JPS61292062A - α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法 - Google Patents

α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法

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JPS61292062A
JPS61292062A JP12396985A JP12396985A JPS61292062A JP S61292062 A JPS61292062 A JP S61292062A JP 12396985 A JP12396985 A JP 12396985A JP 12396985 A JP12396985 A JP 12396985A JP S61292062 A JPS61292062 A JP S61292062A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、腫瘍マーカーである体液中のα−フェトプロ
テイン(以下AFPと称する)または細胞培養液上清中
のAFPを分画・検出するための検出試薬キットおよび
体液中または細胞培養液上清中のα−フェトプロテイン
の分画検出方法に関する。
(従来の技術) 腫瘍のマーカー物質である体液中のα−フェトプロテイ
ンを分画・検出することについては従来などで1次元の
電気泳動を行って、レクチン親和性の異なるAFPを分
離し、さらに抗A、FP抗体を含有するアガロースゲル
で1次元目とは直角の方向に2次元目の電気泳動を行な
い、分離されたAFPの各スポットを色素を用いた非特
異的蛋白染色十−゛°  −チ −ロ    − −・
 ′合倹含によシ検出している。〔スカンジナビアンジ
ャーナルオブイムノロジー(5cand、 J、 Im
munol、 ) ] 4 )ネ〆) 15〜20 (1,981) ]、〔肝臓υ、1559
〜1568(1981)〕シかしながら、この方法は感
度が低く、低濃度AFPの試料のレクチン親和性による
分離結果を定量的に評価することは不可能であった。
この点を改良するために、本発明者らは、分離されたA
FPと抗AFP抗体の複合物からなるピークをプロティ
ンA−酵素複合体を用いて特異的に染色する方法を開発
した〔エレクトロフオレシス(Electrophor
esis ) 4.37N −373(1983) ]
。この方法では0.5ngのAFPを検出できるが、レ
クチン親和電気泳動に用いるにはまだ充分な感度ではな
く、また、これらの方法は電気泳動を2回行うため長時
間を要し、多数の検体を同時に処理することも困難であ
った。
そこで、本発明者らはさきにレクチン含有アガロースゲ
ルを用いた1次元電気泳動を行ない、こ ″れによシ分
離したレクチン親和性の異なるAFPを第2次元日の電
気泳動を実施することなく、抗AFP抗体を結合させた
ニトロセルロース膜に電気ゴ 転写またはゴロツテイングによる抗体親和転写をするこ
とによシ検出できることを見出した。〔生物物理化学第
28巻、第2号、第21頁および第28巻、第5号、第
13頁(1984))  かかる方法は、上記の電気泳
動を2回行う方法に比べ簡単でしかもAFPを感度よく
検出できるが、まだ実用的レベルには達してはいなかっ
た。
(発明が解決しようとする問題点) したがって、本発明が解決しようとする問題点は、低濃
度のAFPを含む少量のサンプルについてAFPをレク
チン親和性の差異によって分画して高感度に検出するた
めの、検出試薬キットおよび検出方法を見出すことであ
る。
(問題点を解決するための手段) かかる問題点は以下に述べて本発明(AFPの分画検出
試薬キットおよびAFPの分画検出方法の2発明からな
る)により解決される。
1) (+)レクチン含有アガロースゲル(I+) 抗
AFP抗体結合ニトロセルロース膜・  佃)該レクチ
ンと特異的相互作用を有する単糖またはオリゴ糖の溶液 0φ該抗AFP抗体とは異なる動物種由来の抗AFP抗
体 (■)Qφで用いる動物種の免疫グロブリンに対する抗
体に酵素標識したものおよび (VD (V)の酵素によって発色する基質からなるA
FPの分画検出試薬キット。
■ レクチン含有アガロースゲルにて電気泳動を行なっ
てAFPを分画したものを抗AFP抗体結合ニトロセル
ロース膜にブロッティングによシ抗体親和転写し、転写
されたニトロセルロース膜を、使用したレクチンと特異
的相互作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶液で洗浄し、
しかる後に該膜への結合に用いた抗AFP抗体とは異な
る動物種由来の抗AFP抗体をかえ、さらに、上記の動
物種の免疫グロブリンに対する抗体に酵素標識したもの
をかえ、ついで該酵素によって発色する基質を加えるこ
とを特徴とするAFPの分画検出方法。
以下、本発明の構成をさらに詳細に説明する。
(1)  レクチン含有アガロースゲルによる電気泳動
レクチンとしては、コンカナバリンA(Con −A 
)、レンズマメレクチンA(LCA−A)、赤血球凝集
性インゲンマメレクチン(E−PHA)などが用いられ
る。アガロースゲルは通常のアガロース(LitexL
SBなど)をpH8,61、イオン強度0.025のベ
ロナール緩衝液に溶解して作成した厚さ1111111
程度のゲルで、これにレクチンが含有される。レクチン
の添加量としてはアガロースゲル】rnl当J)Con
Aで0、6〜1− OH/ml、LCA−Aで0.21
rLg/WL1前後、Ii’−PHAで0.5 mQ/
m1前後が適当である。試料溝の大きさは0.8 X 
5 wn程度が適当である。電気泳動は、15Vフイm
の定電圧下、5℃で行なわれるが、これによシ体液(血
清、腹水等)中のAFPがゲル中で分画される。
(2)抗AFP抗体結合ニトロセルロース膜の作成抗A
FP抗体としては、アクタ メゾイカ オカヤマ(Ac
ta MBd、 Okayama ) 1984年第3
8巻第409〜413頁に記載されたものが用いられる
。これをアフイニテイ・クロマトグラフィーで精製して
用いる場合には、100μM讐の抗体を含む10−のト
リス塩酸緩衝液(PH7,s )にニトロセルロース膜
(5X9.2c11)を30分間浸漬して結合させる。
・高純度の抗体は、111Lg当シ200μm以上のA
FPを結合するが、純度の低い抗体でも、その力価に応
じて使用量を増加させることによ)使用できる。
ニトロセルロース膜に結合した抗AFP抗体は、グルタ
ルアルデヒドの蒸気に30分さらすことによ)固定化さ
れる。未反応のアルデヒド基は水素化ホウ素ナトリウム
によシ還元、不活性化される。
タンパク質のニトロセルロース膜への非特異的吸着を防
ぐためには、3%のゼラチンも用いられるが2%のツイ
ーン(Tween ) 20で2分、又は0.5%のツ
イーン20で30分処理することによシ同時に感度も増
加させ得る。
処理の終った抗AFP抗体結合ニトロセルロース膜は、
トリス塩酸緩衝液で洗浄後、減圧乾燥して4℃で保存す
る。
(3)  アガロースゲルから抗AFP抗体結合ニトロ
セルロース膜への転写 電気泳動処理の終ったアガロースゲルと、抗AFP抗体
結合ニトロセルロース膜とを密着させ、1c11当px
o1程度の圧力を加えて20分程度放置することによJ
、AFPをアガロースゲルからニトロセルロース膜へ転
写する。従来、ここで電気転写が用いられていたが、毛
細管現象によるブロッティングを利用した本発明の抗体
親和転写法の方が感度が良い。転写後、使用したレクチ
ンと特異的相互作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶液、
すなわち、Con−AおよびLCA−Aに対しては0.
2モルのα−メチル−D−マンノシド、グルコース、マ
ンノース、マルトースなどでニトロセルロース膜を洗浄
する。とくに、Con−Aの場合は、α−メチ/l/−
D−マンノシドが適している。これは、純度が低い抗A
FP抗体を用いたときには、ニトロセルロース膜の非特
異発色によるバックグラウンドが高いので、これを低減
するために重要でアシ、また、純度が高い抗AFP抗体
を用いたときにも、分離されたAFPのレクチン親和性
の差によって発色の濃度が異なるという現象を避けるこ
とができる。
(4)第二抗体の結合 転写、洗浄の終ったニトロセルロース膜をAFPに対す
る第二抗体の溶液で処理する。第二抗体としては、最初
にニトロセルロース膜に結合させた抗AFP抗体とは別
の動物種のもの、たとえば第一抗体がウマであれば第二
抗体はウサギのものを周込る。この抗体は市販の抗AF
Pグロブリンを250〜1000倍、好ましくは500
倍にトリス塩酸緩衝液(1%ゼラチン又は0.05%ツ
イーン2oを含む)で希釈したものを用いる。
た場合、これを検出するためにパーオキシダーゼで標識
したヤギ抗つサギエgG抗体を加える。この抗体は50
0倍〜2000倍、好ましくは1000倍にトリス塩酸
緩衝液で希釈して用いる。
(7)  AFPバンドの検出 AFPの検出にはパーオキシダーゼによシ発色する基質
を加えれば良く、0.025%ジアミノベンジジン(o
、osモルトリス塩酸、pH7,6)  及び0.00
5%過酸化水素、0.05%4−クロロ−1−ナフトー
ル(メタノ−μ加トリス塩酸) 及び0.015%過酸
化水素、又は0.02%4−メトキシ−1−ナフトール
(メタノール加トリノ塩酸)及び0.005%過酸化水
素などが用いられる。発色したバンドは肉眼観察又はデ
ンシトメーターでの定量によ、9 AFP濃度が測定で
きる。
したがって、(1)レクチン含有アガロースゲル、(i
i)抗AFP抗体結合ニトロセルロース膜、0ii)該
レクチンと特異的相互作用を有する単糖又はオリコ゛糖
の溶液、Qφ該抗AFP抗体とは異なる動物種由来の抗
AFP抗体、(v)Oφで用いる動物種の免疫グロブリ
ンに対する抗体に酵素標識したものおよびIVO(■)
の酵素によって発色する基質をセットとして分析者に提
供することによシ、AFPの検出が便利に行われる。
(発明の効果) 本発明によシ、低濃度のAFPが少量のサンプルで検出
可能となった。後述の実施例に示す最良の結果では、A
FP 4 nvrnlの試料3 μnを0.5 X 6
 tanの試料溝に添加することによシ検出されている
。すなわちAFP 4 pf/−の存在を検出できる。
従来の無処理ニトロセルロース膜への転写法では、血清
検体あるいはレクチンを含むゲルを用いての電気泳動の
ように多量の他の蛋白質が存在する時にはAFPの定量
的な転写ができなく、また、電気転写では感度が低かっ
たが、本発明では前述のようにプロッティングによる抗
体親和転写を採用しているのでAFPの定量的転写が可
能となシ、また、本発明では従来から知られている抗体
親和転写法に比し、転写後のニトロセルロースatレク
チンと相互作用を有する単糖またはオリゴ糖の溶液で洗
條するので、レクチンの存在によジニトロセルロース膜
上の反応でレクチン結合性AFPがレクチン非結合性A
FPに比べて発色が強くなるという問題もなくなシ、ま
た、純度の低い抗AFP抗体を用いたときの発色段階に
おける高いバックグランドを低減させることもできる。
(実施例) (1)抗体結合膜の調製 ヒトAFPに対する純化ポリクロナールウマ抗体(また
はIgG分画、とくにことわらない場合はウマ抗体) 
100 ttf/−を含むTBS (20mM Tri
s −HCl 。
NC膜という。)を処理した。30分間処理を行な歎 った後、炉7で膜をぬぐい、さらに膜を30分間グルタ
ルアルデヒド蒸気にさらした後、0.02%NaBH4
−TB S溶液で中和処理した。ついで、該膜にTBS
洗條、0.5%ツイーン−20のTBS溶液(またはゼ
ラチンのTBS溶液、とくにことわらない場合はツイー
ン−20のTSB溶液)によるブロック(30分間)、
TBS洗條を行ない、該膜を真空乾燥し、4℃で保存し
た。
(iD  を気泳動 バルビタール/バルビタールソーダのゲル緩衝液(イオ
ン強度0.025、pH8,6)で、レクチン添加のも
とで、ゲルボンドフィルム(FMC製)上に調製した1
M厚のアガロースゲル板(1%Litex %LSB 
)中で以下の条件で電気泳動を行なった。すなわち、0
.8×5×1サイズのサンプル溝に適度に希釈したAF
P試料4μ4を入れ、電子冷却泳動槽中で、バpビター
/I//パルビターA/ソーダ(イオン強度0.05、
pH8,6)を電極緩衝液として15v/αの定電圧下
5℃で行った。なお、AFPの希釈はBPBを含むゲル
緩衝液で行い、BPBの最終濃度を0.05%に調製し
た。
011)抗体親和転写 電気泳動後のアガロースゲルを、TBSを含浸させた抗
体結合NC膜と密着させ、口紙パッドを用いて1cII
t当p1oy程度の圧力を20分加えることによ、9、
AFPをアガロースゲルからニトロセルロース膜へブロ
ッテイングにより転写させた。0.2Mのα−メチル−
D−マンノシドを加えた緩衝液(0,05%ツイーン2
0−TBS溶液)10−で2回洗條後、30分間ヒ) 
AFPに対するウサギ免疫グロブリン(DAK&−イム
ノグロブリン環)で処理した。このウサギグロブリンは
トリス塩酸緩衝液(1%ゼラチン含有)で500倍に希
釈しである。
処理した膜に対し、緩衝液を用いて10分間洗條の抗ウ
サギIgG −nP抗体10rn1中で30分間処理し
た。
得られた膜を0.025%3,3′−ジアミノベンチデ
ィン テトラハイドロクロライドとO,OO5%H2O
2の0.05 M )リス塩酸溶液、0.05%4−ク
ロロ−1−ナフトールのTBS溶液(メタノールと0.
015%凹2添加)、または0.02%4−メトキシ−
1−ナフトールの0.05 M Tri8−HCIJ溶
液(メタノールと0.005%H2O2添加)の中で3
0分間処理することによシ発色した。(とくに記さない
場合は3.3’−ジアミノベンチディンを使用)抗体親
和転写およびこれにつづく処理は25℃で行った。発色
後、膜は水洗、デカリン処理して、アタゴ製のクイック
デンシトメーターを用い、500nmでデンシトメトリ
ーを行った。
GV)  実験結果 抗体親和転写の効果を第1図に示す。第1図において、
ムは抗体結合NC膜にブロッティングによシ転写された
、日本AFP標準液(100城AFP / u牛血清ア
ルブミン)中のAFPを示し、・は比較の   。
ために抗体を結合していないNC膜に転写された精製A
FPを示し、またOも比較のために抗体が結合されてい
ないNC膜に転写した精製AFP (AFP不含血清に
添加(57ngAFP /■血清タンパク)〕を示す。
第1図よシプロツテイングによる抗体親和転写が有効で
あることが明らかである。
第2図に転写されたAFPを0.2Ma−メチル−D−
マンノシドで洗條する効果を示す。OL洗條する場合、
△は比較のために洗條しない場合を示し、第2図からN
C膜に結合させる抗体が精製されていない場合には、洗
條効果が非常に大きいことが明らかである。
第3図に純化抗体を用いた場合Con Aの存在下で分
離されたAFPのCon−A反応性およびCon A非
反応性分子種の染色強度に及?Ejすα−メチル−D−
マンノシド洗條の効果を示した。洗條によ多Con −
A反応性、非反応性いずれも他の方法で求めた理論値に
近い発色を示している。とくに、洗條によ、9ConA
非反応性分子種のものもCan −A反応性分子種のも
のと同程度に染色されるようになることは注目すべきこ
とである。
第4図にAFPバンドの発色強度におよほす、ブロッキ
ング剤のツイーン−20とゼラチンとの比較を示す。・
は2.0%ツイーン20によるブロックを示し、Oは3
.0%ゼラチンによるブロックを示す。これからブロッ
ク剤としてゼラチンも用いられるが、ツイーン−20の
方がすぐれていることが認められる。
第1表にIgG分画および純化抗体を用いた場合のそれ
ぞれについて単糖類および二糖類による洗および純化抗
体いずれの場合にも、洗條によシCon −A非結合性
のAFPバンド(AFp−0)の強度が増加しているこ
とが認められる。
IgG分画             180    
  3.9a−メ’−D95         5.5
−マンノシッド D−グルコース     121        4.
2D−ぺηレトーヌ       121      
     5.3純化        53   3.
4α−メチル−D56         6.9−マン
ノシッド D−グルコ−7、514,4 D−マルトース      49       4.7
第5図にHRP反応における種々の基質による発色を示
す。AFPとしては日本AFP標準を用い、AFPの最
低レベルは4 pyytaであった。反応時間は4−メ
トキシ−1−ナフトールの場合2分、他の場合30分で
あった。これから、本発明によるAFP検出が非常に高
感度であることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
第1図は抗体結合NC膜を用いた場合と、抗体を結合し
ていないNC膜を用いた場合とのAFP転写効果の違い
を示す図であシ、第2図は純化していない抗AFP抗体
をNC膜に結合させた際、転写されたAFPをα−メチ
ル−D−マンノシドで洗條する場合と、洗條しない場合
とのAFP検出効果の違いを示す図であシ、第3図はC
on−A親和電気泳動によるAFPの分離に及ぼすα−
メチル−D−マンノシド(MM)洗條の影響を示す図で
ある。第3図において、十腹は洗條した場合、−塵は洗
條しない場合ヲ示ス。第4図は、ツイーン−20とゼラ
チンのブロック剤としての効果の違いを示す図であ)、
第5図は種々の発色剤を用いた場合の感度を示す図であ
る。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)(i)レクチン含有アガロースゲル (ii)抗α−フェトプロテイン抗体結合ニトロセルロ
    ース膜 (iii)該レクチンと特異的相互作用を有する単糖ま
    たはオリゴ糖の溶液 (iv)該抗α−フェトプロテイン抗体とは異なる動物
    種由来の抗α−フェトプロテイン抗体 (v)(iv)で用いる動物種の免疫グロブリンに対す
    る抗体に酵素標識したものおよび (vi)(v)の酵素によつて発色する基質からなるα
    −フェトプロテインの分画検出試薬キット。
  2. (2)該レクチンがコンカナバリンA、レンズマメレク
    チンAまたは赤血球凝集性インゲンマメレクチンである
    特許請求の範囲第1項記載の分画検出試薬キット。
  3. (3)該単糖がα−メチル−D−マンノシッド、グルコ
    ースまたはマンノースである特許請求の範囲第1項記載
    の分画検出試薬キット。
  4. (4)該オリゴ糖がマルトースである特許請求の範囲第
    1項記載の分画検出試薬キット。
  5. (5)レクチン含有アガロースゲルにて電気泳動を行つ
    てα−フェトプロテインを分画したものを抗α−フェト
    プロテイン抗体結合ニトロセルロース膜にブロッテイン
    グにより抗体親和転写し、転写されたニトロセルロース
    膜を、使用したレクチンと特異的相互作用を有する単糖
    又はオリゴ糖の溶液で洗浄し、しかる後に該膜への結合
    に用いた抗α−フェトプロテイン抗体とは異なる動物種
    由来の抗α−フェトプロテイン抗体を加え、さらに、上
    記の動物種の免疫グロブリンに対する抗体に酵素標識し
    たものを加え、ついで該酵素によつて発色する基質を加
    えることを特徴とするα−フェトプロテインの分画検出
    方法。
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