DE3720655A1 - Diagnostisches verfahren zur bestimmung von infektionen oder von einem befall biologischer substrate durch mikroorganismen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Verfahren zur Bestimmung von Infektionen oder von einem Befall biologischer Substrate bzw. biologisch abbaubarer Substrate durch Mikroorganismen.

Es ist bekannt, daß bei verschiedenen Erkrankungen toxisch wirkende aktive Enzyme vorliegen. Auch wird die Bestimmung der Aktivitäten derartiger Enzyme für diagnostische Zwecke ausgenutzt. So werden beispielsweise bei Krebserkrankungen Aktivitätsbestimmungen der alkalischen Phosphatase im Serum des Patienten durchgeführt. In ähnlicher Weise werden Aktivitätsbestimmungen von Transaminasen durchgeführt, wenn der Verdacht auf Herzinfarkt oder Hepatitis besteht.

R. Schauer, P. Roggentin et al., Clinica Chimica Acta, 146 (1985), 119-127, haben auch empfohlen, die Enzymaktivität bestimmter Sialidasen zur Diagnose von Infektionen durch Clostridienarten auszunutzen. Die Enzymaktivitäten, beispielsweise die Sialidase-Aktivität, wurde entweder in den Seren oder den geschädigten Geweben von Patienten oder in den Seren infizierter Kaninchen bestimmt. Beispielsweise wurde die Enzymaktivität colorimetrisch mit Perjodsäure- Thiobarbitursäure unter Verwendung von Sialyl-α(2-3)lactose als Substrat bestimmt. Eine weitere Methode der Aktivitätsbestimmung von Sialidase bestand in der Bestimmung eines mit Tritium markierten Substrats, Sialyl- α(2-3)lactitol.

Alle bisherigen Bestimmungsmethoden für Enzyme basierten auf einer Ermittlung der Enzymaktivität. Dies erschien einleuchtend, da die toxische Wirkung von Enzymen durch ihre aktive Natur begründet wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung von Mikroorganismen und damit von durch derartige Mikroorganismen bedingten Infektionen, das eine rasche und sichere, artspezifische qualitative und quantitative Ermittlung ermöglicht.

Es hat sich gezeigt, daß diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß die Eiweißkomponente von Enzymen, die von den in Betracht gezogenen Mikroorganismen produziert werden, unabhängig von der bisher für wesentlich erachteten Enzymaktivität, die als solche nicht artspezifisch ist, bestimmt wird.

Gegenstand der Erfindung ist somit das in den Patentansprüchen beschriebene Verfahren.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden Enzyme und/oder deren Abbauprodukte, wie teilweise proteolytisch abgebaute oder andersartig inaktivierte Produkte, unabhängig von ihrer Enzymaktivität, bestimmt. Diese Bestimmung erfolgt unter Verwendung spezifischer Antikörper für das Enzymeiweiß.

Hierzu bedient man sich erfindungsgemäß eines heterogenen Immuno-Assays auf der Basis von enzymeiweiß-spezifischen Antikörpern.

Unter heterogenem Immuno-Assay wird ein Test verstanden, wie er im Prinzip für den Spezialfall der Enzymmarkierung in Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis (Vol. I), Verlag Chemie, 1983, Seiten 237 bis 244 ("Heteerogeneous Enzyme-Immunoassays") beschrieben wird. Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur mit Enzymmarkierung, sondern auch mit anderen Markierungsmethoden, wie die radioaktive Markierung, durchgeführt werden. Bevorzugt ist, schon aufgrund der Möglichkeit, ohne radioaktive Substanzen zu arbeiten, die Enzymmarkierung, wie sie beispielsweise in Bergmeyer loc. cit. beschrieben wird.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden enzymeiweiß-spezifische Antikörper einer Tierart auf einen festen Träger aufgebracht. Derartige feste Träger können beispielsweise hierfür übliche Kunststoffmaterialien sein, wie Polyvinylchlorid. Sie können in Form von Platten oder Granulaten vorliegen. Bevorzugt sind Titerplatten bzw. Mikrotiterplatten, beispielsweise aus Polyvinylchlorid, die mehrere Vertiefungen (Wells) aufweisen.

Die fixierten Antikörper werden nun mit der Enzym bzw. Enzymeiweiß enthaltenden Probe in Kontakt gebracht, wobei eine spezifische Fixierung an dem Antikörper erfolgt. Nach der Wäsche des so erhaltenen Komplexes Antikörper 1 (AK1)-Enzymprobe wird mit ebenfalls enzym- bzw. enzymeiweiß-spezifischen Antikörpern einer anderen Tierart (Antikörper 2 bzw. AK2) unter Bildung des "sandwich"-Komplexes

AK1-Enzym-AK2

behandelt.

Nun erfolgt eine übliche Darstellung des Komplexes AK1-Enzym-AK2, beispielsweise mit einem für den Antikörper 2 spezifischen, markierten Antikörper (Antikörper 3, AK3). Hierbei kann es sich um einen radioaktiv markierten Antikörper oder bevorzugt um einen enzymmarkierten Antikörper, beispielsweise einen peroxidasekonjugierten Antikörper, handeln.

Der Komplex

AK1-Enzym-AK2-AK3

wird nach der weiteren Wäsche in üblicher Weise dargestellt, beispielsweise durch Messung der radioaktiven Strahlung oder durch Farbreaktion des Enzyms (bei dem Beispiel der Peroxidase z. B. Reaktion mit o-Phenylendiamin).

Die Antikörper AK1 und AK2 erhält man durch Beimpfung verschiedener Tierarten mit einer Lösung des in Frage kommenden gereinigten Enzyms. Beispielsweise wird der Antikörper AK1 durch Beimpfen von Schafen bzw. Hammeln erzielt und der Antikörper 2 beispielsweise durch Beimpfen von Kaninchen.

Beim Antikörper AK3 handelt es sich um übliche, markierte Antikörper, die gegen die Immunoglobuline einer bestimmten Tierart gerichtet und handelsüblich sind.

Durch die vorliegende Erfindung wird somit ein heterogener Immuno-Assay in Form eines sandwich-artigen Komplexes auf einem Sorbens ausgebildet. Bevorzugt wird nach der Verfahrensweise zur Durchführung des sogenannten "sandwich"- ELISA-Tests vorgegangen, wie er in der Literaturstelle Bergmeyer, loc. cit. beschrieben wird.

Enzyme als quantitative Marker für die letzte Stufe eines Enzymimmuno- Assays, wie sie für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können, werden beispielsweise von R. Richerich und J. P. Colombo in Klinische Chemie, 4. Aufl., 1978, Karger-Verlag Basel, Seiten 205 bis 208, und in den dort angegebenen Literaturstellen beschrieben. Die Markierung durch Kopplung mit Peroxidase kann z. B. gemäß Sternberger L. A. et al., J. of Histochemistry and Cytochemistry, Vol. 18, Seite 315 (1970), durchgeführt werden.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung des heterogenen Immuno-Assays bzw. sandwich-Tests und insbesondere ELISA-Tests wird es möglich, Enzyme unabhängig von ihrer Aktivität zu bestimmen. Dies widerspricht der bisherigen Gepflogenheit, Enzyme durch ihre Aktivität nachzuweisen. Es ergibt sich der Vorteil, daß Rückschlüsse von dem Enzym, selbst dann, wenn es inaktiviert wurde, auf Mikroorganismen gezogen werden können, die das nachweisbare Enzym erzeugt haben.

Besonders günstig hat sich das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Sialidase erwiesen, die von verschiedenen Clostridienarten erzeugt wird. Da nicht die Enzymaktivität, sondern die Eiweißstruktur des Enzyms ermittelt wird, ist es möglich, verschiedene Clostridienarten bzw. Infektionen, die durch derartige Arten bewirkt werden, zu differenzieren, da die Antikörper keine Kreuzreaktion mit den verschiedenen Enzymeiweißarten eingehen. Es ist somit beispielsweise möglich, zwischen Clostridium perfringens und Clostridium septicum oder Clostridium sordellii zu unterscheiden. Einige Clostridienarten rufen den sogenannten Gasbrand hervor (s. o.). Eine rasche und genaue Differenzierungsmöglichkeit ist hier besonders wichtig; es ist davon auszugehen, daß heute in der Bundesrepublik Deutschland jährlich ca. 200 Patienten an Gasbrand erkranken und die doppelte Anzahl als klinisch verdächtig eingestuft wird. Im Katastrophenfalle ist mit einer drastischen Erhöhung dieser Patientenzahl zu rechnen.

Die erfindungsgemäße Verfahrensweise kann jedoch auch auf die Bestimmung von Enzymeiweiß verschiedener anderer Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterienarten, Pilze oder Viren, angewendet werden. Neben den schon erwähnten Sialidase bildenden Arten von Clostridium, wie Clostridium perfringens, Clostridium septicum und Clostridium sordellii, ist die erfindungsgemäße Verfahrensweise beispielsweise auch verwendbar zur Bestimmung von Sialidase bildenden Trypanosomen, wie T. rangeli (bei Rindern) und T. cruzi (beim Menschen) oder von Sialidase bildenden Pneumokokken, wie Diplococcus pneumoniae. Da erfindungsgemäß nicht die Enzymaktivität, sondern das Enzymeiweiß spezifisch bestimmt wird, ist es möglich, zwischen den von den verschiedenen Erregerstämmen erzeugten Sialidasen zu unterscheiden und so auf Erreger rückzuschließen. Es läßt sich daher auch eine Differenzierung von den körpereigenen Sialidasen vornehmen. Die erfindungsgemäße Verfahrensweise ist beispielsweise auch auf die Bestimmung verschiedener Proteasen anwendbar, die von Pilzen erzeugt werden.

Als Substrate für die erfindungsgemäße Verfahrensweise können Körperflüssigkeiten, wie Wundsekret, Serum und Gewebeproben (insbesondere bei der Diagnose des Gasbrandes) sowie Urin- oder Stuhlproben verwendet werden. Für Stuhlproben ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeinget, da hierdurch eine Spezifizierung von beispielsweise durch Vibrio cholerae erzeugte Sialidase und eine Unterscheidung von anderen darmspezifischen Sialidasen möglich ist.

Selbstverständlich läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur auf biologische Substrate anwenden, die aus körpereigenen Produkten oder Körperausscheidungsprodukten stammen. Vielmehr ist es auch zur Bestimmung eines Mikroorganismenbefalls von biologische Substrate enthaltenden Materialien, wie Nahrungsmitteln, Arzneilösungen, Abwässern usw. geeignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich besonders günstig auf die Bestimmung von Sialidase anwenden, die von Clostridienstämmen, insbesondere von Clostridium perfringens, erzeugt wird. Es eignet sich daher ganz besonders zur Diagnose des Gasbrandes (Gasödem).

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, die sich auf die bevorzugte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Bestimmung von Clostridium perfringens bezieht, wird zunächst Clostridium perfringens Sialidase isoliert, wie in der Literatur z. B. Roggentin et al. Z. Bact. Hyg. A 260, 319-328 (1985) beschrieben. Durch subkutane Injektion dieser Sialidase an Schafe und Kaninchen und Isolieren der gebildeten Antikörper aus dem Serum der geimpften Tier werden Antikörper vom Schaf bzw. vom Kaninchen, die spezifisch gegen die Sialidase von Clostridium perfringens sind, gebildet. Die Antikörper der ersten Tierart (Schaf) werden an einen Kunststoffträger (beispielsweise PVC in Form einer Mikrotiterplatte) gebunden. Der so an das Sorbens fixierte Antikörper ist geeignet, Sialidase von Clostridium perfringens aus einer flüssigen Probe zu binden. Durch Behandeln mit dem aus Kaninchen gewonnenen Antikörper 2 wird ein sandwich-artiger Komplex

Antikörper 1-Sialidaseeiweiß-Antikörper 2

gebildet, der mit einem mit Peroxidase konjugierten Antikörper gegen Kaninchenimmunglobuline (beispielsweise von der Gans) kombiniert werden kann. Durch Entwickeln der Peroxidase mit einer üblichen Peroxidase-Substratlösung auf der Basis von o-Phenylendiamin wird es möglich, die peroxidase-konjugierten Antikörper und damit die in der Probe enthaltene Menge an Sialidase von Clostridium perfringens sichtbar zu machen. Durch Vergleich mit Standardpräparaten ist eine quantitative Bestimmung möglich.

Allgemein wird es durch die erfindungsgemäße Verfahrensweise somit möglich, Enzyme eiweißspezifisch und somit unter Rückschluß auf die erzeugenden Mikroorganismenarten qualitativ und quantitativ zu bestimmen. Zur quantitativen Bestimmung werden entsprechende Eich-Substrate verwendet.

Beispiel

Quantitative Erfassung der Sialidase von Clostridium perfringens:

• I. Material: 96 Well-Mikrotiterplatte (PVC, Titertek)
  • 1. Antikörper (vom Hammel) gegen Clostridium perfringens Sialidase: 40 µl im Eppendorf-cup eingefroren, 100fach konzentriert, mit 0,1 M Karbonatpuffer (pH 9,6) auf 4 ml zu verdünnen, Endkonzentration = 0,01 mg AK-Trockengewicht pro ml Puffer.
    Standards isolierter C. perfringens Sialidase für meßinterne Eichkurve: Je 900 µl pro Eppendorf-cup eingefroren = 3 cups, mit je 50, 5 und 0,5 mU Sialidase pro ml. Probe:
    • a) Fest: bis zu 600 mg Probenmaterial werden 15 min mit 600 µl 0,15 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 6,8) + 0,05% Tween 20 (= PBS/Tween) geschüttelt, zentrifugiert, und der Überstand wird verwendet.
    • b) Flüssig: Die Lösung wird 1 : 2 mit PBS/Tween verdünnt, zentrifugiert, und der Überstand wird verwendet.
  • 2. Antikörper (vom Kaninchen) gegen C. perfringens Sialidase: 500 µl im Eppendorf-cup eingefroren, 10fach konzentriert, mit PBS/Tween auf 5 ml zu verdünnen. Endkonzentration = 0,1 mg AK-Trockengewicht pro ml.
  • 3. Antikörper (von der Gans) (handelsüblich) gegen Kaninchen-Immunoglobuline (Serva), peroxidase-konjugiert: 10 µl im Eppendorf-cup eingefroren, 1000fach konzentriert und mit PBS/Tween auf 10 ml zu verdünnen.
• Peroxidase-Substratlösung:
  8,5 mg o-Phenylendiamin und
  10 µl 30% H₂O₂ in
  25 ml 0,15 M Phosphat/Citratpuffer pH 5,0 lösen.
• II. Gewinnung des Materials:
  Clostridium perfringens Sialidase:
  C perfringens Stamm A 99 wurde in 3 Schritten (20 ml < 400 ml < 4 l) in "chopped meat medium" + 0,1 mM Sialoglycopeptide (s. Roggentin et al., Z. Bakt. Hyg. A 260: 319-328 [1985]) angezüchtet und nach 12 h durch Zentrifugation geerntet (10 000 g; 20 min; 4°C). Der Überstand wurde durch Druckdialyse eingeengt, mit Ammoniumsulfat gefällt, das Sediment gelöst und über Sephadex G-100 filtriert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, eingeengt, gegen aqua bidest. dialysiert und lyophilisiert. Sialidase-Antikörper:
  Schafe bzw. Kaninchen wurden wöchentlich mit 100 mU der angereicherten Sialidase subkutan geimpft (6 bis 8 Wochen). Für die erste subkutane Injektion wurde die Enzymlösung (100 µl) mit dem gleichen Volumen Freund'sches Adjuvans homogenisiert. Die weiteren Injektionen erfolgten ohne Adjuvans in der 1., 2., 6. und 7. Woche nach der ersten Injektion. Der Antikörpertiter wurde anhand der Sialidasehemmung verfolgt. Eine Woche nach der letzten Injektion wurden die Tiere ausgeblutet. Das Serum wurde nach Koagultion des Blutes durch Zentrifugieren (500×g, 20 min, 20°C) abgetrennt. IgG-Antikörper- Fraktionen des Immunserums wurden durch Filtration von 50 ml Serumprotionen bei 4°C über Sephadex G-200 (130×7,5 cm), equilibriert mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 7, isoliert. Es wurden Fraktionen von 15 ml gesammelt. Die Fraktionen mit Sialidase-hemmender Wirkung wurden gepoolt, auf etwa 50 ml in einer Amicon-Zelle eingeengt, bei 4°C gegen aqua bidest. dialysiert und lyophilisiert.
• III. Probenuntersuchung
  Die Mikrotiterplatte wurde für 1 Probe nach folgendem Schema beschickt: Die Wells wurden mit dem ersten Antikörper vom Hammel (100 µl/Well) wie folgt beschickt:
  A1, A3, A4, A5, A6; es wurde 30 min lang inkubiert.
  Anschließend wurden sämtliche Wells A1 bis A6 mit PBS/Tween (200 µl/Well) dreimal 5 min lang gewaschen.
  In die Wells A1 und A2 wurde die Probenlösung gefügt. In die Wells A3, A4 und A5 wurden jeweils zu Eichzwecken je 100 µl Sialidase-Standards (50 mU/ml A3; 5 mU/ml A4 bzw. 0,5 mU/ml A5) gefügt, worauf 80 min lang inkubiert wurde.
  Die Wells wurden wie vorstehend beschrieben gewaschen, worauf der zweite Antikörper vom Kaninchen in die Wells A1 bis A6 (100 µl/Well) gefügt wurde. Nach 60minütiger Inkubation und erneutem Waschen der Wells, wie vorstehend beschrieben, wurde der dritte Antikörper (von der Gans) in die Wells A1-A6 (100 µl/Well) gefügt, worauf erneut 60 min inkubiert und die Wells gewaschen wurden.
  Anschließend wurden die Wells A1-A6 mit dem Peroxidasesubstrat (150 µl/Well) versehen, worauf 30 min inkubiert und jeweils mit 50 µl/Well einer 12,5% Schwefelsäure gestoppt wurde.

Durch Messung der Farbintensität (gelb) bei 492 nm (Mikrotiter-Reader, Titertek) konnte unter Berücksichtigung der Blindproben (Well A2 und A6) die Sialidasemenge in dem Well A1 (Probe) durch Vergleich mit den Standards (Well A3, A4 und A5) bestimmt werden.

Entsprechend diesem Schema konnten 15 weitere Proben auf der gleichen Mikrotiterplatte getestet werden.

Der gleiche Test wurde mit dem Sialidaseenzym von Clkostridium septicum durchgeführt. In diesem Falle war die unspezifische Bindung des Probenenzyms an die Mikrotiterplatte (Well A2) zwar größer als im Falle der Sialidase von Clostridium perfringens, hatte aber keinen entscheidenden Einfluß auf die Durchführung des Tests.

Claims (4)

1. Diagnostisches Verfahren zur Bestimmung von Infektionen oder von einem Befall biologischer Substrate bzw. Materialien oder biologisch abbaubarer Substrate bzw. Materialien durch Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man die in den Substraten bzw. Materialien von den Mikroorganismen produzierten Enzymproteine, unabhängig von einer eventuellen Enzymaktivität dieser Proteine, durch hetereogenen Immuno-Assay unter Verwendung proteinspezifischer Antikörper bestimmt.

2. Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Infektion bzw. einen Befall durch Enzymproteine ausscheidende Bakterien bestimmt.

3. Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Befall oder eine Infektion durch Sialidasen ausscheidende Mikroorganismen bestimmt.

4. Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Befall oder eine Infektion durch Sialidasen ausscheidende Clostridienstämme, Trypanosomen oder Pneumokokken bestimmt.