile (C), une dis-

persion aqueuse d'un mélange d'un monormère polymérisable hydrophobe (A) et d'un agent tensio-actif (D), et une dispersion aqueuse d'un monomère polymérisable hydrophile (C), le monomère polymérisable hydrophobe étant choisi dans le groupe formé par le méthacrylate de glycidyle, le diméthacrylate de l'éthylèneglycol, le méthacrylate du diéthylèneglycol, le diméthacrylate de triéthylèneglycol, le

triméthacrylate de triméthylolpropane, le diméthacrylate du poly-

éthylèneglycol 200, le diméthacrylate du dipropylèneglycol, le

dimêthacrylate du 1,4-butylèneglycol, le'diméthacrylate du 1,6-

hexaneglycol, le diméthacrylate du diméthoxydiméthylèneglycol,

le méthacrylate de méthyle, le méthacrylate d'ethyle, le métha-

crylate de butyle et les acrylates correspondants; le polymère

hydrosoluble (B) est choisi dans le groupe formé par la poly-

vinylpyrrolidone, lVacide polyméthacrylique, l'acide polyacrylique, l'alcool polyvinylique, l'hydroxypropylcellulose et la gomme arabique; le monomère polymérisable hydrophile est choisi dans le groupe formé

par le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate du méthoxy-

têtraéthylèneglycol, le méthacrylate du méthoxypolyêthylèneglycol 400, le méthacrylate du méthoxypolyethylèneglycol 1000, le dimethacrylate du polyéthylèneglycol 400, le diméthacrylate du polyethylèneglycol 600

et les acrylates correspondants, et l'acide méthacrylique, l'acryla-

mide et la N-vinyl-2-pyrrolidone; et l'agent tensioactif D)est choisi dans le groupe formé par le laurylsulfate de sodium, l'olêate de potassium, l'oléate de sodium, le monolaurate de sorbitanne, le

monostéarate de sorbitanne, le monooléate de sorbitanne, le mono-

laurate de propylèneglycol, l'acide oléique, le dodécylbenzène-

sulfonate de sodium.

7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance analogue aux TAG, insolubilisée est une gangue polymère préparée par irradiation d'une dispersion aqueuse de méthacrylate d'hydroxyéthyle contenant de la glucoprotéine sulfatée de la muqueuse gastrique de porc par des rayons X, et la lectine

marquée est de la lectine d'arachide marquee par de la peroxydase.

8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que la substance analogue aux TAG, insolubilisée, consiste en gluco-

protéine sulfatee de la muqueuse gastrique de porc insolubilisée sur des billes de polystyrène, et la lectine marquee consiste en

lectine d'arachide marquee par de la peroxydase.

9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir concurremment les TAG du liquide physiologique soumis à la mesure et une quantité definie de TAG marquee ou d'une substance analogue aux TAG, marquee, avec une quantité définie de lectine ou de lectine insolubilisee, on sépare les TAG marqués ou la substance analogue aux TAG, marquée, fixes à la lectine ou la lectine insolubilisée d'une part et les TAG marqués ou la substance analogue aux TAG, marquee, non fixes d'autre part, et on mesure

l'activité de l'agent de marquage dans chacune des deux fractions.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérise en ce que la substance analogue aux TAG est la galactose-(tl -4 3

ou l - 4)-N-acétylglucosamine, la galactose-(Pl -> 3 ou l -- 4)-

N-acétylgalactosamine ou un dérivé de sucre contenant ledit chaînon

gluco en position terminale.

11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les TAG marqués ou la substance analogue aux TAG, marquée, sont marqués par une enzyme, une substance fluorescente ou une

substance radioactive.

12. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le liquide physiologique est le sang, un liquide de tissu cellulaire, le liquide de la lymphe> le liquide thoracique, le liquide abdominal, le liquide amniotique, le suc gastrique, l'urine,

le suc pancréatique, le liquide cérébrospinal ou la salive.

13. Procédé selon la revendication 9, caracterisé en ce que la substance analogue aux TAG servant à obtenir la substance analogue aux TAG, marquée, est choisie dans le groupe formé par la glucoproteine de la mucine gastrique humaine, la glucoproteine obtenue par élimination du fucose terminal à partir de la glucoproteine sulfatée de la membrane muqueuse gastrique du porc, la glucoprotéine de l'IgG humaine ou son dérivé asialo, la

glucoproteine de l'IgG de bovin, le dérive asialo de la gluco-

protéine du chaînon gluco B de la tyroglobuline de porc, la gluco-

proteine de la p-sous-unité ovomucolde, la glucoproteine B-l de l'IgE ou humaine ou son dérive a ialo, le dérivé asialo de la glucoproteine B-2 ou B-3 de l'IgE humaine et le dérivé asialo de la glucoprotine II-C de l'IgAl humaine, le dérivé asialo de la glucoproteine II-B ou II-A de l'IgA1 humaine, le dérivé asialo de la glucoproteine de transferrine humaine, le dérive asialo de la glucoproteine de fetuine de bovin, le dérivé désasialo de la glucoproteine participant à l'absorption de l'a ialo-glucoprotéine de la membrane protoplasmique de la cellule de foie de lapin, la glucoproteine sulfatée de la muqueuse gastrique de porc, le dérive asialo de la glucoproteine acide a1 humaine, le dérivé asialo de la glucofoline la glucoproteine de l'antigène T, le glucopeptide de l'antigène T, l'asialo GM =AMl- et les glucolipides des erythrocytes de bovin; la matière servant à marquer les TAG nu la substance

analogue aux TAG est choisie dans le groupe formé par la gluco-

amylase, la glucose-oxydase, la peroxydase, la phosphatase alcaline, la 9galactoxidase, le fragment actif de l'hémoctapeptide, 125I, 131I et le tritium radioactif; la lectine est choisie dans le groupe formé par la lectine d'arachide et la lectine de fève de ricin et le support insoluble de la lectine insolubilisee est choisi dans le groupe forme par la poudre de cellulose, le Sephadex, le

Sépharose, le polystyrène, le papier-filtre, la carboxyméthyl-

cellulose, les résines échangeuses d'ions, le dextrane, la pellicule de matière plastique, les tubes de matière plastique,. le Nylon, les

billes de verre, la soie, un copolymère polyamine-éther ethylvinylique-

acide maleique, un copolymère d'acides aminés et un copolymère

ethylène-acide maleique.

14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir les TAG du liquide physiologique avec une lectine insolubilisée, formant ainsi un complexe TAG-lectine insolubilisée qu'on fait réagir avec une quantité définie de lectine marquée, on sépare le complexe fixé à la lectine marquée d'une part et la lectine marquée non fixée d'autre part et on mesure

l'activité de l'agent de marquage dans chacune des deux fractions.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la lectine est marquée par une enzyme, une substance

fluorescente ou une substance radioactive.

16. Procédé selon la revendication14, caractérisé en ce que le liquide physiologique est le sang, le liquide du tissu cellulaire, le liquide de la lymphe, le liquide thoracique, le liquide abdominal, le liquide amniotique, le suc gastrique,

l'urine, le suc pancréatique, le liquide cérébrospinal ou la salive.

17. Procéde selon la revendication 14, caractérise en ce que la lectine insolubilisée ou marquée est choisie dans le groupe formé par la lectine d'arachide et la lectine de fève de ricin; la substance servant à marquer la lectine est choisie dans le groupe formé par la gluco-amylase, la glucose-oxydase, la peroxydase, la phosphatase alcaline, la Pgalactosidase, le

fragment actif de l'hémoctapeptide, 125I, 131I et le tritium radio-

actif, et le véhicule insoluble de la lectine insolubilisée est choisi dans le groupe formé par la poudre de cellulose, le Sephadex,

le Sepharose, le polystyrène, le papier-filtre, la carboxyméthyl-

cellulose, les résines échangeuses d'ions, le dextrane, la pellicule de matière plastique, les tubes de matière plastique, le Nylon, les

billes de verre, la soie, un copolymère polyamine-éther éthylvinylique-

acide maleique, un copolymère d'acides aminés et un copolymère

éthylène-acide maléique.

18. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la lectine insolubilisee-ou marquée est choisie dans le groupe formé par la lectine d'arachide et la lectine de fèv.e de ricin, la substance servant à marquer la lectine est choisie dans le groupe formé par la gluco-amylase, la glucoxydase, la peroxydase, la phosphatase alcaline, la Pgalactosoxydase, le fragment actif de l'hemoctapepetide, 125I, 131I et le tritium radioactif; le véhicule insoluble de la lectine insolubilisée est choisi dans le groupe formé par la poudre de cellulose, le Sephadex, le Sépharose, le polystyrène, le papier-filtre, le carboxyméthylcellulose, les résines échangeuses d'ions, le dextrane, la pellicule de matière plastique, les tubes de matière plastique, le Nylon, les biles de

verre, la soie, les copolymères polyamines-éther méthylvinylique-

acide maléique, les copolymères d'acides aminés et les copolymères ethylène-acide maleique, et la lectine insolubilisee consiste en une gangue polymère préparée par irradiation d'une dispersion aqueuse

d'un monomère polymérisable contenant de la lectine par des radia-

tions ionisantes provoquant la polymérisation dudit monomère, ladite

dispersion aqueuse étant choisie dans le groupe formé par une dis-

persion aqueuse d'un mélange d'un monomère polymérisable hydrophobe (A) et d'un polymère hydrosoluble (B), une dispersion aqueuse d'un mélange

d'un monomère polymérisable hydrophobe (A) et d'un monomère poly-

mérisable hydrophile (C), une dispersion aqueuse d'un mélange d'un monomère polymérisable hydrophobe (A) et dèun agent tensioactif (D) et une dispersion aqueuse d'un monomère polymérisable hydrophile (C), ledit monomère polymérisable hydrophobe étant choisi dans le groupe

formé par le méthacrylate de glycidyle, le diméthacrylate d4êthylène-

glycol, le dimethacrylate du diéthylèneglycol, le diméthacrylate du

triéthylèneglycol, le triméthacrylate du triméthylolpropane, le dimétha-

crylate du polyethylèneglycol 200, le diméthacrylate du dipropylène-

glycol, le diméthacrylate du méthoxydiéthylèneglycol, le méthacrylate de méthyle, le méthacrylate d'éthyle, le méthacrylate de butyle et les acrylates correspondants; le polymère hydrosoluble (B) étant choisi dans le groupe formé par la polyvinylpyrrolidone, l'acide polyméthacrylique, l'acide polyacrylique, l'alcool polyvinylique,

l'hydroxypropylcellulose et la gomme arabique; le monomère polymé-

risable hydrophile étant choisi dans le groupe formé par le poly-

méthacrylate de 2-hydroxyethyle, le méthacrylate du méthoxytétra-

éthylèneglycol, le méthacrylate du méthoxypolyéthylèneglycol 400, le méthacrylate du méthoxypolyethylèneglycol 1000, le diméthacrylate du polyéthylèneglycol 400, le diméthacrylate du polyethylèneglycol 600 et les acrylates correspondants, ainsi que l'acide methacrylique, l'acrylamide et la N-vinyl-2-pyrrolidone; et l'agent tensioactif D étant choisi dans le groupe formé par le laurylsulfate de sodium, l'oleate de potassium, l'oléate de sodium, le monolaurate du sort bitanne, le monstearate du sorbitanne, le monooleate du sorbitanne,

le monolaurate du propylèneglycol, l'acide oleique, le dodécyl-

benzènesulfonate de sodium.

19. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la-lectine marquée est de la lectine d'arachide marquee à la peroxydase et la lectine insolubilisée est de la lectine

d'arachide insolubilisée sur Sépharose.

20. Utilisation du procédé selon l'une quelconque

des revendications 1, 9 et 14, pour le diagnostic du cancer par

détermination de la concentration des chaînons gluco associés aux tumeurs dans le liquide physiologique d'un sujet et comparaison avec la concentration trouvée dans le liquide physiologique

d'un individu en bonne santé.