DE60123752T2

DE60123752T2 - Diagnose von tauopathien durch bestimmung des verhältnisses von tau/phospho-tau

Info

Publication number: DE60123752T2
Application number: DE60123752T
Authority: DE
Inventors: Eugeen Vanmechelen; Hugo Vanderstichele
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 2000-01-24
Filing date: 2001-01-18
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2021-01-19
Also published as: EP1250600A2; HK1048513B; ATE342509T1; DK1250600T3; ES2274869T3; CA2397991C; JP5247963B2; JP2003521499A; US7387879B2; EP1250600B1; CA2397991A1; HK1048513A1; DE60123752D1; AU3731901A; US6680173B2; BR0107851A; AU777837B2; DE1250600T1; US20030194742A1; US20040091942A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose von Tauopathien. Die vorliegende Erfindung sieht ein neues Verfahren für den Nachweis und/oder die differentielle Diagnose von Tauopathien vor. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Phospho-Peptid bereit, welches für die Standardisierung in einem Verfahren der Erfindung verwendet werden kann.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mehrere Formen von Demenz, die sogenannten Tauopathien (Goedert et al., 1998) sind mit dem gleichen pathophysiologischen Mechanismus assoziiert worden, der Beteiligung des Strukturproteins tau. Das Microtubulus-assoziierte Protein tau ist zum Beispiel eine Hauptproteinkomponente von gepaarten helikalen Filamenten (PHF) und neurofibrillären Tangles bzw. Verflechtungen (NFT), welche mit Morbus Alzheimer assoziiert sind (Brion et al., 1985; Delacourte und Defossez, 1986; Grundke-Iqbal et al., 1986; Kosik et al., 1986; Wood et al., 1986; Kondo et al., 1988). Das tau-Protein existiert in unterschiedlichen Isoformen, von welchen 4 bis 6 im adulten Gehirn gefunden werden, aber nur 1 Isoform im fötalen Gehirn gefunden wird. Die Diversität der Isoformen wird von einem einzelnen Gen auf dem menschlichen Chromosom 17 durch alternatives mRNA-Spleissen erzeugt (Himmler, 1989; Goedert et al., 1989; Andreadis et al., 1992). Das erstaunlichste Merkmal des tau-Proteins, wie abgeleitet aus der molekularen Klonierung, ist ein Abschnitt von 31 oder 32 Aminosäuren, welcher im carboxyterminalen Teil des Moleküls vorkommt, der entweder 3- oder 4-mal wiederholt sein kann. Zusätzliche Diversität wird erzeugt durch 29 oder 58 Aminosäuren lange Insertionen im NH₂-terminalen Teil von tau-Molekülen (Goedert et al., 1989). In vivo fördert tau Microtubuli-Zusammenbau und -Stabilität im axonalen Kompartiment von Neuronen durch Interaktionen unter Beteiligung seiner Microtubulus-bindenden Domäne, welche in der Repeat-Region von tau (255-381) lokalisiert ist (Lewis et al., 1988). Unter normalen Umständen enthält erwachsenes Gehirn 2-3 Mol Phosphat pro Mol tau (Selden und Pollard, 1983; Ksiezak-Reding et al., 1992). Phosphorylierung von unterschiedlichen Stellen in normalem tau, wie untersucht in Ratten und Menschen, ist abhängig vom Entwicklungs-Zustand (Lee et al., 1991; Bramblett et al., 1993; Goedert et al., 1993). tau-Varianten von 60, 64 und 68 kDa, welche als eine Konsequenz von Phosphorylierung entstehen, sind in Hirnarealen nachgewiesen worden, welche neurofibrilläre Tangles aufzeigen (Delacourte et al., 1990; Goedert et al., 1992; Flament et al., 1990; Greenberg und Davies, 1990). Diese Gehirne enthalten 6-8 Mol Phosphat pro Mol tau (Ksiezak-Reding et al., 1992). In tau, welches aus PHF isoliert wurde (PHF-tau), findet Phosphorylierung an mehreren Positionen statt (Iqbal et al., 1989; Lee et al., 1991; Hasegawa et al., 1992; Hanger et al., 1998; Buee et al., 1999).
Die Alzheimer-Krankheit bzw. Morbus Alzheimer (AD) ist der häufigste Typ von primärer degenerativer Demenz, welche mit einer tau-Pathologie assoziiert ist, aufweisend eine Häufigkeit von 42-75 % (Brun, 1993; Gustafson, 1993; Ebly et al., 1994). Frontotemporale Demenz (FTD) ist ein klinischer Zustand, bei welchem in pathologischer Weise Morbus Pick, frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus in Verbindung mit dem bzw. gekoppelt an das Chromosom 17, sporadische FTD und Motorneuronen-Erkrankung vorhanden sind. Gemäß einer kleinen Untersuchung durch Mann et al. (2000) konnten 16 der 37 Fälle mit FTD als Tauopathie klassifiziert werden, basierend auf tau-Immunhistochemie. Filemantöse tau-Pathologie, d. h. neurofibrilläre Tangles (NFT) werden konsistent bei AD gefunden (Tomlinson und Corsellis, 1984), aber können auch bei FTD gefunden werden (Spillantini und Goedert, 1998). Pathologische tau-Proteine werden sowohl in AD als auch FTD gefunden (Vermersch et al., 1995; Delacourte et al., 1996), allerdings haben Untersuchungen an Hirngewebe nahe gelegt, dass die tau-Pathologie sich zwischen AD und FTD unterscheidet, was möglicherweise mit dem Grad der Phosphorylierung zusammenhängt (Delacourte et al., 1996). Andere Formen von Demenz, assoziiert mit einer tau-Pathologie, schließen progressive supranukleäre Lähmung (PSP), corticobasale Degeneration (CBD) und subakute sklerosierende Panenzephalitis ein. Die Rolle von Hyperphosphorylierung in der Pathologie dieser Tauopathien ist derzeitig nicht gut verstanden. Darüber hinaus ist es zu verschiedenen Schwierigkeiten bei der exakten Bestimmung des Grads an Phosphorylierung von spezifischen Phospho-Stellen, welche in der Prolin-Region konzentriert sind, gekommen. Wegen dieser Schwierigkeiten fehlt immer noch ein exaktes Verfahren für den spezifischen Nachweis dieser Tauopathien.
ZIELE DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Diagnose einer Tauopathie in einem Individuum bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Diagnose von Morbus Alzheimer, Morbus Pick, sporadischer Frontotemporal-Demenz und/oder frontotemporaler Demenz mit Parkinsonismus, gekoppelt an Chromosom 17, in einer Person bereitzustellen.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die differentielle Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie bereitzustellen.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die differentielle Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie-Neurodegeneration bereitzustellen.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die differentielle Diagnose einer Tauopathie gegenüber vaskulärer Demenz, Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, Schlaganfall und/oder Neurotoxizität in Patienten mit Leukämie bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die differentielle Diagnose von Morbus Alzheimer, Morbus Pick, sporadischer frontotemporaler Demenz und/oder frontotemporaler Demenz mit Parkinsonismus, gekoppelt an Chromosom 17, gegenüber vaskulärer Demenz, Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, Schlaganfall und/oder Neurotoxizität in Patienten mit Leukämie bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein in vitro-Verfahren bereitzustellen, wie oben beschrieben.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Phospho-Peptid zur Verwendung bei der Standardisierung bereitzustellen.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Phospho-Peptid zur Verwendung bei der Standardisierung in einem Verfahren zum Detektieren von Phospho-tau (181) vorzusehen.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Phospho-Peptid zur Verwendung bei der Standardisierung in einem Verfahren, wie oben beschrieben, bereitzustellen.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein diagnostisches Kit zur Verwendung in einem Verfahren, wie oben beschrieben, vorzusehen.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Peptid, ein Verfahren und/oder ein diagnostisches Kit für das Testen oder Screening von Arzneistoffen, für therapeutische Überwachung und/oder für die Bestimmung der Effektivität einer bestimmten Behandlung für eine Tauopathie bereitzustellen.
FIGUREN-LEGENDEN
1. Fein-Kartierung von tau-Antikörpern, HT7, tau1, BT2, AT120 und AT270 auf überlappenden synthetischen Peptiden. Nur immunreaktive Peptide sind gezeigt. A. Kartierung auf Peptiden, welche auf Nadeln synthetisiert wurden. Es wurden 48 Nonapeptide, welche um 8 Aminosäuren überlappen, verwendet, um die tau-Region von 155 bis 208 abzudecken. B. Peptid-Synthese auf Papier. Sechzehn überlappende Peptide, 12 Aminosäuren lang, definieren das AT120-Epitop in der Region 206-232. C. Kartierung des AT270-Antikörpers auf biotinylierten Phosphopeptiden (das phosphorylierte Threonin ist angezeigt), welcher die Region 166 bis 196 abdeckt.
2. Spezifität des AT270-Antikörpers für Phosho-Thr 181, wie sie durch Screening von synthetischen Phosphopeptiden definiert wurde. Biotinylierte Phosphopeptide wurden auf Streptavidin-beschichteten Platten bei einer Konzentration von 1 μg/ml eingefangen. AT270 wurde durch einen Peroxidase-gekoppelten sekundären Antikörper detektiert. Die Sequenzen der Peptide sind in der Tabelle 1 gezeigt.
3. Beziehung von Phospho-tau-Spiegeln, bestimmt durch den HT7-AT270-Assay, und Gesamt-tau-Spiegeln (AT120-(HT7-BT2)-Assay). Mehrere PHF-tau-Präparationen wurden bei unterschiedlichen Verdünnungen geassayt. Die Figur zeigt die Rohdaten, wie geassayt in zweifacher Ausfertigung auf zwei verschiedenen Platten aus der Verdünnung der PHF-tau-Präparation, welche ungefähr 0,5 OD₄₅₀ entspricht. Balken in der Grafik sind Standardabweichungen. PHF-A bis -D sind aus dem frontotemporalen Cortex abgeleitet, wohingegen PHF-E aus einer hippocampalen Region eines Alzheimer-Gehirns präpariert ist.
4. Scatter-Plot bzw. Streuungs-Auftragung von Liquor-Gesamt-tau bei frontotemporaler Demenz, Parkinson-Krankheit, Morbus Alzheimer und subcorticaler artheriosklerotischer Enzephalopathie.
5. Scatter-Plot von Liquor-Phospo-tau (181) bei frontotemporaler Demenz, Parkinson-Krankheit, Morbus Alzheimer und subcorticaler artheriosklerotischer Enzephalopathie.
6. Auftragung der Korrelation zwischen Liquor-Gesamt-tau und Liquor-Phospho-tau (181), wobei alle Individuen in der Untersuchung eingeschlossen sind.
7. Scatterplot von Phospho-tau (181)/Gesamt-tau-Verhältnis in Liquor aus Patienten mit frontotemporaler Demenz, Parkinson-Krankheit, Morbus Alzheimer und subcorticaler artheriosklerotischer Enzephalopathie.
8. Liquor-Gesamt-tau (links) und Liquor-Phospho-tau (181) (rechts) bei unterschiedlichen Zeitpunkten nach akutem Schlaganfall. Balken stehen für Mittelwerte und Striche für die SD bzw. Standardabweichung. Zahl von Proben bei unterschiedlichen Zeitpunkten: Tag 0-1: n = 9, Tag 2-3: n = 18, Tag 7-9: n = 22, Woche 3: n = 21, Monat 3-5: n = 21. Signifikanz, verglichen mit Tag 0-1: für Liquor-tau: Tag 2-3: p = 0,002, Tag 7-9: p < 0,0001, Woche 3 : p < 0,0001, Monat 3-5: p = 0,035; für Liquor-Phospho-tau: Keine signifikanten Unterschiede zu irgendeinem Zeitpunkt, verglichen mit Tag 0-1.
9. Individuelle Werte für Liquor-Gesamt-tau (links) und Liquor-Phospho-tau (181) (rechts) an verschiedenen Zeitpunkten für die neun Patienten, von denen Liquorproben am Tag eins entnommen wurden.
10. Korrelation zwischen Liquor-Gesamt-tau und Liquor-Phospho-tau (181) in Patienten mit Morbus Alzheimer (n = 54) und Kontrollen (n = 17) (links), und in Patienten mit akutem Schlaganfall (n = 22, Zahl von Proben = 91) (rechts). TABELLEN Tabelle 1: Sequenz der phosphorylierten Peptide, welche zum Bestimmen der Spezifizität von AT270 für Phospho-Thr 181 verwendet wurden.

(p): Aminosäure ist phosphoryliert.

^a MMSE-Bewertung; ^b Albumin-Verhältnis = [Liquor-Albumin (mg/l)/Serum-Albumin (g/l)]. Alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
FTD: Frontotemporale Demenz; AD: Morbus Alzheimer; SAE: Subcorticale artheriosklerotische Enzephalopathie; PD: Parkinson-Krankheit; wahrsch.: wahrscheinlich; mögl.: möglich; N: Anzahl von Individuen; M: männlich; F: weiblich; y: Jahre; CSF: Cerebrospinalflüssigkeit bzw. Liquor.

Alle Werte sind als Mittelwerte ± SD ausgedrückt:
Abkürzungen:

FTD: frontotemporale Demenz; AD: Morbus Alzheimer; PD: Parkinson-Krankheit; SAE: Subkortikale Artheriosklerotische Enzephalopathie.
***: Wert ist signifikant unterschiedlich, verglichen zum Wert für Kontrollen (p < 0,001).
**: Wert ist signifikant unterschiedlich, verglichen zum Wert für Kontrollen (p < 0,01).
*: Wert ist signifikant unterschiedlich, verglichen zum Wert für Kontrollen (p < 0,05).

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Diagnose einer Tauopathie in einem Individuum, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

– Bestimmung des Verhältnisses von Phospho-tau (181)/Gesamt-tau in dem Individuum;
– Schlußfolgern, daß das Individuum an einer Tauopathie leidet, indem man das erhaltene Verhältnis von Phospho-tau (181)/Gesamt-tau in dem Individuum mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181)/Gesamt-tau in Kontroll-Individuen vergleicht, wobei ein gegenüber dem Verhältnis in Kontrollindividuen geändertes Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau ein Anzeichen darstellt.

Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren für die differentielle Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie in einem Individuum, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

– Bestimmen des Verhältnis von Phospho-tau (181)/-Gesamt-tau in dem Individuum;
– Schlußfolgern, daß das Individuum unter einer Tauopathie leidet, durch Vergleichen des erhaltenen Verhältnisses von Phospho-tau (181)/Gesamt-tau in dem Individuum mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181)/Gesamt-tau in Individuen, welche unter einer Nicht-Tauopathie leiden, oder mit dem Phospho-tau (181)/Gesamt-tau-Verhältnis in Kontroll-Individuen, wobei ein verändertes Verhältnis von Phospho-tau (181)/Gesamt-tau, verglichen zu dem Verhältnis in Individuen, welche unter einer Nicht-Tauopathie leiden, oder in Kontroll-Individuen, ein Anzeichen darstellt.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, dass das Verhältnis von Phospho-tau (181)/Gesamt-tau in Liquor aus Patienten, welche unter AD leiden, und in Liquor aus Patienten, welche unter bestimmten Formen von FTD leiden, signifikant verändert ist im Vergleich zu dem Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau-Verhältnis in Liquor aus Kontroll-Individuen. Die vorliegende Erfindung basiert ferner auf dem Befund, dass das Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in Liquor aus Patienten, welche unter AD leiden, signifikant verändert ist im Vergleich zu dem Phospho-tau (181)/Gesamt-tau-Verhältnis in Liquor aus Patienten, die unter Schlaganfall leiden. Das Anzeichen, dass das Phospho-tau (181)/Gesamt-tau-Verhältnis in Patienten mit einer Tauopathie verändert ist, bildet eine Grundlage für die Entwicklung eines diagnostischen Tests für die Diagnose einer Tauopathie in einem Individuum und/oder für die differentielle Diagnose von Individuen, welche unter einer Tauopathie leiden, gegenüber Individuen, welche unter einer Nicht-Tauopathie leiden.
"Eine Tauopathie" ist jedwede Form von Demenz, welche mit einer tau-Pathologie assoziiert ist.
Morbus Alzheimer und bestimmte Formen von frontotemporaler Demenz (Morbus Pick, sporadische frontotemporale Demenz und frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus, gekoppelt an Chromosom 17) sind die häufigsten Formen von Tauopathie. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung jegliches Verfahren, wie oben beschrieben, wobei es sich bei der Tauopathie um Alzheimer, Morbus Pick, sporadische frontotemporale Demenz und frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus handelt, gekoppelt an Chromosom 17. Andere Tauopathien schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, progressive supranukleäre Lähmung (PSP), kortikobasale Degeneration (CBD) und subakute sklerosierende Panenzephalitis ein.
In einer spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Diagnose von Morbus Alzheimer in einem Individuum, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

– Bestimmen des Verhältnisses von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in dem Individuum;
– Schlussfolgern, dass das Individuum an Morbus Alzheimer leidet, durch Vergleichen des erhaltenen Verhältnisses von Phospho-tau (181)/Gesamt-tau in dem Individuum mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181)/Gesamt-tau in Kontroll-Individuen, wobei ein verändertes Verhältnis von Phospho-tau (181)/Gesamt-tau, verglichen zu dem Verhältnis in Kontroll-Individuen, ein Anzeichen darstellt.

Eine "Nicht-Tauopathie" ist jedweder Status des Gehirns, welcher nicht mit einer tau-Pathologie assoziiert ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Nicht-Tauopathie eine Nicht-Tauopathie-Neurodegeneration. Eine Nicht-Tauopathie-Neurodegeneration ist jegliche Form von neurologischer Krankheit bzw. Störung, die nicht mit einer tau-Pathologie assoziiert ist. Nicht-Tauopathie-Neurodegenerationen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, vaskuläre Demenz, Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, Schlaganfall und/oder Neurotoxizität in Patienten mit Leukämie ein.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung, in einer spezifischen Ausführungsform, ein Verfahren zur differentiellen Diagnose von Morbus Alzheimer gegenüber Schlaganfall in einem Individuum, wobei dass Verfahren folgende Schritte umfasst:

– das Bestimmen des Verhältnisses von Phospho-tau (181) Gesamt-tau in dem Individuum;
– das Schlussfolgern, dass das Individuum an Morbus Alzheimer und nicht an Schlaganfall leidet, indem man das erhaltene Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in dem Individuum mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in Individuen, die an Schlaganfall leiden, vergleicht, wobei ein verändertes Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau, verglichen mit dem Verhältnis in Individuen, welche unter einem Schlaganfall leiden, ein Anzeichen darstellt.

Phospho-tau (181) schließt alle tau-Moleküle ein, welche ein Phosphat auf dem Threonin an Position 181 tragen. Die Nummerierung in Bezug auf die Aminosäuresequenz bezieht sich auf die längste tau-Isoform hTau40 (Goedert et al., 1989).
Gesamt-tau bezieht sich auf alle Formen von tau und beinhaltet tau in jedwedem Phosphorylierungs-Zustand.
Die vorliegende Erfindung beruht daher auf der Verwendung von tau und Phospho-tau (181) als neurologische Marker für die Diagnose einer Tauopathie und/oder für die differentielle Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie.
Basierend auf dem Spiegel von Phospho-tau (181) und Gesamt-tau in einem Individuum kann dann das Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in dem Individuum bestimmt werden.
Das Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau kann in vitro genauso gut wie in vivo bestimmt werden.
Das Verfahren für den in vitro-Nachweis des Verhältnisses von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einem Individuum umfasst folgende Schritte:

– Erhalten einer Probe aus dem Individuum;
– Bestimmen des Verhältnisses von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in der Probe;
– Schlussfolgern, dass das Individuum unter einer Tauopathie leidet, durch Vergleichen des erhaltenen Verhältnisses von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in dem Individuum mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einer Probe aus Individuen, welche unter einer Nicht-Tauopathie leiden, oder mit dem Phospho-tau (181)/Gesamt-tau-Verhältnis in einer Probe aus Kontroll-Individuen, wobei ein verändertes Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau, verglichen mit dem Verhältnis in Individuen, welche an einer Nicht-Tauopathie leiden, oder in Kontroll-Individuen, ein Anzeichen darstellt.

Der Begriff "Probe" bezieht sich auf jedwede Quelle von biologischem Material, beispielsweise Körperflüssigkeiten, Hirnextrakt, peripheres Blut oder eine beliebige andere Probe, umfassend Phospho-tau (181)-Protein. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in vitro durch Analyse des Verhältnisses von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einer Körperflüssigkeitsprobe des Patienten bestimmt. Der Begriff "Körperflüssigkeit" bezieht sich auf alle Fluide, welche im menschlichen Körper vorhanden sind, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Blut, Lymphe, Urin und Liquor (CSF), umfassend Phospho-tau (181)-Protein. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einer Liquor (CSF)-Probe bestimmt, die aus dem Patienten entnommen wird. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie oben beschrieben, umfassend die folgenden Schritte:

– Erhalten einer Liquorprobe aus dem Individuum;
– Bestimmen des Verhältnisses von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in der Liquorprobe;
– Schlussfolgern, dass das Individuum an einer Tauopathie leidet, durch Vergleichen des erhaltenen Verhältnisses von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in dem Individuum mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau im Liquor aus Individuen, welche an einer Nicht-Tauopathie leiden, oder mit dem Phospho-tau (181)/Gesamt-tau-Verhältnis in Liquor aus Kontroll-Individuen, wobei ein verändertes Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau, verglichen zu dem Verhältnis im Liquor aus Individuen, die unter einer Nicht-Tauopathie leiden, oder im Liquor aus Kontroll-Individuen ein Anzeichen ist.

Gesamt-tau kann durch jedwedes bekannte Verfahren quantifiziert werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Verwendung von Antikörpern oder ansonsten durch einen funktionellen Assay (Bramblett et al., 1992). Jedweder monoklonale oder polyklonale Antikörper, welcher spezifisch Gesamt-tau erkennt, kann für die Quantifizierung von Gesamt-tau verwendet werden. Antikörper, welche normal und abnormal phosphoryliertes tau erkennen, schließen Alz50 (Ghanbari et al., 1990), HT7 (Mercken et al., 1992) und AT120 (Vandermeeren et al., 1993) ein. Es können aber auch andere im Fachgebiet bekannte Antikörper, welche Gesamt-tau erkennen, verwendet werden. Ein sehr schnelles und anwenderfreundliches Verfahren für die Quantifizierung von Gesamt-tau ist der INNOTEST hTau-Ag (Innogenetics, Gent, Belgien).
Phospho-tau (181) kann durch jedwedes im Fachgebiet bekannte Verfahren quantifiziert werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Verwendung von Antikörpern. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Phospho-tau (181) quantifiziert durch einen Immunoassay, welcher mindestens die folgenden Schritte umfasst:

– Erhalten einer Probe aus dem Patienten;
– Inkontaktbringen der Probe mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch Phospho-tau (181) erkennt, unter Bedingungen, welche zur Erzeugung eines Antigen-Antikörper-Komplexes geeignet sind;
– Nachweisen der immunologischen Bindung des Antikörpers an die Probe.

In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform kann Phospho-tau (181) durch einen Sandwich-ELISA quantifiziert werden, welcher die folgenden Schritte umfasst:

– Erhalten einer Probe aus dem Patienten;
– Inkontaktbringen der Probe mit einem monoklonalen Antikörper (primärer Antikörper oder Einfang-Antikörper), welcher Phospho-tau (181) erkennt, unter Bedingungen, die zur Erzeugung eines Antigen-Antikörper-Komplexes geeignet sind;
– Inkontaktbringen der Probe mit einem monoklonalen Antikörper (sekundärer Antikörper oder Detektor-Antikörper), der Phospho-tau (181) spezifisch erkennt, unter Bedingungen, welche zur Erzeugung eines Antigen-Antikörper-Komplexes geeignet sind;
– Inkontaktbringen des Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem Marker, entweder für spezifisches Tagging oder Koppeln mit dem sekundären Antikörper, wobei der Marker jedweder mögliche Marker ist, der dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist;
– möglicherweise, für Standardisierungs-Zwecke, auch Inkontaktbringen der Antikörper mit einem gereinigten Phospho-tau-Protein oder Phospho-Peptid, welches mit beiden Antikörpern reaktiv ist.

Vorteilhafterweise trägt der sekundäre Antikörper selbst einen Marker oder eine Gruppe für direkte oder indirekte Kopplung mit einem Marker.
Der Ausdruck "erkennend", "reagierend mit", "immunologische Bindung" oder "einen Antigen-Antikörper-Komplex erzeugend", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, soll so interpretiert werden, dass die Bindung zwischen dem Antigen und dem Antikörper unter allen Bedingungen stattfindet, welche die immunologischen Eigenschaften des Antikörpers und des Antigens berücksichtigen.
Der Ausdruck "spezifisch erkennend", wie verwendet in der vorliegenden Erfindung, soll so interpretiert werden, dass der Antikörper zur Bildung eines immunologischen Komplexes mit Phospho-tau (181), aber nicht mit einem tau-Molekül, welchem die Phosphorylierung am Threonin 181 fehlt, in der Lage ist.
Jedweder monoklonale Antikörper, welcher spezifisch Phospho-tau (181) erkennt, kann in dem Verfahren für die Quantifizierung von Phospho-tau (181) verwendet werden. Ein bevorzugter monoklonaler Antikörper zur Verwendung in der Quantifizierung von Phospho-tau (181) ist AT270 (Internationale Anmeldung, veröffentlicht unter WO 95/17429). Es können jedoch auch andere im Fachgebiet bekannte Antikörper, welche Phospho-tau (181) spezifisch erkennen, verwendet werden.
Für Standardisierungs-Zwecke kann ein tau-Protein oder -Peptid, das am Threonin 181 phosphoryliert ist, verwendet werden. Dieses kann durch jegliches Verfahren erhalten werden, wie Extraktion aus Hirn oder in vitro-Phosphorylierung von normalem tau. Da es schwierig ist, akkurat den Grad der Phosphorylierung von spezifischen Phospho-Stellen, welche in der Prolinregion konzentriert sind, zu bestimmen, wird in einer Ausführungsform der Erfindung ein synthetisches Phospho-Peptid für die Standardisierung verwendet. Das synthetische Phospho-Peptid sollte in der Lage sein, einen immunologischen Komplex mit den im Immunoassay verwendeten Antikörpern zu bilden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Phospho-Peptid, umfassend mindestens zwei Epitope, welche von einem monoklonalen Antikörper erkennt werden, wobei das Phospho-Peptid dazu neigt, einen immunologischen Komplex mit den monoklonalen Antikörpern in einem Sandwich-ELISA zu bilden. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass, obwohl ein Peptid ein Epitop für einen bestimmten monoklonalen Antikörper enthält, der monoklonale Antikörper das Peptid nicht immer erkennt (DeLeys et al., 1996). Die Anmelder der vorliegenden Erfindung waren in der Lage, ein Phospho-Peptid mit zwei Epitopen zu definieren, sodass tatsächlich das Phospho-Peptid in der Lage ist, einen immunologischen Komplex mit den monoklonalen Antikörpern zu bilden, welche die Epitope erkennen. Darüber hinaus waren die Anmelder der vorliegenden Erfindung in der Lage, beide Epitope zu definieren, sodass das Phospho-Peptid in der Lage ist, einen immunologischen Komplex mit den monoklonalen Antikörpern zu bilden, welche die Epitope in einem Sandwich-ELISA erkennen.
Der Begriff "Peptid" bezieht sich auf ein Polymer von Aminosäuren (aa) und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts. In einer Ausführungsform der Erfindung beträgt die Länge für das Phospho-Peptid zwischen 15 und 100 Aminosäuren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das Phospho-Peptid 20 bis 50 Aminosäuren. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das Phospho-Peptid 30 bis 40 Aminosäuren.
Das Peptid der Erfindung kann durch jedwedes im Fachgebiet bekannte Verfahren produziert werden, wie klassische chemische Synthese, wie beschrieben von Houbenweyl (1974) und Atherton und Shepard (1989), durch jedwedes kommerziell verfügbare Verfahren, wie beschrieben im Abschnitt "Beispiele", oder durch Methoden von rekombinanten DNA-Techniken, wie beschrieben von Sambrook et al. (1989).
Ein Phospho-Peptid ist ein Peptid, welches ein Phosphat auf mindestens einer Aminosäure trägt. Die Verwendung des Phospho-Peptids der Erfindung gestattete den Anmeldern der vorliegenden Erfindung, die Beziehung von Phospho-Peptid zu spezifischen Phospho-Isoformen zu bestimmen und den Phosphorylierungsgrad von spezifischen Phospho-Stellen zu prüfen (siehe Beispiel 1, 1.5). Die Verwendung des Phospho-Peptids der Erfindung wird die Quantifizierung von bestimmten molekularen Formen von tau in einer standardisierten Weise zulassen.
Phosphorylierte Peptide können durch jedwedes bekannte Verfahren hergestellt werden. Sie können nach der Assemblierung bzw. dem Zusammenbau hergestellt werden, zum Beispiel durch Reaktion mit Di-t-butyldiisopropyl-Diisopropylphosphoaramidit und Oxidation mit t-Butylhydroperoxid von ungeschützten Serin- und Threonin-Resten. Sie können ebenfalls hergestellt werden durch Einbau von phosphorylierten Aminosäuren während der Peptidsynthese. Seit kurzem sind neue phosphorylierte Serinderivate (N-α-Fmoc-O-benzyl-L-phosphoSer) kommerziell verfügbar (Calbiochem-Novabiochem AG, San Diego, CA 92121), um Phospho-Peptide direkt ohne Nach-Assemblierungs-Phosphorylierung zu synthetisieren.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Phospho-Peptid, welches dazu neigt, einen immunologischen Komplex mit monoklonalem Antikörper HT7 und monklonalem Antikörper AT270 zu bilden, welcher wenigstens Folgendes umfasst:

– das minimale Epitop von HT7: PPGQK (SEQ ID NR.: 1); und
– das minimale Epitop von AT270: PPAPKT(p)P (SEQ ID NR.: 2).

In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Phospho-Peptid, wie oben beschrieben, welches die folgende Sequenz umfasst:
PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT(p)PPSSGE (SEQ ID NR.: 3)
worin '(p)' anzeigt, dass Threonin phosphoryliert ist, oder Variantensequenzen unter den Bedingungen, dass sie noch an die monoklonalen Antikörper HT7 und AT270 binden. Der Ausdruck 'Variantensequenzen' bezieht sich auf jedwede Variante oder jedwedes Fragment des in SEQ ID NR. 3 repräsentierten Peptides, durch Substitution oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren, welches noch die monoklonalen Antikörper HT7 und AT270 erkennt. Der Begriff bezieht sich nicht spezifisch auf, noch schließt er aus, post-translationale Modifikationen des Peptids, wie Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Modifikationen mit Fettsäure und dergleichen. Eingeschlossen in der Definition sind beispielsweise Peptide, welche ein oder mehrere Analoge einer Aminosäure (einschließlich unnatürlichen Aminosäuren) enthalten, Peptide mit substituierten Bindungen, mutierte Versionen, Peptide, enthaltend Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten, biotinylierte Peptide sowie andere im Fachgebiet bekannte Modifikationen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Phospho-Peptids in einem Verfahren zur Messung des Spiegels an Phospho-tau (181).
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Phospho-Peptids in einem Verfahren für die Diagnose einer Tauopathie und/oder für die differentielle Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Phospho-Peptids in einem Verfahren für die Diagnose von Morbus Alzheimer.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Phospho-Peptids in einem Verfahren für die differentielle Diagnose von Morbus Alzheimer gegenüber Schlaganfall.
Das Verfahren für den in vitro-Nachweis des Verhältnisses von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einem Individuum kann auch zum Testen oder Screening von Arzneimitteln, für therapeutische Überwachung und/oder zur Auswertung des Effekts einer bestimmten Behandlung auf die Tauopathie in dem Individuum verwendet werden.
Das Verfahren für den frühen in vivo-Nachweis des Verhältnisses von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einem Individuum umfasst die Schritte des Bestimmens des Verhältnisses von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in dem Individuum und des Vergleichens von diesem mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in gesunden Kontroll-Individuen. In einer Ausführungsform können Phospho-tau (181) und Gesamt-tau durch in vivo-Bildgebung quantifiziert werden. Phospho-tau (181) und Gesamt-tau können in situ durch nicht-invasive Verfahren quantifiziert werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Hirn-Abbildungs-Verfahren, welche beschrieben wurden von Arbit et al. (1995), Tamada et al. (1995), Wakabayashi et al. (1995), Huang et al. (1996), Sandrock et al. (1996), Mariani et al. (1997). Diese in vivo-Bildgebungsverfahren können die Lokalisierung und Quantifizierung von Phospho-tau (181) und Gesamt-tau gestatten, zum Beispiel durch die Verwendung von markierten Antikörpern, welche jeweilig spezifisch Phospho-tau (181) erkennen oder Gesamt-tau erkennen.
Phospho-tau (181) und Gesamt-tau können auch als Marker für in vivo-Bildgebung zum Testen oder Screening von Arzneistoffen, zur therapeutischen Überwachung und/oder zur Auswertung des Effekts einer bestimmten Behandlung auf die Tauopathie in dem Individuum verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen diagnostischen Kit für die Diagnose einer Tauopathie in einem Individuum und/oder für die differentielle Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie, umfassend mindestens einen Antikörper, welcher spezifisch Phospho-tau (181) erkennt.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit, wie oben beschrieben, welcher wenigstens Folgendes umfasst:

– einen Antikörper, welcher Phospho-tau (181) spezifisch erkennt;
– einen Antikörper, welcher tau erkennt.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit, wie oben beschrieben, umfassend wenigstens ein Phospho-Peptid gemäß der Erfindung.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit, wie oben beschrieben, welcher wenigstens Folgendes umfasst:

– einen Antikörper, der Phospho-tau (181) spezifisch erkennt;
– ein Phospho-Peptid gemäß der Erfindung.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein diagnostisches Kit, wie oben beschrieben, umfassend wenigstens:

– einen Antikörper, welcher Phospho-tau (181) spezifisch erkennt;
– einen Antikörper, welcher tau erkennt;
– ein Phospho-Peptid gemäß der Erfindung.

Ein bevorzugter Kit für die Diagnose einer Tauopathie in einem Individuum basiert auf einem Immunoassay und umfasst Folgendes:

– einen monoklonalen Antikörper (primärer Antikörper), der einen immunologischen Komplex mit einem Epitop von Phospho-tau (181) bildet;
– einen monoklonalen Antikörper (sekundärer Antikörper), welcher spezifisch Phospho-tau (181) erkennt;
– einen Marker, entweder für spezifisches Tagging bzw. Markieren oder spezifische Kopplung mit dem sekundären Antikörper;
– geeignete Pufferlösungen zum Ausführen der immunologischen Reaktion zwischen dem primären Antikörper und der Testprobe, zwischen dem sekundären Antikörper und der Testprobe und/oder zwischen dem gebundenen sekundären Antikörper und dem Marker;
– ein Phospho-Peptid gemäß der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines diagnostischen Kits, wie oben beschrieben, für die Diagnose einer Tauopathie in einem Individuum und/oder für die differentielle Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines diagnostischen Kits, wie oben beschrieben, für die Diagnose von Morbus Alzheimer, Morbus Pick, sporadischer frontotemporaler Demenz und/oder frontotemporaler Demenz mit Parkinsonismus, gekoppelt an das Chromosom 17.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines diagnostischen Kits, wie oben beschrieben, für die differentielle Diagnose von Morbus Alzheimer, Morbus Pick, sporadischer frontotemporaler Demenz und/oder frontotemporaler Demenz mit Parkinsonismus, gekoppelt an das Chromosom 17, gegenüber vaskulärer Demenz, Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, Schlaganfall und/oder Neurotoxizität in Patienten mit Leukämie.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung von Gesamt-tau und Phospho-tau (181) als neurologische Marker für die Herstellung eines diagnostischen Kits zur Diagnose einer Tauopathie und/oder zur differentiellen Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Phospho-Peptids, ein Verfahren und/oder einen diagnostischen Kit der Erfindung zum Testen oder Screening von Arzneistoffen, für die therapeutische Überwachung und/oder für die Bestimmung der Effektivität einer bestimmten Behandlung für eine Tauopathie.
Überall in dieser Beschreibung und den Ansprüchen, welche folgen, wird, es sei denn, der Kontext erfordert es anderweitig, das Wort "umfassen" und Variationen wie "umfasst" und "umfassend", so zu verstehen sein, dass es die Beinhaltung einer angegebenen ganzen Zahl oder einer Stufe oder einer Gruppe von angegebenen ganzen Zahlen oder Stufen bzw. Schritten, jedoch nicht den Ausschluss von jedweder anderen ganzen Zahl oder Stufe oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Stufen impliziert.
Die Bezugnahme auf jedweden Stand der Technik in dieser Patentschrift wird nicht und sollte nicht als eine Anerkennung oder irgendeine Form von Nahelegung ausgelegt werden, dass dieser Stand der Technik einen Teil des üblichen allgemeinen Kenntnisstands in Australien darstellt.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, welche besonders vorteilhafte Ausführungsformen darstellen. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass diese Beispiele veranschaulichend sind und nicht ausgelegt werden können, um die Erfindung in irgendeiner Weise einzugrenzen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Entwurf eines Phospho-Peptids zur Verwendung bei der Standardisierung
1.1 Synthese von tau und von tau abgeleiteten Peptiden
Zwei PCR-Primer (ein Primer, welcher das Start-Methionin-Codon enthält CATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAAGTGATGG (-1 bis 34) (SEQ ID NR.: 4) und der Rückwärtsprimer in der Nähe des Stop-Codons CCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGC (SEQ ID NR.: 5)) wurden verwendet, um die kleinste Form aus humanem tau in einem P_L-basierenden Expressionssystem (Innogenetics, Gent, Belgien) zu amplifizieren. Die Sequenz des PCR-Produktes wurde durch Sequenzierung bestätigt. Änderungen wurden nur am dritten Basenpaar in folgenden Codons beobachtet: bei Pro 182 CAG anstatt von CAA, bei Ala 227 GCG anstatt von GCA, und bei Asn 251 AAC anstatt AAT. Sämtliche Nummerierung in Hinsicht auf die Aminosäuresequenz bezieht sich auf die längste tau-Isoform: hTau40 (Goedert et al., 1989). Deletionsmutanten wurden hergestellt, basierend auf dem Konstruieren von Rasterschub-Mutanten durch Auffüllen der SacII-Stelle (Aminosäureposition 154-155) und der PstI-Stelle (Position 242-243).
Automatisierte Peptidsynthese wurde auf einem Millipore 9050-Synthesizer durchgeführt, üblicherweise als N-terminal biotinylierte Peptide. Eine Synthese im großen Maßstab des Peptides Ac-PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT(p)PPSSGE-NH₂ (Position 154-187) (SEQ ID NR.: 3) für Sandwich-ELISA wurde betriebsintern sowie durch Neosystems (Strasbourg, Frankreich) synthetisiert. Die Qualitätskontrolle umfasste RP-HPLC (Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie) (>99 % rein), Massenspektrometer-Analyse (durchschnittliches MW: 3454,8) und Aminosäureanalyse (Netto-Peptidgehalt 84,3 %).
Für die Epitop-Kartierung wurden Peptide manuell auf derivatisierten Nadeln (Multiple Peptide Systems, San Diego, CA92121) oder auf Papier synthetisiert. Für auf Papier synthetisierte Peptide wurde das Papier unter Anwendung des symmetrischen Anhydrids von Fmoc-β-Alanin (9-Fluorenylmethoxycarbonyl-β-alanin) in Gegenwart von Dimethylaminopyridin derivatisiert. Nach Entfernung der Fmoc-Gruppe wurde ein zweiter β-Alanin-Rest addiert, im Anschluss an Aktivierung mit TBTU (= 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1',3,3'-tetramethyluroniumtetrafluorborat). Peptide wurden anschließend manuell als Spots bzw. Flecken synthetisiert.
Phosphorylierte Peptide wurden durch Nach-Assemblierungs-Reaktion mit Di-t-Butyldiisopropyl-diisopropylphoshoaramidit und Oxidation mit t-Butylhydroperoxid von ungeschützten Serin- und Thereoninresten hergestellt. Seit kurzem sind neue phosphorylierte Serinderivate (N-α-Fmoc-O-benzyl-L-phosophoSer) kommerziell verfügbar (Calbiochem-Novabiochem AG, San Diego, CA 92121), um Phospho-Peptide direkt ohne Nach-Assemblierungs-Phosphorylierung zu synthetisieren. Nach Ablösung von dem festen Träger wurden Peptide und Phospho-Peptide durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (RP-HPLC) gereinigt. Die Qualität der Peptide wurde durch Massenspektrometrie bestätigt.
1.2 Immunoassays
Einzelheiten der Isolierung und Charakterisierung von Antikörpern sind für AT120 (Vandermeeren et al., 1993b), HT7 (Mercken et al., 1992), BT2 (Vandermeeren et al., 1993a) und AT270 (Goedert et al., 1994) beschrieben worden. Um Peptid-Antikörper-Wechselwirkungen durch Einfang-Assay zu quantifizieren, wurde Streptavidin (Roche Diagnostics, Brüssel, Belgien) bei 5 μg/ml über Nacht in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,5, aufbeschichtet. Nach dem Blockieren wurden biotinylierte Peptide zugegeben und mit den tau-Antikörpern nachgewiesen. Ein zweiter Antikörper, welcher an Meerettichperoxidase gekoppelt war, wurde verwendet, um die Immunreaktion zu quantifizieren.
Die Untersuchungsversion des INNOTEST-Phospho-tau (181P) war wie folgend ausgelegt: HT7-beschichtete Immunplatten wurden über Nacht bei 4°C mit 75 μl Probe oder Standard, gleichzeitig mit biotinyliertem AT270, inkubiert. Nach dem Waschen wird mit Meerrettichperoxidase markiertes Streptavidin (RDI, Flanders, NJ, US) 30 Minuten lang zugegeben. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 μl 0,9 N H₂SO₄ gestoppt.
Gesamt-tau wurde unter Verwendung des INNOTEST hTau-Ag gemessen, und man wandte ein berechnetes Molekulargewicht von 41065 für rekombinantes tau, welches als Standard verwendet wurde, zum Umrechnen von pg/ml in pM an.
1.3 Kartierung von tau-Antikörpern
Um die tau-Antikörper, welche rekombinantes tau erkennen, auf dem vollständigen tau-Molekül zu kartieren, wurden Deletionsmutanten konstruiert, basierend auf den PstI- und SacII-Stellen. Die getesteten Antikörper, d.h. HT7, AT120, BT2 und tau1, kartieren alle in der prolinreichen Region (Position 154-242 auf hTau40, Ergebnisse nicht gezeigt). Um die Epitope weiter abzugrenzen, wurden kleine überlappende Peptide synthetisiert. In einem ersten Schritt wurden 48 Peptide, 9 Aminosäuren lang und überlappend um 8 Aminosäuren, auf Nadeln synthetisiert. Die Sequenz reichte von 155 bis 208. AT120, HT7, BT2 und tau1 wurden getestet. Vier der fünf Antikörper konnten kartiert werden: Das minimale Epitop von HT7 war PPGQK (Position 159-163) (SEQ ID NR.: 1), wohingegen die Reaktivitäten von BT2 und tau-1 nicht zu unterscheiden waren. DRSGYS (Position 193-198) (SEQ ID NR.: 6) (1a). Da AT120 nicht auf diesen Peptiden kartiert werden konnte, wurde ein neuer Satz von Peptiden auf Papier synthetisiert, welcher die Sequenz von 206-232 abdeckte. Insgesamt 16 Peptide, 12 Aminosäuren lang und um 11 Aminosäuren überlappend, wurden benötigt, um diese Region abzudecken. Das minimale Epitop von AT120 wurde definiert durch die Sequenz PPTREPK (Position 218- 224) (SEQ ID NR.: 7) (1b).
1.4 Spezifität von AT270
Die Spezifität des phospho-abhängigen Antikörpers, AT270, wurde auf synthetischen Phospho-Peptiden bestätigt, welche 22 Phosphorylierungsstellen auf tau abdeckten. Die Sequenzen dieser Peptide sind in der Tabelle 1 zusammengefasst. Nicht-phosphorylierte Peptide, entsprechend 12 dieser Stellen, wurden parallel analysiert (2). AT270 reagiert nur mit Phospho-Peptiden, welche Phospho-Thr181 und/oder Phospho-Thr175 enthielten. Als diese Peptide in einem Einfang-Assay austitriert wurden, war AT270 18fach weniger reaktiv, auf einer molaren Basis, mit dem Peptid, welches Phosho-Thr175 enthielt, verglichen mit demjenigen von Phospho-Thr181 (Ergebnisse nicht gezeigt). Schließlich wurde das Minimal-Epitop unter Verwendung von biotinylierten phosphorylierten Peptiden, welche 15 Aminosäuren lang waren und die Region 166-196 abdeckten, definiert. Immunreaktive Peptide sind in der 1c gezeigt, und das Minimalepitop von AT270 war PPAPKT(p)P (Position 176-182) (SEQ ID NR.: 2).
1.5 Entwurf des Phospho-Peptids und Bestimmung des Phosphorylierungsgrades
Unter Verwendung dieser Peptid-Information wurde ein Phospho-Peptid synthetisiert, welches die Position 154 bis 187 abdeckte. Diese Sequenz deckt das Epitop von HT7 (159-163) und AT270 (176-182) und ein. zusätzliche 5 Aminosäuren, N-terminal zum HT7-Epitop und C-terminal zum AT270-Epitop, ab. Die exakte Konzentration des Phospho-Peptids wurde unter Anwendung von Aminosäureanalyse bestimmt (Blennow et al., 1995). Basierend auf dieser Konzentration liegt der dynamische Bereich eines auf Peroxidase basierenden ELISA zwischen 5 und 300 pM unter Verwendung einer Präzisions-Profilerstellung. Die Intra-Assay- und Inter-Assay-Koeffizienten der Variation lagen unterhalb von 10 %.
Um zu bestimmen, wie der Grad der Phosphorylierung mit den Absolutspiegeln an Phospho-tau (181) und Gesamt-tau zusammenhängt, wurden fünf unterschiedliche PHF-tau-Präparationen gleichzeitig in den jeweiligen Assays quantifiziert. PHF-tau wurde gemäß Goedert et al. (1992) unter Verwendung von 1 % N-Lauroylsarcosinat hergestellt, um PHF-tau selektiv aus Hirnextrakt-Überständen zu fällen. Gewebe aus dem temporalen Cortex (PHF-A-D) oder Hippocampus (PHF-E) von AD-Patienten wurde aus der "Born-Bunge-Brain"-Bank (Dr. P. Cras, Antwerpen, Belgien) erhalten.
Wie in der 3 gezeigt, war der Grad der Phosphorylierung von Phospho-Thr 181 zwischen den PHF-tau-Präparationen unterschiedlich. Unter der Annahme, dass die PHF-tau-Präparation mit den höchsten Phospho-tau-Spiegeln einen Phosphorylierungsgrad nahe 100 aufweist, überschätzt das Verhältnis Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau den Phosphorylierungsgrad mindestens 3,3-fach. Nichtsdestoweniger, bei Berücksichtigung, dass das Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau den Phosphorylierungsgrad überschätzt, beträgt der Phosphorylierungszustand von Thr 181 in tau aus Liquor-tau höchstens 59 % ± 18 % (1,952/3,3), was in enger Übereinstimmung mit dem Phosphorylierungszustand von Thr 181 mit aus Hirn abgeleitetem tau unter normalen Bedingungen steht (20-30 %; Watanabe et al., 1993; Matsuo et al., 1994).
Beispiel 2: Verwendung des Phospho-Peptids zur Standardisierung in einem Assay zur Bestimmung von Phospho-tau (181) in Patienten mit Morbus Alzheimer, frontotemporaler Demenz und/oder vaskulärer Demenz
2.1 Patienten
In der Untersuchung eingeschlossen waren 18 Patienten mit FTD (Altersbereich 48-77 Jahre), 60 Patienten mit AD (Altersbereich 'möglich' 68-88 Jahre; 'wahrscheinlich' 58-90 Jahre), 17 Patienten mit subcorticaler artheriosklerotischer Enzephalopathie (SAE; einer vermeintlichen Form von vaskulärer Demenz) (Altersbereich 67-84 Jahre), 15 Patienten mit PD (Altersbereich 59-82 Jahre), und 17 Kontrollen (Altersbereich 68-80 Jahre). Ihre Charakteristika sind in der Tabelle 2 zusammengefasst.
Alle in der Untersuchung eingeschlossenen Patienten wiesen eine klinische Diagnose von FTD, AD, SAE bzw. PD auf und wurden nachfolgend bzw. fortlaufend aus prospektiven Longitudinalstudien an Patienten mit Demenz oder PD rekrutiert. Die klinischen Diagnosen wurden aufgestellt, und Liquorprobenentnahme wurde durchgeführt. Dann wurden neurochemische Analysen am Institute of Clinical Neuroscience, Sahlgrenska University Hospital, Mölndal, Schweden, durchgeführt. Patienten mit unspezifizierter Demenz (z. B. gemischter Demenz), einer Krankheitsgeschichte einer schweren psychiatrischen Krankheit (z. B. Schizophrenie), chronischem Alkoholismus, unterschiedlicher bzw. ausgeprägter nicht-degenerativer neurologischer Erkrankung (z. B. normotensiver Hydrocephalus), einer Krankheitsgeschichte mit schwerer Kopfverletzung, schweren Infektion im CNS, systemischer Erkrankung (z. B. bösartige Tumoren) und sekundären Ursachen (z. B. Hypothyreose) für Demenz gemäß dem "Diagnostic and statistical manual of mental disorders" bzw. "Diagnostisches und statistisches Handbuch für Geistesstörungen" (Association AP, 1987) oder biochemische Kriterien wurden ausgeschlossen. Ausgeschlossen wurden auch Patienten mit großen cerebralen Infarkten und/oder mehreren Lakunen. Alle eingeschlossenen Patienten durchliefen eine gründliche klinische Untersuchung, einschließlich medizinischer Geschichte, physikalischen, neurologischen und psychiatrischen Untersuchungen, Screening-Labortests des Blutes (relevante Laboratoriumstests zum Ausschließen anderer Ursachen von Demenz, z. B. Hypothyroidismus), Routineanalyse des Liquors (z. B. Zytologie), ECG, Brustkorb-Röntgenuntersuchung, EEG, Computertomographie (CT) oder Magnetresonanzabbildung (MRI) des Gehirns, Untersuchung des regionalen cerebralen Blutflusses (CBF), unter Anwendung von entweder Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) oder der ¹³³Xenon-Inhalations-Technik (Cortexplorer; Risberg und Gustafson, 1983).
FTD wurde gemäß den Lund/Manchester-Kriterien (Brun et al., 1994) diagnostiziert, wie früher beschrieben (Sjögren et al., 1997). Keiner der FTD-Patienten wies Zeichen von Infarkten auf, und nur schwache Veränderungen der weißen Substanz wurden in einigen FTD-Patienten gefunden.
Die Diagnose von "wahrscheinlich AD" wurde durch Ausschließen nach den NINCDS-ADRDA-Kriterien (Mc Khann et al., 1984) erstellt. Die AD-Patienten wurden in eine Gruppe mit wahrscheinlicher AD und eine Gruppe mit möglicher AD unterteilt, wie definiert durch die NINCDS-ADRDA-Kriterien.
Die diagnostischen Kriterien für SAE waren sämtliche der nachfolgenden: a) geistiger Verfall (vorwiegend asteno-emotionale Störung und frontale kognitive Dysfunktion); b) Gehstörung (Ataxie und/oder Motordysfunktion); c) fokale neurologische Anzeichen; d) vaskuläre Risikofaktoren, wie Hypertension und Diabetis, oder Vorhandensein von systemischer vaskulärer Krankheit; e) bei MRI oder CT, in bilateraler Weise vorhandene mehrere von diffusen subcorticalen – paraventrikulären Änderungen der tiefen weißen Substanz (> 2 mm), lakunare Infarkte, ein vergrößertes ventrikuläres System und Abwesenheit von mehr als einem kortikalem Infarkt. Die Kriterien waren kompatibel mit denjenigen, welche von anderen vorgeschlagen wurden (Bennett et al., 1990). Fünfzehn der SAE-Patienten wiesen keinen kortikalen Infarkt auf; die restlichen vier wiesen einen kortikalen Infarkt auf.
Die Diagnose von PD wurde gemäß den Empfehlungen von Langstron und Koller (1991a, b) vorgenommen. Alle der PD-Patienten zeigten wenigstens zwei der drei Merkmale Bradykinesie, Rigidität und Ruhezustands-Tremor, und alle der PD-Patienten sprachen auf eine Behandlung mit L-Dopa an. Kein Patient mit PD zeigte irgendwelche Anzeichen von Demenz, und sie wiesen alle einen Wert bei der "Mini-Mental State"-Untersuchung (MMSE) (Folstein et al., 1975) von 27 oder darüber auf.
Alle klinischen Diagnosen wurden durch Ärzte ohne Kenntnis der Ergebnisse der biochemischen Analysen durchgeführt, und umgekehrt. Keiner der Patienten wurde derzeitig hinsichtlich Demenz behandelt (z. B. mit Cholinesterase-Inhibitoren).
In den von Demenz betroffenen Patienten wurde das Ausmaß der Demenz unter Anwendung der MMSE bewertet (Folstein et al., 1997).
Die normalen Kontrollen und die Patienten mit PD wurden in die Analyse der Empfindlichkeit und Spezifität des potenziellen Markers eingeschlossen.
Die Kontrollgruppe bestand aus Individuen ohne Krankheitsgeschichte, Symptome oder Anzeichen von psychiatrischer oder neurologischer Krankheit, maligner Erkrankung oder systemischen Erkrankungen (z. B. rheumatoider Arthritis, Infektionskrankheit). MMSE wurde angewandt, um ihren kognitiven Zustand zu bewerten, und diejenigen Personen mit Bewertungen unter 28 wurden ausgeschlossen.
Die Ethik-Komitees der Universitäten von Göteborg, Lund/Malmö und Linköping, Schweden, genehmigten die Studie. Alle Patienten (oder ihre nächsten Verwandten) und Kontrollen gaben ihre schriftlich mitgeteilte Einverständniserklärung an der Teilnahme in der Studie ab, welche in Übereinstimmung mit den Maßgaben der Helsinki-Erklärung durchgeführt wurde.
2.2 Liquor-Analysen.
Bei allen Patienten und Kontrollen wurde eine Lumbar-Punktur am Zwischenraum L3/L4 oder L4/L5 durchgeführt. Die ersten 12 ml Liquor wurden in Polypropylen-Röhrchen aufgefangen und vorsichtig gemischt, um Gradienteneffekte zu vermeiden (Blennow et al., 1993). Zur gleichen Zeit wurde eine Serumprobe entnommen. Alle Liquorproben mit mehr als 500 Erythrocyten pro μl wurden ausgeschlossen. Die Liquor- und Serumproben wurden bei 2000 × g während 10 Minuten zentrifugiert, um Zellen und anderes unlösliches Material zu eliminieren. Aliquots wurden dann bei –80°C bis zur biochemischen Analyse aufbewahrt.
Die quantitative Bestimmung von Serum- und Liquor-Albumin wurde durch Nephelometrie durchgeführt, wobei das Behring-Nephelometer-Analysegerät (Behringwerke AG, Marburg, Deutschland) verwendet wurde. Das Liquor/Serum-Albumin-Verhältnis (Tibbling et al., 1977) wurde berechnet als [Liquor-Albumin (mg/l)/Serum-Albumin (g/l)] und wurde als das Maß der Blut-Hirn-Schranken (BBB)-Funktion herangezogen.
Liquor-tau wurde unter Verwendung eines Sandwich-ELISA (INNOTEST hTau-Ag, Innogenetics, Gent, Belgien) bestimmt, der konstruiert war, um Gesamt-tau (sowohl normales tau als auch PHF-tau) zu messen, wie früher ausführlich beschrieben wurde (Vandermeeren et al., 1993b; Blennow et al., 1995).
Der Spiegel an Phospho-tau (181) wurde durch den INNOTEST Phospho-tau (181P) bestimmt, wie oben beschrieben.
2.3 Statistische Analyse.
Alle Variablen waren normal verteilt, und deshalb wurden parametrische statistische Verfahren für Gruppenvergleiche unter Berücksichtigung der Effektvariablen (Liquor-tau und Liquor-Phospho-tau) angewandt. Eine vollständig faktorielle multiple ANOVA wurde mit Liquor-tau bzw. Liquor-Phospho-tau als abhängigen Variablen, dem Alter, der Dauer und der Schwere der Demenz als Kovariaten und der diagnostischen Kategorie (wahrscheinliche und mögliche AD, FTD, PD, SAE und normale Alterung) als Faktor durchgeführt. Faktoren, welche nicht zur Varianz beitrugen, wurden aus der Analyse ausgeschlossen, und eine erneute Berechnung wurde ausgeführt. Post-hoc-Vergleiche wurden unter Anwendung des Turkey'schen Post-hoc-Tests für ungleiche n's durchgeführt.
Das mittlere Alter war bei PD (p < 0,001) und wahrscheinlicher AD (p < 0,05) signifikant niedriger, verglichen mit möglicher AD. Patienten mit wahrscheinlicher AD waren signifikant stärker dement als Patienten mit möglicher AD (p < 0,05). Es wurden keine Unterschiede zwischen jedweden der Patienten- oder Kontrollgruppen hinsichtlich des Liquor/Serum-Albumin-Verhältnisses (nur für die Demenzgruppen) und des Geschlechts festgestellt (Tabelle 2).
2.4 Liquor-Gesamt-tau und Liquor-Phospho-tau (181) bei Demenz, Parkinson-Krankheit und normalem Altern.
Liquor-tau war in wahrscheinlicher AD und möglicher AD signifikant erhöht, verglichen mit FTD (p < 0,001), PD (p < 0,001), SAE (p < 0,001) und Kontrollen (p < 0,001), und bei FTD verglichen mit SAE (p < 0,01) (Tabelle 3; 4).
Liquor-Phospho-tau (181) war signifikant erhöht bei wahrscheinlicher AD, verglichen mit FTD (p < 0,001), PD (p < 0,001), SAE (p < 0,001) und den Kontrollen (p < 0,0079), und bei möglicher AD, verglichen mit FTD (p < 0,001) und SAE (p < 0,001) aber nicht im Vergleich zu Kontrollen. Darüber hinaus war das Liquor-Phospho-tau (181) auch signifikant verringert bei FTD (p < 0,0001) und in SAE (p < 0,0001) im Vergleich zu Kontrollen (Tabelle 3; 5).
Liquor-tau und Liquor-Phospho-tau (181) war positiv korreliert in allen diagnostischen Gruppen (wahrscheinliche und mögliche AD: r = 0,86, p < 0,001; FTD: r = 0,66, p < 0,01; SAE: r = 0,58, p < 0,05; PD: r = 0,62, p < 0,05; Kontrollen: r = 0,65, p < 0,01; 6).
Ein Liquor-Phospho-tau (181)/Liquor-Gesamt-tau-Verhältnis wurde berechnet und war festgestelltermaßen signifikant verringert bei wahrscheinlicher AD (p < 0,001; 1,16 ± 0,24), möglicher AD (p < 0,001; 1,10 ± 0,20) und FTD (p < 0,001; 0,88 ± 0,34), verglichen zu den Kontrollen (p < 0,001 für alle drei Gruppen; 1,95 ± 0,60), PD (p < 0,001 für alle drei Gruppen; 1,92 ± 0,42) und SAE (p < 0,001 für alle drei Gruppen; 1,96 ± 1,08) (Tabelle 3; 7).
Beispiel 3: Bestimmung des Liquor-Phospho-tau (181)- und Liquor-Gesamt-tau-Spiegels in Patienten mit Morbus Alzheimer gegenüber Patienten mit akutem ischämischen Schlaganfall
3.1 Patienten
Liquor-Gesamt-tau und Liquor-Phospho-tau (181) wurden in longitudinalen Liquorproben aus 22 Patienten, 16 Männer und 6 Frauen, mittleres Alter ± Standardabweichung 65,7 ± 9,2 Jahre, mit einem akuten ischämischen Schlaganfall untersucht. Alle Patienten wurden in einer standardisierten Weise ausgewertet, wie früher beschrieben (Tarkowski et al., 1999). Falls möglich, wurden Liquorproben bei fünf Gelegenheiten gesammelt; am Eintritts-Tag 0-1 (n = 9), Tag 2-3 (n = 18), Tag 7-9 (n = 22), drei Wochen (n = 21) und 3-5 Monate (n = 21).
Es wurden auch 54 Patienten mit wahrscheinlicher AD, 25 Männer und 29 Frauen, mittleres Alter + Standardabweichung 73,3 + 7,4 Jahre und 17 gesunde Kontrollen, 4 Männer und 13 Frauen, mittleres Alter + SD bzw. Standardabweichung 68,6 + 7,5 Jahre, untersucht. Das mittlere Alter war signifikant (p < 0,05) höher in der AD-Gruppe als in der Kontrollgruppe. Die Diagnose von "wahrscheinlich AD" wurde durch Ausschließen, gemäß der NINCDS-ADRDA-Kriterien (McKhann et al., 1984), vorgenommen. Die klinische Auswertung und das diagnostische Vorgehen sind andernorts ausführlich beschrieben worden (Andreasen et al., 1998, 1999). Das Ausmaß an Demenz wurde unter Anwendung der MMSE (Folstein, 1975) ausgewertet, und belief sich auf 23,8 + 4,4 in der AD-Gruppe. Die Kontrollgruppe bestand aus Individuen ohne Krankheitsvorgeschichte, Symptome oder Anzeichen einer psychiatrischen oder neurologischen Erkrankung, bösartigen Krankheit oder systemischen Erkrankungen. Individuen mit MMSE-Werten über 28 wurden nicht eingeschlossen. Alle klinischen Diagnosen wurden ohne Kenntnis der Ergebnisse der biochemischen Analysen erstellt, und umgekehrt.
Die Schlaganfall-Patienten wurden durch Computertomographie (CT) und Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) etwa 1 Monat nach dem Schlaganfall untersucht, wie früher ausführlich beschrieben wurde (Tarkowski et al., 1999). Die Größe (in cm²) wurde mittels CT und das Volumen (in ml) mittels MRT bestimmt.
Der Kruskal-Wallis-Test wurde für Vergleiche zwischen drei oder mehr Gruppen angewendet, und falls signifikant, wurde der Mann-Whitney'sche U-Test für Vergleiche zwischen zwei Gruppen angewendet. Der Spearman-Korrelations-Koeffizient wurde für Korrelationen verwendet.
Die Ethik-Komitees der Universitäten von Göteborg und Umeå stimmten der Studie zu. Alle Patienten (oder ihre nächsten Verwandten) und Kontrollen gaben ihre schriftlich mitgeteilte Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie, welche gemäß den Maßgaben der Helsinki-Erklärung durchgeführt wurde.
3.2 Liquor-Analysen
Eine Lumbar-Punktur wurde im Zwischenraum L3/L4 oder L4/L5 durchgeführt. Die ersten 12 ml Liquor wurden in Polypropylen-Röhrchen aufgefangen und vorsichtig vermischt, um mögliche Gradienteneffekte zu vermeiden (Blennow, 1993). Liquorproben mit mehr als 500 Erythrocyten pro μl wurden ausgeschlossen. Die Liquorproben wurden bei 2000 × g 10 Minuten lang zentrifugiert, um Zellen und anderes unlösliches Material zu eliminieren, und Aliquots wurden dann bei –80°C bis zu den biochemischen Analysen aufbewahrt.
Der Spiegel an Liquor-tau wurde unter Verwendung eines Sandwich-ELISA (Innotest hTAU-Ag, Innogenetics, Gent, Belgien) bestimmt, welcher konstruiert war, um Gesamt-tau (sowohl normales tau als auch PHF-tau) zu messen, wie früher ausführlich beschrieben worden ist (Vandermeeren et al., 1993b; Blennow et al., 1995). Der Spiegel an Liquor-Phospho-tau (181) wurde mittels des INNOTEST Phospho-tau (181P) bestimmt, wie oben beschrieben.
3.3 Liquor-Phospho-tau (181) und Liquor-Gesamt-tau in Patienten mit Morbus Alzheimer und in Patienten mit Schlaganfall
In den Schlaganfallpatienten zeigte Liquor-Gesamt-tau eine merkliche Zunahme am Tag 2-3 (24,4 + 7,4 pM; p = 0,002) nach dem akuten Schlaganfall im Vergleich zu Tag 0-1 (Mittelwert + Standardabweichung bzw. SEM: 5,4 + 1,2 pM), und blieb am Tag 7-9 (24,1 + 4,3 pM; p < 0,0001) und nach drei Wochen (25,0 + 4,1 pM; p < 0,0001) erhöht, und kehrte dann auf normale Spiegel nach 3-5 Monaten zurück (8,5 + 1,2 pM; p = 0,35) (8). Die individuellen Werte für Liquor-Gesamt-tau für die neun Patienten mit Liquorproben, welche an der Basislinie erfasst wurden, sind in der 9 angegeben.
Im Gegensatz dazu gab es keine signifikante Änderung hinsichtlich Liquor-Phospho-tau (181) zwischen der Basislinie (Mittelwert + SEM: 9,1 + 3,1 pM) und Tag 2-3 (10,9 + 1,0 pM), Tag 7-9 (13,0 + 2,1 pM), drei Wochen (11,5 + 2, 0 pM) oder 3-5 Monaten (10,6 + 2,0 pM) (8). Die individuellen Werte für Liquor-Phospho-tau (181) für die neun Patienten, bei denen Liquorproben an der Basislinie entnommen wurden, sind in der 9 angegeben.
Liquor-Gesamt-tau war signifikant erhöht bei wahrscheinlicher AD (Mittelwert + SD: 14,4 + 5,5 pM), verglichen zu Kontrollen (8,3 + 2,8 pM) (p < 0,0001).
Auch Liquor-Phospho-tau (181) war signifikant erhöht in wahrscheinlicher AD (20,5 + 6,5 pM), verglichen mit den Kontrollen (15,9 + 5,7 pM) (p < 0,05).
Liquor-Gesamt tau und Liquor-Phospho-tau (181) waren positiv korreliert in den AD- (r = 0,93; p < 0,0001) und in den Kontroll-Gruppen (r = 0,72, p < 0,01) (10). In der Schlaganfallgruppe war die Korrelation am Tag 0-1 (r = 0,63, p < 0,001) und nach 3 Monaten (r = 0,80) höher als am Tag 2-3 (r = 0,54), Tag 7-9 (r = 0,58) und speziell nach drei Wochen (r = 0,15).
Aus der 10 ist es deutlich, dass es einen Unterschied zwischen dem Verhältnis Liquor-phospho-tau (181)/Liquor-Gesamt-tau für Patienten mit Morbus Alzheimer im Vergleich zu Schlaganfall-Patienten gibt. Eine Regressionsanalyse für Werte, erhalten aus Patienten mit Morbus Alzheimer (y = 0,82x + 4,39, r = 0,90, p < 0,0001) und aus Schlaganfall-Patienten (y = 0,17x + 8,09, r = 0,415, p < 0,0001) enthüllte einen signifikanten Unterschied (p < 0,001).
Es bestand eine positive Korrelation zwischen der Größe des Infarkts, wie gemessen durch CT, und dem Maximumspiegel an Liquor-Gesamt-tau (r = 0,72; p < 0,01), während die Korrelation zu Liquor-Phospho-tau (181) nicht signifikant war (r = 0,349). Es gab auch eine positive Korrelation zwischen dem Volumen des Infarkts, wie gemessen mittels MRI, und dem Maximumwert von Liquor-Gesamt tau (r = 0,66; p < 0,05), wohingegen die Korrelation zu Liquor-Phospho-tau (181) nicht signifikant war (r = 0,59).
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SEQUENZ PROTOKOLL

Claims

In-vitro-Verfahren zur Diagnose einer Tauopathie in einem Individuum, wobei man in dem Verfahren: – das Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einer dem Individuum entnommenen Probe bestimmt; – schlußfolgert, daß das Individuum an Tauopathie leidet, indem man das erhaltene Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in der Probe mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einer Kontrollindividuen entnommenen Probe vergleicht, wobei ein gegenüber dem Verhältnis in der Kontrollindividuen entnommenen Probe geändertes Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau ein Anzeichen darstellt.
In-vitro-Verfahren zur differentiellen Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie in einem Individuum, wobei man in dem Verfahren: – das Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einer dem Individuum entnommenen Probe bestimmt; – schlußfolgert, daß das Individuum an Tauopathie leidet, indem man das erhaltene Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in der Probe mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einer an Nicht-Tauopathie leidenden Individuen entnommenen Probe oder mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einer Kontrollindividuen entnommenen Probe vergleicht, wobei ein gegenüber dem Verhältnis in der an Nicht-Tauopathie leidenden Individuen entnommenen Probe oder in der Kontrollindividuen entnommenen Probe geändertes Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau ein Anzeichen darstellt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei der Nicht-Tauopathie um eine Nicht-Tauopathie-Neurodegeneration handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 3, wobei es sich bei der Nicht-Tauopathie um vaskuläre Demenz, Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, Schlaganfall und/oder Neurotoxizität in Patienten mit Leukämie handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei der Tauopathie um Morbus Alzheimer, Morbus Pick, sporadische frontotemporale Demenz und/oder frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus in Verbindung mit Chromosom 17 handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei man in dem Verfahren: – das Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einer dem Individuum entnommenen Liquorprobe bestimmt; – schlußfolgert, daß das Individuum an Tauopathie leidet, indem man das erhaltene Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in der Liquorprobe mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einer an Nicht-Tauopathie leidenden Individuen entnommenen Liquorprobe oder mit dem Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau in einer Kontrollindividuen entnommenen Liquorprobe vergleicht, wobei ein gegenüber dem Verhältnis in der an Nicht-Tauopathie leidenden Individuen entnommenen Liquorprobe oder in der Kontrollindividuen entnommenen Liquorprobe geändertes Verhältnis von Phospho-tau (181) zu Gesamt-tau ein Anzeichen darstellt.
Antikörper, der tau spezifisch erkennt, und Antikörper, der Phospho-tau (181) spezifisch erkennt zur Verwendung in einem Verfahren zur In-vivo-Diagnose einer Tauopathie und/oder zur differentiellen In-vivo-Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie.
Verwendung eines Antikörpers, der tau spezifisch erkennt, und eines Antikörpers, der Phospho-tau (181) spezifisch erkennt, zur Herstellung eines diagnostischen Kits zur In-vivo-Diagnose einer Tauopathie und/oder zur differentiellen In-vivo-Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie.
Synthetisches Phosphopeptid mit zwischen 15 und 100 Aminosäuren, das leicht einen immunologischen Komplex mit dem monoklonalen Antikörper HT7 und dem monoklonalen Antikörper AT270 formen kann, mindestens umfassend: – das minimale HT7-Epitop: PPGQK, (SEQ ID NO 1); und – das minimale AT270-Epitop: PPAPKT(p)P (SEQ ID NO 2).
Phosphopeptid nach Anspruch 9, wobei das Phosphopeptid die folgende Sequenz umfaßt: PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT(p)PPSSGE (SEQ ID NO 3) oder Sequenzvarianten unter der Bedingung, daß diese noch an die monoklonalen Antikörper HT7 und AT270 binden.
Verwendung eines Phosphopeptids nach einem der Ansprüche 9 bis 10 in einem Verfahren zum Messen des Phospho-tau (181)-Spiegels.
Diagnostischer Kit zur Diagnose einer Tauopathie in einem Individuum und/oder zur differentiellen Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie, mindestens umfassend: – einen Phospho-tau (181) spezifisch erkennenden Antikörper; – einen Gesamt-tau erkennenden Antikörper.
Diagnostischer Kit, mindestens umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche 9 bis 10.
Diagnostischer Kit nach einem der Ansprüche 12 bis 13, mindestens umfassend: – einen Phospho-tau (181) spezifisch erkennenden Antikörper; – einen Gesamt-tau erkennenden Antikörper; – ein Peptid nach einem der Ansprüche 9 bis 10.
Verwendung eines diagnostischen Kits nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur In-vitro-Diagnose einer Tauopathie und/oder zur differentiellen In-vitro-Diagnose einer Tauopathie gegenüber einer Nicht-Tauopathie nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Verwendung eines diagnostischen Kits nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur In-vitro-Diagnose von Morbus Alzheimer, Morbus Pick, sporadischer frontotemporaler Demenz und/oder frontotemporaler Demenz mit Parkinsonismus in Verbindung mit Chromosom 17 und/oder zur differentiellen In-vitro-Diagnose von Morbus Alzheimer, Morbus Pick, sporadischer frontotemporaler Demenz und/oder frontotemporaler Demenz mit Parkinsonismus in Verbindung mit Chromosom 17 gegenüber vaskulärer Demenz, Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, Schlaganfall und/oder Neurotoxizität in Patienten mit Leukämie.