CH658132A5

CH658132A5 - Verfahren zur bestimmung von tumor-assoziierten, glykoprotein enthaltenden substanzen und verfahren zur diagnose von krebs.

Info

Publication number: CH658132A5
Application number: CH4939/81A
Authority: CH
Inventors: Masakazu Adachi
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1980-07-30
Filing date: 1981-07-30
Publication date: 1986-10-15
Also published as: DK339381A; ES504989A0; GB2083623A; DK157346B; DE3129923C2; JPS5729949A; SE453947B; IT8149004A0; FR2487984A1; NL8103606A; GB2083623B; SE8104597L; US4571382A; FR2487984B1; IT1143216B; DK157346C; ES8302315A1; JPS6116945B2; DE3129923A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten Glykoproteine enthaltenden Substanzen (nachfolgend mit TAGS = tumor associated glyco-linkage abgekürzt) in Körperflüssigkeiten von Säugern, d.h. TAGS einschliesslich Glykoproteine, Glykopeptide, Glyko-lipide und/oder Zucker, enthaltend Galaktose-(ßl-> 3 oder ßl-> 4)-N-acetylglukosamin oder GaIaktose-(ß 1 -> 3 oder ßl-> 4)-N-acetylgalaktosamin-Endgruppen, die bei der Wucherung von nichtdifferenzierten Zellen, insbesondere Tumorzellen oder Krebszellen, ansteigen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Diagnose von Krebs durch Bestimmung der vorerwähnten TAGS.

Als Verfahren zur Diagnose von Krebs hat man bereits spezifische Glykoproteine bestimmt, die bei Krebspatienten gebildet werden. Bei diesem Verfahren macht man von der Antigenität hauptsächlich des Proteinteils von Glykopro-teinen Gebrauch; z. B. gibt es bekannte Diagnosen für primären Leberkrebs, indem man arFötoprotein bestimmt und eine Diagnose für Krebs der Verdauungsorgane, insbesondere Rektumkrebs, indem man CEA bestimmt (Igaku No Ayu-mi, Bd. 106, Nr. 5, Fifth Saturday Special Issue, S. 235—250 (1978) in «Progress in Medicine»). Diese Diagnosemethoden sind aber in ihrer Anwendbarkeit relativ beschränkt und es besteht ein Bedürfnis nach einer Diagnosemethode für die Bestimmung von einer Vielzahl von Krebsarten.

Bisher ist keine Diagnosemethode bekannt, bei welcher man die Bindungsspezifität von Zuckerresten an TAGS anwendet.

Es wurde gefunden, dass die Körperflüssigkeit von an Krebs erkrankten Patienten TAGS enthält, das aus nichtdif-ferenzierbaren Zellen (hauptsächlich Krebszellen) stammt und in die Flüssigkeit abgegeben wird, und dass TAGS sich erheblich in der Zuckerkettenstruktur, Zuckerkettenlänge und Art der Zusammensetzung der Zuckerreste unterscheidet. Aufgrund intensiver Untersuchungen wurde gefunden, dass dieses TAGS Glykoproteine, Glykopeptide, Glykolipi-de und/oder Zucker mit Galaktose-(ßl -»■ 3 oder ßl —> 4)-N-acetylglukosamin-Endgruppen oder Galaktose-(ßl-> 3 oder ßl -» 4)-N-acetylgalaktosamin-Endgruppen enthält und dass dieses TAGS sich speziell mit Lectin kombiniert, und dass die Gegenwart oder Abwesenheit von Krebszellen, der Grad der Wucherung und der Anstieg oder der Zerfall dieser Zellen bestimmt werden kann, indem man die Körperflüssig-keits-TAGS mit Lectin umsetzt und man so den Krebs diagnostiziert. Die vorliegende Erfindung beruht auf dieser Entwicklung.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Messung von Körperflüssigkeits-TAGS-Niveaus nach einem kompetitiven Verfahren oder einem Sandwich-Verfahren aufzuzeigen, sowie ein Verfahren zur Diagnose von Krebs durch Messung von TAGS-Niveaus.

Fig. 1 zeigt eine Standardkurve, die man erhält mittels des kompetitiven erfindungsgemässen Verfahrens,

Fig. 2 zeigt eine Kalibrierungskurve für das kompetitive Verfahren gemäss der Erfindung,

Fig. 3 zeigt TAGS-Niveaus von gesunden Personen, gemessen nach dem kompetitiven Verfahren gemäss der Erfindung,

Fig. 4 zeigt TAGS-Niveaus von an Krebs erkrankten Patienten, gemessen nach dem kompetitiven Verfahren der Erfindung,

Fig. 5 zeigt eine Kalibrierungskurve für das Sandwich-Verfahren gemäss der Erfindung,

Fig. 6 zeigt eine Kalibrierungskurve für das kompetitive Verfahren gemäss der Erfindung,

Fig. 7a zeigt die TAGS-Niveaus von gesunden Personen, gemessen nach dem kompetitiven Verfahren gemäss der Erfindung,

Fig. 7b+c zeigen die TAGS-Niveaus von an Krebs erkrankten Personen, gemessen nach dem kompetitiven Verfahren gemäss der Erfindung,

Fig. 7d zeigt die TAGS-Niveaus von Patienten, die an verschiedenen anderen Erkrankungen als Krebs leiden oder von schwangeren Frauen.

Die vorerwähnte Aufgabe der Erfindung wird gelöst werden durch das folgende Verfahren, indem man:

(1) kompetitiv zu messendes Körperflüssigkeits-TAGS (nachfolgend als zu bestimmendes Material bezeichnet) und eine bestimmte Menge an unlöslich gemachtem TAGS oder TAGS-ähnlichem Material (nachfolgend als insolubilisiertes TAGS oder insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material bezeichnet) mit einer definierten Menge Lectin, das mit einem Markierungsmittel markiert ist (nachfolgend als markiertes Lectin bezeichnet) umsetzt, das insolubilisierte TAGS oder das insolubilisierte TAGS-ähnliche Material, das an das markierte Lectin gebunden ist, und ungebundenes markiertes Lectin voneinander trennt und die Aktivität des Markierungsmittels in einer der beiden Komponenten bestimmt;

(2) dass man kompetitiv das zu messende Material und eine definierte Menge TAGS oder TAGS-ähnliches Material, das mit dem Markierungsmittel markiert ist (nachfolgend als markiertes TAGS oder markiertes TAGS-ähnliches Material bezeichnet) mit einer definierten Menge von Lectin oder unlöslich gemachtem Lectin (nachfolgend als insolubilisiertes Lectin bezeichnet) umsetzt, das markierte TAGS oder markierte TAGS-ähnliche Material gebunden an das Lectin oder insolubilisierte Lectin und ungebundenes markiertes TAGS oder TAGS-ähnliches Material voneinander trennt

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und die Aktivität des Markierungsmittels in einer der beiden Komponenten bestimmt; und

(3) indem man das zu bestimmende Körperflüssigkeits-TAGS mit insolubilisiertem Lectin unter Bildung eines TAGS-insolubilisiertes Lectin-Komplex umsetzt, diesen Komplex mit einer definierten Menge an markiertem Lectin umsetzt, den an das markierte Lectin gebundenen Komplex und ungebundenes markiertes Lectin voneinander trennt und die Aktivität des Markierungsmittels in einer der beiden Komponenten bestimmt.

Als Körperflüssigkeit, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, können verschiedene Körperflüssigkeiten eingesetzt werden, z. B. Blut, Zellgewebeflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Toraxflüssigkeit, Eingeweideflüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, Magensaft, Urin, Pankreassaft, Ce-rebrospinalflüssigkeit und Speichel. Von diesen Flüssigkeiten wird Blut in Form von Serum oder Blutplasma besonders bevorzugt. Die Menge der für die Bestimmung benötigten Körperflüssigkeit liegt im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 ml, vorzugsweise von 2 bis 5 ml. Diese Körperflüssigkeit kann noch weiter gereinigt sein, um die Glykoproteine enthaltenden Substanzen, wie Glykoproteine, Glykopeptide, Glykolipide und/oder Saccharide, zu isolieren.

Um eine Substanz, das Glykoproteine in hohen Anteilen enthält, aus der Körperflüssigkeit zu gewinnen, kann man die üblichen Methoden, wie eine Extraktion oder Abtrennung von Glykoproteinen, wie das Aussalzen, Ausfällen, Extraktion, Zentrifugieren, Dialyse, Molekularsiebmethode, Inaktivieren des Enzyms oder eine Kombination davon anwenden. Insbesondere kann man eine solche Fraktion gewinnen, indem man Sulfosalicylsäure, Trichloressigsäure oder Zinksulfat zu Serum oder Plasma zugibt oder Serum oder Plasma erwärmt, den dabei gebildeten Niederschlag zur Entfernung von Albumin, Immunoglobulin und dergleichen filtriert und dann eine Dialyse durchführt.

Bei dem erfindungsgemässen Bestimmungsverfahren kann man gesammelte Körperflüssigkeitsproben, ausgenommen Blut, so wie sie sind als Versuchsproben (nachfolgend als «Proben» bezeichnet) verwenden. Um aber zu vermeiden, dass sich die Proben denaturieren und um die Umsetzung mit Lectin zu beschleunigen, können niedrigzuckerhaltige Proteine, wie Rinderserumalbumin (BSA) und dergleichen zu den Proben als Schutzproteine zugegeben werden. Weiterhin erhält man gute Ergebnisse in einigen Fällen durch die Zugabe einer geeigneten Menge eines Schutzproteins zu einer Probe, aus welchem Albumin, Immunoglobulin und dergleichen entfernt wurden. Bei Blutproben kann man Serum, das nach einem bekannten Serumsammelverfahren erhalten wurde, oder Plasma, das unter Verwendung von Antikoagulantien, wie Häparin, EDTA, Zitronensäure und dergleichen, gesammelt wurde, als Probe verwenden, wobei man besonders eine Serumprobe bevorzugt, die gesammelt und zubereitet wurde unter Verwendung von Häparin als Anti-koagulationsmittel. Wenn die TAGS-Niveaus verhältnismässig hoch sind, wie bei Ascites, kann man gewünschten-falls die Proben mit einer geeigneten Pufferlösung verdünnen.

Als gemäss der vorliegenden Erfindung zu verwendendes Lectin werden solche angeführt, die sich spezifisch mit Galaktose-^ l-> 3 oder ßl-> 4)-N-acetylglukosamin oder Galaktose^ l-> 3 oder ßl-> 4)-N-acetylgalaktosamin kombinieren (J.B.C. 250, 8518 — 8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm., 62,144 (1975); Z. Immunitätsforsch, 138, 423-433 (1969); Br. J. Exp. Pathol., 27, 228-236 (1946); Proc. Nati. Acad. Sei., USA, 75, Nr. 5,2215-2219 (1978); Biochemistry, 13,196 — 204(1974); Carbohydrate Research, 51,107 — 118 (1976)), wie Erdnusslectin, Kastorbohnenlectin (Ricinus communis) und dergleichen.

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Als Markierungsmittel zum Markieren von Lectin und TAGS oder TAGS-ähnliches Material, können verschiedene Enzyme, verschiedene fluoreszierende Materialien und verschiedene radioaktive Materialien, etc., verwendet werden. Solche Enzyme schliessen ein Glukoamylase, Glukoseoxida-se, Peroxidase, alkalische Phosphatase, ß-Galaktosidase und aktive Fragmente von Hämoctapeptiden, etc., und fluoreszierende Materialien schliessen beispielsweise ein Fluores-cein, Fluoresceinisothiocyanatrhodamin, Dansylchlorid (d.h. 5-Dimethylamino-l-naphthalinsulfonylchlorid), etc. Geeignete radioaktive Materialien sind beispielsweise radioaktives Jod (z.B. 125J,131J, etc.), radioaktives Tritium, etc.

In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck «TAGS-ähnliches Material» Galaktose-(ßl-> 3 oder ßl-> 4)-N-acetylglukosamin, Galaktose-(ßl-> 3 oder ßl-> 4)-N-acetylgalaktosamin und Zuckerderivate, die solche Glykoproteine an den Endgruppen enthalten. Solche Zuckerderivate sind beispielsweise Glykoprotein von humaner Magenschleimhaut, Glykoprotein, das man erhält, indem man endständige Fucose aus sulfatiertem Glykoprotein von Schwei-nemagenschleimhautmembran entfernt, humanes IgG-Glykoprotein oder deren Asialoderivate, Rinder-IgG-Glykoprotein, Asialoderivate von Glykoprotein von Schwei-ne-Thyroglobulin-Glykoprotein B, Glykoprotein von ovomukoider ß-Untereinheit, Glykoprotein B-l von Human-IgE oder dessen Asialoderivat, Asialoderivat von Glykoprotein B-2 oder B-3 von Human-IgE und Asialoderivat von Glykoprotein II-C von Human-IgAI; Asialoderivat von Glykoprotein II-B oder II-A von Human-IgA i, Asialoderivat von Human-Transferringlykoprotein, Asialoderivat von Rinderfötos-Glykoprotein, Deasialoderivat von Glykoprotein, das an der Aufnahme von Asialoglykoprotein aus Ka-ninchenleberzellen-protoplasmischen Membranen teilnimmt, sulfatiertes Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut, Asialoderivate von Human-ai-Säureglykopro-tein, Asialoderivate von Glykofolin, Glykoprotein oder Gly-kopeptid von T-Antigen oder dergleichen, wie sie in «Bio-chemical Data Book I» beschrieben werden (verteilt von der Japanese Chemical Society und veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin, 26. November 1979, Seiten 503 — 510) und Asialo-GMi = AM| und Glykolipide von Rinder-Erythro-cyten, wie sie in der gleichen Literaturstelle auf Seiten 840—841 beschrieben werden. Von diesen werden besonders bevorzugt Asialoderivate von Rinderfötus-Glykoprotein, sulfatiertes Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut, sulfatiertes Glykoprotein von Human-Magenschleimhaut und Asialoderivate von Human-arSäureglykoprotein.

Insolubilisiertes TAGS, insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material und insolubilisiertes Lectin stellt man her durch chemische oder physikalische Umsetzung von TAGS, TAGS-ähnlichem Material oder Lectin mit einem unlöslichen Träger. Geeignete unlösliche Träger sind beispielsweise Zellulosepulver, Sephadex, Sepharose, Polystyrol, Filterpapier, Carboxymethylzellulose, Ionenaustauschharze, Dextran, Plastikfilm, Plastikrohr, Nylon, Glasperlen, Seide, Po-lyaminmethylvinylether-Maleinsäure-Copolymere, Amino-säure-Copolymere, Ethylen-Maleinsäure-Copolymere, etc. Die Insolubilisierung kann man bewirken durch ein Verfahren, bei dem ko valente Bindungen gebildet werden (z.B. durch ein Diazoverfahren, ein Peptidverfahren — beispielsweise einem Säureamidderivat-Verfahren, einem Carboxy-chloridharz-Verfahren, einem Carbodiimidharz-Verfahren, einem Maleinsäureanhydridderivat-Verfahren, einem Isocy-anatderivat-Verfahren, einem Cyanogenbromid-aktiviertes Polysaccharid-Verfahren, einem Zellulosekarbonatderivat-Verfahren, einem Verfahren, bei dem man ein Kondensie-rungsmittel verwendet, etc. — einem Alkylierungsverfahren, einem Träger-Bindungsverfahren unter Verwendung eines

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Vernetzungsmittels, wie Glutaraldehyd, Hexamethylenisocy-anat, etc.), einem Träger-Bindungsverfahren nach der Ugi-Reaktion und dergleichen; einem Ionen-Bindungsverfahren unter Verwendung eines Ionenaustauschharzes als Träger; und einem physikalischen Absorptionsverfahren unter Verwendung von porösem Glas, wie Glasperlen, als Träger. Von diesen werden das Cyanogenbromid-aktiviertes Polysaccha-rid-Verfahren für das kovalente Bindungen bildende Verfahren und das Träger-Bindungsverfahren unter Verwendung eines Vernetzungsmittels bevorzugt. Bei dem Cyanogenbromid-aktiviertes Polysaccharid-Verfahren kann man insolubilisiertes TAGS, insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material oder insolubilisiertes Lectin erhalten, indem man TAGS, etc., mit der 10- bis 1000-fachen Menge eines cyanogenbro-midaktivierten Trägers in einem geeigneten Lösungsmittel bei 0 bis 40 °C, vorzugsweise bei 20 bis 30 °C während 2 bis 4 Stunden umsetzt.

Insolubilisiertes TAGS, etc., kann man auch durch ein Bestrahlung-induziertes Polymerisations-Verfahren herstellen. Dabei wird eine wässrige Dispersion eines polymerisierbaren Monomers, enthaltend TAGS oder TAGS-ähnliches Material, hergestellt und mit Licht oder Ionenstrahlung zum Polymerisieren des Monomers bestrahlt. Als Mittel zur Herstellung der wässrigen Dispersion wird ein hydrophobes po-lymerisierbares Monomer (A) in einer 0,1 bis 5 Gew. %-igen wässrigen Lösung eines wasserlöslichen Polymer (B) disper-giert. Alternativ kann man ein hydrophiles polymerisierba-res Monomer (C) oder ein Gemisch aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (A) und einem hydrophilen polymerisierbaren Monomer (C) in einer 3 bis 20 Gew. %-igen wässrigen Salzlösung dispergieren oder ein hydrophobes po-lymerisierbares Monomer (A) wird in einer wässrigen Lösung, die 0,01 bis 5 Gew.% eines oberflächenaktiven Mittels (D) enthält, dispergiert. Wenn eine so erhaltene Dispersion dann mit Licht oder einer Ionenstrahlung bestrahlt wird, dann wird das dort in der dispersen Phase vorliegende polymerisierbare Monomer polymerisiert unter Bildung einer Polymerisationsmatrix für TAGS und dergleichen. Ge-wünschtenfalls kann man diese dann zu einem Blatt oder zu Teilchen ausbilden.

Spezielle Beispiele für hydrophobe polymerisierbare Monomere (A) sind Glycidylmethacrylat, Ethylenglykoldimeth-acrylat, Diethylenglykoldimethacrylat, Triethylenglykoldi-methacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat, Polyethy-lenglykol-200-dimethacrylat, Dipropylenglykoldimethacry-lat, 1,4-Butylenglykoldimethacrylat, 1,6-Hexanglykoldi-methacrylat, Methoxydiethylenglykoldimethacrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Butylmethacrylat und die entsprechenden Acrylate hiervon. Im allgemeinen kann man jedes wasserunlösliche Monomer, das durch Be- . Strahlung mit Licht oder mit Aktivstrahlen polymerisiert werden kann, unabhängig von der jeweiligen Art, verwenden.

Als typische Beispiele für hydrophile polymerisierbare Monomere (C) können angeführt werden 2-Hydroxyethyl-methacrylat, Methoxytetraethylenglykolmethacrylat, Meth-oxypolyethylenglykol-400-methacrylat, Methoxypolyethy-lenglykol-1000-methacrylat, Polyethylenglykol-400-dimeth-acrylat, Polyethylenglykol-600-dimethacrylat und die entsprechenden Acrylate davon, sowie Methacrylsäure, Acryl-amid, N-Vinyl-2-pyrrolidon, etc. Im allgemeinen kann jedes wasserlösliche Monomer, das durch Bestrahlung mit Licht oder mit Aktivstrahlen polymerisiert werden kann, unabhängig von seiner Art, verwendet werden.

Als typische Beispiele für wasserlösliche Polymere (B) können Polyvinylpyrrolidon, Polymethacrylsäure, Poly-acrylsäure, Polyvinylalkohol, Hydroxypropylzellulose und Gummiarabikum erwähnt werden.

Als typische Beispiele für das oberflächenaktive Mittel (D) können Natriumlaurylsulfat, Kaliumoleat, Natrium-oleat, Sorbitmonolaurat, Sorbitmonostearat, Sorbitmono-oleat, Propylenglykolmonolaurat, Ölsäure, Natriumdodecyl-benzolsulfonat, etc., genannt werden. Jedes oberflächenaktive Mittel, das das polymerisierbare Monomer oder das TAGS oder TAGS-ähnliche Material in dem polymerisierbaren Monomer mit dessen Mycelen löst, kann unabhängig von seiner Art verwendet werden.

Mit radioaktivem Material markiertes TAGS, mit radioaktivem Material markiertes TAGS-ähnliches Material und mit radioaktivem Material markiertes Lectin erhält man, indem man in TAGS, TAGS-ähnliches Material oder Lectin ein radioaktives Jodatom, wie 125J oder 131J einführt. Die Einführung von radioaktivem Jod wird durch ein übliches Jodierungsverfahren bewirkt, z. B. durch ein oxidatives Jodierungsverfahren unter Verwendung von Chloramin T (Nature 194, S. 495 (1962); Biochem. J., 89, S. 114 (1963)). Dabei wird die Jodierung in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. einer Pufferlösung mit einem pH von 6 bis 8, vorzugsweise einer 0,2M Phosphatpufferlösung — pH 7), bei etwa Raumtemperatur während 5 bis 60 Sekunden in Gegenwart von Chloramin T durchgeführt. Radioaktives Jod und Chloramin T werden vorzugsweise in Mengen von 1 bis 5 mCi bzw. 10 bis 100 Nanomol pro Nanomol Thyrosin, enthalten in TAGS oder dergleichen, angewendet. Das so markierte TAGS oder dergleichen wird dann isoliert und abgetrennt und kann in üblicher Weise aufbewahrt werden, erforderlichenfalls in lyophilisierter Form.

Enzymmarkiertes TAGS, enzymmarkiertes TAGS-ähnliches Material und enzymmarkiertes Lectin kann man durch ein bekanntes Kupplungsverfahren herstellen (z.B. B.F. Erlanger et al; Acta. Endocrinol. Suppl., 168,206 (1972) und M.H. Karol et al; Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 57, 713 (1967)). Dabei wird TAGS oder dergleichen mit Enzym in einer Pufferlösung von pH 4 bis 6 (z.B. einer ImM Acetatpuf-ferlösung, pH 4,4) bei Raumtemperatur während 2 bis 5 Stunden in Gegenwart eines Oxidationsmittels, wie NaJ04, umgesetzt und anschliessend wird mit NaBH4 oder dergleichen reduziert. Enzym wird in einer Menge von 1 bis 3 Molen pro Mol TAGS oder dergleichen verwendet. Das Oxida-tionsmittel wird in einer Menge von 100 bis 300 Molen pro Mol TAGS und dergleichen verwendet und das Reduktionsmittel in einer Menge von 1 bis 2 Molen.

Mit fluoreszierendem Material markiertes TAGS, mit fluoreszierendem Material markiertes TAGS-ähnliches Material und mit fluoreszierendem Material markiertes Lectin wird hergestellt, indem man TAGS oder dergleichen mit einem bekannten fluoreszierenden Mittel, wie Fluoresceiniso-thioeyanat (FITC) oder Tetramethylrhodaminisothiocyanat (RITC) in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung mit einem pH von 6 bis 8 bei 0 °C bis Raumtemperatur und vorzugsweise bei Raumtemperatur während 0,5 bis 3 Stunden umsetzt (fluoresziierende Antikörper-Verfahren; Ikagaku Jikkenho Koza, Nr. 4, S. 263 — 270). Das fluoreszierende Material wird vorzugsweise in einer Menge von lj5= von TAGS oder dergleichen verwendet.

Nachfolgend wird die Bestimmungsmethode gemäss der vorliegenden Erfindung durch das kompetitive Verfahren oder das Sandwich-Verfahren beschrieben.

Bei diesen beiden Verfahren wird die Umsetzung in einem geeigneten Lösungsmittel bei 45 °C oder weniger, vorzugsweise bei 4 bis 40 °C, und insbesondere bei 20 bis 40 °C vorgenommen. Als Lösungsmittel, die nicht nachteilig auf die Reaktion von TAGS oder TAGS-ähnliches Material mit Lectin einwirken, werden Wasser und Pufferlösungen von pH 6 bis 7,8 (z.B. 0,1 bis 0,3M tris-Hydrochlorwasserstoff-

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säure-Pufferlösung — pH etwa 7,5,0,1M Phosphatpufferlösung — pH etwa 7,4, etc.) bevorzugt. Die Reaktion wird während 5 bis 40 Stunden, vorzugsweise 15 bis 25 Stunden durchgeführt.

Die Abtrennung von TAGS (oder TAGS-ähnlichem Material) das an Lectin gebunden ist, von ungebundenem Lectin oder TAGS (oder TAGS-ähnlichem Material) voneinander kann in üblicher Weise vorgenommen werden. Das heisst, dass, wenn insolubilisiertes TAGS (oder TAGS-ähnliches Material) oder insolubilisiertes Lectin verwendet wird, eine einfache Abtrennung der festen Phase von der flüssigen Phase (durch Zentrifugieren, Filtrieren oder Dekantieren) ausreicht und dass in anderen Fällen Chromatografie, Elektrophorese, Aussalzen, Fraktionieren, Dialyse, Gelfiltration, Absorption oder eine Kombination davon verwendet werden kann oder ein Trennverfahren unter Verwendung von Agargel, Agarosegel oder Polyacrylamidgel (japanische veröffentlichte Patentanmeldung 151 263/80).

Die Aktivität des Markierungsmittels in dem so abgetrennten Produkt wird unter Auswahl einer geeigneten Methode, in Abhängigkeit von der Art des Markierungsmittels, durchgeführt. Beispielsweise wird bei einem Enzym ein geeignetes Enzymsubstrat für eine colorimetrische Analyse, Emissionsanalyse oder Fluoreszenzanalyse ausgewählt und gewünschtenfalls verwendet man einen Farbstoff, einen Aufheller oder ein Färbungsmittel, um die Enzymaktivität zu messen oder, wenn ein Fluoreszierungsmittel oder ein radioaktives Material als Markierungsmittel verwendet wird, wird die Fluoreszenzintensität oder die Radioaktivität gemessen. Auf diese Weise kann man reagiertes und nichtrea-giertes TAGS, TAGS-ähnliches Material oder Lectin bestimmen und daraus kann die Menge des in Frage stehenden Materials erkannt werden.

Wie bereits vorher dargelegt, ermöglicht die vorliegende Erfindung die vorteilhafte Bestimmung von TAGS in einer Körperflüssigkeit. Aus der so bestimmten TAGS-Menge kann man Krebs in jedem Stadium von einem Anfangsstadium bis zum letzten Stadium bestimmen. Dieses Verfahren ist besonders geeignet für die Aufdeckung von Krebs im Frühstadium. Da Glykoproteine bei der vorliegenden Erfindung bestimmt werden, kann man diese Methode für eine grössere Anzahl von Krebsarten, als mit den üblichen Antikörper verwendenden Verfahren (a-Fötoprotein, CEA, etc.), bei denen hauptsächlich die Proteingruppe bestimmt wird, anwenden, z.B. bei Magenkrebs, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Rektalkrebs, Eierstockkrebs, Mundkrebs, Zungenkrebs, Kehlkopfkrebs, Prostatakrebs, Liposarcom, bösarti-

Weiterhin ist das erfindungsgemässe Verfahren dadurch charakterisiert, dass es hochspezifisch für Krebs ist und dass es nicht mit Determinanten ähnlicher Substanzen in der Körperflüssigkeit von schwangeren Frauen und von Patienten, die an anderen Krankheiten als Krebs leiden, wie Gastritis, Magengeschwür, Zwölffingerdarmgeschwür, Colitis, Pankreatitis, Diabetes mellitus, Nephritis, Cystitis, Blasensteine, Cholecystitis, Gallensteine, Hirnerweichung, Apople-xy, Anginapektoris, Herzversagen, Myocardinfarkt, Hochdruck, Artritis, Depression, allergischer Coryza, Purpura, Pneumonie, Pulmonarpneumatose, Bronchitis, Asthma, akute Häpatits, chronische Häpatitis, etc., leiden, kreuzreagiert.

Weiterhin ermöglicht es die Erfindung, Galaktose-(ßl -* 3 oder ßl-> 4)-N-acetylglukosamin oder Galaktose-(ßl-> 3 oder ßl -* 4)-N-acetylgalaktosamin oder Zucker oder Zuk-kerderivate (z.B. Glykoproteine, Glykopeptide, Glykolipide, Glykoterpen, Glykosteroide, etc.) die endständiges Glykoprotein enthalten, zu bestimmen.

Die Erfindung wird nachfolgend ausführlicher in den nicht beschränkend auszulegenden Beispielen anhand von

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bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beschrieben.

Beispiel 1 (I) Aktivierung von Peroxidase:

5 mg Peroxidase (aus Meerrettich) wurden in 1 ml einer 0,3M wässrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung gelöst. 0,1 ml einer 0,1 M Fluordinitrobenzol enthaltenden Ethanol-lösung wurden zu dieser Lösung gegeben und anschliessend wurde leicht während einer Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann wurden 0,1 ml einer 0,06M NaJ04-Lösung zugegeben und weitere 30 Minuten schwach gerührt. Dann wurden zu dem Reaktionsgemisch 1 ml einer 0,16M Ethy-lenglykollösung gegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur schwach gerührt. Anschliessend wurde die Lösung gegen 0,0IM Kohlensäure-Natriumhydrogen-karbonat-Pufferlösung (pH 9,5) bei 4 °C während eines Tages und einer Nacht dialysiert.

(II) Verfahren zum Markieren von Lectin mit Peroxidase (Lectin-Peroxidase) 5 mg Erdnusslectin wurden in 3 ml der gemäss (I) zubereiteten aktivierten Peroxidase gelöst und bei Raumtemperatur während 2 bis 3 Stunden unter Umsetzen schwach gerührt. 5 mg NaBH4 wurden zugegeben und bei 4 °C während 3 Stunden umgesetzt. Anschliessend wurde diese Lösung gegen eine 0,1 M tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH

7.4) während eines Tages und einer Nacht dialysiert und dann einer Sephadex G 150 Gel-Säulenchromatografie (Eluierungsmittel 0,1M tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung; pH 7,4) unter Ausführung einer Gelfiltration unterworfen. Die optischen Dichten (OD28o und OD403) jeder Fraktion wurden gemessen und die Fraktionen, bei denen sich die Peaks von OD2so und OD® überlappten, wurden gesammelt.

(II') Verfahren zur Herstellung von gereinigter Lectin-Peroxidase 20 ml der gemäss (II) erhaltenen Lectin-Peroxidase wurden zu Galaktose-agarose (AGALACTOPYRANOSYL AGAROSE®, hergestellt von P. L. Lab. USA) gegeben und mit 200 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Die Säule wurde mit 0,2M NaCl-Lösung, enthaltend 0,5M Lactose, eluiert, und die ersten 10 ml-Fraktionen mit Peaks für OD2go und OD403 wurden gesammelt und gegen eine physiologische Salzlösung während eines Tages und einer Nacht unter Gewinnung von gereinigter Lectin-Peroxidase dialysiert. Der Proteingehalt des Produktes wurde nach der Lowry-Methode bestimmt (Lowry O.H. et al, J. Biol. Chem., 193, S. 265 (1951) und betrug etwa 1 g.

(III) Verfahren zur Herstellung von insolubilisiertem Lectin (Verfahren zur Herstellung von PNA-Agarose) 15 g CNBr-aktivierte Agarose wurden in 31 einer 0,001N Chlorwasserstoffsäure suspendiert und nach 30-minütigem Stehenlassen mit 110,1 M Natriumhydrogenkarbonat (pH

8.5) auf einem Glasfilter gewaschen. Man erhielt insgesamt etwa 50 ml aktivierte Agarose. Diese wurde in 200 ml 0,1M Natriumhydrogenkarbonat (pH 8,5) suspendiert und 5 ml einer 0,0IM Phosphatpufferlösung (pH 7,7), enthaltend 50 mg Erdnusslectin (nachfolgend als PNA bezeichnet) wurden dazugegeben und während 2 Stunden unter gelegentlichem Rühren bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung auf ein Glasfilter gewaschen und das Reaktionsprodukt wurde zu 200 ml einer IM Monoethanolaminlösung (pH 8,5) gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschliessend wurde

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das Reaktionsprodukt auf einem Glasfilter mit 11 einer 0,1 M Essigsäure-Pufferlösung (enthaltend 0,5M NaCl) und 11 einer 0,1 M Borsäure-Pufferlösung (enthaltend 0,5M NaCl) abwechselnd dreimal gewaschen.

(IV) Verfahren zur Herstellung von TAGS-ähnlichem Material

1 g sulfatiertes Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut (anschliessend als PGM abgekürzt) wurde in 100 ml einer 0,05M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert und dazu wurde unter Eiskühlung des pH's auf 11 eine IN wässrige NaOH-Lösung tropfenweise zugegeben. Nach 30-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde auf pH 7,0 mit IN HCl eingestellt und anschliessend wurde nochmals 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 101 einer 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) über Nacht dialysiert, wobei man gereinigtes TAGS-ähnliches Material (reines PGM) erhielt.

(IV') Verfahren zur Herstellung von TAGS-ähnlichem Material

Alternativ wurde rohes PGM (100 g) zu 11 destilliertem Wasser gegeben. Dann wurde die Mischung über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert und zentrifugiert (100 000 g x 1 Stunde). Die überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt und lyophilisiert, wobei man etwa 5 g gereinigtes PGM erhielt.

(V) Verfahren zur Herstellung von markiertem TAGS

(a) Markierung mit einem Enzym (PGM-Peroxidase):

4 mg Peroxidase aus Meerrettich (HRPO) (0,1 p.mol)

wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Dazu wurden 0,2 ml von 0,1M NaJ04 gegeben und nach 20-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung gegen 1 mM Essigsäure-Pufferlösung (pH 4,4) während eines Tages und einer Nacht zur Entfernung von'nichtumgesetztem NaJ04 dialysiert. Zu dieser dialysierten Reaktionslösung wurden etwa 60 ja.1 einer 0,2M Hydrogenkarbonat-Pufferlösung (pH 9,5) gegeben und der pH der Lösung auf 9,0 eingestellt.

Dann wurden zu dieser Lösung direkt 0,6 ml PGM (10 mg/ ml), gelöst in einer 0,01M Hydrogenkarbonat-Pufferlösung (pH 9,5) gegeben, und 2 Stunden bei Raumtemperatur vermischt und dazu wurden dann 0,1 ml einer 4 mg/ml NaBH4-Lösungin destilliertem Wasser gegeben, worauf man 2 Stunden bei 4°C stehen liess. Diese Lösung wurde dann gegen eine 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,5) während eines Tages und einer Nacht dialysiert und unter Verwendung von Sephadex G 200 (1,5 x 150 cm) unter Erhalt von reiner PGM-Peroxidase (PGM-POX) gereinigt. Das Geleluiermit-tel wurde in 5 ml-Anteilen gesammelt und die Absorption wurde bei OD280 und OD403 gemessen.

(b) Markierung von Isotop (125J-PGM):

PGM wurde mit 125J nach dem oxidativen Jodierungsverfahren unter Verwendung von Chloramin T markiert.

10 jxg PGM wurden in 50 j_il einer 0,2M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gelöst und dazu wurden 10 |il von 1 mCi Na125J (trägerfrei, N.E.N.) und 50 p.g/100 p.1 Chloramin T-Lösung in einer 0,2M Phosphat-Pufferlösung gegeben und nach Vermischen bei Raumtemperatur während 30 Sekunden wurden 1000 p.g/100 |il Na^Oj-Lösung in einer 0,2M Phosphat-Pufferlösung zugegeben. Anschliessend wurde 1 mg von NaI25J zugegeben und untergemischt. Das so erhaltene 125J-PGM wurde über Sephadex G-50 (1 x 30 cm) gereinigt. Das so erhaltene l25J-PGM hatte eine Radioaktivität von etwa 1 bis 2 (iCi/ng.

(VI) Bestimmungsverfahren

0,1 ml von I25J-PGM (100 ng 0,17 jxCi entsprechend etwa 2,4 x 105 cpm), erhalten in (V), 0,1 ml von reinem Standard-PGM (0,1 ng/ml, 0,2 |ig/ml, 0,5 ng/ml, 1 (ig/ml, 2,5 Hg/ml, 5 |ig/ml, 10 ng/ml), erhalten in (IV), 0,1 ml von PNA (10 \ig/ ml) und 0,2 ml einer 0,05M Phosphorsäure-Pufferlösung (0,15M NaCl; 0,1 % BSA: 0,02% NaN03) wurden in einem 10 x 75 mm Reagenzglas vermischt und während 1 Stunde bei 25 °C inkubiert. Nach Beendigung der Umsetzung wurden 0,1 ml Anti-PNA-Kaninchenserum (hergestellt von E.Y. Laboratory: 10-fache verdünnte Lösung) zu der 125J-PGM, gebunden an PNA und I25J-PGM, nichtgebunden an PNA, gegeben und nach 1-stündigem Inkubieren bei 25 °C wurde die Reaktionslösung bei 4 °C während 30 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Die Radioaktivität eines Niederschlags (125J-PGM gebunden an PNA) wurde gemessen und eine Standardkurve aufgestellt (Fig. 1). Aus den dabei gefundenen Ergebnissen geht hervor, dass der Prozentsatz an Gebundenem (B/T) 20 bis 25% betrug und dass eine 50%-ige Inhibierung bei einer Konzentration von 0,6 (xg/ml erzielt wurde.

(VII) Herstellung von insolubilisiertem TAGS-ähnlichen Material

Eine überschüssige Menge von PGM wurde zu 100 ml einer 0,0IM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gegeben und darin suspendiert. Eine 0,01N NaOH-Lösung wurde dazugegeben und der pH der Suspension auf etwa 11 eingestellt und dann wurde 20 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert und die überstehende Lösung gewonnen. Zu dieser überstehenden Lösung wurden tropfenweise 0,03N HCl unter Einstellung des pH-Wertes auf 7,0, zugegeben und dann wurde nochmals mit 3000 Upm während 20 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde gegen eine 0,0IM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) unter Erhalt einer PGM-Lösung dialysiert. Der Zuckergehalt und der Proteingehalt dieser Lösung wurden bestimmt und der Hexosegehalt wurde mit 5 bis 7 mg/ml festgestellt mittels der Phenol-Schwefelsäure-Methode, unter Verwendung von Glukose als Standard, und der Proteingehalt wurde mit 1 bis 2 mg/ml unter Verwendung von BSA als Standard gemessen. Die PGM-Lösung wurde der nachfolgenden strahlungsinduzierten Polymerisation unterworfen.

Die strahlungsinduzierte Polymerisation wurde wie folgt vorgenommen: Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) (als Monomeres verwendet) wurde mit der vorerwähnten PGM-Lösung in einem Mischungsverhältnis von 33:67 abgemischt und die erhaltene Mischung wurde in ein 1 cm x 15—20 cm Glasrohr gegeben und schnell auf — 70 °C oder weniger lyophilisiert. Anschliessend wurde das Gemisch mit 1 x 106 Rad Gammastrahlen zum Polymerisieren des Monomers bestrahlt. Jedes der so fixierten PGM-Materialien wurde hergestellt, indem man den polymeren Stab zu Scheiben einer Dicke von 10 um schnitt.

(VIII) Herstellung von insolubilisiertem TAGS-ähnlichen Material

15 g (Trockengewicht) CNBr-aktivierte Sepharose 4B (hergestellt von Pharmacia AB) wurden in 3 1 einer 0,00IN Chlorwasserstoffsäure suspendiert und nach 30-minütigem Stehen mit 11 einer 0,1 M Natriumhydrogenkarbonatlösung (pH 8,5) auf einem Glasfilter gewaschen, wobei man etwa 50 ml aktivierte Sepharose erhielt. Diese wurde in 200 ml einer 0,1M Natriumhydrogenkarbonatlösung (pH 8,5) suspendiert und dazu wurden 5 ml einer 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,7), enthaltend 50 mg PGM, gegeben und dann liess man das Ganze 2 Stunden bei Raumtemperatur umsetzen unter gelegentlichem Rühren.

Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktions8

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lösung auf einem Glasfilter gewaschen und das Reaktionsprodukt wurde zu 200 ml einer IM Monoethanolaminlösung (pH 8,5) gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur umsetzen gelassen. Dann wurde die Reaktionslösung auf einem Glasfilter mit 11 einer 0,1 M Essigsäure-Pufferlösung (enthaltend 0,5M NaCl) und 11 einer 0,1 M Borsäure-Pufferlö-sung (enthaltend 0,5M NaCl) abwechselnd dreimal gewaschen.

(VIII') Verfahren zur Herstellung von insolubilisiertem TAGS-ähnlichen Material (Herstellung von PGM-Perlen) 10 000 Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von 6,4 mm, hergestellt von der Précision Plastic Co., Ltd., USA, wurden mit einer verdünnten Lösung einer synthetischen Seife (Mamalemon®, hergestellt von Lion Co., Ltd.) in einer Konzentration von 1,5 ml/11 destilliertem Wasser gewaschen und anschliessend mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Anschliessend wurden sie in eine wässrige 0,5M NaOH-Lösung während 3 Tagen getaucht und gründlich gewaschen, bis der pH der Waschlösung etwa 6 betrug. Die so gewaschenen 10 000 Perlen wurden zu 2,51 einer 35 (W/V) %-igen PGM-Lösung in 50 mM Essigsäure-Puffer, eingestellt auf pH 4,5 mit 10N NaOH, gegeben und während 24 Stunden mit 10 Upm geschüttelt und dann filtriert und mit 81 destilliertem Wasser viermal gewaschen. Dann wurden die Perlen zu 2,51 einer Glutaraldehydlösung einer Endkonzentration von 1 V/V % in 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7) gegeben und mit 10 Upm während 2 Stunden rotiert und dann filtriert und dann mit destilliertem Wasser, wie vorher angegeben, gewaschen. Die so behandelten 10 000 Perlen wurden zu 2,51 einer IM Glycinlösung in 50 nM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0) 2 Stunden mit 10 Upm rotiert und dann filtriert und mit destilliertem Wasser in der vorher angegebenen Weise gewaschen und dann über Nacht bei 37 °C getrocknet, wobei man PGM-Perlen erhielt. Die Oberfläche dieser Perlen wurde nach der Otcinol-H2S04-Methode (M. Schönenberger et al: Z. Physiol. Chem. 309, 145 (1957)) bestimmt und ergab 2,7 + 0,2 (jg PGM/Pefle.

(IX) Herstellung von Testproben 5 ml Blut wurden von krebskranken Patienten und von Patienten, die an anderen Krankheiten litten, sowie von schwangeren Frauen und gesunden Personen gesammelt, unter Verwendung von Häparin (500 Einheiten)-behandelten Spritzen und 10 Minuten mit 200 Upm zentrifugiert und die überstehende Lösung wurde zur Herstellung der Testproben verwendet.

Beispiel 2 Kompetitives Verfahren:

Ein Schnitt einer Scheibe (insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material, hergestellt gemäss (VII) wurde in 50 (il PNA-gebundener Peroxidase (markiertes Lectin, hergestellt in (II)) und 200 |al der Probe (Testprobe, hergestellt gemäss (IX)) gegeben und 20 Stunden bei 25 °C inkubiert. Dann wurde diese Scheibe mit PBS gewaschen und in 2,0 ml einer wässrigen Kochsalzlösung gegeben und dazu wurden 0,5 ml des Per-oxidasematerials gegeben und das Ganze wurde 1 Stunde bei 25 °C inkubiert. Anschliessend wurden 1,0 ml einer 3N Chlorwasserstoffsäure zugegeben und die Absorption wurde bei 492 nm gemessen. In gleicher Weise wurde die Absorption gemessen, wobei jedoch Proben mit verschiedenen Kon658 132

zentrationen des Standardmaterials (PGM) verwendet wurden, um eine Kalibrierungskurve (Fig. 2) zu erhalten. Weiterhin wurde TAGS in der Testprobe erhalten gemäss (IX), unter Verwendung der Kalibrierungskurve bestimmt. Die Ergebnisse werden in den Fig. 3 und 4 gezeigt.

Aus den Fig. 3 und 4 geht hervor, dass ein ausgezeichneter Unterschied in den TAGS-Niveaus zwischen gesunden Personen und Personen, die an den verschiedenen Krebsarten erkrankt waren, besteht.

Beispiel 3 Sandwich-Verfahren: 200 ng PNA-Agarose, hergestellt in (III) wurden zu 100 |xl einer 0,05M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), enthaltend in Lösung 1 bis 10 |xg/ml PGM, gegeben und 1 Stunde bei 25 °C unter Rühren inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Reaktionslösung mit einer 0,05M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) wurden 6 |xg PNA, markiert mit Peroxidase, erhalten gemäss Beispiel 1(11), und 100 |il einer 0,05M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) zugegeben und anschliessend wurde 1 Stunde unter Rühren bei 25 °C inkubiert. Nach Zentrifugieren während 10 Minuten mit 3000 Upm wurde der Niederschlag gewonnen und dreimal mit einer 0,05M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gewaschen und die Absorption wurde bei 492 nm gemessen. Die Ergebnisse werden in Fig. 5 gezeigt.

Beispiel 4 Kompetitives Verfahren:

100 jxl einer Probe (Testprobe, erhalten nach dem Verfahren (IX)) wurden in ein Reagenzglas gegeben, zu dem 500 jj.1 einer 0,3M tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,22 W/V % Gelatine und 5 mM CaCl2 gegeben und dazu wurden 5 mM MgCl2 gegeben. Eine PGM-Perle (insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material, hergestellt nach dem Verfahren (VIII')) und 100 |il Lectin-Peroxidase (das lyophilisierte markierte Lectin, hergestellt gemäss Verfahren (II') in einer Konzentration von 1 mg/1 des vorher beschriebenen tris-HCl-Puffers) wurden zu der Probe gegeben und nach Rühren wurde das Gemisch 24 Stunden inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem Saugfilter abgesaugt und die Perle wurde mit 2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung auf einem Saugfilter gewaschen. Dieses Waschverfahren wurde dreimal wiederholt.

60 mg ortho-Phenylendiamin wurden in 200 ml eines 0,2M Mcllevin-Puffers (pH 5,8) gelöst und zu der Lösung wurde H202 bis zu einer Endkonzentration von 0,02 V/V% gegeben und das Gemisch wurde unter Bildung eines Färbungsmittels gerührt.

In einem Reagenzglas wurden 2 ml physiologische Kochsalzlösung und 500 (il des Färbungsmittels sowie die gewaschene Perle vorgelegt und dann wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die Enzymreaktion durch Zugabe von 1 ml 3N HCl abgestoppt. Die optische Dichte des Reaktionsgemisches wurde bei 492 nm bestimmt. In gleicher Weise wurde die Absorption gemessen, wobei aber Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen als Standardmaterial (PGM) verwendet wurden, um eine Kalibrierungskurve zu erhalten (Fig. 6). Dann wurde TAGS in den Testproben erhalten gemäss (IX) unter Verwendung der Kalibrierungskurve bestimmt. Die erzielten Ergebnisse werden in Fig. 7a, 7b, 7c und 7d gezeigt.

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4 Blatt Zeichnungen

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten, Glykoprotein enthaltenden Substanzen, TAGS abgekürzt, dadurch gekennzeichnet, dass man kompetitiv zu messendes Körperflüssigkeits-TAGS und eine definierte Menge an in-solubilisiertem TAGS oder insolubilisiertem TAGS-ähnli-chen Material mit einer definierten Menge markiertem Lec-tin reagiert, dass man das unlöslich gemachte TAGS oder unlöslich gemachte'TAGS-ähnliche Material, welches an das markierte Lectin gebunden ist, und ungebundenes Lectin voneinander trennt und die Aktivität des Markierungsmittels in einer der beiden Substanzen bestimmt.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das TAGS-ähnliche Material Galaktose-(ßl->- 3 oder ßl-> 4)-N-acetylglukosamin, Galaktose-(ßl-)- 3 oder ß 1 —► 4)-N-acetyl-galaktosamin oder ein Zuckerderivat, enthaltend eine solche Zuckerkette als Endgruppe, ist.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Lectin mit einem Enzym, einem fluoreszierenden Material oder einem radioaktiven Material markiert ist.
4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit Blut, Zellgewebeflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Toraxflüssigkeit, Eingeweideflüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, Magensaft, Urin, Pankreassaft, Ce-rebrospinalflüssigkeit oder Speichel ist.
5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das TAGS-ähnliche Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glykoprotein von humanem Magen-muzin, Glykoprotein, erhalten durch Entfernen von terminaler Fucose aus sulfatiertem Glykoprotein von der Magenr schleimhautmembran von Schweinen, humanem IgG-Glykoprotein oder dem Asialoderivat davon, Rinder-IgG-Glykoprotein, Asialoderivaten von Glykoprotein von Schweinethyroglobulin Glykolinkage B, Glykoprotein von ovomukoider ß-Untereinheit, Glykoprotein B-l von Hu-man-IgE oder einem Asialoderivat davon, Asialoderivaten von Glykoprotein B-2 oder B-3 von Human-IgE und Asialoderivaten von Glykoprotein II-C von Human-IgA!, Asialoderivaten von Glykoprotein II-B oder II-A von Human-IgAi, Asialoderivaten von Human-Transferringlykoprotein, Asialoderivaten von Rinderfötus-Glykoprotein, Deasialode-rivaten von Glykoproteinen, die an der Aufnahme von Asia-loglykoprotein von Kaninchenleberzellenprotoplasmischen Membranen teilnehmen, sulfatiertem Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut, Asialoderivaten von Human-arSäureglykoprotein, Asialoderivaten von Glykofolin, Glykoprotein von T-Antigen, Glykopeptid von T-Antigen, Asialo GMj = AMi und Glykolipiden von Rindererythrocyten, wobei das Markierungsmaterial für das Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glukoamylase, Glukose-oxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase, ß-Galaktosidase, aktive Bruchstücke von Hämoctapeptid,125J, 131J und radioaktivem Tritium; wobei das Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erdnusslectin und Kastorbohnenlec-tin; und der unlösliche Träger für das insolubilisierte TAGS oder insolubilisierte TAGS-ähnliche Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellulosepulver, Sephadex, Sepharose, Polystyrol, Filterpapier, Carboxymethylzellulo-se, Ionenaustauschharz, Dextran, Plastikfolie, Plastikrohr, Nylon, Glaskugeln, Seide, Polyamin-methylvinylether-Maleinsäure-Copolymer, Aminosäure-Copolymer und Ethylen-Maleinsäure-Copolymer.
6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das TAGS-ähnliche Material für das insolubilisierte TAGS-ähnliche Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glykoprotein von humanem Magenmuzin, Glykoprotein, erhalten durch Entfernen der terminalen Fucose aus sulfatiertem Glykoprotein von Schweinemagen-schleimhautmembran, Human-IgG-Glykoprotein oder dem Asialoderivat davon, Rinder-IgG-Glykoprotein, Asialoderivaten von Glykoprotein von Schweine-Thyroglobulinglyko-linkage B, Glykoprotein von ovomukoider ß-Untereinheit, Glykoprotein B-l von Human-IgE oder dem Asialoderivat davon, Asialoderivat von Glykoprotein B-2 oder B-3 von Human-IgE und Asialoderivate von Glykoprotein II-C von Human-IgA!, Asialoderivat von Glykoprotein II-B oder II-A von Human-IgA], Asialoderivaten von humanem Trans-ferringlykoprotein, Deasialoderivaten von Glykoprotein, die an der Aufnahme von Asialoglykoprotein aus Kaninchenle-berzellen-protoplasmischen Membranen teilnehmen, sulfatiertem Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut, Asialoderivaten von Human-apSäureglykoprotein, Asialoderivaten von Glykofolin, Glykoprotein von T-Antigen, Glykopeptid von T-Antigen, Asialo GM| = AM! und Glykolipiden von Rindererythrocyten, wobei das Markierungsmaterial für das Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glukoamylase, Glukoseoxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase, ß-Galaktosidase, aktiven Bruchstücken von Hämoctapeptid, 125J, I31J und radioaktivem Tritium; wobei das Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erdnusslectin und Castorbohnenlectin, und das insolubilisierte TAGS oder insolubilisierte TAGS-ähnliche Material eine Polymermatrix ist, die hergestellt wurde, indem man eine wässrige Dispersion eines polymerisierbaren Monomeren, enthaltend TAGS oder TAGS-ähnliches Material, mit Ionenstrahlen unter Polymerisation des Monomeren bestrahlt und wobei die wässrige Dispersion ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer wässrigen Dispersion eines Gemisches aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (A) und einem wasserlöslichen Polymer (B), einer wässrigen Dispersion eines Gemisches aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (A) und einem hydrophilen polymerisierbaren Monomer (C), einer wässrigen Dispersion eines Gemisches aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (A) und einem oberflächenaktiven Mittel (D), und einer wässrigen Dispersion aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (C), bei welchem das hydrophobe polymerisierbare Monomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycidylmethacrylat, Ethylenglykoldimeth-acrylat, Diethylenglykoldimethacrylat, Triethylenglykoldi-methacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat, Polyethy-lenglykol-200-dimethacrylat, Dipropylenglykoldimethacry-lat, 1,4-Butylenglykoldimethacrylat, 1,6-Hexanglykoldi-methacrylat, Methoxydiethylenglykoldimethacrylat, Me-thylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Butylmethacrylat und die entsprechenden Acrylate davon; wobei das wasserlösliche Polymer (B) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylpyrrolidon, Polymethacrylsäure, Polyacrylsäu-re, Polyvinylalkohol, Hydroxypropylzellulose und Gummiarabikum; wobei das hydrophile polymerisierbare Monomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-Hydroxy-ethylmethacrylat, Methoxytetraethylenglykolmethacrylat, Methoxypolyethylenglykol-400-methacrylat, Methoxypoly-ethylenglykol-1000-methacrylat, Polyethylenglykol-400-dimethacrylat, Polyethylenglykol-600-dimethacrylat und den entsprechenden Acrylaten davon, und Methacrylsäure, Acrylamid und N-Vinyl-2-pyrrolidon; und das oberflächenaktive Mittel (D) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natriumlaurylsulfat, Kaliumoleat, Natriumoleat, Sor-bitmonolaurat, Sorbitmonostearat, Sorbitmonooleat, Pro-pylenglykolmonolaurat, Ölsäure und Natriumdodecylben-zolsulfonat.
7. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das insolubilisierte TAGS-ähnliche Material eine Polymermatrix ist, die hergestellt wurde durch Bestrahlen ei2

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ner wässrigen Dispersion eines Hydroxyethylmethacrylats, enthaltend sulfatiertes Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut mit Röntgenstrahlen und wobei das markierte Lectin Peroxidase-markiertes Erdnusslectin ist.
8. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das insolubilisierte TAGS-ähnliche Material auf Polystyrolperlen insolubilisiertes sulfatiertes Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut ist und dass das markierte Lectin ein Peroxidase-markiertes Erdnusslectin ist.
9. Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten, Glykoproteine enthaltenden Substanzen, TAGS abgekürzt, dadurch gekennzeichnet, dass man kompetitiv zu messendes Körperflüssigkeits-TAGS und eine definierte Menge von markiertem TAGS oder markiertem TAGS-ähnlichen Material mit einer definierten Menge an Lectin oder unlöslich gemachtem Lectin umsetzt, dass man das markierte TAGS oder das markierte TAGS-ähnliche Material, das mit dem Lectin verbunden ist oder insolubilisiertes Lectin und ungebundenes markiertes TAGS oder markiertes TAGS-ähnli-ches Material voneinander trennt und die Aktivität des Markierungsmittels in einer der Substanzen bestimmt.
10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das TAGS-ähnliche Material Galaktose-(ßl-> 3 oder ßl -> 4)-N-acetylglukosamin, Galaktose-(ßl-> 3 oder ßl -» 4)-N-acetylgalaktosamin oder ein Zuckerderivat, enthaltend Glykoprotein als Endgruppe, ist.
11. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte TAGS oder das markierte TAGS-ähnliche Material mit einem Enzym, einem fluoreszierenden Material oder einem radioaktiven Material markiert ist.
12. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit Blut, Zellgewebeflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Toraxflüssigkeit, Eingeweideflüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, Magensaft, Urin, Pankreassaft, Ce-
13. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das TAGS-ähnliche Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glykoprotein von Human-Magen-schleimhaut, Glykoprotein, erhalten durch Entfernen der terminalen Fucose von sulfatiertem Glykoprotein von Schweinemagenschleimhautmembran, Human-IgG-glyko-protein oder dem Asialoderivat davon, Rinder-IgG-Glyko-protein, Asialoderivaten von Glykoprotein von Schweine-Thyroglobulin-glykolinkage B, Glykoprotein von ovomukoider ß-Untereinheit, Glykoprotein B-l von Human-IgE oder dem Asialoderivat davon, Asialoderivaten von Glykoprotein B-2 oder B-3 von Human-IgE und Asialoderivaten von Glykoprotein II-C von Human-IgAi, Asialoderivaten von Glykoprotein II-B oder II-A von Human-IgA!, Asialoderivaten von Human-Transferringlykoprotein, Asialoderivaten von Rinderfötusglykoprotein, Deasialoderivaten von Glykoprotein, die an der Aufnahme von Asialoglykoprotein aus Kaninchenleberzellen-protoplasmischer Membran teilnehmen, sulfatiertem Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut, Asialoderivaten von Human-arSäureglyko-protein, Asialoderivaten von Glykofolin, Glykoprotein von T-Antigen, Glykopeptid von T-Antigen, Asialo

GMi = AM! und Glykolipiden von Rindererythrocyten; wobei das Markierungsmaterial für TAGS oder TAGS-ähnliches Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glukoamylase, Glukooxidase, Peroxidase, Alkaliphos-phatase, ß-Galaktosidase, aktiven Bruchstücken von Hämoctapeptid, 125J, 131J und radioaktivem Tritium; und wobei das Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erdnusslectin und Kastorbohnenlectin und der unlösliche Träger für das insolubilisierte Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellulosepulver, Sephadex, Sepharo-se, Polystyrol, Filterpapier, Carboxymethylzellulose, Ionen-austauschharz, Dextran, Plastikfolie, Plastikrohr, Nylon,

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Glasperlen, Seide, Polyaminomethylvinylether-Maleinsäure-Copolymer, Aminosäure-Copolymer und Ethylen-Malein-säure-Copolymer.
14. Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten, Glykoproteinen TAGS abgekürzt, dadurch gekennzeichnet, dass man das zu bestimmende Körperflüssigkeits-TAGS mit einem insolubilisierten Lectin unter Bildung von TAGS-insolubilisiertem Lectinkomplex umsetzt, dass man diesen Komplex mit einer definierten Menge markierten Lectins umsetzt, dass man den an das markierte Lectin gebundenen Komplex und ungebundenes markiertes Lectin voneinander abtrennt und dann die Aktivität des Markierungsmittels in einer der beiden Komponenten misst.
15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Lectin mit einem Enzym, einem fluoreszierenden Material oder einem radioaktiven Material markiert ist.
16. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit Blut, Zellgewebeflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Toraxflüssigkeit, Eingeweideflüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, Magensaft, Urin, Pankreassaft, Cerebrospinalflüssigkeit oder Speichel ist.
17. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Lectin in dem insolubilisierten Lectin oder markierten Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erdnusslectin und Kastorbohnenlectin, dass das Markierungsmaterial für das markierte Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glukoamylase, Glukooxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase, ß-Galaktosidase, aktiven Bruchstücken von Hämoctapeptid, l25J, 131J und radioaktivem Tritium, und dass der unlösliche Träger für das insolubilisierte Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellulosepulver, Sephadex, Sepharose, Polystyrol, Filterpapier, Carboxymethylzellulose, Ionenaustauschharz, Dextran, Plastikfolie, Plastikrohr, Nylon, Glaskugeln, Seide, Poly-amin-methylvinylether-Maleinsäure-Copolymer, Aminosäu-re-Copolymer und Ethylen-Maleinsäure-Copolymer.
18. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Lectin des insolubilisierten Lectins oder markierten Lectins ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend . aus Erdnusslectin und Kastorbohnenlectin, dass das Markierungsmaterial für das markierte Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glukoamylase, Glulcoseoxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase, ß-Galaktosidase, aktiven Bruchstücken von Hämoctapeptid,125J, 131J und radioaktivem Tritium; dass der insolubilisierte Träger für das insolubilisierte Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellulosepulver, Sephadex, Sepharose, Polystyrol, Filterpapier, Carboxymethylzellulose, Ionenaustauschharz, Dextran, Plastikfolie, Plastikrohr, Nylon, Glasperlen, Seide, Poly-amin-methylvinylether-Maleinsäure-Copolymer, Aminosäure-Copolymer und Ethylen-Maleinsäure-Copolymer, und dass das insolubilisierte Lectin eine polymere Matrix ist, die hergestellt wurde durch Bestrahlen einer wässrigen Dispersion eines polymerisierbaren, Lectin enthaltenden Monomers mit Ionenstrahlen unter Polymerisation des Monomers, wobei die wässrige Dispersion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer wässrigen Dispersion eines Gemisches aus hydrophobem polymerisierbaren Monomer (A) und einem wasserlöslichen Polymer (B), einer wässrigen Dispersion eines Gemisches aus hydrophobem polymerisierbaren Monomer (A) und einem hydrophilen polymerisierbaren Monomer (C), einer wässrigen Dispersion eines Gemisches aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (A) und einem oberflächenaktiven Mittel (D), und einer wässrigen Dispersion eines hydrophilen polymerisierbaren Monomers (C), wobei das hydrophobe polymerisierbare Monomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycidylmeth-

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acrylat, Ethylenglykoldimethacrylat, Diethylenglykoldi-methacrylat, Triethylenglykoldimethacrylat, Trimethylol-propantrimethacrylat, Polyethylenglykol-200-dimethacrylat, Dipropylenglykoldimethacrylat, Methoxydiethylenglykoldi-methacrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Butyl-methacrylat und entsprechenden Acrylaten davon; und das wasserlösliche Polymer (B) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylpyrrolidon, Polymethacrylsäure, Po-lyacrylsäure, Polyvinylalkohol, Hydroxypropylzellulose und Gummiarabikum; wobei das hydrophile polymerisierbare Monomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-Hydroxyethylmethacrylat, Methoxytetraethylenglykolmeth-acrylat, Methoxypolyethylenglykol-400-methacrylat, Meth-oxypolyethylenglykol-1000-methacrylat, Polyethylenglykol-400-dimethacrylat, Polyethylenglykol-600-dimethacrylat und den entsprechenden Acrylaten davon, und Methacryl-säure, Acrylamid und N-Vinyl-2-pyrrolidon; und das oberflächenaktive Mittel (D) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natriumlaurylsulfat, Kaliumoleat, Natrium-oleat, Sorbitmonolaurat, Sorbitmonostearat, Sorbitmono-oleat, Propylenglykolmonolaurat, Ölsäure und Natriumdo-decylbenzolsulfonat.
19. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Lectin Peroxidase-markiertes Erdnusslectin und das insolubilisierte Lectin Sepharose-inso-lubilisiertes Erdnusslectin ist.
20. Verfahren zur Diagnose von Krebs, dadurch gekennzeichnet, dass man das Niveau an Tumor-assoziierten Gly-koproteinen in einer Körperflüssigkeit eines Patienten, gemäss dem in den Ansprüchen 1,9 und 14 beschriebenen Verfahren, misst und das so gemessene Niveau mit dem einer Person normaler Gesundheit vergleicht.