JPWO2020105700A1 - 抗体コンジュゲート - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕2種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート。
〔2〕前記2種以上の抗タウタンパク質抗体が、2種以上の抗ヒトタウタンパク質抗体である、〔1〕の抗体コンジュゲート。
〔3〕2種以上の抗タウタンパク質抗体が、配列番号1のアミノ酸配列において153位〜169位の間に存在するエピトープを認識する第1の抗体、および配列番号1のアミノ酸配列において188位〜207位の間に存在するエピトープを認識する第2の抗体を含む、〔2〕の抗体コンジュゲート。
〔4〕前記第1の抗体が認識するエピトープが、PPGQK(配列番号2)であり、前記第2の抗体が認識するエピトープが、DRSGYS(配列番号3)である、〔3〕の抗体コンジュゲート。
〔5〕担体が、標識担体である、〔1〕〜〔4〕のいずれかの抗体コンジュゲート。
〔6〕以下を含む、キット:
(i)2種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート;および
(ii)抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体。
〔7〕前記別のエピトープが、配列番号1のアミノ酸配列において170位〜187位の間または209位〜233位の間に存在するエピトープである、〔6〕のキット。
〔8〕前記別のエピトープが、PPAPKTP(配列番号4)またはPPTREPK(配列番号5)である、〔7〕のキット。
〔9〕2種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートを用いて、サンプル中のタウタンパク質を検出することを含む、タウタンパク質の検出方法。
〔10〕サンプルが、ヒトから採取された体液サンプルである、〔9〕の方法。
〔11〕抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体にサンプルを接触させることをさらに含む、〔9〕または〔10〕の方法。
(i)2種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート;および
(ii)抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体。
タウタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体BT2(エピトープ:DRSGYS(配列番号3)、フジレビオヨーロッパ社製)とペプシンをクエン酸緩衝液(pH3.5)中で混合し、37℃で1時間インキュベートしてペプシン消化を行った。反応を停止させた後、Superdex200カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)によりゲルろ過精製を行い、F(ab’)2断片を得た。次に、精製したF(ab’)2断片の濃度を決定し、必要に応じて、2.5mg/mLの濃度になるように調整した。
タウタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体HT7(エピトープ:PPGQK(配列番号2)、フジレビオヨーロッパ社製)とブロメラインを混合し、37℃で1時間インキュベートしてブロメライン消化を行った。反応を停止させた後、ゲルろ過精製を行い、F(ab’)2断片を得た。次に、精製したF(ab’)2断片の濃度を決定し、必要に応じて、2.5mg/mLの濃度になるように調整した。
得られたBT2のF(ab’)2断片およびHT7のF(ab’)2断片を重量比1:1で混合し、2−メルカプトエチルアミン(2−MEA)塩酸塩を添加して、37℃で90分間インキュベートして、両断片を還元(チオール化)した。さらに脱塩処理し、BT2のFab’断片とHT7のFab’断片の混合物を得た。
モノクローナル抗体BT2とペプシンをクエン酸緩衝液(pH3.5)中で混合し、37℃で1時間インキュベートしてペプシン消化を行った。反応を停止させた後、Superdex200カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)によりゲルろ過精製を行い、F(ab’)2断片を得た。次に、精製したF(ab’)2断片の濃度を決定し、必要に応じて、2.5mg/mLの濃度になるように調整した。
得られたBT2のF(ab’)2断片を、2−MEA塩酸塩を用いて、37℃で90分間インキュベートし、還元して、BT2のFab’断片を得た。
第1および第2のALP標識HT7 Fab’断片は、第1および第2のALP標識BT2 Fab’断片と同様に調製した。
上記にて調製した第1のALP標識BT2 Fab’断片溶液と、第1のALP標識HT7 Fab’断片溶液とを容量比1:1で混合して、第1のALP標識Fab’断片混合物を得た。また、上記にて調製した第2のALP標識BT2 Fab’断片溶液と、第2のALP標識HT7 Fab’断片溶液とを容量比1:1で混合して、第2のALP標識Fab’断片混合物を得た。
固相結合抗体として、181番目のスレオニンがリン酸化されたタウタンパク質を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体AT270(エピトープ:PPAPKT(p)P(配列番号4)、T(p)はリン酸化スレオニン残基を示す)、およびタウタンパク質を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体AT120(エピトープ:PPTREPK(配列番号5))をそれぞれ磁性フェライト粒子に結合した。
具体的には、カルボキシル化された磁性フェライト粒子(富士レビオ社製)にエチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)、およびN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を添加し、25℃で30分ゆるやかに撹拌しながらインキュベートした。洗浄後、マウスモノクローナル抗体AT270を添加し、25℃で1時間ゆるやかに攪拌しながらインキュベートした。反応後、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを添加し、25℃で30分ゆるやかに撹拌しながらインキュベートして反応停止させた。反応停止後、磁性フェライト粒子を磁石で集めて反応液から分離し、粒子を50mM Tris緩衝液(0.15M NaCl、3%BSAを含む、pH7.2)にて洗浄し、AT270結合磁性粒子を得た。得られたAT270結合磁性粒子を0.25mg/mLの濃度になるように50mM MOPS緩衝液に懸濁してAT270結合磁性粒子液を得た。
AT120結合磁性粒子も、AT270結合磁性粒子と同様の方法で作製した。
タウタンパク質の181番目のスレオニンがリン酸化されているリン酸化タウペプチド抗原を、100mM Tris緩衝液を用いて希釈し、各濃度が0、4.5、9、18、36、72、150pMになるようにリン酸化タウ標準溶液を調製した。
実施例2で作製したAT270結合磁性粒子液150μLと、希釈したリン酸化タウ標準溶液100μLを反応槽に分注し、撹拌後37℃で10分間インキュベートした。その後、B/F分離および洗浄を行った。洗浄は、「Lumipulse G(登録商標)」専用洗浄液(Lumipulse G Wash Solution、富士レビオ社製)を用いた。洗浄後、反応槽に、実施例1で作製したハイブリッドコンジュゲートを50mM MOPS緩衝液(1%BSAを含む、pH6.8)で0.2μg/mLに希釈した溶液250μLを分注し、37℃で10分間インキュベートした。その後、B/F分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、化学発光基質である3−(2’−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3’’−ホスホリルオキシ)フェニル−1,2−ジオキセタン・2ナトリウム塩(AMPPD)を含む基質液(Lumipulse G Substrate Solution、富士レビオ社製)200μLを分注し、撹拌後、37℃で5分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム「Lumipulse G」(富士レビオ社製)を用いて行った。
実施例2で作製したAT120結合磁性粒子液150μLと、総タウタンパク質測定用のキャリブレータ試薬(「LUMIPULSE G Total Tau Calibrators set」、富士レビオ社製)または当該キャリブレータ試薬を50mM Tris緩衝液を用いて希釈して調製したタウタンパク質標準溶液75μLと、実施例1で作製したハイブリッドコンジュゲートを50mM Tris緩衝液を用いて0.2μg/mLに希釈した溶液50μLを反応槽に分注し、撹拌後37℃で20分間インキュベートした。その後、B/F分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、AMPPDを含む基質液(Lumipulse G Substrate Solution、富士レビオ社製)200μLを分注し、撹拌後、37℃で5分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム「Lumipulse G」(富士レビオ社製)を用いて行った。
実施例2で作製したAT120結合磁性粒子液150μLと、上記タウタンパク質標準溶液75μLと、ビオチン化モノクローナル抗体BT2およびビオチン化モノクローナル抗体HT7を含む溶液(抗体混合物)50μL(総抗体8μg/mL)を反応槽に分注し、撹拌後37℃で10分間インキュベートした。その後、B/F分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、0.08μg/mLストレプトアビジン標識ALP(SA−ALP)溶液250μLを分注し、37℃で10分間インキュベートした。その後、B/F分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、AMPPDを含む基質液(Lumipulse G Substrate Solution、富士レビオ社製)200μLを分注し、撹拌後、37℃で5分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。
ウシ血清アルブミン(BSA)とGMBSをモル比1:10で混合し、30℃で1時間インキュベートして、BSAのマレイミド化を行った。脱塩した後、実施例1で得られたBT2のFab’断片とHT7のFab’断片の混合物と、マレイミド化BSAとを、モル比2:1で混合し、25℃で1時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、2−MEA塩酸塩を添加することによって停止し、さらに25℃で30分間インキュベートした。次いで、0.5Mヨードアセトアミドを添加し、25℃で30分間インキュベートすることで、反応をクエンチし、コンジュゲート反応混合物を得た。
BSAに2−MEA塩酸塩を添加して、37℃で60分間インキュベートして、還元(チオール化)した。さらに脱塩処理し、チオール化BSAを得た。さらに、チオール化BSAとNHS−PEG4−Bition(サーモフィッシャー社製)をモル比1:25、チオール化BSAと1、2―ビス(マレイミド)エタン(東京化成工業社製)をモル比1:350で混合し、30℃で1時間インキュベートして、BSAのビオチン化、マレイミド化を同時に行った。脱塩した後、実施例1で得られたBT2のFab’断片とHT7のFab’断片の混合物と、ビオチン化マレイミド化BSAとを、モル比2:1で混合し、25℃で1時間インキュベートしてカップリングを行った。カップリング反応は、2−MEA塩酸塩を添加することによって停止し、さらに25℃で30分間インキュベートした。次いで、0.5Mヨードアセトアミドを添加し、25℃で30分間インキュベートすることで、反応をクエンチし、ビオチン化BSAリンカーハイブリッドコンジュゲート2を得た。
モノクローナル抗体BT2とペプシンをクエン酸緩衝液(pH3.5)中で混合し、37℃で1時間インキュベートしてペプシン消化を行った。反応を停止させた後、Superdex200カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)によりゲルろ過精製を行い、F(ab’)2断片を得た。次に、精製したF(ab’)2断片の濃度を決定し、必要に応じて、2.5mg/mLの濃度になるように調整した。
得られたBT2のF(ab’)2断片を、2−MEA塩酸塩を用いて、37℃で90分間インキュベートし、還元して、BT2のFab’断片を得た。
BSAリンカーHT7 Fab’断片は、BSAリンカーBT2 Fab’断片と同様に調製した。
タウタンパク質の181番目のスレオニンがリン酸化されているリン酸化タウペプチド抗原を、100mM Tris緩衝液を用いて希釈し、各濃度が0、40、100、200、400pg/mLになるようにリン酸化タウ標準溶液を調製した。
実施例2で作製したAT270結合磁性粒子液150μLと、希釈したリン酸化タウ標準溶液30μLを反応槽に分注し、撹拌後37℃で10分間インキュベートした。その後、B/F分離および洗浄を行った。洗浄は、「Lumipulse G(登録商標)」専用洗浄液(Lumipulse G Wash Solution、富士レビオ社製)を用いた。洗浄後、反応槽に、実施例5で作製したハイブリッドコンジュゲート反応溶液1または実施例6で作製したハイブリッドコンジュゲート反応溶液2を、250μL分注し、37℃で10分間インキュベートした。その後、B/F分離および洗浄を行った。洗浄後、反応槽に、AMPPDを含む基質液(Lumipulse G Substrate Solution、富士レビオ社製)200μLを分注し、撹拌後、37℃で5分間反応させ、発光量をルミノメーターで測定し、カウント値を得た。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム「Lumipulse G」(富士レビオ社製)を用いて行った。
Claims (11)
- 2種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート。
- 前記2種以上の抗タウタンパク質抗体が、2種以上の抗ヒトタウタンパク質抗体である、請求項1に記載の抗体コンジュゲート。
- 2種以上の抗タウタンパク質抗体が、配列番号1のアミノ酸配列において153位〜169位の間に存在するエピトープを認識する第1の抗体、および配列番号1のアミノ酸配列において188位〜207位の間に存在するエピトープを認識する第2の抗体を含む、請求項2に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記第1の抗体が認識するエピトープが、PPGQK(配列番号2)であり、前記第2の抗体が認識するエピトープが、DRSGYS(配列番号3)である、請求項3に記載の抗体コンジュゲート。
- 担体が、標識担体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 以下を含む、キット:
(i)2種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲート;および
(ii)抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体。 - 前記別のエピトープが、配列番号1のアミノ酸配列において170位〜187位の間または209位〜233位の間に存在するエピトープである、請求項6に記載のキット。
- 前記別のエピトープが、PPAPKTP(配列番号4)またはPPTREPK(配列番号5)である、請求項7に記載のキット。
- 2種以上の抗タウタンパク質抗体を担体に結合させた抗体コンジュゲートを用いて、サンプル中のタウタンパク質を検出することを含む、タウタンパク質の検出方法。
- サンプルが、ヒトから採取された体液サンプルである、請求項9に記載の方法。
- 抗体コンジュゲートに含まれる抗タウタンパク質抗体とは別のエピトープを認識する抗タウタンパク質抗体にサンプルを接触させることをさらに含む、請求項9または10に記載の方法。
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