JPS58129363A - 癌関連糖側鎖の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は一乳動物の体液中の癌関連糖側鎖（以Ｆ、ＴＡ
Ｇと称する）、丁なわち、未分化細胞、籍に腫瘍や＃ｌ
ＩｆＩｍ廁の増殖に伴って増加する末端にＮ−アセチル
−Ｄ−がラクトサミン（以下ムＧと称する）又はＬ−７
コースケ有する棚蛋白、ＩＩペデタイド、ｌ１ａｉｒ質
又は（及びン楯ゲ含むＴムＧ火定歇する方法に関する。 従来、婚欠ｆＩ／に断する方法として、癌患者において
！異的に産生される響Ｉ４塘蛋白χ測定する方法が行わ
れている。この方法は王としてその蛋白部分の抗原性欠
利用する方法で、例えばα１−フェトゾロティｙの測定
による原発生肝癌の診断、あるいはＯＩ！！Ａの測定に
よる消化器系、　４１４Ｃ直腸癌の診断等が知られてい
る（医学のあゆみ：１０６巻、５号、＃Ｉ５土曙脣集、
２３５〜２５０頁（１９７８年）〕。しかし、これらの
方法は癌の種類が比較的限られている欠点があり、広範
な檀羨の癌の診断法が望まれている。 ところで、これまで、癌関連糖側鎖の糖残基結合特異性
を利用する癌の診断法については、未だ知られていない
。 本発明者は、Ｓ、ａ者の体液中には、未分化細胞（主と
して癌細胞）によって産生され体液中に放出されるＴＡ
Ｇが存在すること、しかもこれは分化ａ胞（王として正
常細胞）ＫＪ：つて産生され体液中に放出される槽構造
とはその塘鎖部分の構造、長さ、構成糖残基にかなりの
違いケ有していることに着目し、鋭意研究Ｙ型ねた結果
、このＴＡＧは末熾に＆Ｇ又は、Ｌ−７コース欠有する
糖蛋白。 糖ペプチド、糖脂質又は（及び）糖質Ｖ含み、これはム
Ｇ結合性レクチン又はＬ−フコース結合性レクチンと特
異的に結合すること、従って１体液中のτ＆ＧＶ五Ｇ結
合性レクチン又はＬ−フコース結合性レクチン（以下、
両者をレクチンと称する）と反応せしめてこれを測定す
ることにより癌細胞の有無、増殖度合、消長等χ知り、
これによって癌火診断することができることを屹出し、
本発明ケ完成した。 丁なわも、本発＃４は体准中のＴＬＧｖレクチンと反応
させてＴＡＧ−レクチン結合体又Ｉ寡未反応のレクチン
を欠測定することχ特徴とする体液中のτＡＧレベルの
定量法である。 本発明で使用される体液としては各種の体液がＩＣ用で
き１例えば血液、細ｍ組織液、リンノ（液、１水、腹水
、羊水、＊ａ、　尿、膵液、髄ａ、ｓｇ等が挙げられる
が、就中時に血ａヶ血清または血漿として使用するのが
好ましい。定量に用いられる体液の１１＆ｚＯＪ）１〜
１０ＩＬｔ橿度好ましくは０；１〜０，２プ橿度採取丁
ればよい。 本発明にＨいては、体液からＴＡＧＶ分離し、これケレ
クチンと反応させ、ＴＡＧ−レクチン結合体盪父は残存
レクチン量大測定するか、あるいは体液自体にＪＩＡａ
レクチンケ添加して反応させＴＡＧ−樟繊レクチン結合
体、又は未反応の標識レク千ンケ分畷し、該′ｒ入Ｃｔ
−＊ａレクチン結合体もしくは未反応のｖＩＡ鐵レクし
ン竜ｖｉｌｌ定することによって体液中のＴＡＧレベル
ケ定量することができる。 体液からＴ　ＡＧｖ分畷するには、末熾にムＧ又はＬ−
プコース欠有する糖蛋白、塘ペプチド、糖脂質又は（及
び）糖類χ得るのに丁でに用いられている抽出又は分離
手段、例え％イ壜析、沈ｆａ、抽出、遠心分離、透析、
分子篩法、酵素の失活あるいはこれら欠適宜組合せる方
法が１！！用される。−に詳細には１例えば血清又は血
漿にスルホサリチル酸、トリクロロｅｎ酸、硫ｌｌ犠給
ケ添加する力１゜加熱後沈澱物ｖＦ去する方法によって
アルプ（ｙｓ免疫グロデリン等χ除去し、次いでこれ欠
透析することによって当該分ｍｗ調製する。 本発明の定量法にだいて標識レクチンＶ［用する場合は
、採取されπ体液のうち、血液以外のｔのはそのまま禎
検試料（以下「試料」と略ｆりとして用いることができ
るが、試料が変性′ｆることｙｙＴｎ止し、かつレクチ
ンとの反応Ｖ促進させるために、保Ｓ蛋白として、牛血
清アルブミン（Ｂｅム）等の低級糖含有物ケもった蛋白
冥加えるのが好ましい。区に好ましくは、試料からアル
ジミンや免疫グロブリン等ケ除去した後１遍当量の保ｓ
蛋白ケ加えるのがよい結果ケ与える。血液の場合は公知
の血（＃採取法によって得られた血清、あるいはヘパリ
ン、ＥＤＴム、クエン酸等の抗凝固剤欠用いるｒｍ渠採
収法によって得られた血贋ケ試料として用いることがで
きるが、特にヘパリンケ抗凝固剤として用いて採取調製
した［Ｉｎ晴欠試料とするのが叶ましい。また、上記試
料は、復水症等のτＡＧレベルが相対的に嶋い場合には
、必堤ならば］ＩＩ当な一１＃液で布釈してもよい。 また、本発明で１史用されるへＧ結合性しクチン父はＬ
−７コ一ス結合性レクチンは、未肩にムＧ父はＬ−７コ
ース欠有するＳ蛋白、糖ペデタイにＳ噌實父は（及び）
糖類と４＃異同に結合するものであればよく、例えばＡ
Ｇ結合性レクチンとして＆Ｘ　ｈ’リコスマメレクチン
、オサゲオレンジレクチン、ヒリツクスポマテイアレク
チン、リママメレクチン、ダイズレクチン、バウヒニア
マメレクチン等ケ、Ｌ−フコース緒合性しク千ンとして
は、ミヤコグサレクチｙ　（Ｌｏｔｕｓ　ｔｓｔｒａｇ
ｏｎｏｌｏｂｕｇ　）（８ｒｔ、　Ｊ、　］（ｔｎｐ、
　ｐａｔｈｔ　、　３４．９４（１９５３））、ハリエ
ニシダマメレクチ７　（Ｕｌｅｚ　ｅｕｒｏｐｅｕｇ　
）（ｊ３０７ｄ　、　’Ｉ１．　Ｏ，１Ｌｎ（１８ｈｌ
ｒｐＨｌｉｇｈ、　Ｋ、　８１００ｅＬ、９．１１９５
（１９５４））等が挙けられる。 レクチンの儂繊剤としては、各種酵素、各槽螢光吻質及
び各種放射性物質等欠挙げることができる。酵素として
は、例えばグルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ
、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−だ
ラクトオキシダーぜ又はヘムオクタペプチド等の酵素の
活性フラグメント等が；螢光物質としては、例えばフル
オレセイン、フルオレセインスイッチオシアネート、ロ
ーダミン、ダンジルクロライタ（すなわち、５−ゾメチ
ルアξ）−１−ナフタレンスルフォニルクロライｒ等〕
等が：放射性物質としては１例えば１１１５１．１３１
１等の放射性ヨウ素、放射性トリチウム等が挙げられる
。 上記の標識物質でレクチンＹ＊ＲするＫは、後述でるご
とく、公知の蛋白質、例えば抗原又は抗体ケ酵素、螢光
物質又は放射性物に等でＩＩＡ鐵するのに開用されてい
る通常の方法欠用いることができる。 本発明方法ケ実権するには、先ず一定量の体液又はＴＡ
Ｇ分−にＩＩＩ鷹レクチン又はレクチン欠それぞれ添加
混合し、これｖ４５“Ｃ以下、好ましくは４〜４０−Ｃ
さらに好ましくは２０〜４０℃で反応させる。生成しＴ
こＴＪＬＧ−レクチンもしくはＴムａ−＊ａレクチン結
合体又は未反応のレクチンもしくは４１１Ｉａｌ、’ク
チン欠分喝する方法とじてをち時に限定はなく１通常の
分離手段ケ採用できるが。 例えばクロマト法、電気泳動法、塩析法１分画法、透析
法、ゲルロ過去、吸着法等、もしくはこれらの方法ケ組
合せた方法、あるいは寒天ゲル、アがロースゲル又はポ
リアクリルアミドゲル欠相りる分離法（特開昭５５−１
５１２６３号）も利用でとる。 更に詳細には、未反応のＳ磯又は非標熾しクチンケ分畦
する場合には１例えば上記反応液に糖蛋白−レクチン結
合体沈殿剤、例えばポリエチレングリコール、飽和硫安
、リパノール（アクリノール）１＄χ通当着加え遠心等
によって該結合体ケ除去する。遠心の条件は、用いる沈
澱剤によって１官選択することができ；例えばポリエチ
レングリコール欠使用した場合には、約１．０００Ｇで
６０〜６０分間遠′心ケ行うのがよい。 また、ＴＡＧ−標識又は非１ａ織レクチン結合体ケ分離
する場合には、例えば上記反応により生成したＴＡＧ−
＠繊父は非ＩＩＩ鐵レクチン結合体と未反応の１１．！
ＩＩ又は非砿鐵しクチンケ寒天デル、アがＯ−スゲル又
はポリアクリル了ミドゲルにｇける拡散速度の差を利用
して餓結合体ケ容易に分離できる。特に容器中１反応混
合物がゲル上にｇかれた場合、ＴＡＧ−レクチン結合体
は、拡散しないでゲルの表面上に残っているのに対して
、未反応のレクチンはゲルの中に拡散する。このように
、それらはお互いに有用な方、法で簡単に分離すること
がで會る。 核１’　ル（Ｄ　Ｉ４　ＩＩＩ　法ハ、４１Ｋｌｌｌ定
すｔＬ’）、：となく、通常の方法ン採用できる。例え
ば蒸留水、Ｐｌ′Ｉが約７．５のクエン酸もしくはトリ
ス塩酸緩衝液等の希釈液に４当量の寒天、アがロース又
はポリアクリルアミドケ加え、静かに攪拌Ｆ６０〜８０
℃（加１してｌ＠解させ、適当な容器、例えば試憤管に
入れ、放冷してゼリー状に凝固させる。ゲルの濃度は未
反応レクチン及びＴＡＧ−１１４レクチン結合体の大き
さく分子量、立体構造等）により選択される。該ゲルは
通常０．４〜２．０書Ｉｋ俤、特に０．７〜１・Ｏａｍ
％が好ましく、また、このゲルには必要により防腐剤ケ
添加してもよい。斯くしてｗ４襞されたゲルの表Ｉｉｉ
は、平面でもよいが、凹状にすれば生成しり腹合体が管
壁に付着しないので好ましい。 上記の如くして分離されたＴ　Ａ　Ｇ　−１ｌ１ａ又は
非ｊａ處レクチン結合体又は未反応の１ｍｌ鷹又は非標
識レクチンｔケ常法によって測定することにより、体液
中の７４０１％−算出できる。 反応によって消費されずに残存する非Ｓ職しクチンｔヶ
測定するには各種の方法ケ採用できるが、レクチンと特
異的に反応して凝集又は沈澱衛生ずる′Ｉａ實ケ加えて
、その時異変化ケ視覚で観察するかあるいは光学的分析
法ＫＪ：つて測定するのが好ましい。丁なわち、上記反
応＊ｖＯ−１５モルリン酸緩衝液、生理食塩水等の希釈
液で２倍希釈法で倍々希釈し、その一定量ｙｖ型、Ｕ型
プレート。 スライドグラス又は小試験管等に分注し、これにレクチ
ンとｔｐ＃真的に＃！集反応する物質χ入れて攪拌し、
これ欠４５℃以下、好ましくは４〜４０℃で６０分以上
、好ましくは６０〜９０分間放置して凝集の起るｉ＆終
又は最大希釈倍数ノ求める。この最大希釈倍数は＃巣価
として定−される。この発明にｇいて用いることのでき
るレクチン類は、実質的に同じ凝集価欠示す。 レクチンと、特異的に凝集反応する物質としては、ムＧ
又はＬ−フコース末端を有する糖贋白を挙げることがで
き、例えばムＧ結合性レクチンにはヒト赤血球膜サイト
リぜンＫ及びＲ，ブタ胃粘膜の硫酸化糖ペプチドＡ型、
ヒト血液型活性物質ＡＷアシアロ体、ブタ願下線ムチン
１＋型、７’／アロＧＭ１．ホリスマン抗原物質等のム
Ｇ末４を有する糖贋白ケ、父Ｌ−７コース結合性レクチ
ンにはヒト血液型活性物質り一部及びＩＩ−型、ブタ胃
枯４の硫朦化糖タンパク質Ａ型、ブタ胃粘膜の硫酸化糖
タンパク１ｌｌ）１（０）型活性、ヒト赤血球Ｒ１抗原
等のＬ−７コース末熾ケ有する塘蛋白ンコートさぜＴこ
セファデックス、ラテックス、がラスピーｆ等が開用さ
れる。 像鐵しクチン欠イ史用した場合のＴＡＧレベルの測定方
法はレクチンｇａａ物質にエリ適宜選択される。例えば
レクチンが酵素でｄｉ識されてｖ′ｈる場合には、比色
分析系あるいは螢光分析系の過当な酵素ｊＩｔ′ｊＩケ
過びそのｔ＃素活性χ瀾定することにより、樟慮物″成
が螢光物質であればその螢光強度ケ、放射性物質であれ
ばその放射−欠測定することによりＴＡＧ−ＩＩＩ處レ
クしン結合体量又は未反応の襟鷹しクチン量大醐足する
ことができる。 本発明の上記定量法ケ実施するのに特に便利な方法は血
清や血清のような体液中のτムＧｌ欠決定″′ｒるため
のキラトン便用する方法である。このようなキットには
ＴＡＧと％異的に結合するレクチン試薬有せしめる。こ
のレクチン試薬にをエグリセロールやウシ血清蛋白のよ
うな安定化剤及び／又は保存剤ケ添加することができる
。好ましくは、このレクチン試薬は凍結融鱗したもので
もよく、キットには水溶性もしくは水と混和しうる接媒
ケ含有させることもできる。さらにレクチン試薬には、
再構成された試薬系欠一定の−に保つための緩１ｍ液及
び／又は便用前に試料が悪化丁もの欠防ぐための保存剤
及び／又は安定剤欠添加ｊることができる。緩衝ｔはキ
ット試薬の必須成分とは考えられないが、本発明の定量
法ケ実施丁す際に−６〜７．８ケ便用するのが好ましい
。再構成剤は好ましくは水χ言んだものであるが、水の
一部又は全Ｗ６ン水と混和し得る溶媒で置き換えること
もできる。水と混和し得る溶媒は当業者には周知であり
、グリセリン、アルコール類、グリコール類、グリコー
ルエーテル畑が使用できるが、もちろんこれらに＠定さ
れない。溶剤又は希釈剤中のレクチンの量は、凝集価（
これは試料χ段階的に倍々希釈したときの最終又は最大
希釈によって定められる）、標識剤のＮ類又は測定しよ
うとする物質等によって選ばれるが、一般には、０．０
１〜１００〃９７シ、特に０．０６〜４０μｍ１／ＩＩ
ＬＩが好ましい。 上？標識又は非標識レクチン溶液は更に希釈してもよい
。 本発明の目的は、！に次（示す競合法又はサンドイッチ
法Ｙ利用することにエリ有利に達成される。 ■　測定しようとする体液中のＴＡＧ（以下、測定物質
と称する）と、一定量の不溶化された’ＩＧ父は不爵化
ＴムＣ）様物貰（以下、不溶化ＴＡＧ。 不漕化ＴムＧ様物質と称する）と欠、標識剤で標識され
たレクチン（以下、＊＊レクチンと称する）の一定量と
一合反応させ、次いで不溶化ＴＡＧ又は不溶化ＴＡＧ様
物質と標識レクチンとの結合体及び非結合標識レクチン
ン分噛し、その何れか一方の４１．ｉｌ剤活性ケ測定し
て測定物＠Ｖ定量する。 ■　８足物質と一定肴の標識剤で標識された’ＩＧ父は
ＴＡＧ様物質（以下、Ｉａ鷹Ｔ五Ｇ、標識ＴＡＧ様物ｌ
ｔｔと称する）大、一定量のレクチン又は不溶化されに
レクチン（以下、不溶化レクチンと称する）と−合成石
させ１次いで標識ＴＡＧ又は標識ＴＡＧ様物質とレクチ
ン又は不溶化レクチンとの結合体及び非結合標ＪＩＴ＆
（）又はＩｌｉ＊ＴＡＧ槽物’１ヶ分喝し、その何れか
一方の樟繊剤活性ケ測定して測定物質ケ定量する。 ■　測定物質と不溶化レクチンとＹ反応させてＴＡＧ−
不溶化レクチン複合体Ｖ形成させ、この複合体Ｋ１１ｌ
鐵レクチンの一足量ヶ反応させ、次いで複合体と＊＊レ
クチンの結合体及び非結合Ｉｌ繊レしチン欠分喝し、そ
の何れか一方の樟戚剤活性Ｖ＃Ｉ定して測定物質χ定量
する。 本発明において、ＴＡＧ様物質とはムＧ又はＬ−フコー
スン末膚に有するｌ１ｍ１導体Ｖ指称し１例えばブタ胃
粘膜硫酸化塘ペデチＹム型、ヒト赤血球膜サイ）　ＩＪ
ビンＫ及びＲ％ヒト血液型活性物質入型アクアロ体、ブ
タ瞑下職ムチンム十幸、アクアロＧＭ）　、ホリスマン
抗原物質等のＡＧＶ末ｇｓＫ有する糖誘導体、ヒト血ｔ
ＩＩｌ型活性物質ＬｅＬ型及びＬｅｂ型、ブタ胃粘膜の
硫酸化種タンパク質ム型、ブタ胃−粘属の硫酸化種タン
パク質１１（０）型活性、ヒト赤血球１１１抗原等のＬ
−７コースケ末端に有するＳ誘導体が挙げられる。 不漕化ＴＡＧ％本溶化ＴＡＧ様物質及び不溶イヒレクチ
ンは、ＴｋＧ、ＴＡＧ物質又はレクチンに不溶性担体ン
化学的又は物理的に反応させることにエリ製造される。 不−性担体としては、セルロース粉末、七ファデックス
、セファロース、ポリスチレン、Ｐｇ、カルボキシメチ
ルセルロース、イオン交」１旨、デキストラン、プラス
チ゛ンクフイルム、プラスチックチューブ、ナイロン、
ガラスピーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル
−マレイン酸共電合体、アミノ酸共重合物、エチレン−
マレイン酸共重合物等が挙けられる。不溶化は、共有結
合法としてのシア・１法、ペプチド法（酸アミドａ導体
法、カルボキシクロリド樹脂法、カルぜジイミド樹脂法
、無水マレイン酸誘導体法、インシアナート誘導体失、
Ａ化シアン活性化多１１体法、セルロースカルゼオート
誘導体法、−合試＃！ケ便用する方法）、アルキル化法
、架橋試薬による担体結合法＜９１ｍ試薬としてグルタ
ルアルデヒド、ヘキサメチレンインシアナート等ン用い
る）、Ｕｇｉ反応による担体結合法等の化学的反応：あ
るいはイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合
法；がラスビーズ等の多孔性ザラス欠担体として用いる
物理的吸着法によって行わによれば、ＴＡＧ等に対して
臭化シアン活性化担体１０〜１０００倍量大用いて、適
当な溶媒中０〜４０°０、好ましくは２０〜６０℃で２
〜４時間反応させることによって不溶化ＴムＧ、不溶化
Ｔ五Ｇ様物質、不溶化レクチン欠得ることができる。 また、不溶化ＴＡＧ等は、放射性重合法によっても製造
することができる。すなわち、テＡＧ等欠含む重合性単
量体の水性分散Ｒ欠′ｆ１４裏し、これに元又は電離性
放射線欠照射して誼単量体ケ重合してＴＡＧ等の重合体
！トリックスｗ＋Ａｌｌする。 そして、この水性分散ａｙＩＩ４製する手段として。 疎水性の重合性単量体〔ムコン水溶性重合体（Ｂ）０．
１〜５璽量暢の水＃１１ＩＩＬに分数させる、ある−Ｉ
工疎水性の重合性単量体（ｔｌと親水性の重合性単体〔
表〕ケ界面活性剤ＣＤ　］　０．０１〜５重量囁含む水
溶液に分散させる。このようにして得られた分散板に光
または電噛性放射−欠照射する時、分数値として存在す
る重合性単量体は重合してＴＡＣ）等の重合マトリック
スケ形成する。必要ならば過当な手段で、シート状又は
粒状に形成することができる。ここで疎水性の重合性単
量体〔ム〕の具体例としては、グリシゾルメタクリレー
ト、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレン
グリコールジメタクリレート、トリエチレングリコール
ジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタク
リレート、ポリエチレングリコール２００ゾメタクリレ
ート、ジプロピレングリコールジメタクリレート％　１
．４−デチレングリコールゾメタクリレー）、１．６−
ヘキサンゲリコールゾメタクリレート、メトΦシゾエチ
レングリコールジメタクリレート、メチルメタクリレー
ト。 エチルメタクリレート、ブチルメタクリレートもしくは
それらのアクリレートがある。一般的には水に不溶の単
量体で光もしくは放射４Ｉ照射によって重合する物質で
あればその種類は問わない。 親水性の重合性単量体

〔０〕の具体例としては２−ヒド
ロキシエチルメタクリレート、メトキシテトラエチレン
グリコールメタクリレート、メトキシポリエチレングリ
コール−４００メタクリレート、メトキシポリエチレン
グリコール−１０００メタクリレート、ポリエチレング
リコール−４００ゾメタクリレート、ポリエチレングリ
コール−６００ジメタクリレート、メタクリル酸、アク
リルアミド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドンもしくはそれ
らのアクリレートがある。一般的には水に可溶な単量体
で、かつ光もしくは放射線照射によって重合する物質で
あればその種類は問わない。 水溶性の重合物（Ｂ）の具体例としては、ポリビニルピ
ロリドン、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、ポリビ
ニルアルコール、ヒｒ口キシデ口ビルセルロース、アラ
ビアデム、など？例示することができる。 界面活性４Ｊ　（Ｄ　）の具体例としてはラウリル硫酸
ソーダ、オレイン醗カリ、オレイン酸ソーダ、ソルビタ
ンモノラウレート、フルビタンモノステアレート、ソル
ビタンモノオレエート、プロピレングリコールモノラウ
レート、オレイン酸、ドデシルベンゼンスルフオン酸ソ
ーダ塩など欠測示すりことができる。しかし、それらの
ミセルの中に重合性単量体もしくは重合性単量体中に溶
解しているＴＡＣ等がとりこまれるならば、その種類は
全く問わない。 放射性物１４１處Ｔ＆Ｇ、同Ｊｆ／Ａ識ＴムＧ様物質及
び同標識レクチンは、上記ＴＡＧ等に例えば１露６エ、
１３１工等の放射性ヨードヶ導入することによって製造
される。放射性ヨードの導入は、通常のヨード化法、例
えばクロラミ／Ｔ？用いる酸化的ヨー−化法［Ｎａｔｕ
ｒａ　１９４．４９５１（１９６２）。 Ｂｌｏｃｈｓｍ、Ｊ、　１３９　、１１４頁（１９６３
））によって行われる。丁なわち、適当な溶媒、例えば
…６〜８の＊＊ａ、好ましくは０．２Ｍリン酸緩衝液（
ｐ）１７）中で、クロラミンＴの存在下、室温付近にて
５〜６０秒行われる。使用される放射性ヨード及びクロ
ラミンＴは、上記ＴＡＧ等に含まれるチロシン分子１ナ
ノモルに対し、夫々１〜５ｚリキューリー、１０〜１０
０ナノモルが好ましい。 このようにして標識された標識ＴＡＧ等は通常の方法で
単ｍ樗裏し、必要ならば凍結乾燥して保存しておく。 酵素１１１ｆｉＴＡＧ、同１ｉ繊丁五Ｇ様物質及び同樵
鐵レクチンは通常のカップリング法、例えばＢ、？。 １！１ＲＬＡＮ（）ＩＲ等（ＡＯｔＳＬ、　１ｌｎａｏ
ｏ１−１ｎｏ１．８ｕｐｐ１．　ｌ　１６Ｌ２０６　（
１９７２）］及びＭ、１１．　ＫＡＲＯＬ等［Ｐｒ０ａ
。 ＮＩＬｔ、　Ａ（Ｂａｄ、　８ｃｉ、　ｔｔ、ｓ、ム、
　、　５７　、７１５　（１９６７））の公知の方法に
よって婁透される。丁なわち、ＴＡＧ等と酵素火Ｎ＆Ｉ
Ｏ朱等の酸化剤の存在下、−４〜６の緩衝液、例えば１
ｍＭ酢霞酢漬緩衝液）１４．４）中で、室温付近で２〜
ら時間反応させ１次いで１１！ＬＢ１４等で還元するこ
とによって行われる・酵素はＴＡＧ等１モルに対して１
〜３モル量用いる。酸化剤はＴＡＧ＊の１００〜３００
倍モル。 還７Ｃ削は酸化剤の１〜２倍モルが好ましい。 螢尤物１ｔａｌｉ鷹ＴＡＧ、同標識ＴＡＧ様物質及び１
１（１！鷹レクチンは、公知の螢光物質、例えばフルオ
レツセインインチオシア＄−ト（Ｆ工Ｔｏ）。 テトラメチルローダミンイソチオシアネート（Ｒ工’ｒ
ｅ）等？、Ｐｌ″１６〜８の水又は生理食堪水甲、０〜
室ａ、好ましくは室温にて、’１’ＡＧ等と０．５〜６
時間反応させる（壷元抗体法、医化学実−法−座、Ａ４
，２６６〜２７０頁）。使用する壷７を吻實の縫はＴＡ
Ｇ等の１０００重量が好ましい。 次に、本発明の一合法及びサンドインチ法による測定法
ケ説明する。 両方法ともに、反応は適当な溶媒中、４５ｃ以Ｆ１好ま
しくは４〜４０’Ｏ１更に好ましくは２０〜４０″Ｃの
温度で行われる。該溶媒としては。 ＴＡＧ、ＴＡＧ様物質とレクチンの反応忙悪影響ヶ与え
ないもの、例えば水、生理食塩水、帖〜０３Ｍト　　リ
　　ス−ｔＸ　ｆｌｌｍｍ　　液　（ｐ）ｆ＃７．５）
　　、　　　０．１　　　Ｍ　　　リ　　ン　酸緩備液
（…”＝　７．４　）等の−が６〜７．８の緩衝液が好
ましい。反応時間は５〜４０時間、好ましくは１５〜２
５時間で行われる。 反応によって生成し７；ｚＴＡＧ（ＴＡＧ様物質）−レ
クチン結合体と未反応レクチン又はＴＡＧ（ＴＡＧ４ｍ
！物質）との分離は自体公知の方法によって行われる。 丁なゎち、不溶化ＴＡＧ（ＴＡＧ様物質）、不溶化レク
チンを使用したときは、固相と液相欠分ｌ１ｍ（遠心分
離、Ｐ別、デカンテーション）すればよく、伽の場合に
は前述の方法によって分離される。 斯くして分離されたもののＩｌ繊剤活性は、その１ａ鐵
剤の楢類によって、前述の如くａ定し、これから測定物
質量ケ求めることができる。 叙上の如く本発明によれば体液中のＴ　ＡＧ＋ｙ有利に
定置できる。そしてこのＴＡＧ量を知ることＫより初期
から末期の何れの癌も診断することができ、時に癌の早
期発見に極めて有用である。さらに本発明方法は糖側鎖
ｖｓ定しているので、従来の主として蛋白部分を測定し
た抗体利用系（αｌ−７エトデロテイン、ｏＢム等）よ
り広い５ａＣ１何れの癌、例えば悪性リンパ性白血病　
　悪性リンパ腫、悪性繊毛上皮癌、肝帰、胆のう癌、す
い癌、＃癌、胆管癌、甲状腺帰、多発性骨髄腫、胃癌、
乳癌、結腸癌、直腸癌、ｍ：１１１ｖＩＩ癌、卵巣癌、
口腔癌、舌癌、喉ｌｌｉ癌、前立腺癌、脂肪肉腫、悪性
黒色線、子ｇ＃１％′ｆ４原発肉鑵等の癌の診断に利用
できる。ｆたＩｔ！［ｆるレクチンにより、それぞれ定
量するＴ　ＡＧＫ、特異性ケ有し１例えばムＧ結合性し
クチンケ便用する場合には、轡に悪性リンパ性白血病、
悪性リンパ腫、悪性繊毛上皮癌等の刺矧駕肩の癌の診断
に好適である。 −に、本発明の五Ｇ結合性レクチン及びＬ−７コ一ス結
合性レクチンケ用いた癌の診断法においては、従来の癌
診断法、例えば、α、−７エトプロテイン、ＯＥム等の
測定による診断法に比較して癌以外の疾患、例えば肝硬
変、肝炎、胃潰瘍、糖尿病、大腸炎等に対して交叉性が
極めて低いというｓａｙ有する。すなわち、上記従来法
においては、４！Ｉ以外の疾叡、時に肝硬変、急性及び
慢性肝炎等の肝疾患に対しては、ｖＭめて高込陽性率ケ
示し、Ｎｈの診断に多大の困惑ケ与えて＾たが１本発明
方法によれば、それら肝疾患に対しても交叉性が低く、
癌の適格な判断が可能である。 （にまた、本発明によれば、ムＧ及び／又はＬ−７コー
スを末趨に有する糖類、塘ペデタイド、糖蛋白、糖脂質
、塘テルペン、檀ステロイｒ等の糖鱒導体を定量するこ
ともできる。 以下実施例欠挙けて説明する。 実施例１ ＋１７　　ベルオキシダーぜの活性化：ペルオキシダー
ゼ（西洋わさび）５智ＪＱ、３Ｍ炭酸水素ナトリウム水
溶液１１１４に溶解した。これＫ　Ｏ，１Ｍフルオロジ
ェトロベンゼンエタノール溶液０．１１Ｌｌｙ加え、室
温で’ｉａＰ間靜かに攪拌後、Ｑ、Ｑ　６Ｍ　ｌｌａ工
０４　ｆｔｊｌｆｌｔ　１　ｓｌｙ加え室温で５０分間
静かに攪拌した。更に０．１６Ｍエチレングリコール１
ｄｖ加え室温で１時間靜かに攪拌した。次いで０．０１
Ｍ！酸−炭酸−素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）Ｖ用
いて４℃で一昼夜透析した。 ＋１）　　レクチンのペルオキシダーゼ標識法（トリコ
スマメレクチン−ベルオキシダーｅ）：トリコスマメレ
クチンＳ　Ｉｋｇ欠（ＩＩで得た活性化ペルオキシダー
ゼ３ＩＬｌに溶かし、靜かに攪拌しながら室温で２〜３
時間反応させた。これＫ　ＮａＢＨ４５ＩＩ９ｖ加え、
４℃で６時間反応させた。次いでこの＃ｌＩＷケ０．１
　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ）（７，４）に対して一
昼夜透析し、セファデックスＧ１５０ゲルカラムクロマ
トグラフイー（ｌＦｌｆｊ液：　０．Ｉ　Ｍ　）リス−
ｔｌ［＃４１衡液、ｐＨ７，４３でゲルロ過欠行った。 各分−ｖｏＤｇｓｏ　％　０Ｄ４０１！で測定し％　”
１！１０と０Ｄｉｏｓの直なるピーク欠集めた〇 （−）　　レクチンのペルオキシダーゼ檄繊法（ミヤコ
グサレクチンーベルオキシダーゼ）： ミヤコグサレクチン５１ｖｖ（１）で得た活性化ペルオ
キシダーゼ３ｄに溶かし、靜かに攪拌しながら室温で２
〜３時間反応させた。これにＮａＢＩＩ、　５４ケ加え
、４℃で３時間反応させた。次＾でこの溶液ケ・０．１
　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（…７．４）Ｋ対して一昼夜
透析し、セファデック“スＧ１５０ゲルカラムクＯマド
グラフィー（溶出液：　０．Ｉ　Ｍ　）リスーｔｉｌｌ
緩貴液、　ｐＨ７，４）でゲルロ過欠行った。各分ｍ　
Ｙ　ＯＤ＊ｓｏ　ｓ　Ｏ”ａｏｓで測定し％”１１１０
とｏＤａｏｓの重なる−一り欠集めた。 ｈｌ　　不溶化レクチンの製造法： ｏｍｓｒ−活性化アがロース１ｓｔｉｖ３ｇの０．００
１Ｍ４１１に懸濁し、３０分間静置した後ガラスフィル
ター上で、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐｉ−１８，
５）１１で洗浄した。全体で約５０４の容量の活性化セ
ファロースが得られた。これＶｏ、１Ｍｊｌｅ酸水素ナ
トリウム（ｐｉ’（８−５）２００ｄＶＣ畷濁し、トリ
コスマメレクチン５０Ｉｖχ言む０．０１　Ｍリン峻堰
緩衝液（ｐＪ４７．７　）　５ｊｖ加え、室温で時々攪
拌しながら２時間反応させに。反応後、反応ｍｙがラス
フィルター上で洗浄し、反応物７１モルのモノエタノ−
ルアきン溶液２００ｄ（ｆｌ）１８−５）に加え、室温
にて２時間反応した・次めでガラスフィルター上で洗浄
した。洗浄法としては、０．１輩酢酸緩衝液（０−５Ｍ
　Ｎａ（１／　ｙ含む）１１と０．１Ｍホウ酸緩衝液（
０−５Ｍ　Ｎａｃｌ　Ｙ官む）１１で交互に３［１洗浄
した。 ｔＶ）　　不溶化レクチンの製造法： ＣＭＢｒ−活性化アがロース１５ｇｙ５１の０．００１
Ｎ項酸に４１ＩＩＬ、３０分間静置した後ガラスフィル
ター上で、０．１ＭＲ酸水素ナト１」ラム（ｐＨ８，５
）１１で洗浄しに０全体で約５ＱａｖＪの容量の活性イ
ヒセファロースが祷られに０これｖｏ−ｉｎｓ酸水素ナ
トリウム（ｐ）１８−５）２００ｍｊに憑濁し、ミヤコ
グサレクチン５０〜Ｖ言む０．０１　Ｍリン酸塩緩衝順
（−７，７）５１１４欠加え、室温で時々攪拌しなめｘ
ら２時間反応させた。反応後、反応液Ｘがラスフィルタ
ー上で洗浄し、反応物欠１モルのモノエタノールアミン
溶液２００＋１７（−８，５）に加え、室温にて２時間
反応した０次いで、ガラスフィルター上で洗浄した。洗
浄法としては、０．１Ｍ酢酸緩衝液（０，５Ｍ　ｕＩＬ
ａｌケ含む）１！と０・１Ｍホウ酸緩衝液（０，５Ｍ　
Ｎａ０ｊ　Ｙ含（ｒ）１１で交互に３回洗浄した。 ｔＶｌｌ　　丁ＡＧ様物質の葵造法： ０．０５　Ｍリン酸塩緩ｌＩ液（ｐ）１７．０）１００
１１１１にブタ四帖ＩＩ［硫酸化糖蛋白（以下ＰＧＭと
略丁。）１ｇｖ１１！！濁し、Ｉ　Ｎ　Ｎａ０ｊｉ水溶
液ｙｒｍ下して−１１に調整した。室温で６０分間攪拌
後、３００゜ｒｐｍで１０分間遠心分瑞し、上澄ｙ　１
Ｎ　ｌ１０１溶液で−７，０に調整し、再び５０００　
ｒｐｆｆｌで１０分間遠心分離した。上澄欠０−０１　
Ｍ　＋）ンｉＩ２壜緩衝液（−７・０　）１０１に対し
て終夜透析して、ｎ製ＴＡＧ様物質（ｆｆｌｌＰ（）Ｍ
　）ｖ得ｒ＠−標識ＴＡＧ様物質の製造法： ｔａ）　　酵素による＠ｉｌ！（ＰＧＭ−ペルオキシダ
ーゼ） ４岬の山菜（ワサビ］ペルオキシダーゼ（ＪｉＲＰＯ）
　（０，１μＭ　）？蒸留水１１１ｊＫ＃ｌ解しｒｓ６
　コれＫ　Ｏ，Ｉ　Ｍ　ｌｌａ工０４０−２ｍ１　ｙ加
えて室温にて２０分間攪拌し、１ｍＭ酢酸緩衝ｆｉ（ｐ
）１４．４）Ｋ対して一昼夜透析して未反応のＮ＆工ｏ
４ｖ除去し−この透析反応液に０．２　Ｍ　Ｒ醸水素堰
Ｊｌｌｌ液（ｐ）１９．５）欠約６０μｍ１１度加えて
ｐＨ９，０Ｋ　ｍｌ整した。 次いで、ただちに０．０１　Ｍ置酸水素塩緩衝Ｍ（−９
，５〕にｆｌ解したＰ　Ｇ　Ｍ　（１’１．Ｑ■／ｙｄ
　）　０．６ｄｗ加えて室温で２時間１合し、ＡＩｋＦ
ＩＩ／ＷＬｌのＮａＢ−蒸留水溶液０．１ｍｌケ加え、
４℃で２時間静置した。 −［０，０１Ｍリン酸緩衝液（南７．２）に対して一昼
夜透析後、セファデックスＧ−２００（１，５ｘ１５０
Ｃ１ｌ）にて溶出して楕裂ＰＧＭ−ペルオキシダーゼ（
ＰＧＭ−ＦＯＸ　）欠侵た。ゲル溶出液は％＊５ａｌず
つ集め、各溶出ｆｆ！、はｏＤｇｓｏ、Ｏ”４０３で吸
収を測定した。 ｌｂｌ　　アイソトープによる標識（Ｉｇ’４−ＰＧＭ
）：１ｍ＋１１でクロラミンＴＶ用いる酸化的ヨード化
法にてＰＧＭケｌＩ１歳する。 ＰＧＭ　　　ｌ　　　［］　　　μｇ　ラ一　０．２　
　Ｍ　　　リ　　ン　酸＊＊ｆｆ　　（ｐ）ｌ　　７・
０）５０μｌｃ溶解し、これに１ミリキユーリーのＮ”
”’Ｉ　（１５１体二’−ｚ＝　）　１０　ｐｉとクロ
ラミン〒５０μｇ／１００μｌ　Ｏ，２Ｍリン醗塩緩衝
ＰＩＬケ加え、室温で６０秒間混合後、Ｎａｓ＆１０５
１００μｇ／１００μＩ　Ｏ，２Ｍリン酸堪緩（ｌＩ液
ケ加え温容し１次いでＮａ１Ｊ”Ｉ　％’　Ｉ　Ｉｖ加
えて混合した。−に優られた１２ｈニー　Ｐ　Ｇ　Ｍｙ
セファデックスＧ−５０（１ｘ３０ｃＩＫ）にて精製し
た。このようにして飼養された１８６１−　Ｐ　Ｇ　Ｍ
はほぼ１〜２μ０１／μｙの放射性ケ有していた。 −定量法 １０ｘ７５鵡のがう文管欠用いて、前記−で得られたｚ
ｇａニーＰ　Ｇ　Ｍ　（１００ｎ９０．１７　ｔｔａｌ
：２−４　ｘ　１０’　６ｐＨ）　０−１　ｄ、　ｆｌ
ｉｌｊｅ（ｖｌｌテ得らｆｕｌｌａｍ準Ｐ　Ｇ　Ｍ　（
０−１ｓｆｉ　／ｄ、　０−２　ｐｉ　／ｄ、　０．５
μＩ７Ｍ１．　１μｍ１／Ｉ１１．２．５縛／ｄ、５縛
／ｉｌ。 １０４／Ｍｌ）０．１ｍ？、ＦリコスマメＬ／　りｆ　
ｙ（１０ｓｌ、／ｄ　）　０．１ｉ１Ｊ＄ｉＣヒ０−０
５　Ｍ　ＩＪ　ｙｌｌｌ衝液（０−１５ＭｍａａＪ、ｏ
、１ｓＢ８Ａ、０．０２％ＮａＮ、　）　０−２ｗＪＹ
混合し、２５℃で１時間インキュ／（−）Ｌπ。反応終
了後、トリコスマメレクチン（Ｄ　Ｂム）に結合したＩ
ＩＩニーＰＧＭとＤＢムに結合していなｚｌ１８ニーＰ
ＧＭＶＣ１５１，トリコスマメＥ／　ｌ　チｙ家兎血清
（１，Ｙ、　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ社製＝１０倍希釈液
）０．１１Ｌｌ￥加えて２５℃で１時間インキュベート
した後４℃、３０００　ｒｐｍで３０分間遠心分離した
。沈渣（ＤＢ直に結合した１１１５！−ＰＧＭ）のカラ
ン）！針歯して標準曲線χ作成しｙ：（第１図）。この
結果から明らかな様に通常−ｎｏｕｎａ　（Ｂ　７　Ｔ
　）　ハｌｋ常２ｏ〜２５ｔｓで、５０１１阻害率は０
．０６μｆｉ／ａｔであった。 蚊；　定量法 １１０Ｘ７５ｊ１のがラスｆｖ用いて、前ＩＩ！四で得
られｙ、＝１ｇ５ニーＰＧＭ（１００ｎｇ０．１７．ｇ
ｏｉ＝２．４Ｘ１０′Ｓｃｐｍ　）　０．１　ｄ、前記
（四で得られた椙裏榛準ＰＧＭ（（７，１μＩ／ｉｌｌ
、０．２μｍ７ａｔ、１μＩ　／ｍｌ。 ２．５μｇ／ＩＩＩ、５μｇ／１１．１０μ９／１ｄ）
０．１１１１、ミヤコグサレクチン（１０μ、ｌｉｌ／
ｄ）Ｑ、１ｗ１ｌおよび０．０５　ＭリンＩＩ２緩衝液
（０，１５Ｍ　ＮＩＬ（ｊ　、　０．１％Ｂ８ム、０．
０２　％　Ｎａｐｓ　）　０−２１１７　Ｙ　Ａ合し、
２５°Ｃで１時間インキュベートした。反応終了後。 ミヤコグサレクチンに結合し、、ｘｉｓニーＰＧＭとミ
ヤコグサレクチンに結合していなｔ／％１ｊｌｊニーＰ
ＧＭに抗２ヤコグサレクチン家兎血清（１，Ｙ、　１ａ
ｂｏｒａ　−１、ｏｒｙ社１１：１０倍希釈液）０．１
１ｊｖ加えて２５℃で１時間インキュベートしπ後り℃
、３０００ｒｐｆｆｌで３０分間遠心分離した。沈渣（
７ヤコグサレクチンに結合しｙ、：１２６工−ＰＧＭ）
のカウントケ１ｔｔｌｌｊして標準曲線ケ作成した（第
２図］。この結果から明らかな樟に、通常％　Ｂｏｕｎ
ｔｌ　（Ｂ　／　Ｔ　）４１通常２０〜２５％で、５０
ｑｋ阻害ＩＣ＋Ｘ　Ｏ，６ｔｉｌｌ　／−であった。 （×１　　不溶化ＴＡＧ様物質の調１！（ＰＧＭ−不溶
化シートのＩＩＩｊｌ）： 過剰量のＰＧＭχ０．０１　Ｍリン酸塩緩ｔｉｆｆ１＜
　、Ｈ７−０）１００１１７に加えて、Ｊｌ濁１９Ｉケ
調製した。このものに０．０１　！ｉ　１ｉｌＬＯＨ１
ｌＩｌ加えて一欠約１１にｄＪ４！Ｉｋシ、３０００　
ｒｐｍで２０分間遠心分離し上ｆｙ回収した。この上澄
に０．ｏ　５　Ｎｈｏｚ　ｖ＠下して一１ｆ１ｆ７．０
にｓｌ整し、再び３０００　ｒｌ）ｍで２０分間遠心欠
行なった。上澄？０．０１ＭＩＪン酸１緩衝液（ｐ）１
７．０）に対して透析したものｙ　Ｐ　Ｇ　Ｍ　＠筐と
した。このものの糖及び蛋白含量は、糖についてはフェ
ノール硫酸法でグルコースｖＩｍ準としてヘキソースが
５〜７ダ／ｉｌ、蛋白についてはＢ８ムを標準として醐
足した結果１ゴ２８９７ｄであり。 以下の放射線１合（Ｒ工Ｐ）Ｋ供する。 放射線重合は単量体としてヒドロキシエチルメタクリレ
ート（ｌｉｌｅＭム）と上記ＰＧＭ溶液を３３：６７の
割合で滉合し、１ｃＩＩＬｘ１５〜２０１のがラス管に
入れ、急速に一７０℃以下に凍結した。次いで１ｘ　１
Ｑ’　ｒａｄのｒｍｍ照射性ない単瞳体ン重合した。各
々の固定化されたＰＧＭ材料はこの電合体の樟欠１０虜
ずつ切って１枚ずつのディスクとした＠ −不溶化ＴＡＧ様物質の製造法： □ｓｉｒ　−ｒｔｓ性化老化セファロス４Ｂ（ファリマ
レア社Ｗ）１５ｇ（乾燥型ｔ）ケ６１の０．００１　Ｎ
１＃にａ禰し、６０分間靜置後がラスフィルター上で［
）、ＩＭＩＲ酸水素ナトリウム（Ｊ８．５）１／で洗浄
すると、約５０ｄ各曖の活性化セファロースが侍られた
。これケ０．１　Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＪ−１８，
５）２００１１１７に憑４し、ＰＧＭ５（］ダヶ言む０
．０１　Ｍリン酸基緩衝液（ｏＨ７，７）５’ｌｌｊケ
加えて、室温で時々攪拌しながら２時間反応させた。 反応終了後１反応液ケがラスフィルター上で洗浄し、反
応物ケ１Ｍのモノエタールアミ７溶ｆｆ　（ｐＨ８，５
）２００ｗＬｔに加え、室温にて２時間反応した。 次いでがラスフィルター上で洗浄した。洗浄法として）
Ｘｏ、ＩＭｆｆｊ峻緩ｖＲ液（０，５Ｍ　ＮａＯ＃　”
？含む）１１と０．ＩＭｙｌｔつｉｌ媛嚢液（（１，５
Ｍ　ｈａｃ／　ｖ言む）１１で交互に３回行う。 艶）不溶化ＴＡＧ様物質の調ＩＩ（ＰＧＭ−ビーｔの調
ＩＫ）： ポリスチレンビーズ（直後６−４　ＭＪＬ　；　Ｐｒａ
ｃｌａｌｏｎＰｌａｓｔｉｃ　Ｃｏ、　Ｌｔｄ、　Ｕ１
３Ａ　）　１万１ｍｌ？希釈Ｌ　７．ＨＹ　Ｗレモ声　
〔ライオン（株）、鳳！　１．５１１／／　１１１［水
〕でよく洗浄し、更に蒸留水で洗浄しに０久いでこれケ
０．５Ｍ苛性ソーダ水＃！液中に６日間浸漬した後、洗
液が一約６になるまで蒸留水で洗浄しｙ、：、１ＯＮ−
苛性ソーダ水溶液でｐ）１４．５にＡ１１ｌ豊しｙ：５
ｏｍｕ−ａｍ緩衝液の３５ｗ／ｖ賜ｐＧｎ溶液２．５１
に上で洗浄したビーズ１万１ケ加え、約１３　ｒｐｍで
２４時間攪拌した。ビーズヶ戸取し、これケ蒸留水でよ
く洗浄しｙ、：　（８１ｘ　４　）。これケグルタルア
ルデヒド１Ｖ　／　Ｖ　ｑ＆の５０　ｍＭ　−＋７ン酸
ナトリウム媛＠液（ｃｌＨ７）２．５７に加え、１０　
ｒｐｍで２時間攪拌した。ビーズＶＦ取し、前記と間際
にして蒸留水でよく洗浄した。このビーズ１万＠ｖｉｍ
−グリシンの５　Ｑ　ｍＭ−リン酸ナトリウム４＠液（
ＩＪ）（２，０）　２．５１に加え、１０ｒｐｍで２侍
間攪拌した。ビーズ欠Ｐ取し、蒸留水でよく洗浄し、３
７℃で一夜乾燥してＰＧＭ−ビーズ′ｌ￥得た。このビ
ーでの表面糖ンＱｒＯ１ｎｏ１−硫酸法［Ｍ、　８ｃｈ
′ｏｎｅｎｂｅｒｇａｒら：　Ｚ、　ＰｈｙｓｉＯｌ、
　Ｏｈａｍ、。 ３０９．１４５（１９５７）］で測定したところ、２．
７±０・２μｇＰＧＭ／ビーズであった。 実施例２ （１１＃慣試料の調製 谷橿纏患者、非悪性疾患及び健康人より、へ７マリン（
５００単位）処理しに注射器で５ｄの血液ｖｇ取し、２
０００　ｔ”ｐｍで１０分間遠心分＊ｆｌｋ。 その上澄ケとり被検試料とした０ ＋ｌｌ　　ｍ定力法： （１）で得た試料０．１−に等容のトリコスマメレクチ
ン−ペルオキシダーゼ１０μｇ／−の０．１５　Ｍリン
＃緩衝液溶液０．２ｄ及びＰＧＭ−不溶化シート一枚ケ
加え、良く攪拌して２０〜３７℃で２４時間反応させた
。この反応溶液中のＰＧＭ−不溶化シートンよく洗浄後
ＰＧＭ−不溶化シートに結合したトリコスマメレクチン
−ペルオキシダーゼ活性を過酸化水素を基質及びオルト
フェニルジアミンを発色試薬とした酵素活性測定法でＯ
Ｄ４１１ｍより測定した。同時に前記サンプルを各種濃
度の標準物質（ＰＧＭ）にかえて、検量線を作成した結
果を第３図及び第３′図に示す。第３図のＴＡＧ−Ｄ値
はＰＧＭをＬ−ヘキソース等量として第６′図のＴＡＧ
−Ｄ値はＰＧＭをＮ−アセチルガラクトサミン等量とし
て表示した。 （ＩＩＩ）結　果： 第３図で示される標準曲線を用い上記の測定結果を第４
図に示した。第４図に示される通り健康人では全例１１
　ｎ　ｍｏｌｅｓ　／−以下のＴＡＧ−Ｄ値が得られた
。 実施例３ （１）アガロースゲルの調製； アガロース（岩井化学社製）を１Ｗ／Ｗ％になるように
α０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ＰＨ７，５）に懸濁し、
７０〜８０℃で加温溶解させ、これＫａｏ１ｗ／Ｖ饅の
チメロザールを添加する。傅−れた溶液を１−ずつ試験
管に分注し、室温に放置して、１ｗ／ｗｌのアガロース
ゲルを調製する。 （１）測定方法： 試料者２００μｔを２本の試験管に分取し、これにペル
オキシダーゼ標識トリコスマメレクチン〔レクチンとし
て五５μｔ／ｄ、［１１Ｍ　トリス−塩酸緩ｌＩ液（ｐ
Ｈ＃　７．５　）　）　ｔ−ツレ−ｔ’し５０ｐＬずつ
添加した。軽く攪拌して混和後２０〜６０℃にて１時間
静置反応させた。 その後、上記２本の試験管の一方（検体Ａ）に１１Ｍト
リス−塩酸緩衝液にて８チ（Ｗ／Ｖ　）にｄｅ製したポ
リエチレングリコール（ｍｗ６０００　）溶液２５０μ
ｔを、他方（検体Ｂ）Ｋ０１Ｍトリス−塩酸緩衝液２５
０μｔをそれぞれ加えて軽く混和させた。検体Ａ、Ｂ共
に２０〜′５０℃にて３０〜６０分関靜置反応装せた俵
、スイング型ローターを用いて１０００ｘｆ、４０〜６
０分間遠心分離した。上澄液５０μｔを静かに分取し、
予め調製してあった２−の生理的食塩水に加え十分に攪
拌混和させた後、ベルオキ７ダーゼ基質液（以下［基質
液」と略記）５００μｔを添加し、２０〜３０Ｃの暗所
にて６０分間反応させた。尚、基質液としては１１Ｍク
エン酸−リン酸緩術液にオルトフェニレンジアミン及び
過酸化水素水を各最終濃度６−及びｃＬ１９ＩＩとなる
様に添加したものを使用した。 また、基質液は使用前に調製し、使用時まで４℃にて保
持することが望ましい。反応後、２規定塩＃１−を添加
して反応を停止させ、その発色を分光光度計を用いて波
長４９２ｔ＋ｍの吸光度によって測定した。 検体Ｂの吸光度（ｂ）より検体人の吸光度（＆）を差し
引いた値（Ｃ）をＴＡＧ結合レクチン量としこれをプロ
ットした。その結果は第５図に示される如くである。尚
、図中○は健康人をｓ　（ｔ）　ｅ　（１）は肝癌患者
。 （３）は悪性リンパ性白血病患者を意味する。 第５図に示される如く、健康人より高いＣ値を示す試料
は、血漿中のＴＡＧ量が多い事を意味し。 これより被検者に癌細胞が存在することが示唆される。 （ｊｉＤ　　サンドインチ法を用いる方法：１μＶ／−
〜１０μ？／−のＰＧＭを溶解した１０５Ｍリン＃塩緩
衡液（ｐＨ７，０）　１００ｔｓｔにトリコスマメレク
チン−アガロース２００μｆを加ｊ、２５℃で攪拌下、
１時間インキュベートした。次〜１で［１０５猛リン酸
塩緩ＩＩ液（ｐＨ７，０）で６回洗浄後、実施例１（−
）で得たペルオキシダーゼで標識したト。 リコスマメレクチン６μを及び１０５Ｍリン晶衝液（ｐ
Ｈ７，０）１００μｔを加え、攪拌しながら２５℃で１
時間インキュベートした。３０００　ｒｐｍで１０分間
遠心分離した後、沈渣を回収し、１０５Ｍ　ＩＪン酸塩
緩衝液（ｐＨ７，０）で３回洗浄し、０−フェニレンジ
アミン６０ηに（１２Ｍ−マクレビン緩衝液（ｐＨｓ、
５）２ｏ−を加えて溶解し、更に最＃！＃度［ＬＯ２Ｖ
／Ｖ−のＨ，Ｏ，を加えて攪拌シテ。 発色試薬を調製した。 試験管に生理食塩水２−及び上記発色試薬５００μｔ　
を加え、次いで上記ビーズを入れて、室温で３０分間イ
ンキュベートした。６Ｎ−塩酸１−を加えて酵素反応を
停止させ、４９２ｎｍで吸光度を測定した。その結果を
第６図に示す。 −競合法を用いる方法： 試料（前記実施例２−（１）０被検試料）１００μＬを
試験管にと夛、最終浸度α２２Ｗ／Ｖ１４’ラチン、５
ｍＭ−０＊ＯＬ＠、５蓋Ｍ　−ＭｇＯ１ｓのα３Ｍ）リ
スー塩酸緩ＩＩ棟（ＰＨ７，４）５００μＬを加える。 これにＰＧＭ−ビーズ（前記実施例１−（ｘｌ）で調製
した不溶化ＴＡＧ様物質）１個を加え、更にトリコス！
メレクチ／−ベルオキシターゼ（前記実施例１−（−）
で調製した凍結乾燥標識レクチン１−／上記トリスー塩
酸緩衝液ＩＬ）１００声ｊを加え、攪拌した後４℃で４
８８時間インキュベートた。アスピレータ−で反応液を
吸引除去し、生塩食塩水２−を加え、ビーズを洗浄し、
洗浄液を吸引除去した。この操作を３回縁ヤ返した。 ◆−フェニレンシアζ７６０ＭＩＫα２ｋｉ−マタレビ
／緩衝波（ｐＨａ８）２０ｍｇを加えて溶解し、更に鍛
終盪１αｏ２ｖ／ｖｌのＨ２Ｏ，を加えて攪拌して、発
色試薬を調製した。 試験管に生理食塩水２−及び上記発色試薬５００μ区を
加え、次いで上記ビーズを入れて、室温で３０分間イン
キュベートした。３Ｎ−塩酸１−を加えて酵素反応を停
止させｓ４９２ｘ１ｍで吸光度を測定した。 同様にして、前記試薬の代シに各種濃度の標準物質（Ｐ
ＧＭ）を用いて吸光度を測定して検量線を作成した（第
７図）。 この検量線を使用して、実施例２−（１）で得た試料中
のＴＡＧを測定した結果は第８図のとおりである。 実施例４ （１）　　競合法を用いる方法： ディスク（前記実施！１１−（支）で調製した不溶化’
ｆ’ＡＧ様物質）１枚をイヤコグナレクチンの結合した
ペルオキシダーゼ（１１１１記実施例１−替で調製した
標識レクチン）５０μを及び試料（各種濃度のｐ　ＧＭ
　）　２００ｘｊＫ入れ、２５℃で２０時間インキュベ
ートした。そのディスクをＰＢＢで洗浄し食塩水２．Ｏ
ｗＩｔＫ入れ、ペルオキシダーゼ物質［１５−を添加し
て２５℃で１時間インキュベートした。 次いで３Ｎ塩酸ｔｏ−を添加し、４９２ｎｌｌで吸光度
を測定して検量線を作成した［８９図（ＴＡＧ−り値は
ＰＧＭｔＬ−へ中ソース等量として表示）。 第７図（テＡＧ−Ｄ値紘ＰＧＭをＬ−７コ一ス等量とし
て表示）〕。 （訃　サンドイツチ法を用い為方法； １鍵／−〜Ｉ　Ｑ＃ｆ／　ｄＯＰ　Ｇ　Ｍを溶解した［
ＬＯ５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）　１００ｓｔＫ
ンヤコグナレクチンーアガロース２００μｆを加え、２
５℃で攪拌下、１時間インキュベートした。次いで（１
０５Ｍす／酸塩緩衝ＩＥ（ｐＨ１ｏ）で３ａ洗浄後、実
施例１＠で得たベルオ中シ〆−ゼで標識した擢ヤコグナ
レタチン６μを及び（１０５Ｍリン酸塩緩衝液（）［７
，Ｏ）　１００ｓｔを加え、攪拌しながら２５℃で１時
間インキュベートした。３０００　ｒ１ｐ鳳で１０分間
遠心分離した後、沈渣を１収し、α０５Ｍリン酸塩緩衝
液（ｐｉｉ″１．０）で３１Ｉ洗浄し、・−フエニレン
ジアミン６０ＷＫα２Ｍ−マクレビン緩衝液０１１５．
８）２０−を加えて溶解し、ｊ！に最終濃度α０２Ｖ／
Ｖ’ｌｋのＨｌＯ，を加えて攪拌して。 発色試薬を調製した。 試験管に生理食塩水２ｍ及び上記発色試薬５００μを加
え、次いで上記ビーズを入れて、室温で３０分間インキ
ュベートした。５Ｎ−塩酸１−を加えて酵素反応を停止
させ、４９ハ鵬で吸光度を測定して検量−を作成した。 その検量線を第１０図に示す。 （呻　調定方法： 実施例２−（１）で得たサンプルα１−に等容のミヤコ
グサレクチンーベルオキシダーゼ１０μｔ／−のα１５
Ｍリン酸緩衝液溶液α２−及びＰＧＭ−不溶化シート１
枚を加え、良く攪拌して２０〜３７℃で２４時間反応さ
せた。この反応ｌＩＩ液中のＰＧＭ−不溶化シートをよ
く洗浄後、ＰＣ）Ｍ−不溶イヒシ一トに結合したミヤコ
グサレクチンーベルオキシダーぞ活性を過酸化水素を基
質及びオルトフェニルジアミンを発色試薬とした酵素活
性測定法でｏＤ＆９１１より測定した。標準物質として
はサンプルのかわりに各種濃度のｐＧＭを用〜・て榔準
曲纏を作成した。’ｌ”ＡＧ−Ｄ値はヘキソース等量と
して表示した。上記の測定結果を第１１図に示した。 Ｑψ結果 第１１図に示される通に健康人では全例３ｗ１Ｍ／−以
下の’ｊ’ＡＧ−Ｄ値が得られた。 （Ｓ／）測定方法 実施例２−（１）で得た被検試料各２００−を２本の試
験管に分取し、これに実施例１の（２）で得られたベル
オキシダーぞ標識ミヤコグサレクチン［レクチンとして
五５μｔ／−αＩＭ）リス−塩酸緩衝ｉ１　（ｐＨ＃　
７．５　）　）をそれぞれ５０μＬずつ添加した。 次いで軽く攪拌して混和し、２０〜３０℃にて１時間静
置反応後、一方の試験管（検体Ａ）にα１Ｍトリス−塩
酸緩ａｍにてＩＧ（Ｗ／Ｖ）に調側したポリエチレング
リコール（ｍｗ　６０００　）溶液２５０μＬを、他方
（検体Ｂ）に１１Ｍ）リス−塩酸緩衝液２５０μＬをそ
れぞれ加えて輯（温和させた。検体Ａ、Ｂ共に２０〜３
０℃にて５０〜６０分間静置反応させた後、スイング型
ローターを用いて１０００Ｘｆ、４０〜６０分関連心分
間した。 上澄液５０＃Ｌを静かに分取し、予め調製してあった２
−の生理的食塩水に加え十分に攪拌混和させたｖｋｔペ
ルオキシダーゼ基質液（以下「基質液」と略記）５００
μｔｔ−重加し、２０〜３０℃の暗所にて６Ｄ分間反応
させた。尚、基質液としてはＣＬＩＭクエン酸緩衝液に
オルトフェニレンジアミン及び過酸化水素水を各々最終
層ｆ６チ及びα１チとなる様に添加したものを使用した
。また、基質液は使用前に調製し、使用時まで４℃にて
保持することが望ましい。反応稜、２規定塩ｆｌＩ２１
−を添加して反応を停止させ、その発色を分光光度計を
用いて波長４９２ｎｍの吸光度によって測定した。 検体Ｂの吸光ｖＩＬ（ｂ）より検体Ａの吸光度（−）を
差し引いた値（ｃ）をＴＡＧ結合レクしン量としこれを
プロットした。その結果は第１２図に示される如くであ
る。尚１図中（つけ健康人を（１）〜（３）は次の患者
を意味する。（１）　、　（２）　　胃癌、（３）　　
乳癌第１２図に示される如く、健康人より高いＣ値を示
す試料は、血漿中のＴＡＧ量が多い事を意味し、これよ
り被検者に癌細胞が存在することが示唆される。 実施例５ （１）競合法を用いる方法： 試料（前記実施例２−（１）の被検試料）１００４ｔを
試験管にとシ、最終濃［α２２　Ｗ　／　Ｖ−ゼラチン
、　　５＋＋ａＭ−０＊ＣＪｔ＠、５＋＋ａＭ　−Ｍ７
Ｃ３＋７）　ａ　３　Ｍ　）　９　Ｘ−塩酸緩衝液Ｃｐ
Ｈ７，４）　５００ａｔを加える。これにＰＧＭ−ビー
ズ（前記実施例１−（Ｘｌｉ）で調製した不溶化ＴＡＧ
様物質）１個を加え、更にζヤコグサレクテ／−ペルオ
中シダー４１！（前記実施例１−（２）で調製した凍結
乾燥標識レクチ／１−／上記トリスー塩酸緩衝液１ｔ）
１００μｔを加え、攪拌した後４℃で４８時間イン中ユ
ペートした。アスピレータ−で反応液を吸引除去し、生
理食塩水２−を加え、ビーズを洗浄し、洗浄液を吸引除
去した。 この操作を３回繰り返した。 Ｑ−フェニレンシアミン６０ｑにα２Ｍ−マクレピン緩
衝液（ｐＨａ８）２０−を加えて溶解し。 更に最終濃［ｌｌＯ２ｖ　／ｖ　％　ｅ）　Ｈ，Ｏ露を
加ＪＬ？攪拌して５発色試薬を調製した。 試験管に生理食塩水２−及び上記発色試薬５００ｇを加
え、次いで上記ビーズを入れて、室温で３゜分間イ／キ
ュベートした。５Ｎ−塩酸１−を加えて酵素反応を停止
させ、４９２ｆｉｌｌで吸光度を測定した。 同様にして、前記試薬の代りに各種濃度の標準物質（Ｐ
ＧＭ）を用いて吸光度を測定して検量線を作成した（第
１３図）。 この検量線を使用して、実施例２−（Ｄで得た試料中の
ＴＡＢを測定した結果は第１４図のとおりである。

【図面の簡単な説明】

第１図はトリコスマメレクチンを用いた競合法による標
準曲線、第２図はミヤコグサレクデンを用いた競合法に
よる標準画線、第５図及び第３′図はトリコスマメレク
チンを用いた競合法の検量線、第４図はトリコスマメレ
クチンを用いた競合法によりｌｌ定した健康人と癌患者
のＴＡＧ量、第５図は実施例６の方法により測定した健
康人と癌患者の’１’ＡＧ量、第６図はトリコスマメレ
クチ／を用いたサンドインチ法の検量線、第７図はＰＧ
Ｍ−ビーズとトリコスマメレクチンを用いた競合法の検
量線、第８図は同法による非癌患者と癌患者のＴＡＧ量
、第９図及び第９′図はミヤコグサレクチンを用いた競
合法の検量線、第１０図はミヤコグサレクチンを用いた
サンドイツチ法の検量線、第１１図社ミヤコグサレクチ
ンを用いた競合法により測定した健康人と癌患者の’Ｉ
’ＡＧＩ第１２図は実施例４−翰の方法により測定した
健康人と癌患者のＴ　Ａ　Ｇｔ第１５図はＰＧＭ−ビー
ズとミヤコグサレクチンを用いた競合法の検量線、第１
４図は同法による非癌患者と癌患者のＴＡＧ量である。 以上 出―人株式会社　日本抗体研究所 ＰＧＭのヘキソースＩＪＫ値（ピコモル／−）１　　　
　　　　１０　　　　　　　　Ｉｎ２ＰＧＭ　の　Ｎ−
゛ｒセチルガラクトサミ４Ｎ値（ナノモル／ｒｎ１．）
ＴＡＧ−Ｄ値　　　第４図 （ｎ　ｎｏ　ｌ　／＋＋＋／　） 第１０図 （。。。１／、）第１１図 ０Ｄ４９□　　　　　第１３図 ０　１．０　　２．０　　３．９　　７，８　１５．６
　３１．３　６２．５　１２５　２５０　５００ＰＧＭ
濃度　（ｎ　ｍａｌｅｓ　ｅｑ　Ｆｕｃｏａｅ　ｏｆ　
ＰＧＭ／ｍ）手続補正書（方式。 昭和５７年−月１４日 特許庁技官　島田春樹殿 ■　事件の表示 昭和５７年　特　許　　願第１１７４１　　号２　発＠
Ｏ名称 瘉関連糖儒鎖Ｏ定量法 ３　補正をする者 事件との関係　　　出願人 住　所　群馬県高崎′＊栄町１７番Ｓ号名　称　株式会
社　日本抗体研究所 代継足立正− ４代理人 東　補正の対象 明細書の「図面の簡単な説明」Ｏ＠シよび図画 ７、補正Ｏ内容 （１）　　１！細書中、第４９員１１１１３行、「ｍ３
図及び第１図」とあるを、 ｒｓｓ図（荀及び集３図（至）」と訂正する。 傍）同第５０員ＩＩｚ行、 「第９図及び第９′園」とｓｌゐを、 「ｌｌ１１ｇ図（〜及びａＳ図（９）」と訂正する。 俤）　別紙Ｏ如く、第３図を亀３図（勾と、亀ぎ図ｔＩ
Ｉ３図（９）と、第９図ｔ−１１９図に）と、ｍ１図を
＠９図（ＩＩと訂正する。 １０　　　　　　　　　１０”　　　　　　　　　１１
０３ＰＧのヘキソースｍＸ値（ピコモル／ｄ）１　　　
　　　　　１０　　　　　　　　１０”ＰＧＭのＮ−ア
セチルガラクトケミ４算値（ナノモル／ｒｎｌ）手続補
正書（−１ １，事件の表示 昭和ｓ７年　畳　許　願第１１７４１Ｓ　　号２　尭−
０４称 瘉一連糖儒一〇定量法 ３、　補正をする者 事件との関係　　　出願人 住　所　群馬県高崎市栄町１１番Ｓ号 名　称　株式会社　日本抗体研究所 代表者足　立　正　− ４代理人 明細書Ｏｒ発明ｏｆｌｌｌｌｌＲ１ｋＷｉ嘴」Ｏ欄７、
補正の内容 （１）明細書中、ａＳＳ員亀−行、 ｒｌｌｌｌｌび第ぎ−に示す、亀３馳−−−−−Ｊとあ
るを、 ｒ亀ＩＩＩ（４）及びａＳ−（２）に示す、亀３閣−〇
−一−−−Ｊと釘！する。 拳）　同１１に８＠］ＩＩ第７行、 「亀イ■」と番るを、 「第３■（至）」と訂正する。 （２）岡＄３１１員集１１行、 １１１１３１１」トロ番を、 「亀３■（２）」と訂正する。 俤）　岡ｊ１４４員第１行。 「亀・■」と争るを、 「亀會閣に）」と訂正する。 優）　岡＄１４４］［１ｍ１３行、 「集ｆ′図」とあるを、 ｒｌｌｌｌｌ（２）」と訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、体顯中のτムＧ％−、ムＧＭ！合性又はＬ−７コ一
   ス結合性レクチンと反応させてＴＡＧ−ＡＧ結合性父＋
   Ｘ　Ｌ　−７コ一ス結合性レクチン結合体を形成させ、
   該結合体の量又は残存するムＧ結合性又はＬ−７コ一ス
   結合性レクチンの量欠測定することχ特徴とする癌関連
   ｍ＊鎖の定量法。 ２、　１ｌｌｉｌｌ？しようとする体液中のＴＡＧと、
   一定量の不溶化ＴＡＧ又は不溶化ＴＡＧ様物質と火ａｍ
   ＡＧ結合性又はＬ−フコース結合性レクチンの一定量と
   競合反応させ１次いで不溶化ＴムＧ又は不溶化Ｔ表Ｇ儂
   物質と＊＊ムＧ結合性又はＬ−フコース結合性レクチン
   との結合体及び非結合ムＧ結合性又はＬ−７コース結合
   性レクチンケ分離し、その何れか一方のｌｌ識剤活性欠
   醐定すること欠轡徽−とする礪関遍糖伺鎖の定量法。 ５、ｓ定しようとする体液中のＴＡＧと一定量の標４　
   Ｔ　Ａ　Ｇ又は標識ＴＡＧ様物質を、一定量のムＧ結合
   性又はＬ−７コ一ス結合性レクチン又は不溶化ＡＧ結合
   性又はＬ−フコース結合性レクチンと競合反応させ、次
   いで標識ＴＡＧ父は標識τＡＧ様物質とムＧ結合性又は
   Ｌ−７コ一ス結合性レクチン又は不溶化ム０結合性又は
   Ｌ−７コ一ス結合性レクチンとの結合体及び非結合橡鐵
   ＴムＧ又はｌｌ＊ＴムＧ様物質を分離し、その何れか一
   方の４１ＩＩ＆剤活性を測定することを特徴とする癌関
   逼糖貴鎖の定量法。 ４、　測定しようとする体液中のＴＡＧと不溶化ＡＧ結
   合性又はＬ−７：Ｉ−ス結合性レクチンとを反応させて
   ＴＡＧ−不溶化ムＧ結合性又はＬ−７コ一ス結合性レク
   チン複合体？形成させ、この複合体に標識ム０結合性又
   はＬ−フコース結合性レクチンの一定量火反応させ１次
   いｔ複合体と標識ＡＧ結合性又はＬ−フコース結合性レ
   クチンの結合体及び非結合ｌｌ鐵ＬＧＩｉ１１合性又は
   Ｌ−７コ一ス結合性レクチン欠分鳴し、その何れか一方
   の榔１剤活性Ｖ醐定することを時黴とする癌関連糖伺鎖
   の足ｌｌ法。