EP1520178A2 - Verfahren zur anreicherung und zum nachweis von pathologisch veränderten prion-proteinen (prpsc) - Google Patents

Verfahren zur anreicherung und zum nachweis von pathologisch veränderten prion-proteinen (prpsc)

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Publication number
EP1520178A2
EP1520178A2 EP03762453A EP03762453A EP1520178A2 EP 1520178 A2 EP1520178 A2 EP 1520178A2 EP 03762453 A EP03762453 A EP 03762453A EP 03762453 A EP03762453 A EP 03762453A EP 1520178 A2 EP1520178 A2 EP 1520178A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
prp
detection
sheet
solid support
sample
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03762453A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Claudia Engemann
Katja Hoeschler
Jörg Lehmann
Jörg GABERT
Ulrike Krummrei
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Priontype & Co KG GmbH
Schleussner Cathrin
Original Assignee
Priontype & Co KG GmbH
Schleussner Cathrin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Priontype & Co KG GmbH, Schleussner Cathrin filed Critical Priontype & Co KG GmbH
Publication of EP1520178A2 publication Critical patent/EP1520178A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the present invention relates to methods for the detection of pathologically modified prion proteins (PrP Sc ) from living organisms.
  • TSEs Transmissible spongiform encephalopathies
  • PrP Sc pathologically modified prion protein
  • PrP c a conformer of the naturally occurring cellular prion protein
  • the prion replication that occurs in the course of the disease takes place through direct interaction between PrP Sc and PrP c , whereby the conformation of the pathological PrP Sc is forced on the normal PrP c .
  • PrP Sc is characterized by an increased proportion of ⁇ -sheets and a high resistance to proteases (eg proteinase K).
  • PrP Sc bovine spongiform encephalopathy
  • the principle of the current test systems is that tissue parts of the brain stem (Obex region) are homogenized and treated with Proteinase K. The protease treatment completely degrades the normal PrP, while PrP Sc from BSE-infected animals is only shortened by a few amino acids, which results in a reduction in the molecular weight from 33-35 kDa to 27-30 kDa. The remaining PrP is then visualized using monoclonal antibodies in a Western blot or ELISA.
  • the main disadvantage of this test system is its low sensitivity. Since the PrP Sc concentration in BSE-infected cattle for the current test systems is only sufficiently high in the central nervous system (CNS), the previous diagnosis is limited to post-mortem tests and increases the incubation period of the infected organism from at least 18 months to several years ahead.
  • CNS central nervous system
  • the diagnosis is also made p ost mortem here, since it is not possible to remove the necessary brain material from the living organism.
  • the bioassay is able to detect a single infectious unit, but it takes at least several months or even years.
  • the sensitivity of the previous detection methods must be increased significantly and the detection in tissues / body fluids other than the CNS must be made possible.
  • the specific binding of PrP Sc to human plasminogen is used to isolate PrP Sc from CNS material.
  • human plasminogen is immobilized on magnetic particles.
  • this method is only suitable for the detection of PrP Sc in those body fluids and tissues that do not contain plasminogen and is unsuitable, for example, for the detection of PrP S ⁇ in serum. Further disadvantages of this method are the high price and the limited protein binding capacity of the plasminogen-loaded magnetic particles used therein.
  • the invention is therefore based on the object of providing a method which has an increased sensitivity and enables diagnosis of TSE from living organisms.
  • the object is achieved by the subject-matter defined in the patent claims.
  • FIG. 1 shows a graphic representation of the principle of a method according to the invention for the enrichment and detection of PrP Sc using solid-phase-coupled ⁇ -sheet-binding molecules.
  • FIG. 2 schematically shows the structure of the PrP Sc binding assay in microtiter plate (MTP) format (example 1).
  • MTP microtiter plate
  • BLB ⁇ -sheet-breaker
  • FIG. 4 shows an evaluation of the detection of PrP Sc in aqueous humor and CSF samples from BSE-positive cattle.
  • the peptide KLVFF was used in ELISA format as a capture molecule for PrP Sc .
  • Detection was carried out with the anti-PrP Sc monoclonal antibody V5B2 (r-Biopharm, Darmstadt) and a polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody.
  • ⁇ -sheet binding molecule describes an organic molecule which, owing to its three-dimensional structure and / or its physical properties, is capable of interacting with ⁇ -sheet structures in proteins, for example in pathological terms modified monomeric / oligomeric prion proteins to occur and bind them due to the interactions.
  • Exemplary ⁇ -sheet binding molecules are listed in SEQ ID NO: 1 to 10.
  • ß-sheet-breaker (BSB) describes short peptides which not only bind to ß-sheet structures of ß-amyloid (protein aggregates in Alzheimer's disease) and amyloid-like structures, but also above them can also block or undo their abnormal folding.
  • pathologically modified prion protein refers to PrP Sc .
  • PrP Sc can exist both in monomeric and or oligomeric form and in fibrillar, amyloid aggregate form.
  • BSE-positive cattle are those animals in whose stem-brain tissue post-mortem proteinase K-resistant PrP Sc can be detected.
  • the present invention relates to a method for the detection of pathologically modified prion proteins (PrP Sc ), comprising the following steps: a) incubating a sample with a solid support, the solid support being coupled to a ⁇ -sheet-binding molecule, b ) Removing the sample components not bound to the ⁇ -sheet-binding molecules, and c) detecting the pathologically modified prion proteins (PrP Sc ) bound to the ⁇ -sheet-binding molecules.
  • the monomeric and / or oligomeric pathologically modified prion proteins contained in body fluids, cell lysates or body tissues are enriched, so that even the smallest previously undetectable concentrations of PrP Sc can be detected.
  • This makes it possible to classify living animals or humans as infected shortly after infection with TSE-triggering prions. Until now, this was not possible because such sensitive tests were not available and, moreover, the evidence could only be carried out post mortem from brain tissue, since the concentration of PrP Sc is high enough there.
  • the method can deliver results in the body tissues, eg brain homogenates, at a much earlier point in time after an infection, which with the current detection methods only show results when the infection has already progressed significantly.
  • the sample to be examined can be a body fluid, for example blood, serum, plasma, CSF, aqueous humor, tear fluid, urine, saliva, lymph, milk, or a cell lysate, for example from leukocytes or from cells of the lymphoid tissue, or a tissue homogenate, for example from central nervous system tissues, from lymphatic tissues (e.g. spleen, tonsils, lymph nodes) or other organs.
  • the sample Before the incubation, the sample can optionally be subjected to sample preparation. This may be necessary for tissue samples in particular. After adding a suitable buffer solution, e.g. 50 mM phosphate buffer, pH 7.5, mechanically comminuted, e.g. by ultrasound or ribolyser treatments, and homogenized to get their components in solution or suspension.
  • a suitable buffer solution e.g. 50 mM phosphate buffer, pH 7.5
  • mechanically comminuted e.g. by ultrasound or ribolyser treatments, and homogenized to get their components in solution or suspension.
  • the sample can also be subjected to a centrifugation and / or filtration step to separate the solid components obtained by mechanical treatment of the tissues or cell suspensions or those present in body fluids.
  • the sample with or without sample preparation described above can additionally or exclusively be subjected to a proteinase treatment for the proteolytic degradation of PrP c before the incubation.
  • a proteinase treatment for the proteolytic degradation of PrP c before the incubation.
  • the PrP Sc to be detected for example the monomeric and or oligomeric form of PrP Sc
  • the sample material is treated with a protease, eg Proteinase K.
  • the protease digestion can be carried out under standard conditions for the respective protease or according to the manufacturer, preferably at 37 ° C. for 1 h.
  • the enzyme concentration used can be in the range from approximately 10 ⁇ g / ml to approximately 1 mg / ml, preferably approximately 50 ⁇ g / ml enzyme is used with a protein content of the sample material of approximately 0.5 to approximately 10 mg / ml.
  • Solid supports can be spherical polymers (eg Sepharose, agarose or latex), plastic surfaces (eg microtiter plates), silica gel-coated glass plates (eg for thin layer chromatography), capillaries or membranes.
  • the spherical polymers can be used as supports in column chromatography or in a batch process (for example magnetic beads). If the polymers are used for column chromatography, they are preferably used in prepacked disposable columns. Besides those here Any solid support that can be used for coupling ⁇ -sheet-binding molecules is also suitable.
  • the sample can be incubated in a closed vessel for about 5 to about 120 minutes at a temperature in the range from about 4 ° C. to about 50 ° C. with the solid support, for example glass plates, microtiter plates.
  • the incubation is preferably carried out at 37 ° C. for 1 h in a shaking incubator with a low rotation frequency (eg 80 rpm).
  • a low rotation frequency eg 80 rpm.
  • the PrP Sc contained in the sample is bound to the ⁇ -sheet binding molecule immobilized on the solid support.
  • a spherical polymer is used as the solid support in a column chromatography, the incubation takes place in the column.
  • the incubation time can vary depending on the column, depending on the connection of the column to an apparatus and the flow rate of the sample.
  • the ß-sheet-binding molecules coupled to the solid support bind PrP So with a much higher affinity than PrP c and, according to the invention, are able to capture the soluble and monomeric or oligomeric form of PrP Sc that occurs in body fluids.
  • the ⁇ -sheet-binding molecules are oligopeptides consisting of 3 to about 30 amino acids, preferably 4, 5 or 6 amino acids. These peptides can be modified at the C- and / or N-terminal, for example in order to achieve better solubility.
  • the ß-sheet-binding molecules can also have the properties of the ß-sheet breaker.
  • BSB properties also have the .beta.-sheet binding molecules according to the invention, however, such binding properties (affinity, reversibility of the bond) to PrP Sc, which enable the capture and enrichment of PrP Sc from solutions.
  • BOD peptides that bind the ß-sheet structures too tightly or irreversibly so that elution is not possible are unsuitable as ß-sheet-binding molecules.
  • BODs that bind PrP Sc with too little affinity or do not bind them permanently eg detachment of the PrP Sc from the BOD after the ⁇ -sheet structure has been broken open.
  • Particularly preferred ⁇ -sheet-binding molecules are listed in Table 1 and as SEQ ID NO: 1 to 10.
  • the ⁇ -sheet-binding molecule can also be a substituted heterocyclic aromatic, advantageously a flavonoid, for example thioflavin T, baicalin or quercitrin.
  • the ⁇ -sheet-binding molecules are preferably immobilized on the solid support via a covalent bond.
  • Functional for coupling to the carrier Groups such as amino, carboxyl or hydroxyl groups are used on the ß-sheet binding molecule. If the ⁇ -sheet-binding molecule is a peptide, the coupling is preferably carried out via the amino group at the N-terminus or the carboxyl group at the C-terminus.
  • the oligopeptide is the pentapeptide with the sequence KLVFF (SEQ ID NO: 2), it is preferably coupled via the carboxyl group at the C-terminus, since when coupled via the amino group the peptide is also fixed to the side chain of the lysine residue would lead to steric hindrance of the PrP Sc bond.
  • a buffered solution with suitable, stringency-increasing additives serves as the washing solution.
  • the pH of the wash solution is in the neutral range, preferably at pH 7.5. 50 mM phosphate buffer is preferably used to buffer the solution. In addition, any buffer with which a pH value in the neutral range can be set is suitable.
  • the stringency enhancing additives can be inorganic salts, e.g. NaCl, as well as detergents, e.g. SDS, Triton X 100 or Tween 20, or chaotropic reagents, e.g. Urea, guanidinium hydrochloride or guanidinium isothiocyanate.
  • a buffered solution with 1 to 4 M NaCl is advantageously used as the washing solution.
  • the PrP Sc bound to the ⁇ -sheet-binding molecules may be eluted from the solid carrier (for example when using spherical polymers in column chromatography). With other supports, such as membranes or plastic surfaces, PrP Sc can be detected directly on the solid support. If desired, however, elution can also be carried out here.
  • the support is rinsed with the smallest possible volume of elution solution.
  • the elution volume is many times smaller than the sample volume.
  • a buffered solution containing additives which break the bond between PrP Sc and the capture molecule is used as the elution solution.
  • the pH of the elution solution is in the range from about pH 6 to about pH 8.5, preferably at pH 7.5. 50 mM phosphate buffer is preferably used to buffer the solution. In addition, any buffer with which a pH in the above described, preferably in the neutral range, can be adjusted.
  • the additives can be, for example, detergents, for example SDS, Triton X 100 or Tween 20, chaotropic reagents, for example urea, guanidinium hydrochloride or guanidinium isothiocyanate, inorganic salts, for example NaCl.
  • the elution solution preferably contains detergents, for example 5% SDS.
  • the PrP Sc enriched in the previous process steps is detected.
  • immunochemical e.g. ELISA, Western blot, immunoprecipitation
  • biophysical e.g. mass spectrometry, fluorescence correlation spectroscopy
  • biochemical e.g. determination of biochemical parameters such as relative molecular weight, N-terminal or C-terminal amino acid sequence, association and Dissociation constants of binding partners
  • biological e.g. cytotoxicity assay
  • the detection is preferably carried out using a method which enables rapid detection of PrP Sc .
  • This can be, for example, an immunological detection method, preferably a sandwich ELISA.
  • the sandwich ELISA is carried out according to a known method.
  • the labeling of the detection antibody can be, for example, an enzyme (for example horseradish peroxidase), a colored compound, a fluorescent dye (for example fluorescein), a gold particle or a nucleic acid (for example a DNA or RNA oligonucleotide).
  • the color intensity is measured photometrically after substrate conversion and is proportional to the amount of PrP Sc contained in the sample. If the antibody label is a colored compound or a fluorescent dye, the color or Fluorescence intensity measured directly. If the antibody label is a nucleic acid, the amount of bound antibody is determined via the absorption of the DNA or RNA label, the signal being amplified by PCR (eg real-time PCR).
  • the present invention further relates to a kit for the detection of PrP Sc in body fluids, cell lysates, tissue homogenates or other fluids.
  • the test kit contains a solid carrier for the enrichment of PrP Sc , an immunological detection system, solubilization, washing and elution buffer concentrates, various controls, an enzyme-labeled anti-PrP antibody and a corresponding substrate and stop solution.
  • the solid supports used are preferably affinity chromatography materials, for example Sepharose, which are used in single-use columns, or plastic surfaces, for example microtiter plates, which are coupled to the ⁇ -sheet-binding molecules according to the invention. If the solid supports are affinity-chromatographic materials with the couplings according to the invention, these can be contained in the test kit as a suspension, in dried form or already packed in disposable columns.
  • the immunological detection system is preferably a sandwich ELISA in which a second solid support, e.g. a microtiter plate is coated with a specific antibody against PrP, preferably with monoclonal anti-PrP antibodies, in particular mouse anti-PrP antibodies.
  • the solid supports are included in the test kit, especially in vacuum packaging.
  • PrP or PrP peptides are preferably used as controls.
  • Horseradish peroxidase is preferably used as the antibody label.
  • the methods and test kits according to the invention enable broad-based investigations with large numbers of samples, as are required in the fields of medicine and agriculture. Automation of the detection process is possible in appropriately equipped laboratories. In contrast to all the methods described so far, the methods according to the invention are also suitable for TSE diagnostics on live animals and humans.
  • Example 1 Isolation of PrP Sc from brain homogenate using various peptides in MTP format
  • An MTP (microtiter plate) (Nunc-Immuno TM Plate Maxisorp TM Surface, F96 (Nunc, Roskilde, Denmark)) was coated with the peptides listed in Table 1 (FIG. 2). The coating was carried out by incubation with 100 ⁇ l peptide solution (10 ⁇ g / ml in 0.1 M carbonate buffer pH 9.6) per cavity for 16 h at 4 ° C. The liquid was then suctioned off and the MTP was washed three times with 300 ⁇ l wash buffer (PBS (10 mM phosphate buffer, 0.15 M NaCl, pH 7.2); 0.05% Tween 20)) per cavity.
  • PBS 10 mM phosphate buffer, 0.15 M NaCl, pH 7.2
  • Tween 20 300 ⁇ l wash buffer
  • the absorbance measured is proportional to the amount of PrP Sc bound to the peptides and is therefore a measure of the efficiency of the capture molecule.
  • the relative binding efficiencies of the peptides tested are summarized in Tab. 1, the signal of the best ⁇ -sheet binding molecule (peptide 2) being set to 100%.
  • Peptide 2 Lys-Leu-Val-Phe-Phe 00.0 SEQ ID NO: 2
  • Peptide 7 Propionyl-D Arg-D Arg-D Ala-DPhe-DPhe-DVal-amide 76.5 SEQ ID NO: 7
  • PrP Sc The bond between PrP Sc and the capture molecules is very strong, so that for the elution of P PrrPP S cc vvoonn ddeemm ffeesstteenn TTrrääggeerr vveerrgglleeiicchhsswweeiissee ddrraassttiisschchhee. B 'CONDITIONS needed are.
  • the elution conditions were also tested in MTP format. Analogously to Example 1 a MTP with peptide 2 (KLVFF) was coated and loaded with PrP Sc -containing brain homogenate (OD in the Platelia ®> 3.0).
  • PrP Sc was only partially eluted in the presence of chaotropic reagents (eg 6 M urea). In elution buffers with low pH (eg pH 3) or high ionic strength (eg 2 M NaCl), PrP Sc remained almost completely bound to the capture molecule.
  • chaotropic reagents eg 6 M urea
  • PrP Sc remained almost completely bound to the capture molecule.
  • the peptide When coupled via amino groups, the peptide would be fixed both at the N-terminus and on the side chain (Lys), which could lead to a disruption of the three-dimensional structure. For this reason, the ⁇ -sheet-binding molecule KLVFF was specifically bound to the solid support via the carboxyl group at the C-terminus of the peptide.
  • EAH-Sepharose ® 4B (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) served as the carrier material.
  • the EAH-Sepharose was washed with 0.5 M NaCl and the supernatant liquid was completely removed.
  • the ligand the pentapeptide with the sequence KLVFF, was dissolved in HO to a final concentration of 5 mg / ml and the pH was adjusted to 4.5 with HC1.
  • the gel was resuspended in the ligand solution (1 part gel + 2 parts ligand solution) and EDC (N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) in one Final concentration of 0.1 M was added.
  • EDC N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • the KLVFF-loaded gel was filled into chromatography columns (bed volume 1 ml) and at least three times alternately with 3x 2 ml buffer A (0.1 M Na acetate, 0.5 M NaCl, pH 4) and 3x 2 ml buffer B ( 0.1 M Tris HCl, 0.5 M NaCl, pH 8) and then washed with 10 x 2 ml H 2 O.
  • 3x 2 ml buffer A 0.1 M Na acetate, 0.5 M NaCl, pH 4
  • 3x 2 ml buffer B 0.1 M Tris HCl, 0.5 M NaCl, pH 8
  • PrP Sc from brain homogenate from BSE-positive cattle was bound to the column material and then eluted again.
  • the brain material was processed using the BSE Purification Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the sample material was also taken up in sample digestion buffer R6 (Platelia ® BSE Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) (OD in Platelia ® 6.0) according to the manufacturer's instructions.
  • a dropping column was made with 1 ml of KLVFF-Sepharose, as indicated in Example 3, filled and equilibrated with PBS at room temperature.
  • FIG. 3 shows the elution profile of this experiment and documents the ability of the KLVFF-Sepharose to reversibly bind PrP Sc and thus the suitability of the matrix for the selective enrichment of PrP Sc from large sample volumes.
  • the PrP Sc contained in the run is due here to an overload of the column capacity, since the brain sample used here had a very high PrP Sc content (OD in the Platelia ® 6.0).
  • Example 5 Isolation of PrP Sc from Body Fluids Using KLVFF in MTP Format (Priontype TM In Vivo BSE Test)
  • An MTP (Nunc-Immuno TM Plate Maxisorp TM Surface, F96 (Nunc, Roskilde, Denmark) was coated with the peptide KLVFF (Fig. 2).
  • the coating was carried out by incubation with 100 ⁇ l peptide solution (10 ⁇ g / ml in 0.1 M carbonate buffer pH 9.6) per cavity for 16 h at 4 ° C.
  • the liquid was then suctioned off and the MTP was washed three times with 300 ⁇ l wash buffer (PBS; 0.05% Tween 20; pH 7.2) per cavity. Free binding sites were blocked by incubation with 0.5% casein in wash buffer at room temperature for 1 h.
  • the coated MTP was incubated with 100 ⁇ l per cavity of the sample containing PrP Sc for 1 h at room temperature covered with foil.
  • eye chamber water samples from 9 BSE-positive and 5-negative cattle as well as CSF samples from 6 BSE-positive and 13 BSE-negative cattle were examined. All samples were previously prepared using the BSE Purification Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA). Unbound sample material was aspirated and the MTP was washed three times with 300 ⁇ l wash buffer per cavity.
  • the absorbance measured is proportional to the amount of PrP c bound to the peptides.
  • the values obtained in the BSE-positive versus BSE-negative animals are significantly increased (t-test).
  • the differences between positive and negative samples are much more pronounced in the aqueous humor samples than in the cerebrospinal fluid.
  • the reason for this is the PrP Sc concentration found in the corresponding body fluids. Based on these results, the aqueous humor is preferred over the CSF as sample material for the detection of PrP Sc in body fluids from living animals.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) von lebenden Organismen.

Description

Verfahren zur Anreicherung und zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrP Sc\ )
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) von lebenden Organismen.
Transmissible Spongiforme Encephalopathien (TSE) sind beim Menschen und bei verschiedenen Tierarten auftretende, infektiöse und stets tödlich verlaufende degenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Die dabei auftretenden histopathologischen Veränderungen im Gehirn gehen einher mit der Akkumulation von pathologisch verändertem Prion-Protein (PrPSc), einem Konformer des natürlich vorkommenden zellulären Prion-Proteins (PrP ). Die im Krankheitsverlauf auftretende Prionen-Replikation erfolgt durch direkte Wechselwirkung zwischen PrPSc und PrPc, wodurch dem normalen PrPc die Konformation des pathologischen PrPSc aufgezwungen wird. PrPSc ist im Unterschied zu PrPc durch einen erhöhten ß-Faltblatt- Anteil sowie eine hohe Resistenz gegenüber Proteasen (z.B. Proteinase K) gekennzeichnet.
Diese Resistenz von PrPSc wird derzeit in der -v/tro-Diagnostik zum Nachweis der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie (BSE) genutzt. Das Prinzip der derzeitigen Testsysteme besteht darin, dass Gewebeteile des Stammhirns (Obex-Region) homogenisiert und mit Proteinase K behandelt werden. Durch die Protease-Behandlung wird das normale PrP vollständig abgebaut, während PrPSc aus BSE-infizierten Tieren lediglich um einige Aminosäuren verkürzt wird, was eine Reduktion der relativen Molekülmasse von 33-35 kDa auf 27-30 kDa zur Folge hat. Im Anschluss daran wird das verbleibende PrP mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern im Western-Blot oder ELISA- Verfahren visualisiert.
Der entscheidende Nachteil dieses Testsystems ist die geringe Sensitivität. Da die PrPSc- Konzentration bei BSE-infizierten Rindern für die gegenwärtigen Testsysteme ausschließlich im zentralen Nervensystem (ZNS) ausreichend hoch ist, beschränkt sich die bisherige Diagnostik auf post-mortem-Tests und setzt eine Inkubationszeit des infizierten Organismus von mindestens 18 Monaten bis zu mehreren Jahren voraus. Neben dem oben beschriebenen Nachweis von PrPSc gibt es zwei weitere methodische Verfahren zur Diagnostik von TSEs: die histopathologische Detektion der typischen schwammartigen Veränderungen im ZNS und ein Bioassay, welcher die Infektiösität der Proben im Mausmodell nachweist. Beide Methoden haben ebenfalls entscheidende Nachteile. Die Histopathologie ist nicht zur präklinischen Diagnostik geeignet, da die strukturellen Veränderungen im Gehirn erst zu einem späten Zeitpunkt der Inkubation, kurz vor der klinischen Phase auftreten. Zudem erfolgt die Diagnose auch hier p ost mortem, da die Entnahme des notwendigen Hirnmaterials am lebenden Organismus nicht möglich ist. Der Bioassay ist zwar theoretisch in der Lage, eine einzige infektiöse Einheit zu detektieren, dauert jedoch mindestens mehrere Monate oder auch Jahre.
Um die Diagnostik so schnell wie möglich nach einer eventuellen Infektion bzw. bereits an einem noch lebenden Organismus durchfuhren zu können, muss die Sensitivität der bisherigen Nachweisverfahren wesentlich erhöht und der Nachweis in anderen Geweben/Körperflüssigkeiten als dem ZNS ermöglicht werden.
Von Fischer et al. [Fischer, MB; Roeckl, C; Parizek, P; Schwarz, HP; Aguzzi, A (2000): Binding of disease-associated prion protein to plasminogen. Nature, 408:479-483] wurde eine Bindung des pathologischen PrPSc an humane Serumproteine, wie z.B. Plasminogen, beschrieben. Die Bindung des Prion-Proteins an Plasminogen ist abhängig von der Konformation des Proteins, da PrPc nicht gebunden werden kann. Fibrinogen ist ebenfalls in der Lage, PrPSc zu binden, jedoch nicht in Abwesenheit von Ca2+-Ionen.
Nach WO 02/00713 wird die spezifische Bindung von PrPSc an humanes Plasminogen zur Isolation von PrPSc aus ZNS-Material verwendet. Dazu wird humanes Plasminogen an magnetischen Partikeln immobilisiert. Dieses Verfahren ist jedoch nur für den Nachweis von PrPSc in solchen Körperflüssigkeiten und Geweben geeignet, die kein Plasminogen enthalten und ist z.B. für den Nachweis von PrPSς in Serum ungeeignet. Weitere Nachteile dieses Verfahrens sind der hohe Preis und die begrenzte Proteinbindungs-Kapazität der darin verwendeten Plasminogen-beladenen magnetischen Partikel.
Daher liegt der Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren bereitzustellen, das eine erhöhte Sensitivität aufweist und eine Diagnose von TSE von lebenden Organismen ermöglicht. Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
Die nachfolgenden Figuren erläutern die Erfindung.
Fig. 1 zeigt in einer graphischen Darstellung das Prinzip eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Anreicherung und zum Nachweis von PrPSc unter Verwendung von Festphasen-gekoppelten ß-Faltblatt bindenden Molekülen.
Fig. 2 zeigt schematisch den Aufbau des PrPSc-Bindungsassays im Mikrotiterplatten (MTP)- Format (Beispiel 1). Verschiedene „ß-sheet-breaker (BSB)"-Peptide wurden als potentielle ß- Faltblatt-bindende Moleküle und PrPSc-Fänger an einem Träger immobilisiert, nach Inkubation mit dem Probenmaterial wurde gebundenes PrPSc mittels monoklonaler anti-PrP-Antikörper visualisiert.
Fig. 3 zeigt in einem Elutionsprofil den PrPSc-Gehalt in den einzelnen Fraktionen nach Bindung von PrPSc aus Hirnhomogenat von BSE-positiven Rindern an KLVFF-Sepharose. Die in den Fraktionen enthaltene Menge an PrPSc wurde semiquantitativ mit Hilfe des Platelia® BSE Detection K t ermittelt und ist in OD-Werten ausgedrückt.
Fig. 4 zeigt eine Auswertung des Nachweises von PrPSc in Augenkammerwasser- und Liquor- Proben von BSE-positiven Rindern. Dabei wurde im ELISA-Format das Peptid KLVFF als Fängermolekül für PrPSc eingesetzt. Detektiert wurde mit dem gegen PrPSc gerichteten monoklonalen Antikörper V5B2 (r-Biopharm, Darmstadt) und einem polyklonalen Peroxidase- konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper.
Der Begriff "ß-Faltblatt-bindendes Molekül", wie hier verwendet, beschreibt ein organisches Molekül, welches aufgrund seiner dreidimensionalen Struktur und/oder seiner physikalischen Eigenschaften in der Lage ist, in Wechselwirkungen mit ß-Faltblatt-Strukturen in Proteinen, z.B. in pathologisch veränderten monomeren/oligomeren Prion-Proteinen, zu treten und diese aufgrund der Wechselwirkungen zu binden. Beispielhafte ß-Faltblatt-bindende Moleküle sind in SEQ ID NO: 1 bis 10 aufgeführt. Der Begriff „ß-sheet-breaker (BSB)", wie hier verwendet, beschreibt kurze Peptide, die an ß- Faltblatt-Strukturen von ß-Amyloid (Proteinaggregate bei der Alzheimerschen Erkrankung) und Amyloid-ähnlichen Strukturen nicht nur binden, sondern darüber hinaus deren abnormale Faltung blockieren bzw. rückgängig machen können.
Der Begriff "pathologisch verändertes Prion-Protein", wie hier verwendet, bezeichnet PrPSc. PrPSc kann sowohl in monomerer und oder oligomerer Form als auch in fibrillärer, amyloider Aggregatform vorliegen.
Als „BSE-positive Rinder" werden hier solche Tiere bezeichnet, in deren Stammhirn-Gewebe post mortem Proteinase K-resistentes PrPSc nachgewiesen werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc), umfassend die folgenden Schritte: a) Inkubieren einer Probe mit einem festen Träger, wobei der feste Träger mit einem ß- Faltblatt-bindenden Molekül gekoppelt ist, b) Entfernen der nicht an den ß -Faltblatt-bindenden Molekülen gebundenen Probenbestandteile, und c) Nachweis der an den ß-Faltblatt-bindenden Molekülen gebundenen pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc).
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die in Körperflüssigkeiten, Zelllysaten oder Körpergeweben enthaltenen monomeren und/oder oligomeren pathologisch veränderten Prion-Proteine angereichert, so dass selbst geringste bisher nicht nachweisbare Konzentrationen an PrPSc nachgewiesen werden können. Dadurch ist es möglich, lebende Tiere oder Menschen bereits kurz nach der Infektion mit TSE-auslösenden Prionen als infiziert zu klassifizieren. Dies war bisher nicht möglich, da derart sensitive Tests nicht zur Verfügung standen und darüber tiinaus die Nachweise nur post mortem aus Hirngewebe durchgeführt werden konnten, da dort die Konzentration von PrPSc hoch genug ist. Ferner können mit dem Verfahren aufgrund der lohen Sensitivität bereits zu einem wesentlich früheren Zeitpunkt nach einer Infektion Ergebnisse auch in den Körpergeweben, z.B. Hirnhomogenaten, liefern, die mit den gegenwärtigen Nachweisverfahren erst dann Ergebnisse zeigen, wenn die Infektion bereits leutlich fortgeschritten ist. Die zu untersuchende Probe kann eine Körperflüssigkeit, z.B. Blut, Serum, Plasma, Liquor, Augenkammerwasser, Tränenflüssigkeit, Urin, Speichel, Lymphe, Milch, oder ein Zell-Lysat, z.B. aus Leukozyten oder von Zellen der lymphatischen Gewebe, oder ein Gewebehomogenat, z.B. von Geweben des zentralen Nervensystems, von Lymphgewebe (z.B. Milz, Tonsillen, Lymphknoten) oder anderen Organen sein.
Vor der Inkubation kann die Probe gegebenenfalls einer Probenvorbereitung unterzogen werden. Dies kann insbesondere für Gewebeproben erforderlich sein. Diese können nach Zugabe einer geeigneten Puffer-Lösung, z.B. 50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,5, mechanisch zerkleinert, z.B. durch Ultraschall- oder Ribolyser-Behandlungen, und homogenisiert werden, um deren Bestandteile in Lösung bzw. Suspension zu bekommen. Zur Abtrennung der durch die mechanischen Behandlung der Gewebe oder Zellsuspensionen erhaltenen oder der in Körperflüssigkeiten vorhandenen festen Bestandteile kann die Probe ferner einem Zentrifugations- und/oder Filtrationsschritt unterzogen werden.
Gegebenenfalls kann die Probe mit oder ohne vorstehend beschriebene Probenvorbereitung vor der Inkubation zusätzlich oder ausschließlich einer Proteinase-Behandlung zum proteolytischen Abbau von PrPc unterzogen werden. Dies ist vor allem dann angezeigt, wenn das nachzuweisende PrPSc, z.B. die monomere und oder oligomere Form von PrPSc, mit solchen Antikörpern nachgewiesen werden, die PrPSc von PrPc erst nach einer Proteinase-Behandlung unterscheiden können. Dazu wird das Probenmaterial mit einer Protease, z.B. Proteinase K, behandelt. Der Protease- Verdau kann bei Standardbedingungen für die jeweilige Protease oder nach Angaben des Herstellers, vorzugsweise bei 37 °C für 1 h durchgeführt werden. Die verwendete Enzymkonzentration kann je nach Probenmaterial im Bereich von etwa 10 μg/ml bis etwa 1 mg/ml liegen, vorzugsweise werden etwa 50 μg/ml Enzym bei einem Proteingehalt des Probenmaterials von etwa 0,5 bis etwa 10 mg/ml verwendet.
Feste Träger können sphärische Polymere (z.B. Sepharose, Agarose oder Latex), Plastik- Oberflächen (z.B. Mikrotiterplatten), Kieselgel-beschichtete Glasplatten (z.B. für Dünnschichtchromatographie), Kapillaren oder Membranen sein. Die sphärischen Polymere können als Träger in einer Säulen-Chromatographie oder im Batch- Verfahren (z.B. Magnetic Beads) verwendet werden. Werden die Polymere zur Säulen-Chromatographie eingesetzt, verden sie vorzugsweise in vorgepackten Einweg-Säulen verwendet. Neben den hier aufgeführten festen Trägern ist ferner jeder feste Träger geeignet, der zur Kopplung von ß- Faltblatt-bindenden Molekülen verwendet werden kann.
Die Probe kann in einem geschlossenen Gefäß für etwa 5 bis etwa 120 min bei einer Temperatur im Bereich von etwa 4 °C bis etwa 50 °C mit dem festen Träger, z.B. Glasplatten, Mikrotiterplatten, inkubiert werden. Vorzugsweise erfolgt die Inkubation bei 37 °C für 1 h in einem Schüttelinkubator mit niedriger Rotationsfrequenz (z.B. 80 rpm). Durch die Inkubation der Probe mit dem festen Träger wird das in der Probe enthaltene PrPSc an das an dem festen Träger immobilisierte ß-Faltblatt-bindende Molekül gebunden. Wird als fester Träger z.B. ein sphärisches Polymer in einer Säulen-Chromatographie verwendet, findet die Inkubation in der Säule statt. Je nach Säule kann die Inkubationszeit variieren, abhängig vom Anschluss der Säule an eine Apparatur und der Durchflussgeschwindigkeit der Probe.
Die an den festen Träger gekoppelten ß -Faltblatt-bindenden Moleküle binden PrPSo mit wesentlich höherer Affinität als PrPc und sind erfϊndungsgemäß in der Lage, die in Körperflüssigkeiten vorkommende, lösliche und monomere bzw. oligomere Form von PrPSc einzufangen. Erfindungsgemäß sind die ß -Faltblatt-bindenden Moleküle Oligopeptide bestehend aus 3 bis etwa 30 Aminosäuren, vorzugsweise 4, 5 oder 6 Aminosäuren. Diese Peptide können C- und/oder N-terminal modifiziert sein, z.B. um eine bessere Löslichkeit zu erreichen. Die ß- Faltblatt-bindenden Moleküle können neben ihrer Eigenschaft der Bindung von PrPSc auch die Eigenschaften der ß-sheet-breaker besitzen. Über die BSB-Eigenschaften hinaus weisen die ß- Faltblatt-bindenden Moleküle erfindungsgemäß jedoch solche Bindungseigenschaften (Affinität, Reversibilität der Bindung) zum PrPSc auf, die das Einfangen und Anreichern von PrPSc aus Lösungen ermöglichen. BSB-Peptide, welche die ß-Faltblatt-Strukturen zu fest bzw. irreversibel binden, so dass eine Elution nicht möglich ist, sind als ß-Faltblatt-bindende Moleküle ungeeignet. Ebenso ungeeignet sind BSB, welche PrPSc mit zu geringer Affinität oder nicht dauerhaft binden (z.B. Ablösen des PrPSc vom BSB nach erfolgtem Aufbrechen der ß-Faltblatt- Struktur). Insbesondere bevorzugte ß-Faltblatt-bindende Moleküle sind in Tab. 1 und als SEQ ID NO: 1 bis 10 aufgeführt. Das ß-Faltblatt-bindende Molekül kann ebenfalls ein substituierter heterocyclischer Aromat sein, vorteilhaft ein Flavonoid, beispielsweise Thioflavin T, Baicalin oder Quercitrin.
Die Immobilisierung der ß -Faltblatt-bindenden Moleküle an den festen Träger erfolgt vorzugsweise über eine kovalente Bindung. Zur Kopplung an den Träger werden funktionelle Gruppen, wie z.B. Amino-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen, am ß -Faltblatt-bindenden Molekül genutzt. Ist das ß-Faltblatt-bindende Molekül ein Peptid, erfolgt die Kopplung vorzugsweise über die Amino-Gruppe am N-Terminus oder die Carboxyl-Gruppe am C- Terminus. Ist das Oligopeptid das Pentapeptid mit der Sequenz KLVFF (SEQ ID NO:2), wird vorzugsweise über die Carboxyl-Gruppe am C-Terminus gekoppelt, da bei einer Kopplung über die Amino-Gruppe das Peptid auch an der Seitenkette des Lysin-Restes fixiert werden würde, was zur sterischen Behinderung der PrPSc-Bindung führen könnte.
Im Anschluss an die Inkubation der Probe mit dem festen Träger erfolgt das Entfernen der nicht am ß -Faltblatt-bindenden Molekül gebundenen Probenbestandteile, vorzugsweise durch einen Waschschritt. Als Waschlösung dient eine gepufferte Lösung mit geeigneten, Stringenz- erhöhenden Zusätzen. Der pH-Wert der Waschlösung liegt im neutralen Bereich, vorzugsweise bei pH 7,5. Zum Puffern der Lösung dient vorzugsweise 50 mM Phosphatpuffer. Darüber hinaus ist jeder Puffer geeignet, mit dem ein pH- Wert im neutralen Bereich eingestellt werden kann. Die Stringenz-erhöhenden Zusätze können anorganische Salze, z.B. NaCl, sowie Detergenzien, z.B. SDS, Triton X 100 oder Tween 20, oder chaotrope Reagenzien, z.B. Harnstoff, Guanidinium-Hydrochlorid oder Guanidinium-Isothiocyanat, sein. Vorteilhaft wird eine gepufferte Lösung mit 1 bis 4 M NaCl als Waschlösung eingesetzt.
In Abhängigkeit von der Beschaffenheit des Trägermaterials wird das an die ß-Faltblatt- bindenden Moleküle gebundene PrPSc gegebenenfalls von dem festen Träger eluiert (z.B. bei Einsatz von sphärischen Polymeren in der Säulen-Chromatographie). Bei anderen Trägern, z.B. Membranen oder Plastikoberflächen, kann der Nachweis von PrPSc direkt an dem festen Träger erfolgen. Falls gewünscht, kann jedoch auch hier eluiert werden.
Zur Elution von PrPSc vom ß -Faltblatt-bindenden Molekül und damit von dem festen Träger wird der Träger mit einem möglichst kleinen Volumen Elutionslösung gespült. Um einen für die Sensitivität des verwendeten Nachweissystems ausreichenden Konzentrierungseffekt zu erzielen, ist das Elutionsvolumen um ein Vielfaches kleiner als das Probenvolumen.
Als Elutionslösung wird eine gepufferte Lösung verwendet, Zusätze enthaltend, welche die Bindung zwischen PrPSc und dem Fänger-Molekül lösen. Der pH- Wert der Elutionslösung liegt im Bereich von etwa pH 6 bis etwa pH 8,5, vorzugsweise bei pH 7,5. Zum Puffern der Lösung dient vorzugsweise 50 mM Phosphatpuffer. Darüber hinaus ist jeder Puffer geeignet, mit dem ein pH-Wert im vorstehend beschriebenen, vorzugsweise im neutralen Bereich, eingestellt werden kann. Die Zusätze können beispielsweise Detergenzien, z.B. SDS, Triton X 100 oder Tween 20, chaotrope Reagenzien, z.B. Harnstoff, Guanidinium-Hydrochlorid oder Guanidinium- Isothiocyanat, anorganische Salze, z.B. NaCl, sein. Vorzugsweise enthält die Elutionslösung Detergenzien, beispielsweise 5 % SDS.
Anschließend wird das in den vorhergehenden Verfahrensschritten angereicherte PrPSc nachgewiesen. Dazu können immunchemische (z.B. ELISA, Western Blot, Immunpräzipitation), biophysikalische (z.B. Massenspektrometrie, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie), biochemische (z.B. Bestimmung biochemischer Parameter, wie z.B. relative Molmasse, N- terminale bzw. C-terminale Aminosäuresequenz, Assoziations- und Dissoziationskonstanten von Bindungspartnern) oder biologische (z.B. Cytotoxizitätsassay) Nachweisverfahren zum Einsatz kommen.
Vorzugsweise wird der Nachweis mit einem Verfahren durchgeführt, das eine schnelle Detektion von PrPSc ermöglicht. Das kann z.B. ein immunologisches Nachweisverfahren, vorzugsweise ein Sandwich-ELISA, sein. Der Sandwich-ELISA wird nach bekanntem Verfahren durchgeführt. Dabei kann die Markierung des Detektions- Antikörpers z.B. ein Enzym (z.B. Meerrettich- Peroxidase), eine gefärbte Verbindung, ein Fluoreszenzfarbstoff (z.B. Fluorescein), ein Goldpartikel oder eine Nukleinsäure (z.B. ein DNA- oder RNA-Oligonucleotid) sein.
Bei einer Enzym-Markierung wird die Farbintensität nach Substratumsetzung photometrisch erfasst und ist der in der Probe enthaltenen PrPSc-Menge proportional. Ist die Antikörpermarkierung eine gefärbte Verbindung oder ein Fluoreszenzfarbstoff, wird die Farbbzw. Fluoreszenzintensität direkt gemessen. Ist die Antikörpermarkierung eine Nukleinsäure, wird die Menge an gebundenem Antikörper über die Absorption des DNA- bzw. RNA-Labels bestimmt, wobei das Signal durch PCR (z.B. real-time-PCR) amplifiziert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Kit zum Nachweis von PrPSc in Körperflüssigkeiten, Zell-Lysaten, Gewebehomogenaten oder anderen Flüssigkeiten. Erfindungsgemäß enthält das Test-Kit einen festen Träger zur Anreicherung von PrPSc, ein immunologisches Nachweissystem, Solubilisierungs-, Wasch- und Elutionspufferkonzentrate, verschiedene Kontrollen, einen Enzym-markierten anti-PrP-Antikörper sowie eine entsprechende Substrat- und Stopplösung. Die verwendeten festen Träger sind vorzugsweise affmitätschromatographische Materialien, z.B. Sepharose, die in Einwegsäulen verwendet werden, oder Plasikoberflächen, z.B. Mikrotiterplatten, die mit den erfindungsgemäßen ß -Faltblatt-bindenden Molekülen gekoppelt sind. Sind die festen Träger affmitätschromatographische Materialien mit den erfindungsgemäßen Kopplungen, können diese als Suspension, in getrockneter Form oder bereits in Einweg-Säulen gepackt im Test-Kit enthalten sein.
Das immunologische Nachweissystem ist vorzugsweise ein Sandwich-ELISA, bei dem ein zweiter fester Träger, z.B. eine Mikrotiterplatte mit einem spezifischen Antikörper gegen PrP, vorzugsweise mit monoklonalen anti-PrP-Antikörpern, insbesondere Maus-anti-PrP- Antikörpern, beschichtet ist. Die festen Träger liegen dem Test-Kit insbesondere vakuumverpackt bei.
Als Kontrollen werden vorzugsweise rekombinant hergestelltes PrP bzw. PrP-Peptide verwendet. Als Antikörper-Markierung wird vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase verwendet.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Test-Kits ermöglichen breit angelegte Untersuchungen mit hohen Probenzahlen, wie sie in den Bereichen Medizin und Landwirtschaft gefordert werden. Eine Automatisierung des Nachweisverfahrens ist in entsprechend ausgestatteten Labors möglich. Im Unterschied zu allen bisher beschriebenen Verfahren sind die erfindungsgemäßen Verfahren auch für die TSE-Diagnostik an lebenden Tieren und Menschen geeignet.
Anhand der nachfolgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert:
Beispiel 1 : Isolierung von PrPSc aus Hirnhomogenat mittels verschiedener Peptide im MTP- Format
Eine MTP (Mikrotiterplatte) (Nunc-Immuno™ Plate Maxisorp™ Surface, F96 (Nunc, Roskilde, Dänemark)), wurde mit den in Tabelle 1 aufgeführten Peptiden beschichtet (Fig. 2). Die Beschichtung erfolgte durch Inkubation mit 100 μl Peptidlösung (10 μg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,6) pro Kavität für 16 h bei 4 °C. Anschließend wurde die Flüssigkeit abgesaugt und die MTP dreimal mit 300 μl Waschpuffer (PBS (10 mM Phosphat-Puffer, 0,15 M NaCl, pH 7,2); 0,05 % Tween 20)) pro Kavität gewaschen. Freie Bindungsplätze wurden durch Inkubation mit 0,5 % Casein in Waschpuffer bei Raumtemperatur für 1 h blockiert. Nach einem Waschschritt (dreimal 300 μl Waschpuffer pro Kavität) wurde die beschichtete MTP mit 100 μl pro Kavität einer PrPSc-haltigen Probe (Hirnhomogenat von einem BSE-positiven Rind, welches im Platelia® eine OD > 4,0 ergab, der positive Befund wurde durch immunhistologische Untersuchung des Hirngewebes bestätigt) für 1 h bei 37 °C mit Folie abgedeckt inkubiert. Nicht gebundenes Probenmaterial wurde abgesaugt und die MTP dreimal mit 300 μl Waschpuffer pro Kavität gewaschen. Die Inkubation mit dem Detektions-Antikörper (Platelia® BSE Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur nach Vorschrift des Herstellers. Überschüssiger Detektions-Antikörper wurde durch fünfmaliges Waschen mit 300 μl Waschpuffer pro Kavität entfernt. Nach Zugabe der Substratlösung (Tetramethylbenzidin [TMB], Platelia® BSE Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) wurde die Farbentwicklung nach 30 min durch Zusatz von 1 M H SO4 abgestoppt und die Farbintensität durch Extinktions-Messung bei 450 ran (Referenz 620 ran) registriert.
Die gemessene Extinktion ist der an den Peptiden gebundenen Menge an PrPSc proportional und somit ein Maß für die Effizienz des Fänger-Moleküls. Die relativen Bindungseffizienzen der getesteten Peptide sind in Tab. 1 zusammengefasst, wobei das Signal des besten ß-Faltblatt- bindenden Moleküls (Peptid 2) gleich 100 % gesetzt wurde.
Tab. 1: Vergleich der PrPSc-Bindungseffϊzienz verschiedener Peptide
Nr. Sequenz Effizienz
Peptid 1 Arg-Val-Val-Ile-Ala 54,7 SEQ ID NO: 1
Peptid 2 Lys-Leu-Val-Phe-Phe 00,0 SEQ ID NO: 2
Peptid 3 Leu-Pro-Phe-Phe-Asp 46,6 SEQ ID NO: 3
Peptid 4 Propionyl-Ile-Ile-Gly-Leu 55,1 SEQ ID NO: 4
Peptid 5 Propionyl-Arg-Ile-Ile-Gly-Leu 58,1 SEQ ID NO: 5
Peptid 6 Gly-Val-Val-Ile-Ala 64,5 SEQ ID NO: 6
Peptid 7 Propionyl-D Arg-D Arg-D Ala-DPhe-DPhe-DVal-amid 76,5 SEQ ID NO: 7
Beispiel 2: Elution des an KLVFF gebundenen PrPSc im MTP-Format
Die Bindung zwischen PrPSc und den Fänger-Molekülen ist sehr stark, so dass zur Elution von P PrrPPS cc vvoonn ddeemm ffeesstteenn TTrrääggeerr vveerrgglleeiicchhsswweeiissee ddrraassttiisscchhee . B ' edingungen nötig sind. Die Elutionsbedingungen wurden ebenfalls im MTP-Format getestet. Analog Beispiel 1 wurde eine MTP mit Peptid 2 (KLVFF) beschichtet und mit PrPSc-haltigem Hirnhomogenat (OD im Platelia® > 3,0) beladen. Nach dreimaligem Waschen mit 300 μl Waschpuffer (PBS; 0,05 % Tween 20) pro Kavität wurden jeweils 100 μl der potentiellen Elutionspuffer (siehe Tabelle 2) zugegeben und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit abgenommen und die eluierte Menge PrPSc im Elutionspuffer sowie die verbleibende Menge PrPSc an der MTP mit Hilfe des Platelia® BSE Detection Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) bestimmt. Beim Vergleich der Elutionseffizienzen (Tabelle 2) erwies sich lediglich ein Detergenz-haltiger Puffer (mit 5 % SDS) als geeignet, PrPSc vollständig vom Fänger-Molekül zu eluieren. In Anwesenheit von chaotropen Reagenzien (z.B. 6 M Harnstoff) wurde PrPSc nur teilweise eluiert. In Elutionspuffern mit niedrigem pH-Wert (z.B. pH 3) bzw. hoher Ionenstärke (z.B. 2 M NaCl) blieb PrPSc nahezu vollständig am Fänger-Molekül gebunden.
Tab. 2: Vergleich verschiedener Elutionsbedingungen
Eluent Pufferzusammensetzung Elutionseffizienz
A 2 M NaCl 20 mM Phosphatpuffer, 2 M NaCl, pH 7,4 +[-
B pH 3 100 mM Glycin/HCl-Puffer, pH 3,0 +/-
C 6 M Harnstoff 20 mM Phosphatpuffer, 6 M Harnstoff, pH 7,4 +
D 5 % SDS 20 mM Phosphatpuffer, 5 % SDS, pH 7,4 +++
Beispiel 3: Kovalente Kopplung des Peptids KLVFF an EAH-Sepharose
Bei einer Kopplung über Amino-Gruppen würde das Peptid sowohl am N-Terminus als auch an der Seitenkette (Lys) fixiert werden, was zur Störung der dreidimensionalen Struktur führen könnte. Aus diesem Grund erfolgte die spezifische Bindung des ß -Faltblatt-bindenden Moleküls KLVFF an den festen Träger über die Carboxyl-Gruppe am C-Terminus des Peptids. Als Trägermaterial diente EAH-Sepharose® 4B (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden).
Zur Vorbereitung der Kopplungsreaktion wurde die EAH-Sepharose mit 0,5 M NaCl gewaschen und überstehende Flüssigkeit vollständig entfernt. Der Ligand, das Pentapeptid mit der Sequenz KLVFF, wurde in H O zu einer Endkonzentration von 5 mg/ml gelöst und der pH- ert mit HC1 auf 4,5 eingestellt. Das Gel wurde in der Ligand-Lösung (1 Teil Gel + 2 Teile Ligandlösung) resuspendiert und EDC (N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid) in einer Endkonzentration von 0,1 M zugegeben. Die Kopplungsreaktion erfolgte bei Raumtemperatur über 24 h unter leichtem Schwenken. Anschließend wurde der Überstand des abgesetzten Gels vollständig abgenommen. Gegebenenfalls vorhandene freie Bindungsplätze wurden nach Empfehlung des Herstellers mit 1 M Essigsäure in Anwesenheit von 0,1 M EDC blockiert. Das KLVFF-beladene Gel wurde in Chromatographiesäulen (Bettvolumen 1 ml) gefüllt und mindestens dreimal abwechselnd mit je 3x 2 ml Puffer A (0,1 M Na-Acetat, 0,5 M NaCl, pH 4) und 3x 2 ml Puffer B (0,1 M Tris HCl, 0,5 M NaCl, pH 8) und anschließend mit lOx 2 ml H2O gewaschen.
Beispiel 4: Isolierung von PrPSc aus Hirnhomogenat mittels KLVFF-Sepharose
Zum Nachweis der Eignung der KLVFF-Sepharose als ß -Faltblatt-bindendes Molekül wurde PrPSc aus Hirnhomogenat von BSE-positiven Rindern an das Säulenmaterial gebunden und anschließend wieder eluiert. Die Aufarbeitung des Hirnmaterials erfolgte mit dem BSE Purification Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) nach Angaben des Herstellers. Das Probenmaterial wurde ebenfalls nach Herstelleranleitung in Probenverdürmungspuffer R6 (Platelia® BSE Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) (OD im Platelia® 6,0) aufgenommen. Eine Tropfsäule wurde mit 1ml KLVFF-Sepharose hergestellt, wie in Beispiel 3 angegeben, gefüllt und mit PBS bei Raumtemperatur äquilibriert. Nach Probenauftragung (250 μl) wurde die Säule mit 2 ml PBS gewaschen und der Durchlauf fraktioniert gesammelt. Gebundenes PrPSc wurde anschließend mit 1,5 ml 5 % SDS in PBS fraktioniert eluiert. Die in den einzelnen Fraktionen enthaltene Menge an PrPSc wurde immunologisch mit Hilfe des Platelia® BSE Detection Kit ermittelt. Fig. 3 zeigt das Elutionsprofil dieses Experimentes und dokumentiert die Fähigkeit der KLVFF-Sepharose zur reversiblen Bindung von PrPSc und damit der Eignung der Matrix zur selektiven Anreicherung von PrPSc aus großen Probenvolumina. Das im Durchlauf enthaltene PrPSc ist hier auf eine Überladung der Säulenkapazität zurückzuführen, da die hier verwendete Hirnprobe einen sehr hohen PrPSc-Gehalt (OD im Platelia® 6,0) aufwies. Das im Eluat erhaltene Signal wird durch den im ELISA störenden Einfluss des SDS im Elutionspuffer verringert. Beispiel 5: Isolierung von PrPSc aus Körperflüssigkeiten mittels KLVFF im MTP-Format (Priontype™ In-vivo-BSE-Test)
Eine MTP (Nunc-Immuno™ Plate Maxisorp™ Surface, F96 (Nunc, Roskilde, Dänemark)), wurde mit dem Peptid KLVFF beschichtet (Fig. 2). Die Beschichtung erfolgte durch Inkubation mit 100 μl Peptidlösung (10 μg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,6) pro Kavität für 16 h bei 4 °C. Anschließend wurde die Flüssigkeit abgesaugt und die MTP dreimal mit 300 μl Waschpuffer (PBS; 0,05 % Tween 20; pH 7,2) pro Kavität gewaschen. Freie Bindungsplätze wurden durch Inkubation mit 0,5 % Casein in Waschpuffer bei Raumtemperatur für 1 h blockiert. Nach einem Waschschritt (dreimal 300 μl Waschpuffer pro Kavität) wurde die beschichtete MTP mit 100 μl pro Kavität der PrPSc-haltigen Probe für 1 h bei Raumtemperatur mit Folie abgedeckt inkubiert. In diesem Experiment wurden Augenkammerwasserproben von 9 BSE-positiven und 5 -negativen Rindern sowie Liquor-Proben von 6 BSE-positiven und 13 BSE-negativen Rindern untersucht. Alle Proben wurden zuvor mit dem BSE Purification Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) aufbereitet. Nicht gebundenes Probenmaterial wurde abgesaugt und die MTP dreimal mit 300 μl Waschpuffer pro Kavität gewaschen. Die Inkubation mit dem Detektions-Antikörper (5 μg/ml V5B2 in Waschpuffer, r-Biopharm, Darmstadt) erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die Platte wieder dreimal mit 300 μl Waschpuffer gewaschen und für 1 h bei Raumtemperatur mit einem Ziege-anti-Maus IgG- Peroxidasekonjugat (1:20000 in Waschpuffer, Jackson, USA) inkubiert. Überschüssiges Konjugat wurde durch fünfmaliges Waschen mit 300 μl Waschpuffer pro Kavität entfernt. Nach Zugabe der Substratlösung (TMB) wurde die Farbentwicklung nach 15 min durch Zusatz von 1 M H2SO4 abgestoppt und die Farbintensität durch Extinktions-Messung bei 450 nm (Referenz 620 nm) registriert. Die gemessene Extinktion ist der an die Peptide gebundenen Menge an PrP c proportional. Wie aus der Fig. 4 hervorgeht, sind die erhaltenen Werte bei den BSE-positiven gegenüber BSE-negativen Tieren signifikant (t-Test) erhöht. Die Unterschiede zwischen positiven und negativen Proben sind in den Augenkammerwasser-Proben wesentlich stärker ausgeprägt als im Liquor. Ursache dafür ist die in den entsprechenden Körperflüssigkeiten vorkommende PrPSc-Konzentration. Aufgrund dieser Ergebnisse ist das Augenkammerwasser gegenüber dem Liquor als Probenmaterial zum Nachweis von PrPSc in Körperflüssigkeiten vom lebenden Tier zu bevorzugen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc), umfassend die Schritte, a) Inkubieren einer Probe mit einem festen Träger, wobei der feste Träger mit einem ß- Faltblatt-bindenden Molekül gekoppelt ist, b) Entfernen der nicht an den ß-Faltblatt-bindenden Molekülen gebundenen Probenbestandteile, und c) Nachweis der an den ß-Faltblatt-bindenden Molekülen gebundenen Probenbestandteile.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe vor Schritt a) einer Proteinase-Behandlung unterzogen wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der feste Träger ein sphärisches Polymer, eine Plastik-Oberfläche, Kieselgel-beschichtete Glasplatte, Kapillare oder Membran ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die ß-Faltblatt-bindenden Moleküle Oligopeptide mit einer Länge von drei bis 30 Aminosäureresten oder substituierte heterocyclische Aromaten sind.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Oligopeptide eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:l bis 10 aufweisen.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Nachweis mittels eines immunologischen Nachweisverfahrens durchgeführt wird.
7. Kit zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc), umfassend mindestens einen festen Träger gekoppelt mit ß-Faltblatt-bindenden Molekülen, Wasch- und Elutionslösungen und einem Nachweissystem.
8. Kit nach Anspruch 7, wobei das Nachweissystem ein immunologisches Nachweissystem ist und einen zweiten festen Träger, der mit einem anti-PrP-Antikörper beschichtet ist, einen Enzym-markierten Zweit- Antikörper und Substrat- und Stopplösungen umfasst.
9. Kit nach Anspruch 7 oder 8, wobei ein fester Träger in einer Einwegsäule gepackt ist und der zweite feste Träger eine Mikrotiterplatte ist.
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