DE3686413T2

DE3686413T2 - Verfahren zur bestimmung von immunoglobulin-a-protease.

Info

Publication number: DE3686413T2
Application number: DE8686301661T
Authority: DE
Inventors: Murray A Kittie
Original assignee: MABGON TEST CO
Current assignee: MABGON TEST CO
Priority date: 1986-03-07
Filing date: 1986-03-07
Publication date: 1992-12-24
Anticipated expiration: 2006-03-08
Also published as: US4582699A; EP0236605A1; DE3686413D1; ATE79475T1; EP0236605B1

Description

Gonorrhöe ist eine Geschlechtskrankheit, die durch das Bakterium Neisseria gonorrhea verursacht wird. Diese Krankheit quälte die Menschheit seit der frühen Geschichte, und obwohl Penicillin und verwandte "Wunderarzneimittel" geholfen haben, die Ausbreitung der Gonorrhöe zu kontrollieren, kommt sie immer noch in epidemischen Verhältnissen vor. In den Vereinigten Staaten werden jährlich 3 Millionen Gonorrhöe-Fälle gemeldet, und weltweit werden jährlich über 60 Millionen Fälle gemeldet.
Ein Hauptgrund für die rasante Ausbreitung der Gonorrhöe ist der Mangel eines schnellen Nachweisverfahrens der Infektion im Frühstadium. Neisseria gonorrhea kann auf den Genitalmembranen mehrere Tage wachsen, bevor die offensichtlichen Symptome der eitrigen Entladung sichtbar werden, und während dieser Zeitspanne kann der Kontakt mit einer nichtbefallenen Person zu einer unwissentlichen Übertragung des Bakteriums führen. Ferner sind viele Träger der Krankheit, insbesondere Frauen, symptomlos und verbreiten die Krankheit unwissentlich.
Die gegenwärtigen Diagnoseverfahren auf Gonorrhöe umfassen eine vorläufige mikroskopische Beobachtung eines gram-gefärbten Extrakts aus Uro-Genitalmembranen durch einen geschulten Arzt und anschließende Inkubation des Extrakts auf einem für Neisseria gonorrhea selektiven Medium. Die abschließenden chemischen Tests werden im Labor durchgeführt und schließlich dem Patienten mitgeteilt, der dann behandelt werden kann. Dieses Diagnoseverfahren ist ein zeitaufwendiger Prozeß, der geschultes Personal und komplizierte Instrumente erfordert.
Versuche zur Herstellung von Enzym-inhibierendem Ascites, erhalten aus monoklonalen Antikörpern gegen IgA-Protease aus Laborkulturen von Neisseria gonorrhea, sind in Hybridoma, Bd. 4, 1985, S. 80, beschrieben.
Das US-Patent 4 188 371 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Neisseria-Bakterien unter Verwendung eines Polyseren-Reagens, das für ein Enzym spezifisch ist, das von dem Autor 1,2-Propandiol-Dehydrogenase genannt wird,
Die Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß bestimmte Spezies von Neisseria-, Haemophilus- und Streptococcus-Bakterien, insbesondere Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenza und Streptococcus pneumoniae das Enzym Immunglobulin-A-Protease (IgAP) bilden und daß ein Immunoassay auf IgAP durch Kontaktieren einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der spezifisch an eine antigene Stelle des Enzyms bindet, ein einfaches, schnelles Verfahren zur Diagnose der Krankheiten, die mit solchen IgAP-bildenden Bakterien verbunden sind, darstellt.
Erfindungsgemäß wird ein Immunoassay-Reagens bereitgestellt, das einen Antikörper, der spezifisch an eine entigene Stelle des Enzyms IgAP bindet.
Erfindungsgemäß wird ebenso ein Immunoassay-Kit zum Nachweis von IgAP-bildenden Bakterien bereitgestellt, das in abgepackter Kombination einen ersten Behälter, der einen erfindungsgemäßen Antikörper enthält, und einen zweiten Behälter, der ein Reagens zur Detektion der Reaktion zwischen einer biologischen Probe und dem Antikörper enthält, enthält.
Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Reagens zur Verwendung in dem Immunoassay des Enzyms IgAP nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt, das einen Antikörper, der spezifisch an eine antigene Stelle des Enzyms IgAP bindet und mit einem chromophoren, enzochromen, fluorobromen oder luminogenen Molekül konjugiert ist oder mit einem radioaktiven Element markiert ist, enthält.
Erfindungsgemäß wird ebenso ein Immunoassay-Kit zum Nachweis von IgAP-bildenden Bakterien nach einem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt, das einen Antikörper, der spezifisch an eine antigene Stelle des Enzyms IgAP bindet, und ein Reagens zum Nachweis der Reaktion zwischen einer biologischen Probe und dem Antikörper umfaßt.
Der Antikörper gegen IgAP, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist bevorzugt ein monoklonaler Antikörper. Dieser monoklonale Antikörper kann zur Detektion von IgAP in biologischen Proben, beispielsweise Proben von Uro-Genitalmembranen, unter Verwendung bekannter immunologischer Techniken einschließlich des Enzym-linked Immunoassays (ELISA), der Biliganden-Bindung (Sandwich-Technik), der Radialimmundiffusion, des Radioimmunoassays (RIA) und der Agglutination verwendet werden. Der Antiküorper kann auch zur Isolierung und Reinigung des IgAP aus biologischen Proben, in denen konkurrierende Enzyme vorhanden sind, verwendet werden, wonach die Analyse von IgAP durch Reaktion mit einem geeignet markierten Substrat möglich ist.
Der Antikörper gegen IgAP zur Verwendung in bestimmten diagnostischen Verfahren gemäß der Erfindung kann beispielsweise auf einer inerten Oberfläche immobilisiert sein, in ein Gel eingebettet sein oder an ein Molekül konjugiert sein, das dem Antikörper Farbe, Fluoreszenz oder Radioaktivität verleiht.
Ein Substrat zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren ist bevorzugt Immunglobulin A, Unterklasse 1, oder ein synthetisches Polypeptid, das an ein chromophores oder radioaktives Mittel konjugiert ist. Die Reaktion zwischen IgAP, die mittels eines Antikörpers gegen IgAP isoliert wurde, und einem Substrat wird durch den Verlust der Farbe oder Radioaktivität im Substrat oder die Bildung von Farbe oder Radioaktivität in den Produkten gemessen. Dialyseröhrchen, Filterhilfsmittel oder Elektrophorese können verwendet werden, um die Produkte von den Reaktanten zu trennten. Alternativ kann das Substrat auf einer inerten Oberfläche immobilisiert werden, und die Reaktion mit IgAP, das mit einem Antikörper gegen IgAP isoliert wurde, kann als separate Farbbanden oder Radioaktivitätsbanden auf der inerten Oberfläche beobachtet werden.
Biologische Proben, die auf Neisseria gonorrhea analysiert werden können, können durch Tupfer, Tampons oder Vaginalspülungen bei Frauen und durch Urin oder Abstriche aus dem Penis oder dem Rektum bei Männern erhalten werden. Gezüchtete Proben von Neisseria gonorrhea aus diesen oder anderen biologischen Quellen können ebenfalls analysiert werden. Die Proben können direkt analysiert werden oder können lysiert und/oder konzentriert werden.
Das erfindungsgemäße Kit kann ein Kit zur Verwendung durch einen Arzt während der Untersuchung eines Patienten in der Praxis sein oder kann angepaßt und automatisiert werden, um große Probenzahlen in einer zentralen Sammelstelle, wie einer Einberufungsstelle der Armee, einem College Campus oder einer Klinik für Geschlechtskrankheiten, zu untersuchen, aber bevorzugt ist es ein Kit zur Selbstdiagnose von Gonorrhöe durch die Patienten. Das Kit dieser Ausführungsform umfaßt eine Probensammelvorrichtung, einen Antikörper gegen IgAP und Mittel zur Detektion der Reaktion zwischen dem Antikörper und IgAP in den Proben. Geeignete Puffer und ionische Salze können ebenfalls in dem Kit enthalten sein. Die Erfindung erlaubt ebenfalls die vorläufige Diagnose von Meningitis, einer Krankheit, die durch Neisseria meningitidis, das ebenso IgAP erzeugt, verursacht wird. Zur Analyse geeignete biologische Proben umfassen Spinal- und Synovialflüssigkeit, ebenso wie Extrakte von Uro-Gentialmembranen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Ein Verfahren und Mittel zur Detektion der Bakterien Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae und anderer Bakterien, die das Enzym IgAP bilden, umfassend einen Immunoassay von IgAP, werden im folgenden beschrieben.
Bei immunchemischen Assays aus IgAP können das ganze Antiserum gegen IgAP, die Globulinfraktion oder ein gereinigter, für IgAP spezifischer Antikörper einschließlich eines monoklonalen Antikörpers unter Bedingungen bezüglich des pH-Werts, der Ionenstärke, der Temperatur und der Konzentrationen, die zur Bildung des IgAP-Antikörperkomplexes beitragen, verwendet werden.
Das Antiserum gegen IgAP kann in einem Wirtstier, wie einem Kaninchen oder Schaf, gebildet werden. Die Serumfraktion, die den Antikörper enthält, kann nach Standardtechniken isoliert werden. Dieses Antiserum kann in verschiedenen Ausführungsformen der im folgenden beschriebenen diagnostischen Verfahren verwendet werden, oder das Serum kann weiter mittels Elektrophorese, Zentrifugation mit hoher Geschwindigkeit oder dergleichen zur Erzeugung eines empfindlicheren und spezifischeren Antikörpers gereinigt werden. Schließlich können große Mengen eines hochspezifischen monoklonalen Antikörpers mittels der Hybrid-Myeloma-Technik nach einem Fachmann bekannten Verfahren erzeugt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen des diagnostischen Verfahrens wird der Antikörper gegen IgAP, immobilisiert auf Cellulose, Agarose, Sephadex oder Glaskugeln oder anderen ähnlichen inerten Oberflächen, wie Metall, Plastik oder Keramik, verwendet, die keine Wechselwirkung mit der anschließenden Reaktion zeigen. Die Adsorption, die Br-CN-Aktivierung oder andere, dem Fachmann bekannte Techniken können verwendet werden, um den Antikörper zu immobilisieren.
Bei anderen Ausführungsformen wird der Antikörper gegen IgAP in Konjugation an ein chromophores (hochgefärbtes) Molekül, ein enzochromes (ein Enzym, das nach Zugabe von Reagentien Farbe erzeugt) Molekül, ein fluorochromes (fluoreszentes) Molekül oder ein luminogenes (lumineszentes) Molekül verwendet. Chromophore Moleküle, die verwendet werden können, sind 2,3-Dinitrobenzolsalze (DNB), Dinitrophenol (DNP) und Methyl- und Butylorange. Andere geeignete chromophore Agentien sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Enzochrome Moleküle, die mit dem Antikörper konjugiert werden können, sind Enzyme, die mit geeigneten Reagentien Farbe ergeben. Beispiele sind die alkalische Phosphatase (ALP), die mit Nitrophenylphosphat (NNP) Farbe entwickelt, Glucose-Oxidase mit Glucose und D-Galactopyranosid. Diese und andere Beispiele sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Beispiele für fluorogene Mittel sind 2,4-Dinitrofluorbenzol und "Pipsyl"-Derivate. Luminogene Moleküle können an Antikörper nach dem Verfahren nach Branchini et al. [Biochem. Biophy. Res. Commun. 97, 334 (1980)] konjugiert werden. Der im folgenden zerwendete Ausdruck "chromophor" soll ebenso "enzochrome", "fluorochrome" und "luminogene" Moleküle umfassen.
Bestimmte Ausführungsformen umfassen weiter den Schritt, bei dem ein Substrat gegen IgAP, nämlich IgA&sub1;, oder ein geeignetes Polypeptid, das die benötigte Prolin-Threonin-Bindung enthält, mit dem IgAP, das mittels eines Antikörpers gegen IgAP isoliert worden ist, in Kontakt gebracht wird. Diese Substrate können ebenso an chromophore Moleküle konjugiert sein und/ oder auf einer inerten Oberfläche immobilisiert sein. Das Substrat IgA&sub1; kann nach der monoklonalen Technik nach Isolierung aus einer biologischen Quelle, wie Colostrum, bevorzugt menschliches Colostrum, hergestellt werden. IgA&sub1; kann während der monoklonalen Erzeugung mittels IgAP bestimmt werden, wobei solche Techniken, wie der Enzym-linked Immunoassay, der Radioimmunoassay, die Präzipitin-Reaktion oder die Radialimmundiffusion unter Verwendung von Elektrophorese, sofern notwendig, verwendet werden.
Bei bestimmten Assayverfahren kann auch IgAP, das mit einem radioaktiven Element markiert ist, verwendet werden. I¹²&sup5;, konjugiert nach dem Chloramin-T-Verfahren, ist ein übliches Beispiel, aber andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können ebenfalls verwendet werden.

A. Bindung zweizähniger Liganden - "Sandwich"-Technik

IgAP ist ein großes Molekül mit mehr als einer antigenen Stelle, d.h. es ist zweizähnig, was die Basis des folgenden Immunoassays auf IgAP ist, worin der immobilisierte Antikörper gegen IgAP, bevorzugt auf einer inerten Oberfläche, wie Papier oder einem ähnlichen saugfähigen Vlies, in Kontakt mit einer Probe, die vermutlich IgAP enthält, gebracht wird. Im Falle von wäßrigen Proben, wie Vaginalspülungen oder Urin, wird die Lösung gepuffert, und ionische Salze können bei einer Optimalkonzentration für die IgAP-Antikörper-Wechselwirkung vorliegen. Tris- oder Borat-gepuffertes Phosphat bei pH 7,5 bis 9,0 und eine Ionenstärke von etwa 0,010 bis 0,5 sind beispielsweise geeignete Puffermittel und ionische Salze. Dieses "Sandwich-Verfahren" kann auch direkt an einer Tampon-Probenoberfläche angewendet werden, und in diesem Fall können Puffer und Salze auf der inerten Oberfläche zusammen mit dem Antikörper vorhanden sein. Die inerte Oberfläche mit dem Antikörper oder Antikörper-IgAP-Komplex darauf wird dann in Kontakt mit einem Antikörper gegen IgAP in Konjugation an ein chromophores Molekül gebracht. Bevorzugt ist der Antikörper in einer Lösung, die bei einem pH-Wert von etwa 7,5 bis etwa 9,0 und einer Ionenkonzentration, die etwa 0,01M bis etwa 0,1M NaCl äquivalent ist, gepuffert ist. Nach einer sorgfältigen Spülung unter Wasser oder mit geeigneten oberflächenaktiven Mitteln, wie Tween 20, (Warenzeichen), zur Entfernung von überschüssigem gefärbten Antikörper, wird die inerte Oberfläche auf Farbe, Fluoreszenz oder Lumineszenz direkt oder nach Zugabe eines farbbildenden Mittels untersucht. Farbe auf der inerten Oberfläche zeigt die Wechselwirkung zwischen einem immobilisierten IgAP-Antikörper-IgAP-Komplex und einem konjugierten Antikörper in Lösung. Eine Kontrolle kann zum Farbvergleich laufengelassen werden.
Diese "Sandwich-Technik" kann für die klinische Verwendung angepaßt sein, indem Antikörper, die mit radioaktiven Elementen markiert sind, verwendet werden und entweder die Aktivitätsabnahme in Lösung oder die Radioaktivitätszunahme auf dem festen Träger beobachtet wird. Diese Ausführungsform ist hochempfindlich und schnell und für große Probenzahlen geeignet.

B. Enzym-linked Immunoassay - ELISA

Eine Lösung mit IgAP in Konjugation an ein Enzym, das mit entwickelnden Reagentien eine Farbe bildet, und Puffer und ionischen Salzen, die für die Reaktion zwischen IgAP und dem Antikörper gegen IgAP geeignet sind, werden zusammengegeben und mit dem bevorzugt auf einer inerten Oberfläche, wie einem Papierstreifen oder auf Glaskugeln immobilisierten Antikörper, reagieren gelassen. Die Menge des enzochrom konjugierten IgAPs ist ausreichend, um etwa 50% der reaktiven Stellen auf dem immobilisierten Antikörper abzusättigen. Die inerte Oberfläche mit dem Antikörper-IgAP- Enzymkomplex wird mit einer gepufferten Probe, die vermutlich Neisseria gonorrhea oder andere Bakterien, die IgAP bilden, enthält, in Kontakt gebracht, wobei die Probe eine unbekannte Menge IgAP enthält. Die Farbe des entstandenen immobilisierten Antikörper-IgAP-Enzymkomplexes auf dem Streifen nach Zugabe von farbentwickelnden Reagentien wird im Vergleich mit einem Kontrollstreifen, der nicht mit der IgAP-haltigen Probe behandelt worden ist, beobachtet. Farbverdünnung auf der inerten Oberfläche, die mit der Probe behandelt wurde, bedeutet das Vorliegen von IgAP in der unbekannten Probe.
Dieses Verfahren kann für die klinische Verwendung angepaßt werden, indem Proben und immobilisiertes Enzym, bevorzugt in Zentrifugenröhrchen, in Kontakt gebracht werden und die Farbentwicklung spektrophotometrisch beobachtet wird. Diese Ausführungsform ist sehr empfindlich und schnell.

C. Radialimmundiffusion - Präzipitin-Reaktion

Der monospezifische Antikörper, bevorzugt ein monoklonaler Antikörper gegen IgAP, wird in einem erweichten Gelatinemedium, wie Agar oder Agarose, zusammen mit Puffern und Salzen zum Erhalt des pH-Werts zwischen etwa 6,0 bis etwa 9,0 und der Ionenstärke zwischen etwa 0,01M bis etwa 0,5M für eine optimale Antigen-Antikörper-Wechselwirkung suspendiert. Das Suspensionsmedium gemäß dem US-Patent 4 259 207 ist ein geeignetes Beispiel. Das Gemisch wird ausgebreitet, um auf einer Testplatte auszuhärten, oder bevorzugt in einen scheibchenförmigen Behälter, wie eine Ouchterlony-Platte gegossen. Eine kleine Probenmenge wird auf das verfestigte Gel gegeben, bevorzugt in eine zentrale Kavität, und die Platte oder das Scheibchen läßt man bevorzugt bedeckt für eine Zeitspanne von Stunden Stehen. Die Diffusion der Probe in die umgebende Fläche tritt während dieser Zeitspanne ein. Wenn das Antigen-IgAP vorhanden ist, reagiert es mit dem eingebetteten Antikörper und verursacht eine opake Fläche in einem radialen Muster um den Aufbringungspunkt der Probe. Eine Kontrolle kann zum Vergleich mitlaufen gelassen werden. Die Kalibrierung einer Menge IgAP in der Probe, sofern gewünscht, kann durch Kontrollieren der Temperatur, der Zeit und der Größe der Probe und Vergleich der entstandenen Größe der radialen Fläche mit der einer bekannten Konzentration erhalten werden.
In anderen Ausführungsformen kann ein rohes Antiserum oder ein teilgereinigter Antiköper daraus ebenso in den Agar eingebettet werden. Die Lyse von sensibilisierten Zellen kann ebenfalls beobachtet werden.

D. Radioimmunoassay

Der Antikörper gegen IgAP wird auf einer inerten Oberfläche, wie Glaskugeln, in einer Trennsäule immobilisiert. Ein Teil IgAP wird an ein radioaktives Element, bevorzugt I¹²&sup5;, konjugiert und mit dem immobilisierten Antikörper in einer Menge, die ausreicht, um 50% der Bindungsstellen abzusättigen, reagieren gelassen. Der immobilisierte Antikörper-Enzymkomplex wird mit einer Probe, die vermutlich IgAP enthält, in Kontakt gebracht, wobei die Probe auf einen pH-Wert zwischen 6 und 9 gepuffert wird, und insgesamt ionische Salze etwa 0,05 bis etwa 0,5M für die optimalen Reaktionsbedingungen zur Bildung des IgAP-Antikörper-Komplexes enthält. Das IgAP wird von dem Antikörper eluiert, und der Eluent wird auf Radioaktivität gemessen. Der Aktivitätsverlust im Vergleich mit einer Kontrolle zeigt das Vorhandensein von IgAP in der Probe an.

E. Hämagglutination

IgAP kann nach Standard-Hämagglutinationstechniken mit einem Antiserum gegen IgAP als Sensibilisierungsmittel getestet werden.

F. Assays auf IgAP auf der Basis einer proteolytischen Reaktion mit dem Substrat

IgAP ist ein proteolytisches Enzym, das die Hydrolyse eines Substrats in kleinere Fragmente katalysiert. Somit wird IgA&sub1; zu den kleineren Fab- und Fc-Fragmenten hydrolysiert.
IgA&sub1; kann aus Colostrum oder dem Plasma von Patienten mit multiplem Myelom oder Waldenstroms Makroglobulinämie nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren [Mesticky et al., J. Lab. Clin. Med. 89, 919 (1977)] isoliert werden. IgA&sub1; kann auf DEAE-Cellulose gereinigt werden oder anderweitig behandelt werden, um die Fab- und Fc-Fragmente zu entfernen, und zwar indem es durch Säulen mit immobilisierten Antikörpern, die für die Fragmente spezifisch sind, geleitet wird, durch Elektrophorese oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren. IgA&sub1; in hochgereinigter, spezifischer Form kann mittels der Technik der monoklonalen Antikörper gereinigt werden, indem die Verfahren der Hybrid-Myeloma-Technik, die einem Fachmann gut bekannt sind, verwendet werden.
IgA&sub1; ist das einzige bekannte, natürlich vorkommende Substrat von IgAP, aber ein Polypeptid mit der charakteristischen Prolyl-Threolyl-Bindung, die die Rezeptorstelle für das Enzym ist, kann zum Zweck des Assays synthetisiert werden. Der im folgenden verwendete Ausdruck "Substrat" bedeutet sowohl IgA&sub1; als auch solche synthetische Polypeptide, die als Substrate gegen IgAP dienen können.
Das Vorliegen von IgAP kann zusätzlich durch Hydrolyse eines Substrats demonstriert werden, wie durch die Bildung von charakteristischen Produkten oder durch Verlust des Substrats selbst offensichtlich ist. Die proteolytische Reaktion schreitet am günstigsten in einer Lösung (im folgenden als "Reaktionslösung" bezeichnet), die aus einem Puffer, bevorzugt 0,05M Phosphatpuffer, pH 7,5, mit 0,85% NaCl (PBS) besteht, bei Raumtemperatur für eine Zeitspanne von bis zu 3 Stunden fort. Tris (Hydroxymethylaminomethan), 0,05M, pH 8,1, ist ebenfalls ein geeigneter Puffer. Ein Schwermetall kann in der Reaktionslösung vorhanden sein.
Vor dem Assay wird die Probe behandelt, um IgAP zu konzentrieren und um es von störenden Proteasen abzutrennen, indem die Lösung mit einem Antikörper gegen IgAP, der auf einer inerten Oberfläche, wie Glaskugeln oder einem Papierstreifen, immobilisiert ist, in einer gepufferten Lösung bei pH 8 bis 10 in Kontakt gebracht wird. Die inerte Oberfläche mit dem IgAP-Antikörperkomplex darauf wird gespült und dann mit einem Substrat gegen IgAP in Kontakt gebracht. Alternativ kann IgAP von dem IgAP-Antikörperkomplex mit einer Lösung bei niedrigerem pH - etwa pH 6,5 beispielsweise - vor der Behandlung mit dem Substrat eluiert werden.
Die folgenden Verfahren sind Assays auf der Basis der proteolytischen Reaktion von IgAP.

1. Kolorimetrische Assays auf chromogenes Substrat

Ein bevorzugter Assay auf IgAP umfaßt die kolorimetrische Detektion der Reaktion zwischen IgAP, isoliert mittels eines Antikörpers gegen IgAP, und einem Substrat. Das Substrat wird an ein chromogenes Molekül nach vorstehend beschriebenen Verfahren konjugiert. Farbe in den kleineren Spaltprodukten zeigt eine Reaktion zwischen dem Substrat und IgAP an. In diesem Assay muß das Produkt von der Reaktionslösung abgetrennt werden, um den Farbtransfer zu lokalisieren. Diese Abtrennung kann auf Größenunterschieden zwischen Produkten und Reaktanten beruhen. IgA beispielsweise besitzt ein Molekulargewicht von etwa 120.000, wohingegen die kleineren Spaltfragmente Fab und Fc im Bereich von 30.000 Dalton liegen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden ein konjugiertes Substrat in einer Konzentration von etwa 5 mg/ml und eine Probe, die vermutlich IgAP enthält, für bis zu 3 Stunden in einer Reaktionslösung inkubiert. Das konjugierte Substrat und die Probe werden während dieser Inkubation in einem Dialyseschlauch eingeschlossen, das eine ausreichend große Porengröße besitzt, um das Wandern des größeren Substrats zu verhindern, aber das Austreten der kleineren Reaktionsprodukte gestattet. Der Dialyseschlauch wird dann in einem zweiten Teil der gleichen Reaktantenlösung suspendiert. Die Farbentwicklung in der Suspendier-Reaktionslösung und der Verlust an Farbe in dem Dialyseschlauch zeigen die Reaktion zwischen IgAP und dem Substrat an.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird eine Säule aus Kügelchen mit kontrolliertem Durchmesser verwendet, um die Produkte von der Reaktionslösung gemäß dem Molekulargewicht abzutrennen.
Bei Ausführungsformen, die für die klinische Verwendung geeignet sind, können elektrophoretische Trenntechniken, wie die isoelektrische Fokussierung oder die Zonenelektrophorese, die auf Unterschieden, sowohl in der Größe als auch in der Ladungsverteilung zwischen Produkten und Reaktanten, beruhen, ebenfalls verwendet werden, um die Produkte von den Reaktanten zu trennen. Produkte, die elektrophoretisch abgetrennt sind, können durch charakteristische Lokalisationen im Vergleich mit Standardsubstanzen detektiert werden oder können mittels Farbe oder immunchemisch identifiziert werden. Harzkügelchen mit geladenen Oberflächen können ebenfalls verwendet werden, um die Produkte und Reaktanten zu trennen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfaßt chromophores IgA&sub1;, immobilisiert auf einer bestimmten Fläche einer inerten Oberfläche, wie Papier oder einem ähnlichen saugfähigen Vlies. Diese Oberfläche wird mit einer Reaktantenlösung, die das vermutete IgAP enthält, in Kontakt gebracht, und nach einer Zeitspanne wird das Papier bezüglich der Bewegung der Farbe untersucht. Eine Farbbande, getrennt von der Hauptbande, an der ursprünglichen Lokalisation zeigt die Proteolyse des konjugierten Substrats durch IgAP an. Eine geeignete Kontrolle zum Vergleich umfaßt immobilisiertes chromogenes IgA&sub2;, das gegenüber IgAP resistent ist. Ein elektrisches Feld kann angelegt werden, um die Trennung der Reaktanten und Produkte zu verstärken, und farbentwickelnde Reagentien können angewandt werden, um die Bewegung der Produkte auf dem Streifen zu lokalisieren. Alternativ können Reagentien, die für die Produkte spezifisch sind, feldaufwärts der Startstelle angebracht werden, von wo aus sie mit den Reaktionsprodukten reagieren und sie identifizieren. Bei dieser Ausführungsform kann beispielsweise Prolin-Oxidase mit geeigneten Puffern und ionischen Salzen feldaufwärts zusammen mit einem geeigneten chromophoren Reagens, wie o-Aminobenzaldehyd, der sich in Gegenwart von 1'-Pyrrolin-5-carbonsäure (PCA') [Dendinger und Brill, J. Biochemistry 103, 145 (1970)], einem Reaktionsprodukt zwischen Prolin-Oxidase und Prolin, gelb färbt, angebracht werden. Die feldaufwärts lokalisierte Farbe auf dem Papier zeigt somit Prolin am terminalen Ende des von IgAP gebildeten Fragments an. Zum Farbvergleich kann eine Kontrolle auf Proben, die kein IgAP enthalten, laufengelassen werden.
In weiteren Ausführungsformen für die klinische Verwendung kann die Reaktion von Prolin-Oxidase und terminalem Prolin spektrophotometrisch durch Zugabe von o-Aminobenzaldehyd oder durch Aufzeichen eines assoziierten NADH-gekoppelten Enzymsystems in Lösung gemessen werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann der Reaktionsstreifen mit chromogenen Antikörpern, die für die Reaktionsprodukte spezifisch sind, behandelt werden.

2. Immunoassay auf Substrat oder Produkte

Standard-immunchemische Techniken können angepaßt werden, um die Konzentrationsabnahme des Substrats oder die Konzentrationszunahme der Produkte in der Reaktionslösung, die von IgAP erzeugt wird, in der zu analysierenden Probe zu verfolgen.
Ein bevorzugtes Assayverfahren umfaßt die Messung des Substrats mittels Hämagglutination. Eine Menge an Substrat gegen IgAP wird mit der zu analysierenden Probe, die bevorzugt lysiert ist und in der Reaktionslösung vorliegt, in Kontakt gebracht. Nach einer Zeitspanne von bis zu 3 Stunden wird eine abgemessene Menge der Lösung zu Latexkügelchen gegeben, die mit dem Antiserum gegen des Substrat in Rinderserumalbumin, gepuffert zwischen pH 9 und 10, beschichtet worden sind. Die gleiche Menge an Lösung, die keine Probe enthält, wird als Kontrolle zu einem anderen Teil beschichteter Latexkügelchen gegeben. Ein Unterschied in der Agglutinationsgeschwindigkeit und der Menge zwischen Probe und Kontrolle zeigt einen Substratverlust durch die Proteolyse mit IgAP an. Spektrophotometrische Beobachtung der Reaktion ist ebenfalls möglich. Die Empfindlichkeit dieser Reaktion kann durch Einarbeiten des Antikörpers in eine Gelmatrix und Beobachten der Präzipitation des Enzym-Antikörperkomplexes als einzelne Linie oder als kreisbildende Fläche verbessert werden. Eine grobe quantitative Bestimmung wird durch Kontrollkonzentrationen des Antikörpers erzielt.
Zum Test auf die Produkte der proteolytischen Reaktion zwischen dem Substrat und IgAP können Antikörper gegen Reaktionsprodukte verwendet werden, um die Latexkügelchen zu sensibilisierten. Ein positiver Test ist die Agglutination der Präzipitation im Vergleich zu einer Kontrolle ohne Probe. Ein Antikörper, spezifisch für das terminale Prolin oder Threonin, kann verwendet werden, um die Latexkügelchen zu beschichten, oder, wenn IgA&sub1; als Substrat verwendet wird, die Antikörper gegen Fab und Fc.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Substrat auf einer inerten Oberfläche immobilisiert. Die Oberfläche mit dem Substrat wird in Kontakt mit einer Probe in der Reaktionslösung gebracht, und nach einer Zeitspanne von bis zu 3 Stunden wird die Oberfläche entfernt, gespült und in Kontakt mit einer Lösung, die einen Antikörper gegen das Substrat enthält, gebracht, wobei der Antikörper mit einem gefärbten Molekül markiert ist. Nach Spülen wird die Oberfläche auf Farbe untersucht. Farbe zeigt die Reaktion zwischen dem gefärbten Antikörper und dem immobilisierten Substrat an. Mangel an Farbe zeigt Verlust von Substrat durch Reaktion mit IgAP an. Eine Kontrolle kann zum Farbvergleich laufengelassen werden.
Alternativ kann das immobilisierte Substrat nach Kontakt mit der Reaktionslösung in Kontakt mit farbkonjugierten Antikörpern, die für das auf der inerten Oberfläche verbleibende Fragment spezifisch sind, gebracht werden. Bei diesem Verfahren zeigt Farbe, die an der inerten Oberfläche haftet, die Reaktion von IgAP und Substrat an.
Auf gleiche Weise kann das immobilisierte Substrat nach Kontakt mit der Reaktionslösung in Kontakt mit einer Substanz, die für das terminale Prolin- oder Threoninende des hydrolysierten Substrats spezifisch ist, gebracht werden. Das Substrat kann ein chromophorer Antikörper, der für diese terminale Gruppe spezifisch ist, sein, oder er kann eine Prolinase und ein Chromophor sein, das die Farbe bei Vorliegen von terminalem Prolin erzeugt. Prolinase und der Chromophor können in lösung vorliegen oder können auf eine zweite inerte Oberfläche immobilisiert sein.
Andere Immonoassays einschließlich der Radialimmundiffusion, des RIAs oder des ELISAs, wie vorstehend beschrieben, können verwendet werden, um der Verlust an Substrat und an Reaktionsprodukten zu detektieren.
Es ist zu verstehen, daß die vorstehend beschriebenen Verfahren zum Test auf IgAP, bei denen gefärbte Reagentien verwendet werden, sehr spezifisch für die Anwendung dargelegt wurden, bei der weder geschultes Personal noch komplizierte Instrumente verfügbar sind. Diese Verfahren können jedoch zur Verwendung in einer klinischen Ausrüstung, mit der große Probenzahlen untersucht weden sollen, angepaßt werden, indem die chromogenen konjugierten Moleküle durch radioaktive Elemente ersetzt werden. Somit kann der radioaktive Assay durch die proteolytische Reaktion als Transfer von Radioaktivität von dem Substrat auf das Produkt, gemessen mittels Szintillationszählern, Geigerzählern und anderen Instrumenten zur Messung des radioaktiven Zerfalls, verfolgt werden.
Es ist auch zu verstehen, daß der Ausdruck "Farbe" nicht als auf den engen sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums beschränkt zu interpretieren ist, sondern Wellenlängen umfassen soll, die mit Standard-spektrophotographischen Instrumenten, wie Spektrophotometern und Absorptions- und Emissions-Kolorimetern, sowohl im UV- als auch im IR-Bereich, gemessen werden können.
Obwohl in Betracht gezogen wird, daß die Assayverfahren auf biologische Flüssigkeiten selbst angewandt werden können, können die Empfindlichkeit und die Spezifität des Verfahrens durch Kultivieren der Flüssigkeiten, bevorzugt auf einem Selektivmedium für Neisseria gonorrhea, wie Thayer-Martin, Chocolate-sugar, NYC-Medium oder Transgro-Medium, für 24 Stunden mit einer Eisenquelle, wie Fe-Dextran-Komplex (Inferon) gemäß dem US-Patent Nr. 4 229 530, vor dem Test verbessert werden. Proben in klinischen Ausrüstungen können Vaginalspülungen, die durch Gewinnen von 10 ml PBS gegen die Cervix im Falle von Frauen erhalten werden können, oder können die ersten paar Milliliter Urin im Falle von zu untersuchenden Männern sein. Der Urin kann zentrifugiert werden und das Sediment für die Analyse verwendet werden, bevorzugt nach Typisierung. Vaginal-, Urethral- oder Rektaltupfer können ebenfalls verwendet werden.
Die Sensitivität kann auch durch Vorbehandlung der biologischen Proben mit lysierenden Mitteln, wie isotoner Lösung, Schall oder Lysozym, zur Freisetzung von IgAP in die extrazelluläre Umgebung verbessert werden. Das US-Patent Nr. 4 166 765 beschreibt beispielsweise geeignete Lyseverfahren für biologische Verfahren, die Bakterien enthalten, die IgAP bilden. Jedes beliebige Lysemittel, das keine Wechselwirkung mit der anschließenden Enzymaktivität zeigt, kann verwendet werden.

III. Assays in Kitform ausgeführt

Das Kit umfaßt ein Mittel zum Sammeln der Probe, einen Antikörper gegen IgAP und ein Mittel für die Detektionsreaktion zwischen Probe und Antikörper. Das Kit kann auch ein Substrat gegen IgAP und Reagentien für eine geeignete Reaktionslösung umfassen.
Die Vorrichtung zum Probensammeln im Falle von Männern ist ein Gefäß, das markiert ist, um nur die ersten paar Milliliter des abzugebenden Urins aufzunehmen. Diese ersten paar Milliliter waschen aus der Harnröhre die eitrige Absonderung, die von Neisseria gonorrhea verursacht wird und die die höchste Konzentration an IgAP enthält. Eine Probe vom frühen Morgen ist bevorzugt.
Die Probensammlung im Falle von Frauen ist ein Tampon, der in der Scheide nahe der Cervix für eine Zeitspanne von mehreren Stunden, bevorzugt unmittelbar nach vermutlichem Kontakt mit Neisseria gonorrhea, getragen werden soll. Nach dieser Zeit wird er in ein Aufnahmegefäß entfernt, wo er entweder direkt mit dem Antikörper gegen IgAP in Kontakt gebracht wird, oder er wird mit lysierenden Mitteln und einer Reaktionslösung in einem verschlossenen Reagensglas extrahiert.
Der Antikörper gegen IgAP kann immobilisiert sein und/oder mit einem Chromophor konjugiert sein. IgAP kann an den Antikörper zur Verwendung in einem Enzym-linked Immunoassay komplexiert sein. Bei Ausführungsformen, bei denen die proteolytische Wirkung von IgAP, bevorzugt IgA&sub1;, gegebenenfalls in Konjugation mit einem chromophoren Molekül, verwendet wird, sind eingeschlossen. Das Substrat kann auf einer inerten Oberfläche, wie Papier oder einem ähnlichen saugfähigen Vlies, oder auf inerten Kügelchen, wie Sepharose oder Glas, immobilisiert sein. Diese proteinartigen Reagentien können in sterile, hermetisch versiegelte Päckchen abgepackt sein, um die Lagerzeit während des Vertriebs zu verlängern.
Reagentien, die Puffer und ionische Salze umfassen, können in dem Kit als Pulver in einem verschlossenen Gefäß vorliegen. Das Gefäß ist markiert, um das Volumen anzugeben, auf das es mit Wasser aufzufüllen ist, um die geeignete Verdünnung der Reagentien zur Reaktion zu ergeben. Gegebenenfalls kann destilliertes Wasser in dem Kit zur Verdünnung der Reagenslösung vorhanden sein.
Das Mittel für die Detektionsreaktion im Falle eines Immunoassays in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein Gelatinemedium, in dem der Antikörper gegen IgAP suspendiert ist. Das Gelatinemedium liegt in einem transparenten Glas- oder Plastikbehälter vor und umfaßt Puffer- und ionische Salze für die optimalen Bedingungen zur Bildung des IgAP-Antikörperkomplexes. Die Reaktion wird als transparente Fläche festgestellt, die sich von dem zentralen Punkt, an dem die Probe aufgebracht wurde, kreisförmig ausbreitet.
Das Mittel zur Detektionsreaktion in einer anderen bevorzugten Ausführungsform, die einen Immunoassay umfaßt, ist der Antikörper gegen IgAP in Konjugation an einen Chromophor in einem versiegelten, sterilen Paket zusammen mit Puffer- und ionischen Salzen. Zum Assay wird der Inhalt des Pakets mit Wasser in einem markierten Röhrchen, das in dem Kit bereitgestellt wird, verdünnt. Eingeschlossen in dieser Ausführungsform ist auch der Antikörper gegen IgAP, immobilisiert auf einer inerten Oberfläche. Für den Assay wird die inerte Oberfläche mit dem immobilisierten IgAP in Kontakt mit der Probe und dann mit der Lösung des Chromophor-konjugierten IgAPs gebracht. Die inerte Oberfläche wird auf Farbe untersucht, welche Gonorrhöe anzeigt.
Das Mittel zur Detektion von IgAP in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, die einen Enzym-linked Immunoassay (ELISA) umfaßt, sind Puffer- und ionische Salze in einem Reagensglas, die vor Gebrauch auf ein markiertes Volumen mit Wasser verdünnt werden. Ein immobilisierter Antikörper gegen IgAP wird mit IgAP in Konjugation an ein farbbildendes Enzym beschichtet, so daß etwa 50% der reaktiven Stellen bedeckt sind. Die Probe wird in die gepufferte Lösung, bevorzugt nach Lyse, eingeführt und mit der inerten Oberfläche mit einem immobilisierten Antikörper-Enzymkomplex darauf in Kontakt gebracht. Die farbentwickelnden Mittel werden der inerten Oberfläche, die den immobilisierten Antikörper-Enzymkomplex enthält, zugesetzt. Die Verdünnung der Farbe auf der inerten Oberfläche im Vergleich mit einer Kontrolle zeigt IgAP in der Probe an.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits umfaßt ein Substrat gegen IgAP, das auf einer umgrenzten Fläche auf einer inerten Oberfläche, bevorzugt Papier, immobilisiert ist und an ein chromophores Molekül konjugiert ist. Bei dieser Ausführungsform wird der immobilisierte Antikörper gegen IgAP mit der Probe in Kontakt gebracht, bevorzugt gespült, und in Kontakt mit dem immobilisierten Substrat gebracht. Die Bewegung der Farbe auf dem Papier in einer getrennten Bande zeigt die Proteolyse des immobilisierten Substrats mittels IgAP in der Probe an. Die separate Bande kann auch durch entwickelnde Mittel für ein Enzym in Bindung an ein Substrat identifiziert werden. Alternativ können Prolinase und o-Aminobenzaldehyd in einer Entfernung von der ursprüngliche Stelle der Substratimmobilisierung aufgebracht werden. Proteolysefragmente, die in diese separate Bande wandern, ergeben die gelbe Farbe, die für terminales Prolin charakteristisch ist.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits wird der immobilisierte Antikörper gegen IgAP mit einer Probe in Kontakt gebracht und dann zu einer Reaktionslösung, die ein Substrat in Konjugation an ein chromophores Molekül über die Länge eines Dialyseschlauches, der an beiden Enden verschlossen ist, enthält, gegeben und in einem zweiten Volumen der Reaktionslösung, die weder Substrat noch Probe enthält, suspendiert. Der Dialyseschlauch enthält Poren, die die Passage kleinerer Reaktionsprodukte, aber nicht des Substrats, erlauben. Die Farbentwicklung in der Suspendier-Reaktionslösung zeigt die Reaktion durch IgAP an.
Alternativ läßt man den immobilisierten Antikörper-IgAP und das gefärbte Substrat in dem Glas bzw. Schlauch, das bzw. der die Reaktionslösung enthält, reagieren und gießt ihn dann durch eine Säule aus inerten Kügelchen mit graduierter Größe oder Harzkügelchen mit geladenen Oberflächen, die die Passage kleinerer Fragmente erlauben, aber die Passage des großen Substrats zurückhalten. Die Farben in dem Eluenten zeigt die Reaktion der Probe mit IgAP an.
Das erfindungsgemäße Kit kann auch den Antikörper gegen IgAP, suspendiert in einem Gelatinemedium, zusammen mit geeigneten Puffermitteln und ionischen Salzen, um die Reaktionsbedingungen zwischen IgAP und dem Antikörper einzuhalten, umfassen. Die Probe wird auf einen Teil des Gelatine- Antikörpers aufgebracht, und die Reaktion wird als eine opake Fläche, die sich kreisförmig von dem Auftragungsort der Probe ausbreitet, beobachtet.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. Es ist jedoch zu verstehen, daß der Gegenstand der Erfindung nicht auf die spezifischen Details in diesen Beispielen beschränkt ist.

BEISPIEL 1

Technik zur Bindung zweizähniger Liganden ("Sandwich")

A. Herstellung der Reagentien:

1. Herstellung des Antikörpers gegen IgAP:

30 mg IgAP, das aus wachsenden Kulturen von Neisseria gonorrhea gewonnen wurde, wurden Kaninchen über eine Zeitspanne von 3 bis 4 Wochen injiziert. Den Kaninchen wird Antiserum, das Antikörper gegen das Enzym enthält, entnommen, und die Globulinfraktion wird nach dem Standardverfahren der Ammoniumsulfat-Präzipitation hergestellt.

2. Herstellung eines immobilisierten Antikörpers gegen IgAP:

250 mg der auf 10 ml in 0,01M Borat-gepufferter Salzlösung (BBS) mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,2% Triton -X-100 (Warenzeichen), pH 7,5, verdünnten Globulinfraktion wird nach der Standardtechnik der Azo- Kopplung auf die Oberfläche eines inerten saugfähigen Vlieses immobilisiert.

3. Herstellung des chromogenen Antikörpers gegen IgAP:

250 mg Globulinfraktion, verdünnt auf 10 ml in 0,01M Borat-gepufferter Salzlösung (BBS), wird zu 10 ml 2,4-Dinitrobenzol (0,05M) gegeben. Die Lösung wird zentrifugiert, und das Präzipitat wird gewaschen und in 10 ml 0,01 BBS resuspendiert.

B. Vorbereitung der Probe:

Das Exudat, das durch das Wachstum von N.gon. erzeugt wurde und das auf dem Penis außerhalb der Öffnung der Harnröhre sich angesammelt hat, wird auf einem Holzstäbchen mit einer baumwollumhüllten Spitze gewonnen.

C. Diagnosetest:

Das Holzstäbchen mit dem Exudat der Harnröhre wird auf die inerte Oberfläche mit dem immobilisierten Antikörper darauf gestrichen. Die inerte Oberfläche wird in die Lösung, die den chromogenen Antikörper gegen IgAP enthält, eingetaucht, gespült durch Eintauchen in die Reagenslösung, und auf Farbe untersucht. Das Vorliegen von Farbe auf der inerten Oberfläche zeigt das Vorliegen von IgAP in dem Exudat und somit N.gon. an.

BEISPIEL 2

Monoklonaler Antikörper gegen IgAP: Hybridoma-Technik

Die, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhaltene Globulinfraktion wird weiter elektrophoretisch gereinigt. Der rohe Antikörper wird von dem Elektrophoresegel eluiert und zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers nach der Myeloma-Hybridoma-Technik, bei der eine Zelle aus einer stabilen Myeloma-Zellkultur in Anwesenheit von Polyethylenglykol mit den IgAP-Antikörper-erzeugenden Zellen aus einer Tumor-Maus fusioniert wird, verwendet. Die fusionierte Zelle wird nach Standardtechniken für Zellkulturen gezüchtet, und der Antikörper gegen IgAP wird daraus gewonnen.
Dieser monoklonale Antikörper wird in Tris-Puffer, pH 7,5, 0,05M, zur Reaktion mit dem Antigen IgAP suspendiert. Der monoklonale Antikörper kann zum Zweck der verschiedenen hier beschriebenen diagnostischen Verfahren immobilisiert oder mit einem chromogenen Molekül oder einem radioaktiven Element nach den in den Beispielen 1, 3 und 4 beschriebenen Verfahren markiert werden.

BEISPIEL 3

Detektion von Neisseria gonorrhea unter Verwendung des IgAP-Antikörpers: Enzym-linked Immunoassay-Technik (ELISA)

A. Herstellung der Reagentien:

Der Antikörper gegen IgAP wird hergestellt und wie in Beispiel 1 immobilisiert. Ein zweiter Teil des IgAPs wird mit alkalischer Phosphatase konjugiert und in 5 ml 0,05M Tris-Puffer, pH 8,5, suspendiert. Das inerte saugfähige Vlies mit dem darauf immobilisierten Antikörper wird mit konjugiertem IgAP in einer Menge, die ausreicht, um etwa 50% der reaktiven Stellen zu sättigen, behandelt.

B. Vorbereitung der Probe:

10 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) werden gegen die Scheidenwand geleitet und davon gewonnen.

C. Diagnostischer Test:

Ein erster inerter Streifen mit enzochromem IgAP darauf immobilisiert, wird in die Probe der Scheidenspülung eingeführt, entfernt und zu einer Lösung aus p-Nitrophenylphosphat (NPP) (1 mg/ml) in 10% Diethanolamin-Puffer, pH 8,8, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid, gegeben. Eine zweite Kontrolle ist ohne NPP. Die Farbe der zwei Streifen wird verglichen. Die Verdünnung der Farbe auf dem Probenstreifen, verglichen mit dem Kontrollstreifen, zeigt das Vorliegen von IgAP an.

BEISPIEL 4

Automatischer Screening-Test auf Neisseria gonorrhea und Neisseria meningitidis: Radioimmunoassay (RIA)

A. Herstellung der Reagentien:

Das Antiserum gegen IgAP wird hergestellt und wie in Beispiel 1 immobilisiert. IgAP wird mit I¹²&sup5; nach dem Chloramin-T-Verfahren markiert, wobei 0,02 mg IgAP in 0,05 ml 0,5M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, zu 1,0 Millicurie I¹²&sup5; und 0,01 ml Chloramin-T-Lösung (1,25 mg/ml in 0,5M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5) gegeben werden. Die Lösung wird 15 Sekunden lang gerührt und dann durch Zugabe von 0,01 ml Natriummetabisulfit-Lösung (1,25 mg/ml in 0,5M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5) gequencht. Eine Säule, hergestellt aus Sephadex G-25 (Pharmacia Co.), wird mit 0,05M Phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,5, 5% Rinderserumalbumin gewaschen und dann mit Phosphat-gepufferter Salzlösung equilibriert. Das Gemisch für die Iodierungsreaktion wird auf die Säule aufgebracht und anschließend PBS. Das markierte Protein wird gewonnen und mit Rinderserumalbumin auf 5% verdünnt.

B. Vorbereitung der Probe:

Männlich: Urinproben von Männern, die vermutlich mit Gonorrhöe Kontakt hatten, werden durch Zentrifugation der ersten paar Milliliter des Urins aus der Harnröhre hergestellt. Die überstehende Lösung wird abgegossen, und das verbleibende Präzipitat wird in 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung, 0,05M, pH 8,5, suspendiert.
Weiblich: Vaginalspülungen werden, wie in Beispiel 3 beschrieben, erhalten.

C. Diagnostischer Test:

Radioaktives IgAP (0,1 ml, enthaltend etwa 15.000 cpm) wird zu 0,05 ml Probe in 0,3 ml Tris-Puffer, 0,05M, pH 8,0, gegeben. Die Lösung wird mit inerten Kügelchen mit Antiserum gegen IgAP, die darauf immobilisiert sind, 1 Stunde bei Raumtemperatur in Kontakt gebracht. Die Lösung wird zentrifugiert, und der Überstand wird auf Radioaktivität ausgemessen. Der Vergleich mit einer Standardkurve ergibt eine quantitative Bestimmung einer Menge an IgAP in der Probe.

BEISPIEL 5

Detektion von Neisseria gonorrhea: Radialimmundiffusion

A. Herstellung der Reagentien:

Das Antiserum gegen IgAP wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. 0,5 mg Antiserum in 1% Weichagar mit 0,05M Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 8,0, wird in eine Ouchterlony-Platte in Scheibchenform gegossen und dann aushärten gelassen.

B. Vorbereitung der Probe - weiblich:

Ein Tampon, der gegen die Cervix für 4 bis 8 Stunden eingeführt worden war, wird in ein Aufnahmegefäß, das 10 ml isotone Salzlösung enthält, entfernt. Das Gefäß wird mit einem Stopfen verschlossen und gut geschüttelt, um die Bakterien auf dem Tampon zu extrahieren und zu lysieren.

C. Diagnostischer Test:

0,1 ml Probe werden mit einem Tropfer in die zentrale Kavität auf der Ouchterlony-Platte gegeben. Die Platte wird bedeckt und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gelagert und danach auf Trübung angeschaut. Ein getrübtes Scheibchen, das sich strahlenförmig von der zentralen Kavität ausbreitet, zeigt das Vorliegen von IgAP in der Probe an.

BEISPIEL 6

Extraktion und Konzentration von IgAP aus einer biologischen Probe

A. Herstellung der Reagentien:

Ein Antikörper gegen IgAP wird wie in Beispiel 1 hergestellt und immobilisiert.

B. Herstellung der Probe:

Flüssige biologische Proben einschließlich einer Vaginalspülung, Urin, Tamponextrakt oder eines Tupfers, Spinalflüssigkeit, Synovialflüssigkeit oder eine Bakterienkultur sind geeignet. Die Probe kann vor der Extraktion von IgAP durch Zugabe von hypertonen Salzen und anschließende Einstellung des pH-Werts zurück auf 7,5 und der Ionenstärke auf etwa 0,05M für optimale Bedingungen vor der Behandlung der Probe mit dem Antikörper lysiert werden.

C. Extraktion von IgAP:

Zu 2 ml einer biologischen Probe werden 2 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (pH 7,5, 0,05M) gegeben. Die inerte Oberfläche mit dem darauf immobilisierten Antiserum wird in die Probe inseriert und dann entfernt und in PBS gespült.

D. Konzentration von IgAP:

Die feuchte Oberfläche mit dem Antiserum-IgAP-Komplex darauf wird in ein Röhrchen, das 1 ml oder weniger PBS bei einem pH-Wert unter 6, bevorzugt etwa 5,0, enthält, gegeben und gründlich geschüttelt, um den Antigen-Antikörperkomplex aufzubrechen. IgAP wird dadurch zur Abtrennung in die Lösung veranlaßt.

BEISPIEL 7

Immunoassay auf IgAP: Reaktion mit einem chromphoren Substrat

A. Extraktion von IgAP:

IgAP wird aus einer biologischen Probe mittels eines immobilisierten Antikörpers gegen IgAP, wie in Beispiel 6 beschrieben, extrahiert.

B. Herstellung des Substrats:

IgAP aus menschlichem Colostrum wird nach der monoklonalen Hybridoma-Myeloma-Technik hergestellt. IgAP wird verwendet, um selektiv die Zellkulturlinien zu testen, um die Erzeugung von reinem Substrat zu gewährleisten. Das IgA&sub1; wied mit Dinitrophenylhydrazin (DNP) nach dem Verfahren von Castner und Eisen [J.A.C.S. 75, 4454 (1953)] markiert.

C. Vorbereitung der Probe:

Die in den Beispielen 1 bis 6 angegebenen Proben sind geeignet.

D. Diagnostischer Test:

5 ml der Probe werden mit einem inerten Papierstreifen, auf den der Antikörper gegen IgAP immobilisiert ist, in Kontakt gebracht. Der Streifen mit dem Antikörper-Enzymkomlex wird dann in einen Dialyseschlauch (Porengröße 500 nm, der Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), pH 8,0, 0,05M, enthält) gegeben und in PBS mit dem gleichen pH-Wert und der gleichen Ionenstärke suspendiert. Nach 2 Stunden wird die Lösung außerhalb des Schlauches auf Farbe untersucht. Das Vorliegen von Farbe zeigt das Vorliegen von IgAP an.

BEISPIEL 8

Immunoassay auf IgAP: Reaktion mit dem immobilisierten chromophoren Polypeptid

Das Verfahren nach Beispiel 7 wird angewandt, aber ein Polypeptid mit einer Prolyl-Threolyl-Bindung wird als immobilisiertes chromogenes Substrat verwendet.

BEISPIELE 9 bis 15

Immunoassay mit monoklonalen Antikörpern

Die Beispiele 1, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 können mit dem monoklonalen Antikörper anstelle des Antiserums oder der Globulinfraktion in diesen Beispielen durchgeführt werden.

BEISPIELE 16 bis 29

Die Bakterien Haemophilus influenza, Neisseria meningitidis und Streptococcus pneumoniae können in biologischen Proben nach den Verfahren, wie in den Beispielen 1, 3, 4, 5, 7, 8 und 9 bis 15 beschrieben, detektiert werden.

BEISPIEL 30

Diagnose der Gonorrhöe: Immunoassay auf IgAP in Extrakten der uro-genitalen Membranen

A. Vorbereitung der Probe:

Proben werden durch Spülungen oder Extrakte aus Tupfern oder Tampons in Falle von Frauen erhalten. Proben von Männern sind die ersten paar Milliliter des Urins, die nach einer Periode der Verhaltung entleert werden. Das Exudat der Harnröhre kann ebenfalls verwendet werden. Die Proben können auf einem für Neisseria gonorrhea selektiven Medium gezüchtet werden und vor dem Assay gewonnen werden. Die Proben können auch lysiert werden, um das Enzym in die extrazelluläre Umgebung freizusetzen. Beispielsweise kann Eiweiß-Lysozym (Biozyme Laboratories), hergestellt in 0,03M Tris-Puffer, pH 9,0, mit 5 ml der Probe bei Raumtemperatur inkubiert und dann zentrifugiert werden, um das lysierte Enzym in die überstehende Flüssigkeit freizusetzen.

B. Immunoassay auf IgAP

IgAP wird durch seine Reaktion mit dem Antikörper gemäß den Techniken, die in den Beispielen 1 bis 29 beschrieben sind, getestet. Das Vorliegen von IgAP in dem Uro-Genital-Trakt ist ein vermutlicher Beweis von Gonorrhöe. Weitere chemische Tests erhärten die Diagnose positiv.

BEISPIEL 31

Kit zur Detektion der Gonorrhöe

Ein Kit aus einem Apparat und Reagentien zur Detektion von Gonorrhöe umfaßt folgendes:

A. Probensammelvorrichtung:

Im Falle von Männern ein kleines Gefäß zum Aufnehmen der ersten paar Milliliter des Urins, der aus der Harnröhre nach einer Nacht der Verhaltung ausgewaschen wird;
im Falle von Frauen ein Tampon, der in die Scheide gegen die Cervix eingeführt wird und dort während der Schlafstunden getragen wird. Ein Glas ist ebenfalls enthalten, um den getragenen Tampon aufzunehmen und das Exudat daraus herauszuwaschen.

B. Antikörper gegen IgAP:

Paket 1: Der Antikörper gegen IgAP ist auf einem Papierstreifen immobilisiert und hermetisch verpackt.
Paket 2: Ein zweiter Teil des Antikörpers ist mit 2,4-Dinitrobenzol markiert und in einem sterilen Paket zusammen mit Puffersalzen und ionischen Salzen versiegelt.

C. Mittel zur Detektionsreaktion zwischen der Probe und dem Antikörper:

In ein mit einem markierten Volumen Wasser gefülltes Reagensglas wird der Inhalt des Pakets 1 gegeben.
Der Papierstreifen aus Paket 2 wird in die Probe eingetaucht, mit Puffer gespült und in das Reagensglas getaucht, das den Inhalt von Paket 1 enthält. Der Streifen wird entfernt, sanft durch Eintauchen in die Pufferlösung gespült und auf Farbe untersucht.
An dem Streifen haftende Farbe zeigt das Vorliegen von IgAP in der Probe an und ist ein diagnostischer Hinweis auf Gonorrhöe.
Dieses Kit kann von einem Patienten zur Selbstdiagnose der Gonorrhöe angewandt werden oder kann von einem Arzt in seiner Praxis oder der Klinik verwendet werden.

BEISPIEL 32

Kit zur Diagnose von Gonorrhöe

A. Probensammelvorrichtung wie in Beispiel 31 beschrieben.
B. Der Antikörper gegen IgAP ist in Gelatine in einer scheibchenförmigen Platte vom Ouchterlony-Typ zusammen mit Puffersalzen und ionischen Salzen, wie in Beispiel 5 beschribenen, eingebettet.
C. Mittel und Verfahren für die Detektionsreaktion zwischen dem Antikörper und dem Substrat:
Ein Tropfen einer Probe wird auf die zentrale Kavität des Ouchterlony-Scheibchens aufgebracht. Das Scheibchen wird bedeckt und bei Raumtemperatur 4 Stunden lang stehengelassen. Danach wird es auf Trübung untersucht. Eine dunstige weiße Fläche, die sich strahlenförmig von der zentralen Kavität ausbreitet, zeigt das Vorliegen von IgAP in der Probe und somit Gonorrhöe.
Dieses Kit kann zur Selbstdiagnose oder zur proffessionellen Diagnose an Patienten oder in einer Klinik zum Screenen einer großen Anzahl von Proben verwendet werden.

BEISPIEL 33

Kit zur Detektion von Gonorrhöe

A. Probensammelvorrichtung wie in Beispiel 29 beschrieben.
B. Antikörper gegen IgAP, immobilisiert auf einem inerten Streifen in einem hermetisch abgesiegelten Paket.
C. Mittel zur Detekion von IgAP und Antikörper:
IgA&sub1;, markiert mit 2,4-Dinitrobenzol in einem hermetisch versiegelten Paket zusammen mit einem isotonen Puffer und Salzen.

D. Verfahren:

Der inerte Streifen mit dem darauf immobiliserten Antikörper gegen IgAP wird in die Probe eingeführt und mit der Pufferlösung gespült. Das substrat IgA&sub1; wird zusammen mit Puffermitteln und Salzen in ein Reagensglas gegeben und auf ein markiertes Volumen verdünnt. Der Inhalt des Reagensglases und die Probe werden über die Länge eines Dialyseschlauches, der an einem Ende, wie in Beispiel 7 beschrieben, versiegelt ist, gegossen. Nach Verschließen des Schlauches am anderen Ende wird er in einer Lösung aus isotonem Puffer und Salzen suspendiert. Das Auftreten von Farbe in der Lösung für die Suspendier-Reaktion außerhalb des Schlauches beweist das Vorliegen von IgAP in der Probe und zeigt somit Gonorrhöe an. Dieses Kit kann zur Selbstdiagnose oder zur professionellen Diagnose auf Gonorrhöe verwendet werden.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Neisseria-, Haemophilus - oder Streptococcus-Bakterien, die das Enzym Immunoglobulinprotease (IgAP) bilden, dadurch gekennzeichnet, daß ein Immunoassay einer biologischen Probe für das Enzym IgAP durchgeführt wird, wobei der Immunoassay die Behandlung eines Antikörpers, der spezifisch an eine antigene Stelle des Enzyms IgAP bindet, mit der Probe in einem Reaktionsmedium bei einem pH-Wert und einer Ionenstärke, die für die Bildung eines Immunkomplexes zwischen IgAP und dem Antikörper geeignet sind, umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der für IgAP spezifisch ist, ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Neisseria gonorrhea, Haemophilus influenzae, Neisseria neningitidis oder Streptococcus pneumoniae nachgewiesen werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine biologische Flüssigkeit oder ein Extrakt, ein lysierter Extrakt oder ein gezüchteter Extrakt von uro-genitalen Membranen ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem chromophoren, enzochromen, fluorchromen oder luminogenen Molekül konjigiert oder mit einem radioaktiven Element markiert ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Assay ein Radial- Immunodiffusions-, Bidentat-Ligand-Bindungs-, Enzym-Bindungs-Immunoassay, Radioimmunoassay oder eine Hämagglutination ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper an einem inerten Träger immobilisiert ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Assay ein Enzym-gebundener Immunoassay ist, bei dem immobilisierter Antikörper für IgAP mit IgAP, das mit einem Enzym konjugiert ist, behandelt wird, ein Aliquot des immobilisierten Antikörper-IgAP- Enzymkomplexes mit der Probe behandelt wird, ein Aliquot des immobilisierten Antikörper-IgAP-Enzymkomplexes mit einer Kontrollprobe behandelt wird und die Ergebnisse der zwei Behandlungsstufen verglichen werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich das Substrat für IgAP mit IgAP behandelt wird, welches aus der Probe mittels eines Antikörpers für IgAP isoliert worden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat IgA&sub1; oder ein Polypeptid, das eine Prolyl-Threonyl-Bindung enthält, ist.

11. Screeningtest für Gonorrhöe, dadurch gekennzeichnet, daß ein Immunoassay einer biologischen Probe eines Individuums für das Enzym IgAP, das von Neisseria gonorrhea freigesetzt wird, nach einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 10 durchgeführt wird.

12. Reagens für die Verwendung eines Immunoassays des Enzyms IgAP nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Antikörper, der spezifisch an die antigene Stelle des Enzyms IgAP gebunden wird und der mit einem chromophoren, enzochromen, fluorchromen oder luminogenen Molekül konjugiert ist oder mit einem radioaktiven Element markiert ist, enthält.

13. Kit für den Nachweis von Neisseria gonorrhea gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Kit umfaßt:

(a) einen Antikörper, der spezifisch an die antigene Stelle des Enzyms IgAP gebunden wird;

(b) ein Reagens zum Nachweis der Reaktion zwischen einer biologischeb Probe und dem Antikörper.

14. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich eines oder mehrere der folgenden Bestandteile enthält:

(a) Reagentien für die Lysierung der Zellen in der Probe; und

(b) mindestens einen Probenkollektur, bevorzugt einen oder mehrere aus der Gruppe Urinkollektoren, Tampons oder Tupfer.