JPS61292062A - α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法 - Google Patents
α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法Info
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- JPS61292062A JPS61292062A JP12396985A JP12396985A JPS61292062A JP S61292062 A JPS61292062 A JP S61292062A JP 12396985 A JP12396985 A JP 12396985A JP 12396985 A JP12396985 A JP 12396985A JP S61292062 A JPS61292062 A JP S61292062A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、腫瘍マーカーである体液中のα−フェトプロ
テイン（以下ＡＦＰと称する）または細胞培養液上清中
のＡＦＰを分画・検出するための検出試薬キットおよび
体液中または細胞培養液上清中のα−フェトプロテイン
の分画検出方法に関する。
テイン（以下ＡＦＰと称する）または細胞培養液上清中
のＡＦＰを分画・検出するための検出試薬キットおよび
体液中または細胞培養液上清中のα−フェトプロテイン
の分画検出方法に関する。
（従来の技術）
腫瘍のマーカー物質である体液中のα−フェトプロテイ
ンを分画・検出することについては従来などで１次元の
電気泳動を行って、レクチン親和性の異なるＡＦＰを分
離し、さらに抗Ａ、ＦＰ抗体を含有するアガロースゲル
で１次元目とは直角の方向に２次元目の電気泳動を行な
い、分離されたＡＦＰの各スポットを色素を用いた非特
異的蛋白染色十−゛° −チ −ロ − −・
′合倹含によシ検出している。〔スカンジナビアンジ
ャーナルオブイムノロジー（５ｃａｎｄ、 Ｊ、 Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、 ） ］ ４ ）ネ〆） １５〜２０ （１，９８１） ］、〔肝臓υ、１５５９
〜１５６８（１９８１）〕シかしながら、この方法は感
度が低く、低濃度ＡＦＰの試料のレクチン親和性による
分離結果を定量的に評価することは不可能であった。
ンを分画・検出することについては従来などで１次元の
電気泳動を行って、レクチン親和性の異なるＡＦＰを分
離し、さらに抗Ａ、ＦＰ抗体を含有するアガロースゲル
で１次元目とは直角の方向に２次元目の電気泳動を行な
い、分離されたＡＦＰの各スポットを色素を用いた非特
異的蛋白染色十−゛° −チ −ロ − −・
′合倹含によシ検出している。〔スカンジナビアンジ
ャーナルオブイムノロジー（５ｃａｎｄ、 Ｊ、 Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、 ） ］ ４ ）ネ〆） １５〜２０ （１，９８１） ］、〔肝臓υ、１５５９
〜１５６８（１９８１）〕シかしながら、この方法は感
度が低く、低濃度ＡＦＰの試料のレクチン親和性による
分離結果を定量的に評価することは不可能であった。
この点を改良するために、本発明者らは、分離されたＡ
ＦＰと抗ＡＦＰ抗体の複合物からなるピークをプロティ
ンＡ−酵素複合体を用いて特異的に染色する方法を開発
した〔エレクトロフオレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ
ｅｓｉｓ ） ４．３７Ｎ −３７３（１９８３） ］
。この方法では０．５ｎｇのＡＦＰを検出できるが、レ
クチン親和電気泳動に用いるにはまだ充分な感度ではな
く、また、これらの方法は電気泳動を２回行うため長時
間を要し、多数の検体を同時に処理することも困難であ
った。
ＦＰと抗ＡＦＰ抗体の複合物からなるピークをプロティ
ンＡ−酵素複合体を用いて特異的に染色する方法を開発
した〔エレクトロフオレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ
ｅｓｉｓ ） ４．３７Ｎ −３７３（１９８３） ］
。この方法では０．５ｎｇのＡＦＰを検出できるが、レ
クチン親和電気泳動に用いるにはまだ充分な感度ではな
く、また、これらの方法は電気泳動を２回行うため長時
間を要し、多数の検体を同時に処理することも困難であ
った。
そこで、本発明者らはさきにレクチン含有アガロースゲ
ルを用いた１次元電気泳動を行ない、こ ″れによシ分
離したレクチン親和性の異なるＡＦＰを第２次元日の電
気泳動を実施することなく、抗ＡＦＰ抗体を結合させた
ニトロセルロース膜に電気ゴ 転写またはゴロツテイングによる抗体親和転写をするこ
とによシ検出できることを見出した。〔生物物理化学第
２８巻、第２号、第２１頁および第２８巻、第５号、第
１３頁（１９８４）） かかる方法は、上記の電気泳
動を２回行う方法に比べ簡単でしかもＡＦＰを感度よく
検出できるが、まだ実用的レベルには達してはいなかっ
た。
ルを用いた１次元電気泳動を行ない、こ ″れによシ分
離したレクチン親和性の異なるＡＦＰを第２次元日の電
気泳動を実施することなく、抗ＡＦＰ抗体を結合させた
ニトロセルロース膜に電気ゴ 転写またはゴロツテイングによる抗体親和転写をするこ
とによシ検出できることを見出した。〔生物物理化学第
２８巻、第２号、第２１頁および第２８巻、第５号、第
１３頁（１９８４）） かかる方法は、上記の電気泳
動を２回行う方法に比べ簡単でしかもＡＦＰを感度よく
検出できるが、まだ実用的レベルには達してはいなかっ
た。
（発明が解決しようとする問題点）
したがって、本発明が解決しようとする問題点は、低濃
度のＡＦＰを含む少量のサンプルについてＡＦＰをレク
チン親和性の差異によって分画して高感度に検出するた
めの、検出試薬キットおよび検出方法を見出すことであ
る。
度のＡＦＰを含む少量のサンプルについてＡＦＰをレク
チン親和性の差異によって分画して高感度に検出するた
めの、検出試薬キットおよび検出方法を見出すことであ
る。
（問題点を解決するための手段）
かかる問題点は以下に述べて本発明（ＡＦＰの分画検出
試薬キットおよびＡＦＰの分画検出方法の２発明からな
る）により解決される。
試薬キットおよびＡＦＰの分画検出方法の２発明からな
る）により解決される。
１） （＋）レクチン含有アガロースゲル（Ｉ＋） 抗
ＡＦＰ抗体結合ニトロセルロース膜・ 佃）該レクチ
ンと特異的相互作用を有する単糖またはオリゴ糖の溶液 ０φ該抗ＡＦＰ抗体とは異なる動物種由来の抗ＡＦＰ抗
体 （■）Ｑφで用いる動物種の免疫グロブリンに対する抗
体に酵素標識したものおよび （ＶＤ （Ｖ）の酵素によって発色する基質からなるＡ
ＦＰの分画検出試薬キット。
ＡＦＰ抗体結合ニトロセルロース膜・ 佃）該レクチ
ンと特異的相互作用を有する単糖またはオリゴ糖の溶液 ０φ該抗ＡＦＰ抗体とは異なる動物種由来の抗ＡＦＰ抗
体 （■）Ｑφで用いる動物種の免疫グロブリンに対する抗
体に酵素標識したものおよび （ＶＤ （Ｖ）の酵素によって発色する基質からなるＡ
ＦＰの分画検出試薬キット。
■ レクチン含有アガロースゲルにて電気泳動を行なっ
てＡＦＰを分画したものを抗ＡＦＰ抗体結合ニトロセル
ロース膜にブロッティングによシ抗体親和転写し、転写
されたニトロセルロース膜を、使用したレクチンと特異
的相互作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶液で洗浄し、
しかる後に該膜への結合に用いた抗ＡＦＰ抗体とは異な
る動物種由来の抗ＡＦＰ抗体をかえ、さらに、上記の動
物種の免疫グロブリンに対する抗体に酵素標識したもの
をかえ、ついで該酵素によって発色する基質を加えるこ
とを特徴とするＡＦＰの分画検出方法。
てＡＦＰを分画したものを抗ＡＦＰ抗体結合ニトロセル
ロース膜にブロッティングによシ抗体親和転写し、転写
されたニトロセルロース膜を、使用したレクチンと特異
的相互作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶液で洗浄し、
しかる後に該膜への結合に用いた抗ＡＦＰ抗体とは異な
る動物種由来の抗ＡＦＰ抗体をかえ、さらに、上記の動
物種の免疫グロブリンに対する抗体に酵素標識したもの
をかえ、ついで該酵素によって発色する基質を加えるこ
とを特徴とするＡＦＰの分画検出方法。
以下、本発明の構成をさらに詳細に説明する。
（１） レクチン含有アガロースゲルによる電気泳動
レクチンとしては、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ −Ａ
）、レンズマメレクチンＡ（ＬＣＡ−Ａ）、赤血球凝集
性インゲンマメレクチン（Ｅ−ＰＨＡ）などが用いられ
る。アガロースゲルは通常のアガロース（ＬｉｔｅｘＬ
ＳＢなど）をｐＨ８，６１、イオン強度０．０２５のベ
ロナール緩衝液に溶解して作成した厚さ１１１１１１１
程度のゲルで、これにレクチンが含有される。レクチン
の添加量としてはアガロースゲル】ｒｎｌ当Ｊ）Ｃｏｎ
Ａで０、６〜１− ＯＨ／ｍｌ、ＬＣＡ−Ａで０．２１
ｒＬｇ／ＷＬ１前後、Ｉｉ’−ＰＨＡで０．５ ｍＱ／
ｍ１前後が適当である。試料溝の大きさは０．８ Ｘ
５ ｗｎ程度が適当である。電気泳動は、１５Ｖフイｍ
の定電圧下、５℃で行なわれるが、これによシ体液（血
清、腹水等）中のＡＦＰがゲル中で分画される。
レクチンとしては、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ −Ａ
）、レンズマメレクチンＡ（ＬＣＡ−Ａ）、赤血球凝集
性インゲンマメレクチン（Ｅ−ＰＨＡ）などが用いられ
る。アガロースゲルは通常のアガロース（ＬｉｔｅｘＬ
ＳＢなど）をｐＨ８，６１、イオン強度０．０２５のベ
ロナール緩衝液に溶解して作成した厚さ１１１１１１１
程度のゲルで、これにレクチンが含有される。レクチン
の添加量としてはアガロースゲル】ｒｎｌ当Ｊ）Ｃｏｎ
Ａで０、６〜１− ＯＨ／ｍｌ、ＬＣＡ−Ａで０．２１
ｒＬｇ／ＷＬ１前後、Ｉｉ’−ＰＨＡで０．５ ｍＱ／
ｍ１前後が適当である。試料溝の大きさは０．８ Ｘ
５ ｗｎ程度が適当である。電気泳動は、１５Ｖフイｍ
の定電圧下、５℃で行なわれるが、これによシ体液（血
清、腹水等）中のＡＦＰがゲル中で分画される。
（２）抗ＡＦＰ抗体結合ニトロセルロース膜の作成抗Ａ
ＦＰ抗体としては、アクタ メゾイカ オカヤマ（Ａｃ
ｔａ ＭＢｄ、 Ｏｋａｙａｍａ ） １９８４年第３
８巻第４０９〜４１３頁に記載されたものが用いられる
。これをアフイニテイ・クロマトグラフィーで精製して
用いる場合には、１００μＭ讐の抗体を含む１０−のト
リス塩酸緩衝液（ＰＨ７，ｓ ）にニトロセルロース膜
（５Ｘ９．２ｃ１１）を３０分間浸漬して結合させる。
ＦＰ抗体としては、アクタ メゾイカ オカヤマ（Ａｃ
ｔａ ＭＢｄ、 Ｏｋａｙａｍａ ） １９８４年第３
８巻第４０９〜４１３頁に記載されたものが用いられる
。これをアフイニテイ・クロマトグラフィーで精製して
用いる場合には、１００μＭ讐の抗体を含む１０−のト
リス塩酸緩衝液（ＰＨ７，ｓ ）にニトロセルロース膜
（５Ｘ９．２ｃ１１）を３０分間浸漬して結合させる。
・高純度の抗体は、１１１Ｌｇ当シ２００μｍ以上のＡ
ＦＰを結合するが、純度の低い抗体でも、その力価に応
じて使用量を増加させることによ）使用できる。
ＦＰを結合するが、純度の低い抗体でも、その力価に応
じて使用量を増加させることによ）使用できる。
ニトロセルロース膜に結合した抗ＡＦＰ抗体は、グルタ
ルアルデヒドの蒸気に３０分さらすことによ）固定化さ
れる。未反応のアルデヒド基は水素化ホウ素ナトリウム
によシ還元、不活性化される。
ルアルデヒドの蒸気に３０分さらすことによ）固定化さ
れる。未反応のアルデヒド基は水素化ホウ素ナトリウム
によシ還元、不活性化される。
タンパク質のニトロセルロース膜への非特異的吸着を防
ぐためには、３％のゼラチンも用いられるが２％のツイ
ーン（Ｔｗｅｅｎ ） ２０で２分、又は０．５％のツ
イーン２０で３０分処理することによシ同時に感度も増
加させ得る。
ぐためには、３％のゼラチンも用いられるが２％のツイ
ーン（Ｔｗｅｅｎ ） ２０で２分、又は０．５％のツ
イーン２０で３０分処理することによシ同時に感度も増
加させ得る。
処理の終った抗ＡＦＰ抗体結合ニトロセルロース膜は、
トリス塩酸緩衝液で洗浄後、減圧乾燥して４℃で保存す
る。
トリス塩酸緩衝液で洗浄後、減圧乾燥して４℃で保存す
る。
（３） アガロースゲルから抗ＡＦＰ抗体結合ニトロ
セルロース膜への転写 電気泳動処理の終ったアガロースゲルと、抗ＡＦＰ抗体
結合ニトロセルロース膜とを密着させ、１ｃ１１当ｐｘ
ｏ１程度の圧力を加えて２０分程度放置することによＪ
、ＡＦＰをアガロースゲルからニトロセルロース膜へ転
写する。従来、ここで電気転写が用いられていたが、毛
細管現象によるブロッティングを利用した本発明の抗体
親和転写法の方が感度が良い。転写後、使用したレクチ
ンと特異的相互作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶液、
すなわち、Ｃｏｎ−ＡおよびＬＣＡ−Ａに対しては０．
２モルのα−メチル−Ｄ−マンノシド、グルコース、マ
ンノース、マルトースなどでニトロセルロース膜を洗浄
する。とくに、Ｃｏｎ−Ａの場合は、α−メチ／ｌ／−
Ｄ−マンノシドが適している。これは、純度が低い抗Ａ
ＦＰ抗体を用いたときには、ニトロセルロース膜の非特
異発色によるバックグラウンドが高いので、これを低減
するために重要でアシ、また、純度が高い抗ＡＦＰ抗体
を用いたときにも、分離されたＡＦＰのレクチン親和性
の差によって発色の濃度が異なるという現象を避けるこ
とができる。
セルロース膜への転写 電気泳動処理の終ったアガロースゲルと、抗ＡＦＰ抗体
結合ニトロセルロース膜とを密着させ、１ｃ１１当ｐｘ
ｏ１程度の圧力を加えて２０分程度放置することによＪ
、ＡＦＰをアガロースゲルからニトロセルロース膜へ転
写する。従来、ここで電気転写が用いられていたが、毛
細管現象によるブロッティングを利用した本発明の抗体
親和転写法の方が感度が良い。転写後、使用したレクチ
ンと特異的相互作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶液、
すなわち、Ｃｏｎ−ＡおよびＬＣＡ−Ａに対しては０．
２モルのα−メチル−Ｄ−マンノシド、グルコース、マ
ンノース、マルトースなどでニトロセルロース膜を洗浄
する。とくに、Ｃｏｎ−Ａの場合は、α−メチ／ｌ／−
Ｄ−マンノシドが適している。これは、純度が低い抗Ａ
ＦＰ抗体を用いたときには、ニトロセルロース膜の非特
異発色によるバックグラウンドが高いので、これを低減
するために重要でアシ、また、純度が高い抗ＡＦＰ抗体
を用いたときにも、分離されたＡＦＰのレクチン親和性
の差によって発色の濃度が異なるという現象を避けるこ
とができる。
（４）第二抗体の結合
転写、洗浄の終ったニトロセルロース膜をＡＦＰに対す
る第二抗体の溶液で処理する。第二抗体としては、最初
にニトロセルロース膜に結合させた抗ＡＦＰ抗体とは別
の動物種のもの、たとえば第一抗体がウマであれば第二
抗体はウサギのものを周込る。この抗体は市販の抗ＡＦ
Ｐグロブリンを２５０〜１０００倍、好ましくは５００
倍にトリス塩酸緩衝液（１％ゼラチン又は０．０５％ツ
イーン２ｏを含む）で希釈したものを用いる。
る第二抗体の溶液で処理する。第二抗体としては、最初
にニトロセルロース膜に結合させた抗ＡＦＰ抗体とは別
の動物種のもの、たとえば第一抗体がウマであれば第二
抗体はウサギのものを周込る。この抗体は市販の抗ＡＦ
Ｐグロブリンを２５０〜１０００倍、好ましくは５００
倍にトリス塩酸緩衝液（１％ゼラチン又は０．０５％ツ
イーン２ｏを含む）で希釈したものを用いる。
た場合、これを検出するためにパーオキシダーゼで標識
したヤギ抗つサギエｇＧ抗体を加える。この抗体は５０
０倍〜２０００倍、好ましくは１０００倍にトリス塩酸
緩衝液で希釈して用いる。
したヤギ抗つサギエｇＧ抗体を加える。この抗体は５０
０倍〜２０００倍、好ましくは１０００倍にトリス塩酸
緩衝液で希釈して用いる。
（７） ＡＦＰバンドの検出
ＡＦＰの検出にはパーオキシダーゼによシ発色する基質
を加えれば良く、０．０２５％ジアミノベンジジン（ｏ
、ｏｓモルトリス塩酸、ｐＨ７，６） 及び０．００
５％過酸化水素、０．０５％４−クロロ−１−ナフトー
ル（メタノ−μ加トリス塩酸） 及び０．０１５％過酸
化水素、又は０．０２％４−メトキシ−１−ナフトール
（メタノール加トリノ塩酸）及び０．００５％過酸化水
素などが用いられる。発色したバンドは肉眼観察又はデ
ンシトメーターでの定量によ、９ ＡＦＰ濃度が測定で
きる。
を加えれば良く、０．０２５％ジアミノベンジジン（ｏ
、ｏｓモルトリス塩酸、ｐＨ７，６） 及び０．００
５％過酸化水素、０．０５％４−クロロ−１−ナフトー
ル（メタノ−μ加トリス塩酸） 及び０．０１５％過酸
化水素、又は０．０２％４−メトキシ−１−ナフトール
（メタノール加トリノ塩酸）及び０．００５％過酸化水
素などが用いられる。発色したバンドは肉眼観察又はデ
ンシトメーターでの定量によ、９ ＡＦＰ濃度が測定で
きる。
したがって、（１）レクチン含有アガロースゲル、（ｉ
ｉ）抗ＡＦＰ抗体結合ニトロセルロース膜、０ｉｉ）該
レクチンと特異的相互作用を有する単糖又はオリコ゛糖
の溶液、Ｑφ該抗ＡＦＰ抗体とは異なる動物種由来の抗
ＡＦＰ抗体、（ｖ）Ｏφで用いる動物種の免疫グロブリ
ンに対する抗体に酵素標識したものおよびＩＶＯ（■）
の酵素によって発色する基質をセットとして分析者に提
供することによシ、ＡＦＰの検出が便利に行われる。
ｉ）抗ＡＦＰ抗体結合ニトロセルロース膜、０ｉｉ）該
レクチンと特異的相互作用を有する単糖又はオリコ゛糖
の溶液、Ｑφ該抗ＡＦＰ抗体とは異なる動物種由来の抗
ＡＦＰ抗体、（ｖ）Ｏφで用いる動物種の免疫グロブリ
ンに対する抗体に酵素標識したものおよびＩＶＯ（■）
の酵素によって発色する基質をセットとして分析者に提
供することによシ、ＡＦＰの検出が便利に行われる。
（発明の効果）
本発明によシ、低濃度のＡＦＰが少量のサンプルで検出
可能となった。後述の実施例に示す最良の結果では、Ａ
ＦＰ ４ ｎｖｒｎｌの試料３ μｎを０．５ Ｘ ６
ｔａｎの試料溝に添加することによシ検出されている
。すなわちＡＦＰ ４ ｐｆ／−の存在を検出できる。
可能となった。後述の実施例に示す最良の結果では、Ａ
ＦＰ ４ ｎｖｒｎｌの試料３ μｎを０．５ Ｘ ６
ｔａｎの試料溝に添加することによシ検出されている
。すなわちＡＦＰ ４ ｐｆ／−の存在を検出できる。
従来の無処理ニトロセルロース膜への転写法では、血清
検体あるいはレクチンを含むゲルを用いての電気泳動の
ように多量の他の蛋白質が存在する時にはＡＦＰの定量
的な転写ができなく、また、電気転写では感度が低かっ
たが、本発明では前述のようにプロッティングによる抗
体親和転写を採用しているのでＡＦＰの定量的転写が可
能となシ、また、本発明では従来から知られている抗体
親和転写法に比し、転写後のニトロセルロースａｔレク
チンと相互作用を有する単糖またはオリゴ糖の溶液で洗
條するので、レクチンの存在によジニトロセルロース膜
上の反応でレクチン結合性ＡＦＰがレクチン非結合性Ａ
ＦＰに比べて発色が強くなるという問題もなくなシ、ま
た、純度の低い抗ＡＦＰ抗体を用いたときの発色段階に
おける高いバックグランドを低減させることもできる。
検体あるいはレクチンを含むゲルを用いての電気泳動の
ように多量の他の蛋白質が存在する時にはＡＦＰの定量
的な転写ができなく、また、電気転写では感度が低かっ
たが、本発明では前述のようにプロッティングによる抗
体親和転写を採用しているのでＡＦＰの定量的転写が可
能となシ、また、本発明では従来から知られている抗体
親和転写法に比し、転写後のニトロセルロースａｔレク
チンと相互作用を有する単糖またはオリゴ糖の溶液で洗
條するので、レクチンの存在によジニトロセルロース膜
上の反応でレクチン結合性ＡＦＰがレクチン非結合性Ａ
ＦＰに比べて発色が強くなるという問題もなくなシ、ま
た、純度の低い抗ＡＦＰ抗体を用いたときの発色段階に
おける高いバックグランドを低減させることもできる。
（実施例）
（１）抗体結合膜の調製
ヒトＡＦＰに対する純化ポリクロナールウマ抗体（また
はＩｇＧ分画、とくにことわらない場合はウマ抗体）
１００ ｔｔｆ／−を含むＴＢＳ （２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ −ＨＣｌ 。
はＩｇＧ分画、とくにことわらない場合はウマ抗体）
１００ ｔｔｆ／−を含むＴＢＳ （２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ −ＨＣｌ 。
ＮＣ膜という。）を処理した。３０分間処理を行な歎
った後、炉７で膜をぬぐい、さらに膜を３０分間グルタ
ルアルデヒド蒸気にさらした後、０．０２％ＮａＢＨ４
−ＴＢ Ｓ溶液で中和処理した。ついで、該膜にＴＢＳ
洗條、０．５％ツイーン−２０のＴＢＳ溶液（またはゼ
ラチンのＴＢＳ溶液、とくにことわらない場合はツイー
ン−２０のＴＳＢ溶液）によるブロック（３０分間）、
ＴＢＳ洗條を行ない、該膜を真空乾燥し、４℃で保存し
た。
ルアルデヒド蒸気にさらした後、０．０２％ＮａＢＨ４
−ＴＢ Ｓ溶液で中和処理した。ついで、該膜にＴＢＳ
洗條、０．５％ツイーン−２０のＴＢＳ溶液（またはゼ
ラチンのＴＢＳ溶液、とくにことわらない場合はツイー
ン−２０のＴＳＢ溶液）によるブロック（３０分間）、
ＴＢＳ洗條を行ない、該膜を真空乾燥し、４℃で保存し
た。
（ｉＤ を気泳動
バルビタール／バルビタールソーダのゲル緩衝液（イオ
ン強度０．０２５、ｐＨ８，６）で、レクチン添加のも
とで、ゲルボンドフィルム（ＦＭＣ製）上に調製した１
Ｍ厚のアガロースゲル板（１％Ｌｉｔｅｘ ％ＬＳＢ
）中で以下の条件で電気泳動を行なった。すなわち、０
．８×５×１サイズのサンプル溝に適度に希釈したＡＦ
Ｐ試料４μ４を入れ、電子冷却泳動槽中で、バｐビター
／Ｉ／／パルビターＡ／ソーダ（イオン強度０．０５、
ｐＨ８，６）を電極緩衝液として１５ｖ／αの定電圧下
５℃で行った。なお、ＡＦＰの希釈はＢＰＢを含むゲル
緩衝液で行い、ＢＰＢの最終濃度を０．０５％に調製し
た。
ン強度０．０２５、ｐＨ８，６）で、レクチン添加のも
とで、ゲルボンドフィルム（ＦＭＣ製）上に調製した１
Ｍ厚のアガロースゲル板（１％Ｌｉｔｅｘ ％ＬＳＢ
）中で以下の条件で電気泳動を行なった。すなわち、０
．８×５×１サイズのサンプル溝に適度に希釈したＡＦ
Ｐ試料４μ４を入れ、電子冷却泳動槽中で、バｐビター
／Ｉ／／パルビターＡ／ソーダ（イオン強度０．０５、
ｐＨ８，６）を電極緩衝液として１５ｖ／αの定電圧下
５℃で行った。なお、ＡＦＰの希釈はＢＰＢを含むゲル
緩衝液で行い、ＢＰＢの最終濃度を０．０５％に調製し
た。
０１１）抗体親和転写
電気泳動後のアガロースゲルを、ＴＢＳを含浸させた抗
体結合ＮＣ膜と密着させ、口紙パッドを用いて１ｃＩＩ
ｔ当ｐ１ｏｙ程度の圧力を２０分加えることによ、９、
ＡＦＰをアガロースゲルからニトロセルロース膜へブロ
ッテイングにより転写させた。０．２Ｍのα−メチル−
Ｄ−マンノシドを加えた緩衝液（０，０５％ツイーン２
０−ＴＢＳ溶液）１０−で２回洗條後、３０分間ヒ）
ＡＦＰに対するウサギ免疫グロブリン（ＤＡＫ＆−イム
ノグロブリン環）で処理した。このウサギグロブリンは
トリス塩酸緩衝液（１％ゼラチン含有）で５００倍に希
釈しである。
体結合ＮＣ膜と密着させ、口紙パッドを用いて１ｃＩＩ
ｔ当ｐ１ｏｙ程度の圧力を２０分加えることによ、９、
ＡＦＰをアガロースゲルからニトロセルロース膜へブロ
ッテイングにより転写させた。０．２Ｍのα−メチル−
Ｄ−マンノシドを加えた緩衝液（０，０５％ツイーン２
０−ＴＢＳ溶液）１０−で２回洗條後、３０分間ヒ）
ＡＦＰに対するウサギ免疫グロブリン（ＤＡＫ＆−イム
ノグロブリン環）で処理した。このウサギグロブリンは
トリス塩酸緩衝液（１％ゼラチン含有）で５００倍に希
釈しである。
処理した膜に対し、緩衝液を用いて１０分間洗條の抗ウ
サギＩｇＧ −ｎＰ抗体１０ｒｎ１中で３０分間処理し
た。
サギＩｇＧ −ｎＰ抗体１０ｒｎ１中で３０分間処理し
た。
得られた膜を０．０２５％３，３′−ジアミノベンチデ
ィン テトラハイドロクロライドとＯ，ＯＯ５％Ｈ２Ｏ
２の０．０５ Ｍ ）リス塩酸溶液、０．０５％４−ク
ロロ−１−ナフトールのＴＢＳ溶液（メタノールと０．
０１５％凹２添加）、または０．０２％４−メトキシ−
１−ナフトールの０．０５ Ｍ Ｔｒｉ８−ＨＣＩＪ溶
液（メタノールと０．００５％Ｈ２Ｏ２添加）の中で３
０分間処理することによシ発色した。（とくに記さない
場合は３．３’−ジアミノベンチディンを使用）抗体親
和転写およびこれにつづく処理は２５℃で行った。発色
後、膜は水洗、デカリン処理して、アタゴ製のクイック
デンシトメーターを用い、５００ｎｍでデンシトメトリ
ーを行った。
ィン テトラハイドロクロライドとＯ，ＯＯ５％Ｈ２Ｏ
２の０．０５ Ｍ ）リス塩酸溶液、０．０５％４−ク
ロロ−１−ナフトールのＴＢＳ溶液（メタノールと０．
０１５％凹２添加）、または０．０２％４−メトキシ−
１−ナフトールの０．０５ Ｍ Ｔｒｉ８−ＨＣＩＪ溶
液（メタノールと０．００５％Ｈ２Ｏ２添加）の中で３
０分間処理することによシ発色した。（とくに記さない
場合は３．３’−ジアミノベンチディンを使用）抗体親
和転写およびこれにつづく処理は２５℃で行った。発色
後、膜は水洗、デカリン処理して、アタゴ製のクイック
デンシトメーターを用い、５００ｎｍでデンシトメトリ
ーを行った。
ＧＶ） 実験結果
抗体親和転写の効果を第１図に示す。第１図において、
ムは抗体結合ＮＣ膜にブロッティングによシ転写された
、日本ＡＦＰ標準液（１００城ＡＦＰ ／ ｕ牛血清ア
ルブミン）中のＡＦＰを示し、・は比較の 。
ムは抗体結合ＮＣ膜にブロッティングによシ転写された
、日本ＡＦＰ標準液（１００城ＡＦＰ ／ ｕ牛血清ア
ルブミン）中のＡＦＰを示し、・は比較の 。
ために抗体を結合していないＮＣ膜に転写された精製Ａ
ＦＰを示し、またＯも比較のために抗体が結合されてい
ないＮＣ膜に転写した精製ＡＦＰ （ＡＦＰ不含血清に
添加（５７ｎｇＡＦＰ ／■血清タンパク）〕を示す。
ＦＰを示し、またＯも比較のために抗体が結合されてい
ないＮＣ膜に転写した精製ＡＦＰ （ＡＦＰ不含血清に
添加（５７ｎｇＡＦＰ ／■血清タンパク）〕を示す。
第１図よシプロツテイングによる抗体親和転写が有効で
あることが明らかである。
あることが明らかである。
第２図に転写されたＡＦＰを０．２Ｍａ−メチル−Ｄ−
マンノシドで洗條する効果を示す。ＯＬ洗條する場合、
△は比較のために洗條しない場合を示し、第２図からＮ
Ｃ膜に結合させる抗体が精製されていない場合には、洗
條効果が非常に大きいことが明らかである。
マンノシドで洗條する効果を示す。ＯＬ洗條する場合、
△は比較のために洗條しない場合を示し、第２図からＮ
Ｃ膜に結合させる抗体が精製されていない場合には、洗
條効果が非常に大きいことが明らかである。
第３図に純化抗体を用いた場合Ｃｏｎ Ａの存在下で分
離されたＡＦＰのＣｏｎ−Ａ反応性およびＣｏｎ Ａ非
反応性分子種の染色強度に及？Ｅｊすα−メチル−Ｄ−
マンノシド洗條の効果を示した。洗條によ多Ｃｏｎ −
Ａ反応性、非反応性いずれも他の方法で求めた理論値に
近い発色を示している。とくに、洗條によ、９ＣｏｎＡ
非反応性分子種のものもＣａｎ −Ａ反応性分子種のも
のと同程度に染色されるようになることは注目すべきこ
とである。
離されたＡＦＰのＣｏｎ−Ａ反応性およびＣｏｎ Ａ非
反応性分子種の染色強度に及？Ｅｊすα−メチル−Ｄ−
マンノシド洗條の効果を示した。洗條によ多Ｃｏｎ −
Ａ反応性、非反応性いずれも他の方法で求めた理論値に
近い発色を示している。とくに、洗條によ、９ＣｏｎＡ
非反応性分子種のものもＣａｎ −Ａ反応性分子種のも
のと同程度に染色されるようになることは注目すべきこ
とである。
第４図にＡＦＰバンドの発色強度におよほす、ブロッキ
ング剤のツイーン−２０とゼラチンとの比較を示す。・
は２．０％ツイーン２０によるブロックを示し、Ｏは３
．０％ゼラチンによるブロックを示す。これからブロッ
ク剤としてゼラチンも用いられるが、ツイーン−２０の
方がすぐれていることが認められる。
ング剤のツイーン−２０とゼラチンとの比較を示す。・
は２．０％ツイーン２０によるブロックを示し、Ｏは３
．０％ゼラチンによるブロックを示す。これからブロッ
ク剤としてゼラチンも用いられるが、ツイーン−２０の
方がすぐれていることが認められる。
第１表にＩｇＧ分画および純化抗体を用いた場合のそれ
ぞれについて単糖類および二糖類による洗および純化抗
体いずれの場合にも、洗條によシＣｏｎ −Ａ非結合性
のＡＦＰバンド（ＡＦｐ−０）の強度が増加しているこ
とが認められる。
ぞれについて単糖類および二糖類による洗および純化抗
体いずれの場合にも、洗條によシＣｏｎ −Ａ非結合性
のＡＦＰバンド（ＡＦｐ−０）の強度が増加しているこ
とが認められる。
ＩｇＧ分画 １８０
３．９ａ−メ’−Ｄ９５ ５．５
−マンノシッド Ｄ−グルコース １２１ ４．
２Ｄ−ぺηレトーヌ １２１
５．３純化 ５３ ３．
４α−メチル−Ｄ５６ ６．９−マン
ノシッド Ｄ−グルコ−７、５１４，４ Ｄ−マルトース ４９ ４．７
第５図にＨＲＰ反応における種々の基質による発色を示
す。ＡＦＰとしては日本ＡＦＰ標準を用い、ＡＦＰの最
低レベルは４ ｐｙｙｔａであった。反応時間は４−メ
トキシ−１−ナフトールの場合２分、他の場合３０分で
あった。これから、本発明によるＡＦＰ検出が非常に高
感度であることが明らかである。
３．９ａ−メ’−Ｄ９５ ５．５
−マンノシッド Ｄ−グルコース １２１ ４．
２Ｄ−ぺηレトーヌ １２１
５．３純化 ５３ ３．
４α−メチル−Ｄ５６ ６．９−マン
ノシッド Ｄ−グルコ−７、５１４，４ Ｄ−マルトース ４９ ４．７
第５図にＨＲＰ反応における種々の基質による発色を示
す。ＡＦＰとしては日本ＡＦＰ標準を用い、ＡＦＰの最
低レベルは４ ｐｙｙｔａであった。反応時間は４−メ
トキシ−１−ナフトールの場合２分、他の場合３０分で
あった。これから、本発明によるＡＦＰ検出が非常に高
感度であることが明らかである。
第１図は抗体結合ＮＣ膜を用いた場合と、抗体を結合し
ていないＮＣ膜を用いた場合とのＡＦＰ転写効果の違い
を示す図であシ、第２図は純化していない抗ＡＦＰ抗体
をＮＣ膜に結合させた際、転写されたＡＦＰをα−メチ
ル−Ｄ−マンノシドで洗條する場合と、洗條しない場合
とのＡＦＰ検出効果の違いを示す図であシ、第３図はＣ
ｏｎ−Ａ親和電気泳動によるＡＦＰの分離に及ぼすα−
メチル−Ｄ−マンノシド（ＭＭ）洗條の影響を示す図で
ある。第３図において、十腹は洗條した場合、−塵は洗
條しない場合ヲ示ス。第４図は、ツイーン−２０とゼラ
チンのブロック剤としての効果の違いを示す図であ）、
第５図は種々の発色剤を用いた場合の感度を示す図であ
る。
ていないＮＣ膜を用いた場合とのＡＦＰ転写効果の違い
を示す図であシ、第２図は純化していない抗ＡＦＰ抗体
をＮＣ膜に結合させた際、転写されたＡＦＰをα−メチ
ル−Ｄ−マンノシドで洗條する場合と、洗條しない場合
とのＡＦＰ検出効果の違いを示す図であシ、第３図はＣ
ｏｎ−Ａ親和電気泳動によるＡＦＰの分離に及ぼすα−
メチル−Ｄ−マンノシド（ＭＭ）洗條の影響を示す図で
ある。第３図において、十腹は洗條した場合、−塵は洗
條しない場合ヲ示ス。第４図は、ツイーン−２０とゼラ
チンのブロック剤としての効果の違いを示す図であ）、
第５図は種々の発色剤を用いた場合の感度を示す図であ
る。
Claims (5)
- （１）（ｉ）レクチン含有アガロースゲル （ｉｉ）抗α−フェトプロテイン抗体結合ニトロセルロ
ース膜 （ｉｉｉ）該レクチンと特異的相互作用を有する単糖ま
たはオリゴ糖の溶液 （ｉｖ）該抗α−フェトプロテイン抗体とは異なる動物
種由来の抗α−フェトプロテイン抗体 （ｖ）（ｉｖ）で用いる動物種の免疫グロブリンに対す
る抗体に酵素標識したものおよび （ｖｉ）（ｖ）の酵素によつて発色する基質からなるα
−フェトプロテインの分画検出試薬キット。 - （２）該レクチンがコンカナバリンＡ、レンズマメレク
チンＡまたは赤血球凝集性インゲンマメレクチンである
特許請求の範囲第１項記載の分画検出試薬キット。 - （３）該単糖がα−メチル−Ｄ−マンノシッド、グルコ
ースまたはマンノースである特許請求の範囲第１項記載
の分画検出試薬キット。 - （４）該オリゴ糖がマルトースである特許請求の範囲第
１項記載の分画検出試薬キット。 - （５）レクチン含有アガロースゲルにて電気泳動を行つ
てα−フェトプロテインを分画したものを抗α−フェト
プロテイン抗体結合ニトロセルロース膜にブロッテイン
グにより抗体親和転写し、転写されたニトロセルロース
膜を、使用したレクチンと特異的相互作用を有する単糖
又はオリゴ糖の溶液で洗浄し、しかる後に該膜への結合
に用いた抗α−フェトプロテイン抗体とは異なる動物種
由来の抗α−フェトプロテイン抗体を加え、さらに、上
記の動物種の免疫グロブリンに対する抗体に酵素標識し
たものを加え、ついで該酵素によつて発色する基質を加
えることを特徴とするα−フェトプロテインの分画検出
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12396985A JPH06100604B2 (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12396985A JPH06100604B2 (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61292062A true JPS61292062A (ja) | 1986-12-22 |
| JPH06100604B2 JPH06100604B2 (ja) | 1994-12-12 |
Family
ID=14873795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12396985A Expired - Lifetime JPH06100604B2 (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06100604B2 (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999039209A1 (de) * | 1998-02-02 | 1999-08-05 | Biogenes Gmbh | Immunoassay und testkit zur bestimmung von fucosyliertem protein in einer biologischen probe |
| JP2005522712A (ja) * | 2002-04-15 | 2005-07-28 | アメリカン ナショナル レッド クロス | 混合物中のリガンドおよび標的を検出する方法 |
| WO2008031288A1 (fr) * | 2006-09-13 | 2008-03-20 | Beijing Hotgen Biotech Co., Ltd | Colonne centrifuge préremplie servant à dépister un variant d'alpha-fétoprotéine spécifique de l'hépatocarcinome, et trousse d'analyse contenant ladite colonne |
| WO2009048196A1 (en) * | 2007-10-08 | 2009-04-16 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | An identification method of glycoproteins using a specific lectin precipitation |
| CN102353791A (zh) * | 2011-06-30 | 2012-02-15 | 倪润洲 | 一种分离检测afp亚型的新方法 |
| WO2013161614A1 (ja) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | コニカミノルタ株式会社 | 酵素処理工程を含むレクチンを用いた抗原検出方法 |
| US10222385B2 (en) | 2013-12-27 | 2019-03-05 | Konica Minolta, Inc. | Methods for discriminating between prostate cancer and a benign prostate-disease |
| US10371704B2 (en) | 2013-12-27 | 2019-08-06 | Konica Minolta, Inc. | Method for discriminating between prostate cancer and a benign prostate disease |
| US10697959B2 (en) | 2014-06-20 | 2020-06-30 | Konica Minolta, Inc. | Sandwich assay using labeled lectin and kit therefor |
-
1985
- 1985-06-06 JP JP12396985A patent/JPH06100604B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999039209A1 (de) * | 1998-02-02 | 1999-08-05 | Biogenes Gmbh | Immunoassay und testkit zur bestimmung von fucosyliertem protein in einer biologischen probe |
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| US8119356B2 (en) | 2007-10-08 | 2012-02-21 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Identification method of glycoproteins using a specific lectin precipitation |
| CN102353791A (zh) * | 2011-06-30 | 2012-02-15 | 倪润洲 | 一种分离检测afp亚型的新方法 |
| WO2013161614A1 (ja) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | コニカミノルタ株式会社 | 酵素処理工程を含むレクチンを用いた抗原検出方法 |
| US10527615B2 (en) | 2012-04-27 | 2020-01-07 | Konica Monolta, Inc. | Antigen detection method which uses lectin and comprises enzyme treatment step |
| US10222385B2 (en) | 2013-12-27 | 2019-03-05 | Konica Minolta, Inc. | Methods for discriminating between prostate cancer and a benign prostate-disease |
| US10371704B2 (en) | 2013-12-27 | 2019-08-06 | Konica Minolta, Inc. | Method for discriminating between prostate cancer and a benign prostate disease |
| US10697959B2 (en) | 2014-06-20 | 2020-06-30 | Konica Minolta, Inc. | Sandwich assay using labeled lectin and kit therefor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06100604B2 (ja) | 1994-12-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |