DE60032932T2

DE60032932T2 - Verfahren zur diagnose einer von einem prionenstamm verursachten übertragbaren subakuten spongiformen enzephalopathie in einer biologischen probe

Info

Publication number: DE60032932T2
Application number: DE60032932T
Authority: DE
Inventors: Jean-Philippe Deslys; Emmanuel Comoy; Jacques Grassi
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2020-11-14
Also published as: ZA200203342B; ES2280263T3; BG65933B1; FR2801106B1; CA2390891A1; US7097997B1; CN100383529C; RO121829B1; EP1232395A1; US20060084130A1; PT1232395E; DZ3229A1; BG106686A; US7429463B2; EP1232395B1; DE60032932D1; JP4842478B2; CA2390891C; FR2801106A1; MA26043A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches Verfahren für eine von einem ATNC-Stamm verursachte ESST durch Nachweis des PrPres in einer biologischen Probe, sowie seine Verwendung im Rahmen einer Differentialdiagnose der verschiedenen ATNC-Stämme in einer biologischen Probe.
Die transmissiblen spongiformen subakuten Encephalopathien (ESST) werden von unkonventionellen übertragbaren Erregern (ATNC), auch Prionen genannt, verursacht, deren genaue Natur immer noch umstritten ist.
Die ESST umfassen im Wesentlichen die Kreutzfeldt-Jakob-Krankheit beim Menschen (CJK, oder CJD für Creutzfeldt-Jakob-Disease), Scrapie bei Schafen und Ziegen, und bovine spongiforme Encephalopathie (BSE für bovine spongiforme Encephalopathie) bei Rindern; andere Encephalopathien wurden bei Felidae, beim Nerz oder bestimmten Wildtieren wie Hirsch und Elch gefunden.
Diese Krankheiten verlaufen immer tödlich und es gibt zurzeit keine wirksame Behandlung.
Bei den ESST kommt es zu einer Akkumulation eines Wirtsproteins, PrP (oder Prionprotein), in einer anomalen Form (PrPres), und zwar hauptsächlich im Zentralnervensystem; PrPres hängt mit der Infektiosität zusammen und seine Akkumulation geht dem Auftreten von histologischen Läsionen voraus. In vitro ist es für Neuronenkulturen toxisch.
Die zwei Isoformen von PrP haben dieselbe Aminosäurensequenz (vgl. 1), unterscheiden sich aber in ihrer Sekundärstruktur: PrPres weist einen deutlich höheren Anteil an β-Faltblättern auf, wohingegen normales PrP (PrPsens) eine größere Anzahl an α-Helices aufweist.
Im Allgemeinen gibt es zwei biochemische Eigenschaften, welche die Unterscheidung dieser beiden Isoformen ermöglichen.

– PrPres ist partiell proteasebeständig, insbesondere gegen Proteinase K (PK), welche eine Spaltung des N-terminalen Endes verursacht. Nach Einwirkung der PK, wird PrPres wegen des apparenten Molekulargewichts der diglycosylierten Form häufig PrP27-30 genannt; es ist allgemein anerkannt, dass sich die Spaltstelle von PrPres bei herkömmlichen Stämmen zwischen den Aminosäuren 89 und 90 befindet (Prusiner et al., Cell, 1984).
– PrPres ist in nicht-ionischen Detergentien, wie zum Beispiel Triton X100 oder Triton 114, unlöslich.

Die normale Form des Prionproteins (PrPsens) wird prinzipiell vollständig durch Proteasen abgebaut und ist in Gegenwart von nicht-ionischen Detergentien vollständig löslich.
Die Peptidsequenzen von Hamster-, Human-, Rinder- und Schaf-PrPsens sind in 1 gezeigt; sie umfassen insbesondere ein Octapeptidmotiv (P(H/Q) GGG (-/T) WGQ), das je nach Spezies 4 oder 5 mal wiederholt ist. Dieser Octapeptidmotiv-Repeat (oder Octapeptidmotiv-Wiederholung) entspricht den Aminosäuren 51–91 des PrP (Nummerierung der Sequenz des humanen PrP) (B. Oesch et al., 1991).
Zur Detektion der Gegenwart des Infektionserregers basieren die neuesten Methoden auf einem selektiven Nachweis des an den Infektionserreger gebundenen anomalen PrP (PrPres), indem dessen partielle Resistenz gegen Proteasen ausgenutzt wird.
Zu unterscheiden sind:

– Western-Blot-Verfahren, die auf dem immunologischen Nachweis von PrPres in einem Gewebeextrakt basieren, nach der Behandlung des Extraktes mit einer Protease, um die normale Isoform des PrP (PrPsens) zu zerstören, Trennung der Proteine des Extraktes durch Elektrophorese, Transferieren auf eine Polymermembran, und Nachweis mit einem spezifischen Antikörper, der das PrP erkennt (Schaller O. et al., 1999),
– ELISA-Tests, die ebenfalls die Behandlung des Gewebeextraktes mit einer Protease umfassen.

Von den verschiedenen Tests, die die Behandlung der Gewebeextrakte mit einer Protease umfassen, sind zu nennen:

– der von Serban et al. (Neurology, 1990, 40, 110) beschriebene und entwickelte Test zum Nachweis von PrPres, der die Immobilisierung von Proteinen auf einer Nitrozellulosemembran umfasst, gefolgt von einem Proteaseverdau, einer Denaturierung und einem Immunnachweis mit monoklonalen Antikörpern.
– der von Oesch et al. (Biochemistry, 1994, 33, 5926–5931) beschriebene Test, bei dem zur Quantifizierung der Menge an PrPres ein Immunfiltrationstest für die Reinigung von PrPres (ELIFA oder Enyzm-Linked-Immunofiltration-Assay) vorgeschlagen wurde.
– der von Gratwohl et al., 1997, beschriebene Test, die einen ELISA-Assay vorschlagen. Nach Behandlung der Proben mit Proteinase K und Reinigung von PrPres durch Zentrifugation wird dieses an Mikrotiterplatten adsorbiert und mit polyklonalen Kaninchenantikörpern nachgewiesen.
– der von Safar et al., 1998, beschriebene Test, bei dem keine Proteinase K verwendet wird, sondern die Immunreaktivität von an festem Träger immobilisierten PrPres vergleichen, nachdem es einer Denaturierungsbehandlung unterzogen wurde oder nicht.

Generell haben diese unterschiedlichen Tests den Nachteil, dass sie nicht empfindlich genug sind und daher falsch-negative Ergebnisse liefern.
Andere Verfahren schlagen Behandlung der Proben mit denaturierenden Substanzen (Oesch et al., 1994 und 1999; WO 00/22438, The Regents of the University of California), limitierte Behandlung mit Proteinase K (WO 00/29850, Wallac Oy et al.) oder Behandlung mit einer Metallopeptidase (WO 00/22438) vor, wodurch versteckte antigene Stellen zugänglich werden, die mit dem monoklonalen Antikörper 3F4 nachgewiesen werden können, der die Region 109–112 des PrP erkennt (WO 00/29850 oder WO00/22438).
Der größte Nachteil des in der WO 00/29850, Wallac Oy et al., beschriebenen Verfahrens ist, dass es vor allem wegen der unter den empfohlenen Behandlungsbedingungen unvollständigen Eliminierung von PrPsens nicht spezifisch genug ist, während das in der WO 00/22438, The Regents of the University of California, beschriebene Verfahren nicht empfindlich genug ist, da als Antikörper zur Detektion 3F4 (WO 00/22438) verwendet wird, der nur an ein einziges Motiv auf dem Protein bindet.
Der Anmelder schlug kürzlich einen Test zum quantitativen Nachweis von PrPres vor, der einen Reinigungsschritt umfasst, der zu einem wesentlich empfindlicheren Nachweis führt und einen großen Fortschritte für die Hygieneüberwachung und die PrPres-Assays auf Schlachthöfen darstellt. Dieses Verfahren wird insbesondere in der Internationalen PCT-Anmeldung WO 99/41280 und in einem vorläufigen Bericht der Generaldirektion XXIV der Europäischen Kommission (Gesundheit und Verbraucherschutz; http://europa.eu.int/comm/dg24/health/) beschrieben.
Aufgrund des Bedarfs an einem besonders verlässlichen Test zur ESST-Diagnose setzte der Anmelder seine Untersuchungen fort.
Er stellte insbesondere fest, dass es für einen Nachweistest, der

(i) empfindlich ist, d.h. mit dem sich nicht infizierte Tiere korrekt identifizieren lassen,
(ii) spezifisch ist, d.h. mit dem sich infizierte Tiere, die klinische Symptome zeigen, korrekt identifizieren lassen,
(iii) eine möglichst niedrige Nachweisgrenze aufweist, d.h. zum Nachweis geringer Mengen an PrPres geeignet ist (Nachweis von PrPres vor dem Auftreten klinischer Symptome), und
(iv) reproduzierbar ist, erforderlich ist, die zu analysierende biologische Probe unter Bedingungen zu behandeln, die es erlauben, die Octapeptidmotive ganz oder teilweise ausschließlich in PrPres zu konservieren.

Er hat insbesondere gefunden, dass es für eine effiziente Erfüllung der oben genannten vier Bedingungen (i)–(iv) notwendig ist, genaue Behandlungsbedingungen für die zu analysierende Probe zu definieren, die PrPsens vollständig aus der Probe eliminieren und gleichzeitig einen spezifischen „Capture" von PrPres erlauben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein diagnostisches Verfahren (Verfahren A) für eine von einem ATNC-Stamm verursachte ESST oder Prionenerkrankung durch Nachweis des PrPres in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

(1) Behandlung der Probe mit wenigstens einer Proteinase K, entweder in einer Konzentration zwischen 30 μg/ml und 200 μg/ml für 10 Minuten bei 37 °C für ein 10%iges Homogenat oder für eine Dauer und bei einer Konzentration entsprechend der Konzentration zwischen 30 μg/ml und 200 μg/ml unter den oben genannten Bedingungen, und besonders bevorzugt für 10 Minuten bei einer Konzentration zwischen 30 μg/ml und 200 μg/ml für ein 10%iges Homogenat oder für 30 Minuten bei einer Konzentration zwischen 10 μg/ml und 70 μg/ml für ein 10%iges Homogenat, wobei die Proteinase K in Lösung in einem Puffer eingesetzt wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Homogenisierungspuffern für die biologische Probe und Puffern, die wenigstens eines der folgenden Mittel umfassen: wenigstens ein Tensid und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel und/oder wenigstens ein Salz, so dass das PrPsens vollständig abgebaut wird, während die Octapeptidmotiv-Repeats des PrPres unabhängig davon, um welchen ATNC-Stamm es sich handelt, ganz oder teilweise erhalten bleiben.
(2) In-Kontakt-Bringen der behandelten Probe mit einem Liganden für die Octapeptidmotive, und
(3) Nachweis des eventuellen Vorliegens des Komplexes aus Octapeptidmotiv-Repeats-Ligand.

Es ist anzumerken, dass bestimmte Parameter eng miteinander verbunden sind: Die Konzentration an Proteinase K hängt direkt von der Behandlungsdauer (Inkubationszeit) der Probe ab; man kann davon ausgehen, dass zum Beispiel bei 37°C eine 10-minütige Inkubation mit einer PK bei einer Konzentration zwischen 30 und 200 μg/ml 10%igem Homogenat einer 30-minütigen Inkubation mit einer PK bei einer Konzentration von 10 bis 70 μg/ml 10%igem Homogenat entspricht. So entspricht eine 30-minütige Inkubation mit einer PK bei 25 μg/ml einer 10-minütigen Inkubation mit einer PK bei einer Konzentration von 75 μg/ml.
Unabhängig von der PK-Konzentration und der Inkubationsdauer sollte die behandelte Probe kein nicht abgebautes PrPsens mehr aufweisen, während die Octapeptidmotive in dem gegebenenfalls vorhandenen PrPres ganz oder teilweise erhalten sind.
Andere Parameter können die Feststellung der aktiven PK-Konzentration in geringerem Ausmaß (d.h. nur unwesentlich) beeinflussen: dabei handelt es sich insbesondere um den Puffer, in dem die PK gelöst wird; wird die PK in dem Homogenisierungspuffer für die Probe gelöst, kann die Mindestkonzentration an PK je nach verwendetem Homogenisierungspuffer im Bereich der oben angegebenen Konzentrationen variieren:

– in einem Glucosepuffer oder Guanidin (oder einem Salz davon) beträgt die Mindestkonzentration an PK bevorzugt 25 μg/ml (30-minütige Inkubation) oder 75 µg/ml (10-minütige Inkubation);
– in einem PBS-Puffer beträgt die Mindestkonzentration an PK bevorzugt 50 µg/ml (30-minütige Inkubation) oder 150 µg/ml (10-minütige Inkubation).

Vorteilhaft kann die PK in einem anderen Puffer als dem Homogenisierungspuffer verwendet werden; ein solcher Puffer umfasst vorteilhaft wenigstens ein Tensid und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel und/oder wenigstens ein Salz.
Ebenso vorteilhaft wird die nach der Behandlung (oder Inkubation) der Probe mit Proteinase K erhaltene Suspension vorteilhaft unter den in der Internationalen Anmeldung 99/41280 definierten Bedingungen behandelt, d.h.:

– Zugabe eines Puffers B zu der Suspension, wie in der internationalen Anmeldung 99/41280 beschrieben, und insbesondere von C₃-C₆-Alkoholen und Alkoholmischungen, deren mittlere theoretische Dielektrizitätskonstante zwischen 10 und 25 liegt,
– Abzentrifugieren der erhaltenen Suspension, und
– Solubilisierung des Pellets in einem Puffer, der wenigstens ein Tensid und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel umfasst, unter den in der Internationalen Anmeldung 99/41280 definierten Bedingungen.

Ein derartiger Test hat den Vorteil, das er für die Differentialdiagnose von im selben Wirt durch verschiedene ATNC-Stämme verursachte ESST besonders geeignet ist, und besonders für die Differentialdiagnose von BSE-Stämmen im Vergleich mit herkömmlichen Scrapie-Stämmen bei Schafen.
Es wurde zum Beispiel durch Analyse der Elektrophoreseprofile von PrPres, das abhängig vom ATNC-Stämm unterschiedlich migrierte, gezeigt, dass Menschen in Großbritannien durch den BSE-Stamm infiziert wurden; ein charakteristisches Profil (Typ 4) wurde bei Patienten gefunden, die eine neue Variante der Kreutzfeld-Jakob-Krankheit (vCJK) entwickelten, die damit zusammenzuhängen scheint, dass Rind, das mit dem BSE-Erreger infiziert war, in die menschliche Nahrung gelangte (Collinge et al., Nature, 1996). Ein ähnliches Profil wurde bei einem Makaken beobachtet, der mit dem BSE-Erreger infiziert war (Lasmezas et al, 1996) und bei einer Katze, die wahrscheinlich mit dem Erreger verseucht war (Priola et al., Nature Med., 1996).
Allerdings ist die Anwendung des Verfahrens zeitintensiv und schwierig, wenn reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden sollen. Dies ist vermutlich ein Teil der augenblicklichen Kontroverse um die Klassifikation der verschiedenen PrPres-Typen und der Verwendung dieses Verfahrens. (Parchi et al., Nature, 1997).
Es besteht ein starker Verdacht, dass Schafe mit dem BSE-Erreger verseucht waren (Butler, Nature, 1998). Diese Tiere reagieren tatsächlich empfindlich auf diesen Erreger, obwohl es bei Scahfen ebenfalls eine endemische Krankheit, Scrapie, eine weitere ESST, gibt, die ähnliche und nicht differenzierbare klinische und histologische Charakteristika aufweist. Die einzige Referenzmethode zur Differentialdiagnose zwischen dem BSE-Erreger und dem Scrapie-Erreger ist die Inokulation der Maus und das Studium des Läsionsprofils, wofür jedoch eine Wartezeit von zwei Jahren notwendig ist und das in Großbritannien bei einer Population von einigen zehn Millionen Schafen nur an 9 Schafen durchgeführt wurde.
Es wurden erste Tests durchgeführt, um zu versuchen, die verschiedenen ATNC-Stämme in einer Probe zu unterscheiden; Kuczius T. et al. 1999 bemerkten, dass die bei der Methode der Glykotypisierung beobachteten Abweichungen zwischen den verschiedenen ESST-Stämmen (Scrapie, BSE und CJK) keine Unterscheidung der einzelnen Stämme zulässt; sie wählten andere biochemische und biologische Marker für PrPres, die eine deutlichere Unterscheidung der verschiedenen Prionenstämme ermöglichten. Die verwendeten Analyseparameter sind wie folgt: Langzeitbeständigkeit gegen Proteinase K, Molekülmasse von PrPres, Typologie und Menge der PrPres-Abscheidungen. Die erhaltenen Resultate zeigen, dass PrPres von verschiedenen BSE-Stämmen und von Scrapie signifikante Unterschiede in der Langzeitbeständigkeit gegen Proteinase K aufweist. Entsprechend dem Scrapie-Stamm variiert die Beständigkeit gegen PK: wenig beständig: Chandler-Stamm; mittelmäßig beständig: Stamm 22A; relativ stabil: Stamm 87V. Unter gleichen Bedingungen zeigten die BSE-Stämme eine mittlere Beständigkeit. Obwohl die Glykotypisierung keine Unterscheidung zwischen dem Scrapie-Stamm 87V und den BSE-Stämmen ermöglicht, können diese beiden Stämme nach Langzeitbehandlung mit PK klar unterschieden werden. Diese Protokolle sind jedoch nicht zuverlässig genug und können nicht in großem Maßstab an Ort und Stelle verwendet werden.
Unter diesen Umständen ist es wichtig, ausgehend von einer biologischen Probe, wie einer Gewebeprobe, ein zuverlässiges und empfindliches Verfahren zum Nachweis von PrPres bereitzustellen, das eine Differenzialdiagnose erlaubt, relativ günstig und leicht durchführbar ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist folglich ein differentialdiagnostisches Verfahren (Verfahren B) für von ATNC-Stämmen verursachte ESSTs in einer biologischen Probe durch Nachweis der mit den verschiedenen ATNC-Stämmen assoziierten PrPres, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst:

(a) Nachweis des PrPres von einem ATNC-Stamm in einer ersten Fraktion der Probe gemäß den folgenden Schritten (1) bis (3): (1) Behandlung der Probe mit wenigstens einer Proteinase K, so dass das PrPsens vollständig abgebaut wird, während die Octapeptidmotiv-Repeats des PrPres unabhängig davon, um welchen ATNC-Stamm es sich handelt, ganz oder teilweise erhalten bleiben, (2) In-Kontakt-Bringen der behandelten Probe mit einem Liganden für die Octapeptidmotive, und (3) Nachweis des eventuellen Vorliegens des Komplexes aus Octapeptidmotiv-Repeats-Ligand, und dann:
(b) für jede Probe, für die das Vorliegen eines Komplexes aus Octapeptidmotiv-Repeats-Ligand in Schritt (a) nachgewiesen wird: – Behandlung einer zweiten Fraktion der Probe mit wenigstens einer Proteinase K, so dass der größte Teil der Octapeptidmotiv-Repeats für das mit wenigstens einem Stamm von Interesse, insbesondere dem ESB-Stamm, assoziierte PrPres eliminiert wird, und die Gruppe der mit den anderen ATNC-Stämmen assoziierten PrPres die Octapeptidmotiv-Repeats ganz oder teilweise behält, – In-Kontakt-Bringen der zweiten Fraktion der behandelten Probe mit einem Liganden für die Octapeptidmotiv-Repeats, und – Nachweis des eventuellen Vorliegens des Komplexes aus Octapeptidmotiv-Repeats-Ligand.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein differentialdiagnostisches Verfahren (Variante des Verfahrens B) für von ATNC-Stämmen verursachte ESST in einer biologischen Probe, von der man annimmt, dass sie PrPres enthält (mit jedem beliebigen Verfahren durchgeführter Nachweistest), das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst, für jede Probe, für die das Vorliegen eines PrPres nachgewiesen wurde, die Durchführung von Schritt (b) wie oben beschrieben,

– das In-Kontakt-Bringen der zweiten Fraktion der behandelten Probe mit einem Liganden für die Octapeptidmotiv-Repeats, und
– Nachweis des eventuellen Vorliegens des Komplexes aus Octapeptidmotiv-Repeats-Ligand.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird die Behandlung mit der Proteinase K nach Schritt (a) oder (b) 30 Sekunden bis 2 Stunden bei einer Temperatur unter 80 °C durchgeführt wird, vorzugsweise 10 Minuten bis 30 Minuten.
Gemäß einer vorteilhaften Form dieser Ausführungsform erfolgt die Behandlung mit der Proteinase K entweder bei einer Konzentration zwischen 30 µg/ml und 200 µg/ml für 10 Minuten bei 37 °C für ein 10%iges Homogenat oder für eine Dauer und bei einer Konzentration entsprechend der Konzentration zwischen 30 µg/ml und 200 µg/ml unter den oben genannten Bedingungen, und besonders bevorzugt für 10 Minuten bei einer Konzentration zwischen 30 µg/ml und 200 µg/ml für ein 10%iges Homogenat oder für 30 Minuten bei einer Konzentration zwischen 10 µg/ml und 70 µg/ml für ein 10%iges Homogenat.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird die Proteinase K in Lösung in einem Puffer eingesetzt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Homogenisierungspuffern für die biologische Probe und Puffern, die wenigstens eines der folgenden Mittel umfassen: wenigstens ein Tensid und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel und/oder wenigstens ein Salz.
Im Rahmen der Differentialdiagnose (Verfahren B), können außer der PK-Konzentration, abhängig vom Stamm, auch andere Bedingungen die Degradation der Octapeptidmotive beeinflussen: Wenn die PK in einem Puffer verwendet wird, der sich von dem Homogenisierungspuffer unterscheidet, wie zum Beispiel ein Puffer, der vorteilhaft wenigstens ein Tensid und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel und/oder ein Salz umfasst, kann die Anzahl der abgebauten Octapeptidmotive je nach Zusammensetzung des Puffers und Konzentration der verschiedenen Agentien variieren.
Unter "Stamm von Interesse" versteht man den oder die ATNC-Stämme, insbesondere den BSE-Stamm, bei dem zum Beispiel die Octapeptidmotiv-Repeats eliminiert werden sollen.
Eines der Hauptcharakteristika der Verfahren A und B ist es, mit den Bedingungen zu spielen, unter denen die Proteasebehandlung durchgeführt wird, um die Degradation der Octapaptidmotiv-Repeats zu kontrollieren. Je nach der gewünschten Anwendung wird das Verfahren so durchgeführt, dass diese Motive erhalten bleiben (Verfahren A) oder zerstört werden (Verfahren B):

– im Rahmen von Verfahren A zielt die Kontrolle darauf ab, diese Octapeptidmotiv-Repeats ganz oder teilweise zu erhalten, um so einen sehr empfindlichen PrPres-Nachweis zu ermöglichen.
– Im Rahmen von Verfahren B zielt die Kontrolle des Abbaus durch Protease darauf ab, den größten Teil und gegebenenfalls auch alle Octapapetidmotiv-Repeats des PrPres abzubauen, das dem oder den Stämmen von Interesse entspricht, egal, in welcher Spezies es exprimiert wird, und zwar unter Bedingungen, unter denen die Octapeptidmotiv-Repeats der PrPres, die allen anderen ESST-Stämmen entsprechen, erhalten bleiben. In diesem Fall ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Differentialdiagnostik des Stamms von Interesse im Vergleich mit den anderen ATNC-Stämmen zu ermöglichen.

Tatsächlich spaltet die PK unter den Bedingungen gemäß Schritt (1) oder Schritt (a) überraschenderweise nicht alle oder einige der Octapeptidmotiv-Repeats der mit allen ATNC-Stämmen oder Prionen assoziierten PrPres, während die Bedingungen von Schritt (b) zur Spaltung der Octapeptidmotiv-Repeats des mit dem Stamm von Interesse assoziierten PrPres führen, während die Octapeptidmotiv-Repeats bei allen PrPres, die mit den anderen ATNC-Stämmen assoziiert sind, ganz oder teilweise erhalten bleiben.
Ebenfalls überraschend hat ein solcher Test, insbesondere wenn der Ligand ein Antikörper ist, die folgenden Vorteile:

– eine hohe Nachweisempfindlichkeit, da die Antikörper, die gegen diese Octapeptidmotiv-Repeats gerichtet sind, eine viel größere Affinität haben, als die gegen andere Regionen von PrPres 27–30 gerichteten Antikörper, und gegen die verwendeten Puffer beständiger sind; tatsächlich fördert die Erkennung eines Wiederholungsmotivs Wechselwirkungen hoher Affinität und ermöglicht es, dass mehrere Antikörpermoleküle an einem einzigen PrP-Molekül zu binden.
– Die Möglichkeit einer Differenzialdiagnose von ATNC-Stämmen oder Prionen, da es möglich ist, je nach angewandten Bedingungen einen Verdau dieser Motive zu erreichen oder nicht; es ist insbesondere möglich, sie für alle Krankheiten, die mit dem Stamm von Interesse zusammenhängen, zum Beispiel dem BSE-Erreger, zu eliminieren, wohingegen es möglich ist, es für die anderen sog. Prionen-Erkrankungen zu erhalten. Deswegen bieten die erfindungsgemäßen Verfahren einen einfachen Test zur differentiellen Diagnose von BSE und/oder von anderen Stämmen von Interesse im Vergleich mit anderen Stämmen, indem zwei unterschiedliche Bedingungen angewandt werden (Schritt (1) oder (a) und Schritt (b)), wobei die Bedingungen von Schritt (1) oder (a) (unter denen die Octapeptidmotiv-Repeats der mit der Gesamtheit der ATNC-Stämme assoziierten PrPres erhalten bleiben) den Nachweis aller Stämme ermöglichen, und die Bedingungen von Schritt (b) (unter denen diese Motive nur in dem PrPres eliminiert werden, das mit einem Stamm von Interesse assoziiert ist) nur die anderen Stämme zeigen.

Diese Tests finden daher insbesondere bei der Untersuchung der Verseuchung von Schafen mit dem BSE-Stamm Anwendung, den man normalerweise nicht von klassischen Scrapie-Stämmen unterscheiden kann.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform dieser Verfahren wird das PK in einem Puffer gelöst, der vorzugsweise umfasst:

a. wenigstens ein Tensid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: – anionischen Tensiden wie SDS (Natriumdodecylsulfat), Sarkosyl (Lauroylsarcosin), Natriumcholat, Natriumdesoxycholat, Natriumtaurocholat; – zwitterionischen Tensiden wie SB 3–10 (Decyl-Sulfobetain), SB 3–12 (Dodecyl-Sulfobetain), SB 3–14, SB 3–16 (Hexadecyl-Sulfobetain), CHAPS und DeoxyCHAPS; – nichtionischen Tensiden wie C12E8 (Dodecyloctaethylenglycol), TRITON X100, TRITON X114, TWEEN 20, TWEEN 80, MEGA 9 (Nonanoylmethylglucamin), Octylglucosid, LDAO (Dodecyldimethylaminoxid) oder NP40, oder – Mischungen von Tensiden, wie eine Mischung aus einem ionischen Tensid und einem nichtionischen Tensid, eine Mischung aus zwei ionischen Tensiden oder eine Mischung aus einem ionischen Tensid und einem zwitterionischen Tensid, und/oder
b. wenigstens ein chaotropes Mittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Harnstoff und Guanidin oder einer Mischung davon, und/oder
c. wenigstens ein Salz, ausgewählt aus Alkalimetall- oder Nichtalkalimetallsalzen.

Gemäß einer vorteilhaften Form dieser Ausführungsform umfasst der Puffer wenigstens 5 % anionisches Tensid, vorzugsweise Sarkosyl, gegebenenfalls zusammen mit SDS.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform dieser Verfahren ist der der Ligand ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aptameren und Antikörpern, die an die Region der Octapeptidmotiv-Repeats binden.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform dieser Verfahren wird die Behandlung von Schritt (b) unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie sie in Schritt (a) (1) definiert sind, aber bei einer PK-Konzentration über der, die in Schritt (a) verwendet wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein diagnostischer Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, dadurch gekennzeichnet, dass er in Kombination wenigstens ein Tensid und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel und/oder wenigstens ein Salz und eine Protease enthält, wie oben definiert.
Der Komplex aus Octapeptidmotiv-Repeats-Antikörper (wenn der Ligand ein Antikörper ist) wird durch übliche immunologische Verfahren nachgewiesen.
Neben den vorhergehenden Ausführungsformen umfasst die Erfindung noch weitere Ausführungsformen, wie sie sich aus der folgenden Beschreibung ergeben, die auf Ausführungsbeispiele für das den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildende Verfahren und auf die anliegenden Zeichnungen Bezug nehmen, wobei:
1 verschiedene PrP-Sequenzen zeigt: humane, ovine, bovine und murine Sequenz und Cricetidae-Sequenz;
2 den Nachweis von PrPres durch Western-Blot zeigt;
3 bis 6 verschiedenen Bedingungen gemäß einerseits Schritt (1) oder (a) und andererseits Schritt (b) beim Menschen (3 und 4) und bei Wiederkäuern (5 und 6) entsprechen, wenn die Gegenwart von Octapeptidmotiv-Repeats durch einen immunometrischen "Two-Site"-Assay nachgewiesen wird;
7 bis 12 den Einfluss der Puffer beim differentiellen Nachweis von BSE und Scrapie zeigen;
13 und 14 den Einfluss der Zusammensetzung der Puffer und der Proteinase K (PK)-Konzentration für den Nachweis der verschiedenen CJK-Typen zeigen;
15 die Ergebnisse zeigt, die durch einen direkten Verdau von Hirnhomogenaten mit Proteinase K erhalten werden;
16 die Unterschiede in der Beständigkeit von PrPres gegen Proteinase K in Abhängigkeit vom Typ der CJK zeigt;
17 den Nachweis von mit PK verdautem und in SAF-Form gereinigtem PrPres durch Western-Blot zeigt.
Es versteht sich, dass diese Beispiele lediglich der Veranschaulichung des Gegenstands der Erfindung dienen und diese in keiner Weise einschränken.
BEISPIEL 1: Herstellung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern, die für den Octapeptidmotiv-Repeat spezifisch sind.
– Synthese und Markierung des Peptids
Ein Peptid, das für den Octapeptid-Repeat des PrP, beispielsweise das Motiv G-G-W-G-Q-P-H-G-G-G-W-G-Q-G-_(NH2), das der Sequenz 79–92 des humanen PrP entspricht, repräsentativ ist, wurde mit einem automatischen Synthesegerät (Milligen 9050, Waters, Milford, MI) synthetisiert. Das Peptid wurde über ein heterobifunktionelles Reagens, Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC, Calbiochem, Frankreich) kovalent an Acetylcholinesterase (AchE) gekuppelt, wie bereits für andere Peptide oder Proteine beschrieben (McLaughlin et al., 1987, Grassi et al., 1989). Dieses Verfahren beinhaltet die Umsetzung einer in das Peptid eingeführten Thiolgruppe mit der Maleimidfunktion, die durch Umsetzung mit SMCC an die AchE gebunden wurde. Die Thiolgruppe wurde wie bereits beschrieben (McLaughlin et al., 1987) durch Umsetzung mit N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA) in das Peptid eingeführt. Die Kupplung erfolgte, indem die AchE-SMCC mit einem Überschuss an thioliertem Peptid reagieren gelassen wurde.
– Immunisierung und Herstellung monoklonaler Antikörper
Ein Präparat von „Scrapie-associated fibrils" (SAFs, PrPres-Präparat) wurde wie bereits beschrieben aus Hirn von infizierten Hamstern (Scrapie-Stamm 263K) erhalten (Lasmezas et al., 1997). Dieses Präparat wurde vor Immunisierung der Mäuse durch Behandlung mit Ameisensäure inaktiviert. Knockout-Mäuse für das PrP-Gen (PrP^0/0-Mäuse) wurden mit diesen SAF-Präparaten immunisiert, und Hybridomzellen wurden wie bereits beschrieben präpariert (Grassi et al., 1988, 1989). Kulturüberstände wurden wie oben beschrieben gescreent. 57 Hybridome konnten identifiziert und stabilisiert werden; sie wurden SAF-1 bis SAF-90 genannt. Es zeigte sich, dass all diese Antikörper die auf den Mikrotiterplatten immobilisierten SAFs erkannten, während ein kleiner Teil von ihnen die Fähigkeit besaß, Peptid-AchE-Konjugate zu erkennen. Von Letzteren erkannten sieben klar den Octapeptid-Repeat (Peptid 79–92); dies sind die Antikörper SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 und SAF-37. Die Liste der erhaltenen Antikörper sowie ihre wesentlichen Eigenschaften sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt. Nach Klonierung und Expansion in Form von Aszitesflüssigkeit wurden die monoklonalen Antikörper durch Affinitätschromatographie an einer Protein A-SEPHAROSE^®-Säule gereinigt und bis zur Verwendung bei –20 °C aufbewahrt. Der Isotyp der Antikörper wurde durch radiale Immundiffusion nach der Methode von Ouchterlony bestimmt.
– Screening der Überstände von Hybridomkulturen
Das Vorliegen von PrP-spezifischem Antikörper im Überstand von Hybridomkulturen wurde auf zwei Wegen gezeigt, wobei entweder deren Fähigkeit getestet wurde, an Peptid-AchE-Konjugate oder an Hamster-SAFs zu binden. Im ersten Fall erfolgte das Screening in Platten, die einen Anti-Maus-IgG-Antikörper enthielten, der wie bereits beschrieben immobilisiert war (Créminon et al., 1993, Frobert et al., 1991). Zusammengefasst wurden 100 μl Kulturüberstand und 100 μl Peptid-AchE-Konjugat über Nacht bei +4 °C in Platten reagieren gelassen, die immobilisierte Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper enthielten. Nach Waschen der Platten wurden 200 μl Ellman-Reagens (Ellman et al., 1961) in die Vertiefungen gegeben, um an die feste Phase gebundene AchE nachzuweisen. Im zweiten Fall wurden Platten mit einem immobilisierten SAF-Präparat hergestellt, indem man 50 μl einer 2 μg/ml-Lösung in einem 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, über Nacht bei Raumtemperatur reagieren ließ. Nach dem Waschen wurden die Platten mit EIA-Puffer (100 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, der 150 mM Natriumchlorid, 0,1 % bovines Serumalbumin (BSA) und 0,01 % Natriumazid enthielt) über Nacht bei +4 °C gesättigt und bis zur Verwendung bei dieser Temperatur aufbewahrt. Die Bindung der monoklonalen Antikörper an die immobilisierten SAFs wurde mit Hilfe von Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörpern nachgewiesen, die wie bereits beschrieben mit AchE markiert waren (Negroni et al., 1998).
Tabelle: Monoklonale Antikörper, gebildet gegen ein Hamster-SAF-Präparat

79–92: Antikörper, die das Peptid 79–92 erkennen
142–160: Antikörper, die das Peptid 142–160 erkennen
Epitop X: Antikörper, die nur die immobilisierten SAFs erkennen
Epitop A: Antikörper, die das Peptid 126–164 erkennen, aber nicht an das Peptid 142–160 binden
* Monoklonale Antikörper, die die Fähigkeit besaßen, das PrPsens wenigstens einer bei dieser Studie getesteten Spezies (Mensch, Rind, Schaf, Maus und Hamster) bei einem immunometrischen Assay zu erkennen.

Beispiel 2: Nachweis von PrPres durch Western Blot
I. Behandlung der Probe

(i) Herstellung eines Gewebehomogenats aus verschiedenen biologischen Proben – Rinder-BSE, Schaf-Scrapie, humane vCJK (Typ 4), sporadische humane CJK (Typ 1) und entsprechende negative Kontrollen Es wurden 350 mg Rinderhirn als Probe genommen, das vermahlen und zu 20 % (Gewicht/Volumen) in einer 5%igen Glucoselösung homogenisiert wurde. Zur Homogenisierung werden die Hirnprobe (350 mg) und 1,4 ml Glucoselösung in Reagensgläser mit Keramikkügelchen gegeben und kräftig gerührt (Hybaid Ribolyser). Die positiven Proben wurden in einem Homogenat, das von gesundem Hirn der entsprechenden Spezies stammte, wie folgt verdünnt: • Schaf: auf 1/100 • Rind: auf 1/50 • Mensch: Typ 1 oder 4: auf 1/40, Typ 3: auf 1/80; Typ 2: auf 1/20
(ii) Bedingungen für Schritt (1) Eine erste Fraktion (500 µl) von in (i) erhaltenem 20%igem Homogenat wird 10 min bei 37 °C mit 500 µl eines Puffers inkubiert, der 10 % Sarkosyl (SK10), 10 % Triton^® X100 (T10), 2 M Harnstoff (U2) und 60 30 µg/ml µg Proteinase K (PK)/ml Puffer umfasst (PK1) (entsprechend einer Endkonzentration von 30 µg/ml für ein 10%iges Homogenat). In den 3–6 entspricht PK3 einer PK-Konzentration von 180 µg/ml Puffer, und PK6 entspricht einer PK-Konzentration von 360 µg/ml Puffer.
(iii) es werden 500 µl eines Puffers zugegeben, der aus 1-Butanol besteht (entsprechend den Puffern B, wie sie in der Internationalen Anmeldung WO 99/41280 beschrieben sind); dann wird 5 min bei 15.000 Upm (etwa 17.000 g) zentrifugiert.
(iv) Das Zentrifugationspellet, das das PrPres enthält, wird in 80–100 µl Puffer C, wie in der internationalen Anmeldung WO 99/41280 beschrieben, vorzugsweise einem Laemmli-Puffer mit 4 % SDS, aufgenommen und zur Durchführung eines Western Blot 5 min auf 100 °C erhitzt oder zur Durchführung eines immunometrischen Tests nacheinander in einem Puffer C1 mit 6 M Harnstoff und 0,5 % Sarkosyl, gefolgt von 5 min Erhitzen auf 100 °C, und dann in einem Puffer C2 mit 2 M Guanidin, gefolgt von 5 min Erhitzen auf 100 °C, aufgenommen.
(v) Bedingungen für Schritt (b) Eine zweite Fraktion (500 µl) von in (i) erhaltenem 20%igem Homogenat wird 10 min bei 37 °C mit 500 µl eines Puffers inkubiert, der 5 % Sarkosyl (SK5), 5 % SDS (SDSS), 1 M Harnstoff (U1) und 360 µg Proteinase K (PK)/ml (PK6) umfasst, und dann werden die obigen Schritte (iii) und (iv) durchgeführt.

II. Western Blot
Die erhaltenen Proben werden für eine SDS-PAGE-Elektrophorese verwendet und unter den in Beispiel 1 und Beispiel 3 der oben zitierten internationalen Anmeldung WO 99/41280 angegebenen Bedingungen auf Nitrocellulosemembranen transferiert.
Der Immunnachweis von PrPres erfolgt mit den oben in Beispiel 1 beschriebenen monoklonalen Antikörpern SAF70 und SAF37 und mit Peroxydase-konjugierten Anti-Kaninchen-Ziegen-IgGs (1/2500). Die Immunreaktivität wird durch Chemilumineszenz (ECL, Amersham) nachgewiesen, quantifiziert und wie in 2 dargestellt auf Autoradiografiefilmen sichtbar gemacht.
In dieser Figur entsprechen:

* die Spuren 1–5 Bedingungen gemäß Schritt (1) oder (a) (SK10 + T10 + U2 + PK1): Spur 1: negative Kontrolle Spur 2: Rinder-BSE Spur 3: Schaf-Scrapie Spur 4: humane vCJK (Typ 4) Spur 5: humane CJK (Typ 1) und
* die Spuren 6–10 Bedingungen gemäß Schritt (b) (SK10 + SDS5 + U1 + PK6): Spur 1: negative Kontrolle Spur 2: Rinder-BSE Spur 3: Schaf-Scrapie Spur 4: humane vCJK (Typ 4) Spur 5: humane CJK (Typ 1).

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass:

– das PrPsens in Schritt (1) oder (a) (Spuren 1 bis 5) systematisch zerstört wird, während das mit gegen die Octapeptidmotiv-Repeats gerichtetem Antikörper für PrPres erhaltene Signal systematisch stärker ist als das Signal, das für die gleichen Proben mit einem gegen die Region 142–160 von PrP gerichtetem Antikörper erhalten wird.
– das PrPsens in Schritt (b) (Spuren 6 bis 10) systematisch zerstört wird, während das in den Spuren 8 und 10 erhaltene Signal (in Gegenwart des gegen die Octapeptidmotiv-Repeats gerichteten Antikörpers) ähnlich oder stärker ist als das Signal, das bei den gleichen Proben mit einem Antikörper erhalten wird, der gegen die Region 142–160 von PrP gerichtet ist, während es in den Spuren 7 und 9 (PrPres von BSE) schwächer und sogar gar nicht nachweisbar ist.

BEISPIEL 3: Nachweis von PrPres mit einem immunometrischen „Two Site"-Assay, wobei als Capture-Antikörper ein monoklonaler Antikörper verwendet wird, der die Octapeptidmotiv-Repeats erkennt.
Zur Durchführung eines immunometrischen „Two Site"-Assays wird das bei (iv) in Beispiel 2 erhaltene Pellet beispielsweise in einem Puffer gelöst, der Sarkosyl (0,25–1 %) und Harnstoff (0,25–8 M) oder SDS (0,25–1 %) und Harnstoff (0,25–1 M) enthält; die erhaltene Probe wird vorzugsweise nach Erhitzen mit einem Puffer verdünnt (auf ¼ oder auf ½), der Albumin enthält, so dass sich eine Albumin-Endkonzentration zwischen 0,1 und 1 % (Gewicht/Volumen) ergibt, oder mit einem Puffer, der 1 % Deoxycholat enthält.
Der immunometrische „Two Site"-Assay erfolgt in Mikrotiterplatten, die einen Antikörper enthalten, der unter den bereits für andere Proteine beschriebenen Bedingungen immobilisiert wurde (Grassi et al., 1989). Sein Prinzip ist wie folgt: das analysierte PrP wird von einem Antikörper erkannt, der an den festen Träger gebunden ist (Capture-Antikörper), und von einem zweiten Antikörper, der einen anderen Teil des Moleküls erkennt und der mit einem Enzym (in diesem Fall Acetylcholinesterase, Tracer-Antikörper) mit 5 Ellman-Einheiten/ml markiert ist (1 Ellman-Einheit = 7,35 × 10^–2 Enzymeinheiten).
Bei dieser Erfindung ist der Capture-Antikörper gegen die Octapeptidmotiv-Repeats gerichtet, und der Tracer-Antikörper erkennt eine Sequenz in der Region 94–230 des PrP, beispielsweise den Bereich 142–160 von PrP. Nach Waschen der festen Phase ist die auf der Platte gebundene Enzymaktivität proportional zur Menge von anfänglich in der analysierten Probe vorhandenem PrPres, das die Octapeptidmotiv-Repeats besitzt.
In der Praxis wird der Assay wie folgt durchgeführt:
100 μl der zu analysierenden PrP-Lösung werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben, die den Antikörper enthält, der die Octapeptidmotiv-Repeats erkennt. Nach 3 Stunden Reagierenlassen bei Raumtemperatur wird die Platte gewaschen, und dann werden 100 µl einer Lösung des Tracer-Antikörpers (5 Ellman-Einheiten/ml) zugegeben. Nach Reagierenlassen über Nacht bei +4 °C werden die Platten erneut gewaschen, und dann werden 200 μl einer Substratlösung (Ellman-Reagens, Grassi et al., 1989) zugegeben, wodurch die Aktivität der an die feste Phase gebundenen Acetylcholinesterase gemessen werden kann. Nach 30 Minuten enzymatischer Umsetzung wird die Extinktion (OD bei 414 nm) von jeder Vertiefung gemessen.
BEISPIEL 4: Vergleichende Untersuchung verschiedener Bedingungen: Schritt (1) oder (a) und Schritt (b)
Die Proben werden wie in Beispiel 2 beschrieben präpariert.
Die Homogenate werden wie in Beispiel 2 präpariert.
– beim Menschen
Die 2 und 4 zeigen die mit verschiedenen Puffern erhaltenen Ergebnisse:

* Bedingungen gemäß Schritt (1) oder (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens: I: 20%iges Homogenat + SK10 + T10 + U2 + PK1 III': 10%iges Homogenat + SK5 + T5 + U1 + PK0,5 (4)
* Bedingungen gemäß Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens: II: 20%iges Homogenat + SK10 + T10 + U2 + PK3 III: 20%iges Homogenat + SK10 + T10 + U2 + PK6 III": 10%iges Homogenat + SK5 + T5 + U1 + PK6 (4) IV: 20%iges Homogenat + SK20 + PK3 V: 20%iges Homogenat + SK20 + U1 + PK3 VI: 20%iges Homogenat + SK20 + U2 + PK3 VII: 10%iges Homogenat + SK20 + PK3 VIII: 10%iges Homogenat + SK20 + U1 + PK3 IX: 10%iges Homogenat + SK20 + U2 + PK3 X: 10%iges Homogenat + SK5 + SDSS + U1 + PK6 X': 10%iges Homogenat + SK2,5 + SDS2,5 + U2 + PK6 (4) XI: 20%iges Homogenat + SK20 + PK6 XII: 20%iges Homogenat + SK20 + U1 + PK6 XIII: 20%iges Homogenat + SK20 + U2 + PK6 XIV: 10%iges Homogenat + SK20 + PK6 XV: 10%iges Homogenat + SK20 + U1 + PK6 XVI: 10%iges Homogenat + SK20 + U2 + PK6

Die Menge PrPres mit konserviertem Octapeptidmotiv-Repeat wird mit dem immunometrischen „Two Site"-Assay gemessen (Extinktion oder OD bei 414 nm, siehe Beispiel 3; gemessen wird das Auftreten einer gelben Färbung, Ellman-Reagens): negative Kontrolle (☐), sporadische CJK Typ 1 (☐) und vCJK Typ 4 (∎).
– bei Wiederkäuern
Die 5 und 6 zeigen die mit verschiedenen Puffern erhaltenen Ergebnisse:

* Bedingungen gemäß Schritt (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens: I: 20%iges Homogenat + SK10 + T10 + U2 + PK1 III': 10%iges Homogenat + SK5 + T5 + U1 + PK0,5 (6)
* Bedingungen gemäß Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens: II: 20%iges Homogenat + SK10 + T10 + U2 + PK3 III: 20%iges Homogenat + SK10 + T10 + U2 + PK6 III'': 10%iges Homogenat + SK5 + T5 + U1 + PK3 (6) IV: 20%iges Homogenat + SK20 + PK3 V: 20%iges Homogenat + SK20 + U1 + PK3 VI: 20%iges Homogenat + SK20 + U2 + PK3 VII: 10%iges Homogenat + SK20 + PK3 VIII: 10%iges Homogenat + SK20 + U 1 + PK3 IX: 10%iges Homogenat + SK20 + U2 + PK3 X: 10%iges Homogenat + SK5 + SDSS + U1 + PK6 X': 10%iges Homogenat + SK5 + SDSS + U2 + PK3 (5) XI: 20%iges Homogenat + SK20 + PK6 XII: 20%iges Homogenat + SK20 + U1 + PK6 XIII: 20%iges Homogenat + SK20 + U2 + PK6 XIV: 10%iges Homogenat + SK20 + PK6 XV: 10%iges Homogenat + SK20 + U1 + PK6 XVI: 10%iges Homogenat + SK20 + U2 + PK6

Die Menge PrPres mit konserviertem Octapeptidmotiv-Repeat wird mit dem immunometrischen „Two Site"-Assay gemessen (Extinktion oder OD bei 414 nm, siehe Beispiel 3): negative Kontrolle (⎕), bovines ATNC (⎕) und ovines ATNC (∎).
– 7 (Western Blot) und 8 (immunometrischer „Two Site"-Assay):

• Der Vergleich erfolgt mit 20%igen Hirnhomogenaten, die unter den in Beispiel 2 erläuterten Bedingungen von gesundem Schaf, von Schaf, das an Scrapie litt, und von Rind, das an BSE litt, erhaltenen wurden.
• Behandlung der Proben: A: 10 % Sarkosyl + 10 % Triton + 2 M Harnstoff + 60 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten B: 10 % Sarkosyl + 2 M Harnstoff + 240 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten C: 10 % Sarkosyl + 240 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten
• Nachweis durch Western Blot (7): Antikörper Saf37 und Saf84 (siehe Beispiel 1) durch Immunometrie (8): Capture mit Saf37 und Nachweis durch einen gegen die Region 94–230 von PrP gerichteten Antikörper.

– 9 (Western Blot) und 10 (immunometrischer „Two Site"-Assay):

• Der Vergleich erfolgt mit 20%igen Hirnhomogenaten, die unter den in Beispiel 2 erläuterten Bedingungen von gesundem Schaf, Schaf, das an Scrapie litt, und Rind, das an BSE litt, erhalten wurden.
• Behandlung der Proben: A: 10 % Sarkosyl + 10 % Triton^® + 2 M Harnstoff + 60 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten B: 10 % SDS + 5 % Triton^® + 2 M Harnstoff + 180 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten
Nachweis unter den gleichen Bedingungen wie oben.

Das Erhöhen lediglich der PK-Dosis ermöglicht es, eine differenzielle Empfindlichkeit der Region der Octapeptidmotiv-Repeats zwischen BSE und Scrapie beim Schaf sichtbar zu machen, aber nicht bei Menschen (zwischen Typ 1 und Typ 4).
Umgekehrt ermöglicht es die gleichzeitige Modifikation der Zusammensetzung aus Tensid und chaotropem Mittel in allen Fällen, eine differenzielle Empfindlichkeit der Region der Octapeptidmotiv-Repeats sichtbar zu machen.
BEISPIEL 5: Einfluss der Zusammensetzung der Puffer auf den differenziellen Nachweis von BSE und Scrapie
– 11 (Western Blot) und 12 (immunometrischer „Two Site"-Assay):

• Der Vergleich erfolgt mit 10%igen Hirnhomogenaten, die unter den in Beispiel 2 erläuterten Bedingungen von gesunden Mäusen oder von experimentell mit dem Stamm C506M3 (Scrapie) oder von mit einem 6PB1-Stamm (BSE) infizierten Mäusen erhalten wurden.
• Behandlung der Proben: A: 10 % Sarkosyl + 10 % Triton^® + 2 M Harnstoff + 30 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten B: 10 % Sarkosyl + 10 % Triton^® + 2 M Harnstoff + 60 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten C: 10 % Sarkosyl + 10 % Triton^® + 2 M Harnstoff + 180 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten D: 10 % Sarkosyl + 10 % Triton^® + 2 M Harnstoff + 360 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten E: 10 % Sarkosyl + 2 M Harnstoff + 180 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten
• Nachweis durch Western Blot (11): Antikörper Saf37 und Saf70 (siehe Beispiel 1) durch Immunometrie (12): Capture mit Saf37 und Nachweis durch einen gegen die Region 94–230 von PrP gerichteten Antikörper.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass es die Erhöhung lediglich der PK-Dosis ermöglicht, eine differenzielle Empfindlichkeit der Region der Octapeptidmotiv-Repeats zwischen BSE und Scrapie bei Mäusen sichtbar zu machen.
BEISPIEL 6: Einfluss der Puffer und der Proteinase K-Konzentration auf den Nachweis verschiedenere CJK
– 13 (Western Blot) und 14 (immunometrischer „Two Site"-Assay):

• Der Vergleich erfolgt mit 10%igen Hirnhomogenaten, die unter den in Beispiel 2 erläuterten Bedingungen von gesunden Menschen und Menschen, die an CJK (Typ 1, 2, 3 und 4) litten, erhalten wurden.
• Behandlung der Proben: A: 10 % Sarkosyl + 10 % Triton^® + 2 M Harnstoff + 30 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten B: 10 % Sarkosyl + 10 % Triton^® + 2 M Harnstoff + 180 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten C: 10 % Sarkosyl + 30 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten D: 10 % Sarkosyl + 60 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten E: 10 % Sarkosyl + 180 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten F: 10 % Sarkosyl + 360 µg/ml Proteinase K, 10 Minuten
• Nachweis durch Western Blot (13): Antikörper Saf37 und Saf70 (siehe Beispiel 1) durch Immunometrie (14): Capture mit Saf37 und Nachweis durch einen gegen die Region 94–230 von PrP gerichteten Antikörper.

– 15 (Western Blot) und 16 (Immunometrie)

• Der Vergleich erfolgt mit 10%igen Hirnhomogenaten, die unter den in Beispiel 2 erläuterten Bedingungen von gesunden Menschen und Menschen, die an CJK (Typ 1, 2, 3 und 4) litten, erhalten wurden.
• Behandlung der Proben: 15: Verdau mit Proteinase K (150 µg/ml), 10 Minuten 16: 10 % Sarkosyl + 2 M Harnstoff + Proteinase K (30 bis 360 µg/ml), 10 Minuten
• Nachweis durch Western Blot (15): Antikörper Saf37 und ein gegen die Region 94–230 von PrP gerichteter Antikörper (siehe Beispiel 1) durch Immunometrie (16): Capture mit Saf37 und Nachweis durch einen gegen die Region 94–230 von PrP gerichteten Antikörper.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass es die Erhöhung der PK-Dosis ermöglicht, eine differenzielle Empfindlichkeit der Region von Octapeptidmotiv-Repeats bei den verschiedenen Typen von CJK sichtbar zu machen. Unter diesen Bedingungen gibt es zwischen Typ 1 und Typ 4 keinen signifikanten Unterschied; die Änderung der Zusammensetzung aus Tensid und chaotropem Mittel bei gleicher PK-Dosis (E, 13 und 14) ermöglicht es, die Octapeptide bei Typ 4 zu zerstören und sie gleichzeitig bei Typ 1 zu erhalten.
Ferner ermöglicht es 16, den Empfindlichkeitsunterschied von PrPres aus verschiedenen Stämmen bei gleichem Puffer als Funktion der PK-Dosis zu zeigen.
Darüber hinaus zeigt 15, dass eine direkte Behandlung des Homogenats mit PK einen anderen Empfindlichkeitstyp von PrPres gegenüber Abbau sichtbar macht.
BEISPIEL 7: Nachweis von verdautem und in Form von SAF gereinigtem PrPres durch Western Blot
Homogenate, die unter den Bedingungen gemäß Beispiel 2 erhalten wurden, werden wie folgt behandelt:
20%iges Homogenat (500 μl) + 20 % NaCl (500 μl) + [20 % Sarkosyl + 2 % SB314] (500 μl) + PK (20 µg/ml Endkonzentration), 1 Stunde
17 zeigt die Ergebnisse:
b und d:
Spuren 1–7: mit verschiedenen Verdünnungen von Scrapie-Stamm C506M3 bei Mäusen erhaltene Ergebnisse (Verdünnungen 1/20, 1/50, 1/250, 1/500, 1/1000 und 1/2000)
Spur 8: Molekulargewichte
Spuren 9–15: mit verschiedenen Verdünnungen des BSE-Stamms bei Mäusen erhaltene Ergebnisse (Verdünnungen von 1/1000 bis 1/10)
Es ist möglich, das BSE-Signal vollständig zu eliminieren.
a und c: die erhaltenen Ergebnisse bestätigen, dass das Signal in Gegenwart von gegen die Octapeptidmotiv-Repeats gerichteten Antikörpern signifikant zunimmt.
e: Diese Figur zeigt, dass es möglich ist, sowohl bei Affen als auch bei Menschen eine Abnahme des Signals mit BSE zu erreichen (Spuren 4 und 7).
Literaturstellen

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Claims

Diagnostisches Verfahren für eine von einem ATNC-Stamm verursachte ESST oder Prionenerkrankung durch Nachweis des PrPres in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (1) Behandlung der Probe mit wenigstens einer Proteinase K, entweder in einer Konzentration zwischen 30 µg/ml und 200 µg/ml für 10 Minuten bei 37 °C für ein 10%iges Homogenat oder für eine Dauer und bei einer Konzentration entsprechend der Konzentration zwischen 30 µg/ml und 200 µg/ml unter den oben genannten Bedingungen, und besonders bevorzugt für 10 Minuten bei einer Konzentration zwischen 30 µg/ml und 200 µg/ml für ein 10%iges Homogenat oder für 30 Minuten bei einer Konzentration zwischen 10 µg/ml und 70 µg/ml für ein 10%iges Homogenat, wobei die Proteinase K in Lösung in einem Puffer eingesetzt wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Homogenisierungspuffern für die biologische Probe und Puffern, die wenigstens eines der folgenden Mittel umfassen: wenigstens ein Tensid und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel und/oder wenigstens ein Salz, so dass das PrPsens vollständig abgebaut wird, während die Octapeptidmotiv-Repeats des PrPres unabhängig davon, um welchen ATNC-Stamm es sich handelt, ganz oder teilweise erhalten bleiben, (2) In-Kontakt-Bringen der behandelten Probe mit einem Liganden für die Octapeptidmotive, und (3) Nachweis des eventuellen Vorliegens des Komplexes aus Octapeptidmotiv-Repeat-Ligand.
Differentialdiagnostisches Verfahren für von ATNC-Stämmen verursachte ESSTs durch Nachweis der mit den verschiedenen ATNC-Stämmen assoziierten PrPres in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (a) Nachweis des PrPres von einem ATNC-Stamm in einer ersten Fraktion der Probe gemäß den folgenden Schritten (1) bis (3): (1) Behandlung der Probe mit wenigstens einer Proteinase K, so dass das PrPsens vollständig abgebaut wird, während die Octapeptidmotiv-Repeats des PrPres unabhängig davon, um welchen ATNC-Stamm es sich handelt, ganz oder teilweise erhalten bleiben, (2) In-Kontakt-Bringen der behandelten Probe mit einem Liganden für die Octapeptidmotive, und (3) Nachweis des eventuellen Vorliegens des Komplexes aus Octapeptidmotiv-Repeats-Ligand, und dann: (b) für jede Probe, für die das Vorliegen eines Komplexes aus Octapeptidmotiv-Repeats-Ligand in Schritt (a) nachgewiesen wird: – Behandlung einer zweiten Fraktion der Probe mit wenigstens einer Proteinase K, so dass der größte Teil der Octapeptidmotiv-Repeats für das mit wenigstens einem Stamm von Interesse, insbesondere dem ESB-Stamm, assoziierte PrPres abgebaut wird, und die Gruppe der mit den anderen ATNC-Stämmen assoziierten PrPres die Octapeptidmotiv-Repeats ganz oder teilweise behält, – In-Kontakt-Bringen der zweiten Fraktion der behandelten Probe mit einem Liganden für die Octapeptidmotiv-Repeats, und – Nachweis des eventuellen Vorliegens des Komplexes aus Octapeptidmotiv-Repeats-Ligand.
Differentialdiagnostisches Verfahren für von ATNC-Stämmen verursachte ESSTs in einer biologischen Probe, von der man annimmt, dass sie PrPres enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es für jede Probe, für die das Vorliegen eines PrPres nachgewiesen wurde, die Durchführung von Schritt (b) nach Anspruch 2 umfasst, – das In-Kontakt-Bringen der zweiten Fraktion der behandelten Probe mit einem Liganden für die Octapeptidmotiv-Repeats, und – den Nachweis des eventuellen Vorliegens des Komplexes aus Octapeptidmotiv-Repeats-Ligand.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung mit der Proteinase K nach Schritt (a) oder (b) 30 Sekunden bis 2 Stunden bei einer Temperatur unter 80 °C durchgeführt wird, vorzugsweise 10 Minuten bis 30 Minuten.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung mit der Proteinase K entweder bei einer Konzentration zwischen 30 µg/ml und 200 µg/ml für 10 Minuten bei 37 °C für ein 10%iges Homogenat durchgeführt wird oder für eine Dauer und bei einer Konzentration entsprechend der Konzentration zwischen 30 µg/ml und 200 µg/ml unter den oben genannten Bedingungen, und besonders bevorzugt für 10 Minuten bei einer Konzentration zwischen 30 µg/ml und 200 µg/ml für ein 10%iges Homogenat oder für 30 Minuten bei einer Konzentration zwischen 10 µg/ml und 70 µg/ml für ein 10%iges Homogenat.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinase K in Lösung in einem Puffer eingesetzt wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Homogenisierungspuffern für die biologische Probe und Puffern, die wenigstens eines der folgenden Mittel umfassen: wenigstens ein Tensid und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel und/oder wenigstens ein Salz.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer vorzugsweise umfasst: a. wenigstens ein Tensid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: – anionischen Tensiden wie SDS (Natriumdodecylsulfat), Sarkosyl (Lauroylsarcosin), Natriumcholat, Natriumdesoxycholat, Natriumtaurocholat; – zwitterionischen Tensiden wie SB 3–10 (Decyl-Sulfobetain), SB 3–12 (Dodecyl-Sulfobetain), SB 3–14, SB 3–16 (Hexadecyl-Sulfobetain), CHAPS und DeoxyCHAPS; – nichtionischen Tensiden wie C12E8 (Dodecyloctaethylenglycol), TRITON X100, TRITON X114, TWEEN 20, TWEEN 80, MEGA 9 (Nonanoylmethylglucamin), Octylglucosid, LDAO (Dodecyldimethylaminoxid) oder NP40, oder – Mischungen von Tensiden, wie eine Mischung aus einem ionischen Tensid und einem nichtionischen Tensid, eine Mischung aus zwei ionischen Tensiden oder eine Mischung aus einem ionischen Tensid und einem zwitterionischen Tensid, und/oder b. wenigstens ein chaotropes Mittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Harnstoff und Guanidin oder einer Mischung davon, und/oder c. wenigstens ein Salz, ausgewählt aus Alkalimetall- oder Nichtalkalimetallsalzen.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer wenigstens 5 % anionisches Tensid, vorzugsweise Sarkosyl, gegebenenfalls zusammen mit SDS umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aptameren und Antikörpern, die an die Region der Octapeptidmotiv-Repeats binden.
Verfahren nach Anspruch 2, Anspruch 4 oder Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung von Schritt (b) unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wird, wie sie in Schritt (a)(1) definiert sind, aber bei einer PK-Konzentration über der, die in Schritt (a)(1) verwendet wird.
Diagnostischer Kit zur Durchführung des Verfahrens nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass er in Kombination wenigstens ein Tensid und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel und/oder wenigstens ein Salz und eine Protease enthält, wie definiert in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10.