JPS62187254A

JPS62187254A - ガングリオシドの分析方法

Info

Publication number: JPS62187254A
Application number: JP2889286A
Authority: JP
Inventors: Akira Matsumoto; 亮松本; Yoshio Hirabayashi; 義雄平林; Hitomi Kasakura; 笠倉　仁美; Hideyoshi Azuma; 秀好東; Shiro Kato; 加藤　四郎
Original assignee: SHINOTESUTO KENKYUSHO KK; Shino Test Corp
Current assignee: SHINOTESUTO KENKYUSHO KK; Shino Test Corp
Priority date: 1986-02-14
Filing date: 1986-02-14
Publication date: 1987-08-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は生体試料中の糖脂質を免疫学的に分析する方法
に関するものである。

更に詳しくは、本発明は生体試料中の糖ｍ質であるＧＭ
、ＳＧＭ、、ＧＤ、　ａ、ＧＤ、　ｂ等のガングリオシ
ドをそれぞれアシアロ誘導体とし、それに特異的な抗体
を作用させ、酵素抗体染色して分析する方法に関するも
ので、この方法により、神経疾患、ガングリオシド−シ
ス及び癌の早期発見等の臨床診断に役立てようとするも
のである。

［従来技術とその問題点］ガングリオシドはシアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総
称であり、神経細胞中に多く含まれている。又、ｍ胞膜
成分として、ｍ胞接着や増殖１ｌ１３ｉＷ１などに関与
するとともに、ホルモンなどの受容体や膜の抗原決定基
としての役割を果たしている。しかも、悪性化細胞膜上
の糖脂質のいくつかは個体の免疫系により腫瘍抗原とし
て認識されるにつれ、近年、微量ガングリオシドの生理
Ｗ１能に大きな関心が寄せられている。

ガングリオシドの分析法については、本発明者らは、既
にＮ−グリコリルノイラミン酸含有ガングリオシドをす
〃ンドとしたアフイニテイクロマト力ラムによりＨＤ抗
体を精製し、この精製抗体を用いて薄層クロマトグラフ
ィー上で＃素抗体染色する方法を紹介した（生化学、５
７巻、２号、１３３頁、１９８５年）。この方法により
微量の材料しか入手できなかったヒト腫ｍＭＬｎの抗原
糖脂質の超微量（ｐｘｏルベル）検出が可能となった。

しかし、脳の主要ガングリオシドである０Ｍ２、ＧＭ、
、ＧＤ、　ａ、ＧＤｌｂ、　ＧＴ、　ｂ、　ＧＱ＋　ｂ
等のように抗原性が無いか、或いは非常に弱いものにつ
いては各々に対する抗体作製が難しく、その検出は極め
て困難であった。この様なガングリオシドの分析に討し
てはその特異抗体を利用できればよいが、その作製は極
めて困難である。

一方、シアル酸は細胞表面に存在する糖タンパク質或い
は糖脂質の糖鎖末端をしめているため、細胞の特異的認
識機構に極めて重要な役割をなしている。この為、シア
ル酸の特異的役割は抗体による認寵機構にも当然大きく
関係する。

従来から、シアル酸のような酸性基をもった糖は免疫性
優位基とはならず、逆にその陰性電荷によって細胞の抗
原性を隠蔽すると考えられてきた。いわゆる、トムセン
（Ｔｈｏｍｓｅｎ）効果といわれているものは、細胞表
面からシアル酸を除去すると抗原性が高まるものである
。この様な現象は、一般的に抗原性の非常に弱いガング
リオシドでも、シアル酸を除去して、アシアロ体−二導
けば、その抗原性は活性化され、より特異的な免疫反応
の可能性を示唆するものである。

実際にガングリオシドのシアル酸残基をシアリダーゼに
よって除去する試みも、従来研究されている。この研究
によれば、ガングリオシドを薄層クロマトグラフィーで
分難し、シアリダーゼによってオリゴ糖鎖骨格からシア
ル酸残基を除去してアシアロ体に導き、これにアシアロ
ガングリオシド抗体を作用させ、その後１２５ニブロチ
インＡを用いてＸ線フィルムでガングリオシドの構造を
解析している（　Ｍ、　５ａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ　、　
Ａｎａ−Ｉｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓ
　１４８．５４．１９８５）　、　　ｔ、かじ、この方
法では厳密なガングリオシドの定量化は行なっておらず
、かつラジオアイソトープを用いているため、その安全
性及び取り扱いの面で依然として問題が残る。

［発明が解決しようとする問題点］本発明者らは、上記のような問題を解決するうえで、ガ
ングリオシドをシアリダーゼで処理することにより、こ
れをアシアロ体に導き、このアシアロ体に対する特異抗
体を作用させることに着目し、研究を重ねた結果、がン
グリオシドを酵素抗体染色法にて超微量で検出・定量化
できる方法を見出し、本発明を完成させた。

［問題点を解決するための手段］本発明は、生体試料中のガングリオシドを薄層クロマト
グラフィーで分離後、薄層上で直接シアリグーゼ処理す
る二とにより、ガングリオシドをアシアロ化合物に導き
、生じたアシアロ化合物に対する特異抗体を作用させ、
酵素抗体染色することを特徴とするガングリオシドの分
析方法である。

ガングリオシドはシアリダーゼの処理によってアシアロ
ガングリオシドに導く。アシアロガングリオシドは、こ
れに対応する抗アシアロＧＭｌ（ＧＡＩ）又は抗アシア
ロＧＭ２（ＧＡ２　）抗体を坩いて特異的に免疫反応さ
せる。この特異的免疫反応によって形成される反応複合
体に、酵素標識抗ＩｇＧ抗体を反応させる。反応後、Ｒ
ｌＨａＩＩｌｋｅｓらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　
Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　１１９＊　１４２．１９
８２．）によりＷ４製した基質溶液で発色反応を行なう
。

シアリダーゼは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｕｒｅａ
　ｆａｃｉｅｕｓ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒ
ｆｒｉｎｇｅｎｓ起源の両酵素共にＧＭ、を氷解する活
性を同程度有していることから、それら起源のものが使
用可能であるが、前者の方が酵素標品の純度が高く、好
適である。シリカゾル薄層板上でのシアリグーゼ反応は
ｐＨ４，５付近で行なう。この際、ＧＭ、及びＧＭ２ｆ
ｆングリオシドを基質に用いたＧＡ、及びＧＡ２生成量
から判断して、酵素量は０．０１〜１．　ＯＵ／ｘｉの
範囲で使用可能であるが、通常０．　Ｉ　Ｕ／ｘｉを用
いれば充分である。又、反応時間は０．５〜１２時間ま
で変化させて、Ｇ　Ａ　＋及びＧＡ２の生成量を調べた
結果、抗アシアロＧＭ、（ＧＡ、　）及び抗アシアロＧ
Ｍ２（ＧＡ２）抗体によるＧＡ、及びＧＡ２の検出感度
から判断して約６時間位で充分である。

シアリダーゼはガングリオシドを基質ｌこするとき、そ
の活性に界面活性創の影響がある。例えば、タウロデオ
キシコール酸での影響ではＯ０５ｙｒｇ／ｄまでその濃
度に依存してＧＡ、及びＧＡ２の　［生成量は増加する
。従って、界面活性斉りを用いると有利になる。使用可
能な界面活性剤はタラロブオキシフール酸のほかに、タ
フロコール酸、タウロケノデオキシコール酸、タウロリ
ドフール酸などの胆汁酸及びトライトンＸ−１００、ト
ライトンＣＦ−５４など公知のものが挙げられる。

本発明で使用する抗アシアロ〃ングリオシド特異抗体は
、高純度の化学合成抗原を用いて得られる。例えば、合
成アシアロガングリオシドをウシ血清アルブミン、赤血
球膜蛋白などの担体高分子と混合したものを抗原として
ヒト以外の動物に皮肉注射して産生させることができる
。

又、酵素５ａ抗ＩｇＧ抗体は抗アシアロガングリ作用］本発明により試料中のＧＭ、、ＧＤｌａ、ＧＤ、　ｂ、
ＧＴ、　ｂ、ＱＱ、ｂｈ４のガングリオシドをＨｉＯ量
（ｐｚｏルベル）にて検出・定量化することが可能とな
った。又、本発明の方法による応用例として、ヒトＷｉ
液中のガングリオシド分析を行なった結果、ヒト髄液中
には微量成分としてＧＡ、、ＧＭ、、ＧＤ、　ａ等のガ
ングリオシドが存在していることを明らかにすると共に
、ＧＭ、ｆｆングリオシドーシス髄液においてはＧＭ、
　ｗングリオシドが正常人の１０倍以上に増大している
ことを明らかにした。この様に、本発明は髄液中のガン
グリオシドを定量することによって中枢神経疾患のみな
らず、ガングリオシド−シス、癌及びその他の疾患の診
断にも応用されることが期待できる。

以下、本発明を試験例と実施例にて具体的に説明するが
、本発明はこれによってなんら限定されるものではない
。

試験例１、抗アンアロＧＭ、抗体の作製 ■抗アシアロＧＭ、抗血清の作製Ｓｕｇｉｍｏｔｏらの方法（ＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕＨａ
ｔｅｓ　ＩＬｆ　２１１　Ｌｉ２８５）により化学合成
したアシアロＧＭ、　２００μｇとメチル化アルブミン
１　ｙｔｇを１　ｄの蒸留水に懸濁させた。この１ｇｌ
濁液に７０インドコンプリードアツユバント１　ｍｌを
加え乳化した。

この乳化液２　ｘｌを家兎に皮肉注射した。２週間後に
再び同乳化液を皮肉注射し、２週間後金採血して抗血清
を得た。

■抗アシアロＧＭ、抗体の精製得られた抗血清は硫安７０％飽和で塩析した。沈澱物を
集めＰＢＳに対して透析した後、セファデックスＧ−２
００カラムクロマトグラフイーにかけ１８０画分を得た
。この１８０画分を別に調製したアシアロＧＭ、結合オ
クチルセファ０−ス１．５ｚｊ！をつめたカラムに流し
た後、カラムをＰＢＳで十分洗浄した。ＰＢＳに溶かし
た１、０Ｍヨウ化ナトリウム、続いて３．０Ｍチオシア
ン化ナトリウム溶液で抗体を溶出した。１．０Ｍヨウ化
ナトリウム溶出画分及び３．０Ｍチオシアン化ナトリウ
ム溶出画分を集めてＰＢＳに対して透析し、抗アシアロ
ＧＭ、抗体とした。

■抗アシアロＧＭ、結合オクチルセファロースの調製アシアロＧＭ、　１　ｚｇを０．１Ｍ塩化カリウム含有
メタ／−ル／水（Ｇ　１　、　ｖ／ｖ）混８Ｉ２　ｍｌ
に加温懸濁した。これをオクチルセファロース懸濁液（
０，１Ｍ塩化カリウム含有メタノール／水（１：１゜ｖ
／ｖ）混液にゲルとして１　ｘｉを懸濁〕２１Ｊ□１中
に速やかに加え、激しく攪拌した。ときどき攪拌しなが
ら３０分間、室温に放置しアシアロＧＭ、をオクチルセ
フ７０−スに結合させた。

２、抗アシアロＧＭ２抗体の作製Ｓ　ｕｇ　ｉｍｏｔｏらの方法により化学合成したアシ
アロＧＭ２２００μｇを用いて、抗アシアロＧＭ、抗体
を作製した方法と同様に行なって抗アシアロＧ　Ｍ２抗
体を作製する。

実施例１、ガングリオシドの分析 ■分析試料の作製髄液１　ｘｉを凍結乾固した。総脂質はクロロホルム／
メタノール（２：１　＝　ｖ／ｖ）混液で抽出した。抽
出液をよく乾固後、クロロホルム／メタノール（８：２
　、　ｖ／ｖ）混液にて再び溶かした後、質を溶出した
後、総糖脂質をクロロホルム／メタ／−ル／水（５：５
：１　、　ｖ／ｖ）にて溶出した。

ここで得た総糖皿質画分をガングリオシド分析の試料と
して用いた。

■分析方法に上記■で作製した総糖脂質試料を３〜４ｕ幅にスポッ
トし、薄層をクロロホルム／メタノール／水（５０：４
０：１０　、　ｖ／ｖ）にて展開する。

ドライヤーにてよく乾かした後、１回目と同じ方向にク
ロロホルム／メタ７−ル／２，５ＮＮＨ，○Ｈ（５０：
４０：１０　、ｖ／ｖ）にて再展開する。風乾後、１％
卵白アルブミン、１％ポリビニルピロリドン（ｐｖｐ）
及び０．０２％ＮａＮ３を含むＰ　Ｂ　Ｓ（Ａ液とする
）に浸し、３０分間放置する。ｒｇＭ　７”　レー）　
ヲ０．０１　Ｍ　酢Ｒ緩Ｍｕ液、ｐＨ４，６にて２回洗
浄後、同腹にシアリダーゼ（ＡｒｔｈｒｏｂａｃＬｅｒ
　ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）　０．　Ｉ　Ｕ／ｚｌ（０
，２ｘｌ／ｃｍ２）を加え、０．２，５３１り／ｘｉの
タウロデオキシコール酸Ｎａ存在下にて３０℃、６時間
ゆるやかに振とうして反応させる。その後、Ａ液で洗浄
してシアリダーゼ反応を停止させる。

シアリダーゼにより生じたアシアロガングリオシドの染
色は、試験例にて作製した抗アシアロＧＭ、（ＧＡ、　
）抗体をＡ液にて１０００倍肴釈したものを（１００μ
ｍ／ｃｙｔ２）プレートに加え、Ｓにて洗浄し、次いで
西洋わさびパーオキシグーゼ標識抗つサギＩｇＧ抗体を
１：１０００にて３％ＰＶＰを含むＰＢＳで希釈したも
のと２時間３０℃で振とうして反応させる。反応後、Ｐ
ＢＳにてよく洗浄し、Ｈａｗｋｅｓらの方法により調製
した４−クロロ−１−す７トール／Ｈ２０２溶液を加え
室温で５〜１０分間呈色反応を行なう。薄層プレートは
水洗後、風乾し、デンシトメトリーにより発色したスポ
ットを５７８ｎｍ、’７７レクタンス・モードにて定量
する。

■分析結果ヒト髄液中には、ＧＡ＋、ＧＭ、、ＧＤ＋　ａ　、　Ｇ
Ｄ＋　ｂ。

が存在していることが判明した。臨床検体として髄液０
．３〜Ｏ，Ｓｘｌもあれば充分分析可能であり、総ガン
グリオシド含量は１００〜１５０ｐｘｏｌ／ｍｌ髄液で
あった。又、各々のガングリオシドの分析結果は表１に
示す通りであった。

°ス丁条色

Claims

【特許請求の範囲】

生体試料中のガングリオシドを薄層クロマトグラフィー
で分離後、薄層上で直接シアリダーゼ処理することによ
り、ガングリオシドをアシアロ化合物に導き、生じたア
シアロ化合物に対する特異抗体を作用させ、酵素抗体染
色することを特徴とするガングリオシドの分析方法。