KR101188861B1

KR101188861B1 - 삼차원적 상호작용을 이용하여 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머로부터 멀티머를 분별 검출하는 방법

Info

Publication number: KR101188861B1
Application number: KR1020117012457A
Authority: KR
Inventors: 성수 알렉산더 안; 임군택; 오현정
Original assignee: 주식회사 피플바이오
Priority date: 2006-04-21
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2012-10-08
Also published as: JP2009534648A; KR20090013186A; US8008026B2; CA2649359A1; EP2010904B1; KR20110081330A; EP2010904A4; US20100021943A1; JP5164971B2; WO2007123345A1; EP2010904A1; AU2007241729A1; KR101132293B1

Abstract

본 발명은 생시료에서 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 고상의 캐리어(solid phase carrier)의 표면에 포획 항체를 3차원적으로 결합시켜 캐리어-포획 항체 복합체를 준비하는 단계로서, 상기 포획 항체는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드의 하나의 특정 에피토프에 결합하고; (b) 검출항체를 준비하는 단계로서, 상기 검출항체가 인식하는 에피토프는 검출항체가 에피토프에 결합한 경우 상기 포획항체의 에피토프에 결합된 포획항체에 의해 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 있는 것을 특징으로 하며; (c) 생시료에 상기 캐리어-포획항체 복합체 및 검출항체를 동시에 반응시키는 단계; 및 (d) 캐리어-포획 항체-멀티머형-검출항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.

Description

삼차원적 상호작용을 이용하여 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머로부터 멀티머를 분별 검출하는 방법{Method for Differentially Detecting a Multimeric Form from a Monomeric Form of Multimer-Forming Polypeptides Through Three-Dimensional Interactions}

본 발명은 삼차원적 상호작용을 이용하여 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.

단백질의 기능은 단백질을 구성하는 폴리펩티드의 멀티머화가 필요하다는 것은 일반적으로 잘 알려져 있다. 그러나, 어떤 단백질에 있어 멀티머 형성은 흔히 질병 또는 질환을 야기한다. 특히, 단백질은 정상적인 상태에서는 모노머로 존재하고 비정상적인 상태에서는 멀티머(또는 응집)로 변환된다(예를 들면, 미스폴딩 형성).

미스폴딩되거나 기능적으로 형성되지 아니한 응집(축적)을 형성된 단백질이 정상적인 생물학적 활성이 없다는 것은 이미 잘 알려져 있다. 단백질이 정확하게 폴딩, 또는 정확하게 폴딩된 것을 유지하지 못하는 경우에는 다양한 생물학적 기능부전(malfuntion)을 야기하기도 하고, 이로 인하여 많은 다양한 질병을 야기한다(Massimo Stefani, et al., J. Mol . Med . 81:678-699(2003); Radford SE, et al., Cell. 97:291-298(1999)). 많은 질병들은 생체내에서 부정확한 구조, 즉 정상적으로 기능하는 기관에서의 단백질과 다른 구조의 단백질 분자로 인하여 야기된다.

예를 들어, 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질병 또는 질환은 알츠하이머, 크로이츠펠트야코프병, 스폰지폼 뇌질환, 파킨스 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 서핀 결핍증, 폐기종, 간경변, 타입 II 당뇨병, 1차 전신성 아밀로이드증, 2차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매, 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병 및 혈투석관련 아밀로이드증이 있다.

응집-관련 질병의 조기 진단은 많이 연구되어져 왔다. 그러나, 모노머형(정상)에서 멀티머형(응집)을 분별적으로 검출하기 위한 어떠한 방법과 연구는 제시되지 못하고 있다.

사람에 있어서 산재성, 변형, 의인성 및 가족성 크로이츠펠드-야곱 증후군, 쿠루, 가족성 치명적 불면증, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 증후군, 양과 염서에서의 스크래피, 고양이에서의 스폰지폼 뇌증, 밍크 스폰지폰 뇌증, 사슴, 엘크 및 무스에서 만성 무기력증, 그리고 소에서의 스폼지폼 뇌증은 치명적인 퇴행성 신경질환이며, 이러한 질병은 전염성 스폰지폼 뇌질환(transmissible spongiform encephalopathies: TSE)으로부터 기인한다(Prusiner S.B. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:13363-13383(1998); and Hope J. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 568-57(2000)). 프라이온 단백질의 비정상적 동형체 또는 스크래피 형(scrapie form)(PrP^Sc)은 TSE의 주요인으로 강력하게 제안되고 있다(Caughey B. Trends Biochem. Sci . 26:235-42(2001)).

프라이온 단백질의 정상형(PrP^c)은 α-사슬과 유동적인 무질서한 부위를 포함하며 모노머형으로 존재하고(Zahn, R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:145-150(2000)), 스크래피 형(PrP^Sc)은 많은 β-쉬트 구조를 가지고 있으며 멀티머형 또는 적어도 이합체 이상으로 존재한다(Caughey, B., et al., J. Biol. Chem .273:32230-35(1998)). α-사슬 구조에서 β-쉬트 구조로의 변화는 신경계 질환을 발생시키는 질병에 있어서 주요 원인이다.

PrP^c는 단백질 가수분해 효소에 민감성(PrP^SEN)을 가지는 반면, PrP^Sc는 단백질 가수 분해에 대한 부분적인 저항성(PrP^RES)을 가지며 고분자 응집체를 형성하는 경향이 있다(Bolton D. C. Lancet . 358:164-5(2001)). 이러한 응집체 형성은 PrP^RES의 형성을 유도하는 구조적 변화에 대한 분석이나 특성을 기술하는데 어렵게 한다.

단백질가수분해효소 K(PK) 절단 방법은 세포형을 절단하고 스크래피형 만을 남겨 놓으며 이는 ELISA에서 검출되는데, PrP (스크래피 형)의 다양한 형태의 저항성을 구별하는데 이용된다. 그러나 PK 절단방법에 대하여는 문제점이 제기되고 있다. 왜냐하면, PrP 컨포메이션, 농도, 조직 항체, 절단 시간 및 완충액은 PK 민감도에 영향을 줄 수 있으며, 이는 PK 절단 방법에 대한 신뢰도를 크게 감소시키기 때문이다.

따라서, 모노머형 (예를 들면, PrP^C, PrP의 세포형)으로부터 멀티머형 (예를 들면, PrP^Sc, PrP의 스크래피형)을 보다 믿을 수 있고 편리하게 분별 검출할 수 있는 새로운 방법에 대한 필요성이 대두되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 목적은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공한다: (a) 고상의 캐리어(solid phase carrier)의 표면에 포획항체를 3차원적으로 결합시켜 캐리어-포획항체 복합체를 준비하는 단계로서, 상기 포획항체는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드의 하나의 특정 에피토프에 결합하고; (b) 검출항체를 준비하는 단계로서, 상기 검출항체가 인식하는 에피토프는 검출항체가 에피토프에 결합한 경우 상기 포획항체의 에피토프에 결합된 포획항체에 의해 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 있는 것을 특징으로 하며; (c) 생시료에 상기 캐리어-포획항체 복합체 및 검출항체를 동시에 반응시키는 단계; 및 (d) 캐리어-포획항체-멀티머형 폴리펩타이드-검출항체 복합체를 검출하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하기 위한 키트를 제공한다: (a) 고상의 캐리어(solid phase carrier)의 표면에 3차원적으로 결합되어 있고, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드의 하나의 특정 에피토프에 결합하는 포획항체; 및 (b) 상기 포획항체의 에피토프에 결합된 포획항체에 의해 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 있는 에피토프를 인식하는 검출항체.

본 발명은 항원-항체 반응인 면역분석을 이용하여 생시료에서 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 모노머형으로부터 분별적으로 검출하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 멀터머-형성 폴리펩타이드와 결합하는데 있어 경쟁적인 관계인 2종 항체 즉, 포획 항체 및 검출 항체를 이용한다. 경쟁적인 항체는 입체적 방해를 일으킨다. 특히, 멀티머-형성 폴리펩타이드의 에피토프에 결합된 포획 항체는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 에피토프에 결합에 있어 검출항체와 경쟁적이기 때문에 검출 항체가 멀티머-형성 폴리펩타이드의 에피토프에 결합하는 것을 억제한다. 본 발명의 특징 중에 하나는 3차원적 결합에 대한 면역분석을 이용한다. 본 발명에서, 포획 및 검출 항체는 생시료에서 항원과 3차원적 결합을 한다.

본 발명자들은 이미 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 모노머형으로부터 분별적으로 검출하는 방법을 이미 개발하였고, 이를 멀티머 검출 시스템(Multimer Detection System: MDS)로 명명하고, PCT 출원하였다(PCT/KR2005/004001). 본 발명은 실시예 15에서 기술하였듯이, 검출도 및 분별력에 있어서 MDS를 향상시켰다. 본 발명의 가장 큰 특징은 포획항체와 검출항체가 3차원적으로 분석대상의 시료와 접촉하는 것이므로, 본 발명에서 제시되는 방법을 “MDS-3D(threedimensional) 시스템”으로 명명한다.

본 명세서에서 용어 “멀티머-형성 폴리펩타이드”는 응집형(aggregation form), 특히 컨포메이션의 변화에 의해 응집형을 형성할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 응집형 폴리펩타이드는 다양한 질환, 예컨대, 알츠하이머질환, 크로이츠펠드-야곱 증후군, 스폰지폼 뇌질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측색 경화증, 서핀 결핍 질환(Serpin deficiency), 폐기종, 간경변, 타입 II 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매, 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병 및 혈투석-관련 아밀로이드증을 유발한다. 따라서 용어 “멀티머-형성 폴리펩타이드”는 “응집형-형성 폴리펩타이드”와 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명은 2종의 항체, 즉 포획항체 및 검출항체를 이용한다. 용어 “포획 항체”는 생시료 내의 타깃으로 하는 멀티머-형성 폴리펩타이드에 결합능을 가지는 항체를 의미한다. 용어 “검출항체”는 포획항체에 의해 포획된 멀티머-형성 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “항체”는 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 항체는 전 항체(entire antibody)뿐만 아니라, 에피토프, 항원 또는 항원성 단편에 결합능을 가지는 항체 단편(예컨대, F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv)도 포함한다.

본 발명에 따르면, 검출항체와 포획항체에 특이적으로 인식되는 에피토프들은 여기에 결합하는 항체들간에 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 곳에 위치한다. 바람직하게는, 포획항체의 에피토프와 검출항체의 에피토프의 아미노산 서열은 동일하거나, 중첩되거나 또는 인접한 아미노산 서열을 가진다. 포획항체의 에피토프와 검출항체의 에피토프의 아미노산 서열이 동일하거나 중첩된 경우에는 여기에 결합된 포획항체와 검출항체가 서로 입체적 방해, 즉 경쟁적 결합을 하게 되는 것은 쉽게 이해할 수 있다. 또한, 상기 2종의 에피토프가 서로 인접한 아미노산 서열이라는 것은, 상술한 입체적 방해, 즉 경쟁적 결합을 유발할 수 있을 정도의 거리에 있는 아미노산 서열이라는 의미를 가진다.

본 명세서에서 용어 “중첩”은 에피토프와 포획 항체 및 검출 항체의 아미노산 서열이 동일 또는 부분적으로 일치하는 것을 의미한다. 예를 들면, T2 및 3E7 항체에 대한 에피토프는 각각 소 프라이온 단백질 아미노산 서열의 147-152 및 140-160이며, 완전하게 중첩된다. 게다가, ICSM35와 1E4 항체에 대한 에피토프는 소 프라이온 단백질 아미노산 서열의 104-113 및 108-119이며, 부분적으로 중첩된다.

에피토프가 인접하는 경우에는 두 항체의 입체적 방해를 일으키기 때문에, 멀티머형 폴리펩티드에서 하나의 특정 에피토프(포획 항체가 인식하는 에피토프)는 다른 하나의 특정 에피토프(검출 항체가 인식하는 에피토프)와 인접하지 않는 곳에 위치한다.

본 발명의 특징 중 하나는, 고상의 캐리어(solid phase carrier)의 표면에 포획항체를 3차원적으로 결합시켜 캐리어-포획항체 복합체를 준비하는 것이다. 예컨대, 입체적 비드 표면에 포획항체를 결합시키는 것이 이에 해당한다. 그러나 플레이트 표면상에 포획항체를 결합시키는 것은 2차원적인 결합이므로 본 발명에서 제외된다. 이렇게 입체적으로 캐리어에 결합된 포획항체는 3차원 방식으로 생시료와 접촉하게 되며, 이는 생시료와 접촉할 수 있는 기회를 더 많이 갖도록 한다.

포획항체가 결합되는 고상의 캐리어는 입체적 구조를 가지는 어떠한 물질도 가능하며, 바람직하게는, 무게(gravity), 전하 또는 자기에 의해 쉽게 분리 또는 회수될 수 있는 물질이다. 가장 바람직하게는, 고상의 캐리어는 자성비드이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 검출항체에는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있거나 친화성 물질이 결합되어 있다. 상기 레이블은 효소(예컨대, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, β-글루코시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C¹⁴ 및 I¹²⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 검출을 용이하게 하기 위하여, 검출항체에 결합될 수 있는 친화성 물질은 바이오틴을 포함한다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies : A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y(1988)에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

검출항체에 결합하는 레이블로서 방사능동위원소가 이용되는 경우에는, 본 발명의 최종 과정에서 형성된 항원-항체 복합체를 방사능을 측정함으로써 검출할 수 있다. 검출항체에 결합하는 레이블로서 발색반응을 촉매하는 효소가 이용되는 경우에는, 효소반응에 이용되는 기질을 본 발명의 측정 시스템에 첨가하여 반응 생성물을 측정하여, 항원-항체 복합체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 레이블로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-ASB1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용 될 수 있고, 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노 에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine) 및 ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate])와 같은 기질이 이용될 수 있다.

검출항체에 친화성 물질이 결합되는 경우에는, 이 친화성 물질에 결합하는 파트너에 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블(예컨대, 발색 반응-촉매 효소)이 결합된 물질을 이용하여 항원-항체 복합체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 바이오틴이 결합된 검출항체를 이용하는 경우에는, 스트렙타비딘이 결합된 발색 반응-촉매 효소(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)를 항원-항체 복합체에 처리한 다음, 발색 반응 기질을 반응시켜 나오는 시그널을 검출함으로써, 항원-항체 복합체를 검출하게 된다.

이러한 표지는 상기 단계 (d)에서 멀티머형 항원-항체 복합체의 검출을 용이하게 할 뿐만 아니라 정량적 분석도 가능하게 한다. 검출항체에 표지가 결합된 경우, 단계 (d)는 폴리펩타이드의 멀티머형에 결합된 검출항체의 표지로부터 나오는 신호를 측정하여 실시된다.

포획항체와 검출항체로 구성된 바람직한 항체 세트는 소 프라이온 아미노산 서열 140-160의 에피토프를 인식하는 포획항체와 소 프라이온 아미노산 서열 147-152의 에프토프를 인식하는 검출항체를 포함한다. 다른 바람직한 항체세트는 소 프라이온 아미노산 서열 104-113의 에피토프를 인식하는 포획항체와 소 프라이온 아미노산 서열 108-119의 에프토프를 인식하는 검출항체를 포함한다.

본 발명의 특징 중 하나는, 캐리어-포획항체와 검출항체를 시료에 동시에 처리하는 것이다. 만일, 두 항체를 동시에 처리하지 않고, 포획항체를 먼저 처리한 다음 검출항체를 처리하게 되면, 유리 상태(free form)의 캐리어-포획항체는 플레이트의 표면에 고정되어 있는 항체와는 달리 멀티머형에 존재하는 다수의 에피토프에 결합함으로써, 나중에 검출항체가 에피토프(상기 포획항체에 대한 에피토프와 동일, 중첩 또는 인접한 에피토프)에 결합하는 것을 입체적으로 방해하는 문제점이 있다. 따라서 별도 처리를 하게 되면, 검출항체에 의한 시그널이 매우 미약하게 나온다. 그러나 두 항체를 동시에 처리하면, 포획항체와 검출항체가 에피토프에 서로 경쟁적인 상태에 놓이게 되며, 농도-의존적으로 두 항체가 에피토프에 결합하게 된다.

본 명세서에서 캐리어-포획항체와 검출항체를 언급하면서 사용되는 용어 “동시 처리”는 (i) 캐리어-포획항체와 검출항체 각각을 시료에 동시에 처리하는 것 또는 (ii) 캐리어-포획항체와 검출항체의 혼합 칵테일을 시료에 처리하는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 포획항체와 검출항체는 몰비 5:1-1:5로 동시에 첨가되고, 보다 바람직한 몰비는 3:1-1:3이며, 보다 더 바람직한 몰비는 2:1-1:2이고, 가장 바람직한 포획항체와 검출항체의 몰비는 1:1이다.

본 발명의 방법으로 MDS-3d-Single Bead 시스템을 실시하는 경우, 바람직하게는 단계 (c)에서 캐리어-포획항체와 캐리어-검출항체의 몰비 5:1-1:5로 동시에 첨가되며, 보다 바람직한 몰비는 3:1-1:3이고, 가장 바람직한 몰비는 2:1이다.

본 발명은 어떠한 멀티머-형성 폴리펩타이드도 멀티머형을 모노머형으로부터 분별적으로 검출할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 검출할 수 있는 멀티머-형성 폴리펩타이드는 알츠하이머 질환에 관여하는 Aβ 펩타이드과 tau 단백질, 스폰지폼 뇌질환 및 크로이츠펠트야코프병에 관여하는 프라이온, 파킨슨 질환에 관여하는 α-시누클레인, 일차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 Ig 경사슬, 이차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 혈청 아밀로이드 A, 프론토-일시적 치매에 관여하는 tau 단백질, 노인 전신성 아밀로이드증에 관여하는 트랜스티레틴, 가족성 아밀로이드 다발신경병에 관여하는 트랜스티레틴, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병에 관여하는 시스타틴 C, 혈투석-관련 아밀로이드증에 관여하는 β₂-마이크로글로블린, 헌팅톤 질병에 관여하는 헌팅틴, 근위축성 측착 경화증에 관여하는 SOD(superoxide dismutase), 서핀 결핍증에 관여하는 서핀(Serpin), 폐기종, 간경변 및 2형 당뇨병에 관여하는 아밀린(amyline)이다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 검출 대상의 멀티머-형성 폴리펩 타이드는 크로이츠펠트야코프병 및 스폰지폼 뇌질환 프라이온 단백질이다.

본 발명의 방법은 이러한 프라이온 단백질의 구조적 변화(conformation change)에 따른 멀티머형 프라이온, 즉 PrP^Sc으로 형성된 멀티머의 검출에 매우 유용하다.

본 발명의 방법이 PrP^Sc에 의해 형성되는 멀티머의 검출에 이용되는 경우에는, 상기 폴리펩타이드의 모노머형은 PrP^c(cellular form of prion)이고, 멀티머형은 PrP^Sc으로 형성된 멀티머이다.

본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 반복되지 않는 서열(non-repeated sequence)을 에피토프로 가지는 항체를 이용하는 것이다. 만일, 항체가 인식하는 에피토프가 반복서열인 경우에는 본 발명의 방법은 모노머형으로부터 멀티머형을 효과적으로 분별하여 검출할 수 없다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 포획항체 및/또는 검출항체가 인식하는 폴리펩타이드의 에피토프는 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열이다.

본 발명에 이용되는 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology , 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature , 352:624-628(1991); 및 Marks et al, J. Mol.Biol. , 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York(1988); Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques , CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida(1984); 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY , Wiley/Greene, NY(1991)에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 효소 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용하는 포획항체 또는 검출항체 칵테일은 포획 항체 칵테일이 검출 항체와 동일 또는 중첩된 에피토프와 반응하는 경우와 검출 항체 칵테일이 포획 항체와 동일 또는 중첩된 에피토프와 반응하는 경우에만 유용하게 사용될 수 있다. 실시예 13 및 14에서 알 수 있듯이, 본 발명에서 사용하는 포획 항체 또는 검출 항체 칵테일은 PrP^c에서 PrP^Sc를 분별적으로 검출한다.

본 명세서에서 용어 “생시료(biosample)"는 검사 대상의 유기체-유래 시료를 의미한다. 생시료는 세포, 조직, 생체액, 본 발명을 실시하는데 바람직한 기타 매개물(medium), 인간 또는 동물로부터 시료 또는 동물 또는 인간 배설물을 포함한다. 바람직하게는, 생시료는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 밀크, 오줌, 분변, 침, 정액, 뇌추출액 (예컨대, 뇌 균질액), 척수액 (SCF), 충수액, 비장액 및 편도선 조직 추출물을 포함하는 생체액이다. 보다 바람직하게는, 생시료는 뇌균질액 또는 혈장이며, 가장 바람직하게는 혈장이다.

생시료가 뇌 균질액인 경우 본 발명의 방법은 생시료를 프로테아제 K 또는 트립신으로 전처리하는 과정을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.

그러나, 생시료가 혈액 또는 혈장인 경우에는 생시료에 프로테아제 K로 전처리 하지 않는 것이 바람직하다. 왜냐하면 프로테아제 전처리를 하면 멀티머형, 특히 본 발명의 방법으로 PrP^Sc을 검출하는데 있어 검출도 및 분별력을 상당히 감소시키는 결과를 나타내기 때문이다. 실시예 10에 기술하였듯이, 본 발명의 방법으로 혈액 또는 혈장 시료에서 PrP^Sc 검출하는데 있어 프로테아제 절단이 필요하지 않음을 확인할 수 있다.

한편, 생시료가 혈액 또는 혈장인 경우, 사코실(sarkosyl) 또는 Triton 계열(예컨대, Triton X-100) 디터젼트, 보다 바람직하게는, Triton 계열, 가장 바람직하게는 Triton X-100로 생시료를 전처리하는 과정을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다. 생시료 (바람직하게는 혈액, 가장 바람직하게는 혈장)를 준비하기 위하여, 바람직한 완충액은 TBST(tris-buffered saline with Tween 20)과 트리신(tricine)이다. 바람직하게는 단계 (c)에서 생시료 (바람직하게는 혈액, 가장 바람직하게는 혈장)의 농도는 10 v/v%에서 70 v/v%이며, 보다 바람직하게는 20 v/v%에서 40 v/v%이고, 가장 바람직하게는 23 v/v%에서 30 v/v%이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공한다: (a) 자성 비드의 표면에 포획항체를 3차원적으로 결합시켜 자성 비드-포획항체 복합체를 준비하는 단계로서, 상기 포획항체는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드의 하나의 특정 에피토프에 결합하고; (b) 검출항체를 준비하는 단계로서, 상기 검출항체가 인식하는 에피토프는 검출항체가 에피토프에 결합한 경우 상기 포획 항체의 에피토프에 결합된 포획항체에 의해 입체적 방해 (steric hindrance)를 일으키는 위치에 있는 것을 특징으로 하며; (c) 생시료에 상기 자성비드-포획항체 복합체 및 검출항체를 동시에 반응시키는 단계; (d) 상기 단계 (c)의 결과물에 자기장을 적용하는 단계; 및 (e) 상기 단계 (c)에서 형성된 자성비드-포획항체-멀티머형 폴리펩타이드-검출항체 복합체를 검출하는 단계.

바람직하게는, 본 발명의 방법은 단계 (d) 및 단계 (e)사이에 분리된 포획 항체-멀티머형-검출 항제 복합체를 세척하는 단계를 더 포함한다. 세척 단계에서는 PBS (phosphate-buffered saline), PBST (phosphate-buffered saline with Tween 20), PBSX (phosphate-buffered saline with Triton X-100), TBSX (tris-buffered saline with triton-100) 및 TBST (tris-buffered saline with Tween 20)과 같은 다양한 세척 완충액을 이용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 세척 단계에서는 TBST 세척 완충액을 이용한다.

캐리어로서 자성비드를 이용하는 본 발명 방법의 일 실시예는 도 1a에 나타나 있다. 도 1a을 참조하여, 본 발명의 방법을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다: 만일, 검체에 PrP의 다양한 형태, 즉 PrP^c 및 PrP^Sc가 있는 경우, 이 검체를 포획항체가 코팅된 자성 비드와 검출항체에 동시에 적용시키면, HRP-검출항체는 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^c에는 결합할 수 없고, 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^Sc에만 결합하게 된다. 또한, 이용된 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 반복되지 않는 서열을 에피토프로 인식하는 것이다. 또한, 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 동일한, 중첩된 또는 인접한 에피토프를 인식한다. 도 1a에서, 에피토프는 삼각형으로 나타나 있다. 검출항체에 의해 인식되는 에피토프는 포획항체와 이미 결합되어 있기 때문에, 이러한 에피토프를 하나만 가지고 있는 PrP^c에는 검출항체가 결합하지 않는다. 그러나, PrP^Sc에 의해 형성된 멀티머 형에는 동일 에피토프가 다수 존재하기 때문에 검출항체가 결합하게 된다. 항원-항체 반응 후, 자기장을 부여하여, 자성비드를 수집하고 이어 세척을 한 다음, HRP의 기질로 발색, 형광 또는 발광반응을 유도한다. 최종적으로, 상기 발색, 형광 또는 발광반응을 측정하여, PrP^Sc로 구성된 멀티머-항체 복합체의 존재 또는 양을 분석한다.

본 발명의 키트의 바람직한 구현예에 따르면, 캐리어-포획항체 및 검출항체는 몰비 5:1-1:5, 보다 바람직하게는 몰비 3:1-1:3, 보다 더 바람직하게는 2:1-1:2, 가장 바람직하게는 몰비 약 1:1의 칵테일 형태로 포함된다. 본 발명의 키트는, 자기장 플레이트, 완충용액, 발색효소, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 MDS-3D 시스템은 MDS-3D Single Bead 시스템 및 MDS-3D Dual Bead 시스템을 포함한다.

MDS-3D Single Bead 시스템(참조: 도 1a)은 상술한 바와 같이, 비드에 결합된 포획항체를 이용하는 것이며, MDS-3D Dual Bead 시스템(도 1b 및 도 1c)은 포획항체 및 검출항체 모두 비드에 결합된 것을 이용하는 것이다.

MDS-3D Dual Bead 시스템에 따르면, 상기 검출항체는 고상의 캐리어의 표면에 3차원적(즉, 입체적)으로 결합되어 있다. 이렇게 입체적으로 캐리어에 결합된 검출항체는 3차원 방식으로 그리고 보다 집중된 방식(concentrated manner)으로 멀티머형 폴리펩타이드와 접촉하게 된다.

검출항체가 결합되는 고상의 캐리어는 입체적 구조를 가지는 어떠한 물질도 가능하며, 바람직하게는, 무게, 전하 또는 자기에 의해 쉽게 분리 또는 회수될 수 있는 물질이다. 가장 바람직하게는, 고상의 캐리어는 라텍스 비드이다. 검출항체가 결합되는 캐리어에는 표지물질이 결합될 수 있다. 이와 같이 캐리어에 표지물질이 결합된 경우, 예컨대 형광물질이 있는 라텍스 비드를 이용하는 경우, 검출항체에 표지(예컨대, HRP)를 결합시키지 않아도 캐리어로부터 나오는 안정된 최종검출 시그널(멀티머형 존재를 가리키는 시그널)을 얻을 수 있다.

MDS-3D Dual Bead 시스템은, 싱글 라벨을 사용하는 MDS-3D Dual Bead 시스템 (참조: 도 1b) 및 더블 라벨을 사용하는 MDS-3D Dual Bead 시스템 (참조: 도 1c)을 더 포함한다.

싱글 라벨을 사용하는 MDS-3D Dual Bead 시스템에 따르면, 검출항체 또는 캐리어에 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있다. 더블 라벨을 사용하는 MDS-3D Dual Bead 시스템에 따르면, 캐리어와 검출항체 둘 모두에 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있다. 이러한 이중적인 레이블링은, 캐리어로부터 나오는 시그널 및 검출항체로부터 나오는 시그널을 상호 체크가 가능하다는 이점이 있다.

도 1b를 참조하여 실글 라벨을 사용하는 MDS-3D Dual Bead 시스템을 설명하면 다음과 같다. 만일, 검체에 PrP의 다양한 형태, 즉 PrP^c 및 PrP^Sc가 있는 경우, 이 검체를 포획항체가 코팅된 자성 비드와 검출항체에 동시에 적용시키면, Fluor-검출항체(형광물질이 결합되어 있는 라텍스 비드에 결합된 검출항체)는 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^c에는 결합할 수 없고, 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^Sc에만 결합하게 된다. 이용된 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 반복되지 않는 서열을 에피토프로 인식하는 것이다. 또한, 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 동일한, 중첩된 또는 인접한 에피토프를 인식한다. 도 1b에서, 에피토프는 삼각형으로 나타나 있다. 검출항체에 의해 인식되는 에피토프는 포획항체와 이미 결합되어 있기 때문에, 이러한 에피토프를 하나만 가지고 있는 PrP^c에는 검출항체가 결합하지 않는다. 그러나, PrP^Sc에 의해 형성된 멀티머형에는 에피토프가 다수 존재하기 때문에 검출항체가 결합하게 된다. 항원-항체 반응 후, 자기장을 부여하여, 자성비드를 수집하고 이어 세척을 한 다음, 형광을 측정하여, PrP^Sc로 구성된 멀티머-항체 복합체의 존재 또는 양을 분석한다.

도 1c를 참조하여 더블 라벨을 사용하는 MDS-3D Dual Bead 시스템을 설명하면 다음과 같다. 만일, 검체에 PrP의 다양한 형태, 즉 PrP^c 및 PrP^Sc가 있는 경우, 이 검체를 포획항체가 코팅된 자성 비드와 검출항체에 동시에 적용시키면, Fluor-HRP-검출항체(형광물질이 결합되어 있는 라텍스 비드에 결합된 검출항체로서 검출항체에는 HRP가 결합되어 있다)는 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^c에는 결합할 수 없고, 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^Sc에만 결합하게 된다. 이용된 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 반복되지 않는 서열을 에피토프로 인식하는 것이다. 또한, 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 동일한, 중첩된 또는 인접한 에피토프를 인식한다. 도 1c에서, 에피토프는 삼각형으로 나타나 있다. 검출항체에 의해 인식되는 에피토프는 포획항체와 이미 결합되어 있기 때문에, 이러한 에피토프를 하나만 가지고 있는 PrP^c에는 검출항체가 결합하지 않는다. 그러나, PrP^Sc에 의해 형성된 멀티머형에는 에피토프가 다수 존재하기 때문에 검출항체가 결합하게 된다. 항원-항체 반응 후, 자기장을 부여하여, 자성비드를 수집하고 이어 세척을 한 다음, HRP에 의한 반응 산물 및/또는 형광을 측정하여, PrP^Sc로 구성된 멀티머-항체 복합체의 존재 또는 양을 분석한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 모노머형(정상)에서 멀티머형(응집)을 분별적으로 검출하기 위한 방법을 제공할 수 있다.

(b) 본 발명은 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질병을 조기 진단을 위한 방법을 제공할 수 있다.

도 1a는 본 발명의 방법의 구체적인 일 구현예인 MDS-3D-Single Bead(Multimer Detection System-3 Dimensional-Single Bead) 시스템의 작동원리를 보여주는 개념도이다.
도 1b는 본 발명의 방법의 구체적인 다른 구현예인 MDS-3D-Dual Bead 시스템의 작동원리를 보여주는 개념도이다.
도 1c는 본 발명의 방법의 구체적인 다른 구현예인 이중으로 레이블링된 MDS-3D-Dual Bead 시스템의 작동원리를 보여주는 개념도이다.
도 2는 본 발명에 따라 자성비드-포획항체 및 검출항체를 시료에 동시에 처리한 경우(simultaneous)와 별도로 처리한 경우(step-by-step), 멀티머형 프라이온 단백질을 검출한 실험 결과를 보여주는 그래프이다. “N”및 “Sc”는 정상 혈장 및 PrP^Sc가 함유된 혈장을 각각 의미하고, “RLU”는 상대적 광 단위를 의미한다.
도 3a은 MDS-3D-Single Bead 시스템에 적합한 완충액을 선별하기 위한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3b는 도 3a 결과를 PrP^Sc혈장 시료의 시그널 대 정상 혈장 시료의 시그널의 비로 나타낸 그래프이다.
도 4는 3E7 항체 및 MA1 750 항체를 이용하는 MDS-3D-Dual Bead 시스템에 의한 혈장 내 멀티머형 멀티머형 프리온 단백질 검출 결과를 보여주는 그래프이다. “RLU”는 상대적 형광 단위를 의미한다.
도 5는 MDS-3D-Dual Bead 시스템에 적합한 완충액을 선별하기 위한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 MDS-3D-Dual Bead 시스템에서 적합한 혈장 시료 농도를 선별하기 위한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 MDS-3D-Single Bead 시스템에서 적합한 혈장 시료 농도를 선별하기 위한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 T2 항체 및 MA1 750 항체를 이용하는 MDS-3D-Dual Bead 시스템을 실시하여, 혈장 내에서 멀티머형 프리온 단백질을 검출한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9는 혈장 시료 준비를 위하여 디터젼트(detergent)의 농도 및 타입을 다양하게 하면서 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하여, 혈장 내에서 멀티머형 프리온 단백질을 검출한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 혈장 시료 및 항체와 함께 배양된 비즈를 세척하기 위하여 다양한 세척 완충액과 함께 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하여, 혈장 내에서 멀티머형 프리온 단백질을 검출한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하여, 30% 및 100%의 혈장 내에서 멀티머형 프리온 단백질을 검출한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하여, 20% 및 25%의 혈장 내에서의 멀티머형 프리온 단백질을 검출한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하여, 혈장 내에서 멀티머형 프리온 단백질을 검출에 있어서 프로테아제 K의 분해에 대한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 14a는 항체의 비율을 다양하게 하면서 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하여, 혈장 내 멀티머형 프리온 단백질 검출에 대한 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 14b는 항체의 비율을 다양하게 하면서 MDS-3D-Dual Bead 시스템을 실시하여, 혈장 내 멀티머형 프리온 단백질 검출에 대한 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 15a 및 15b는 포획 항체 칵테일과 함께 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하여, 혈장 내에서 멀티머형 프리온 단백질 검출에 대한 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 15c는 검출 항체 칵테일과 함께 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하여, 혈장 내에서 멀티머형 프리온 단백질 검출에 대한 분석 결과를 보여주는 그래프이다. 왼쪽 및 오른쪽 바들은 (i) 포획 항체로서 3E7-bead 및 검출 항체 칵테일로서 T2-바이오틴 및 MAI-바이오틴 (ii) 포획 항체로서 MAI-bead 및 검출 항체 칵테일로서 T2-바이오틴 및 3E7-바이오틴을 각각 나타낸다.
도 16은 MDS 및 MDS-3D-Single Bead 시스템의 검출력에 대한 비교 결과를 보여주는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 I: MDS -3D- Single Bead 시스템에 따른 혈장 내 멀티머형 PrP 검출

2705 ㎕의 양 혈장, 22.5 ㎕ 재조합 멀티머형 양 PrP(지노타입 ARQ, 120배 희석된 것) 및 3605 ㎕ 2.5 x 디터전트(detergent)(3% Triton X-100, 1.5% Na 디옥시촐레이트 및 0.25% 사코실 포함)을 포함하는 시료를 제조하였다. 또한, 상기 시료에서 재조합 멀티머형 양 PrP 대신에 22.5 ㎕의 PBS를 포함하는 음성 대조군을 제조하였다. 한편, 자성 비드에 포획항체를 결합시키되, 자성 비드2.5 ㎕에 포획항체가 1 ㎍이 결합되도록 결합시켰다. 자성 비드에 결합시킨 포획항체는 3E7 또는 MA1-750 단일클론항체이다. 3E7 단일클론 항체는 PrP^c의 아미노산 140-160(소 프라이온 기준) 또는 132-152(양 프라이온 기준)을 에피토프로 인식하는 것으로서, 상기 에피토프 서열은 PrP^c에서 반복되지 않는다. MA1-750 단일클론 항체는 PrP^c의 Ser-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg 에피토프를 인식하는 것으로서, 상기 에피토프 서열은 PrP^c에서 반복되지 않는다.

이어, 상기 시료에 자성비드-포획항체 복합체 및 검출항체를 동시에 혈장 시료와 반응시켜 멀티머형 양 PrP를 검출할 수 있는 지 여부를 조사하였다. 검출항체로 이용한 것은, 3B8/D5-HRP 또는 T2-HRP 이다. T2 단일클론 항체는 Hiroko Hayashi, et al., J. Vet . Med . Sci ., 66(6):515(2004)에 개시되어 있으며, PrP^c의 아미노산 서열 147-152(소 프라이온 기준), 140-145(양 프라이온 기준) 에피토프에 특이적으로 반응하는 항체이다. 3B8/D5 단일클론 항체의 에피토프는 PrP^c의 아미노산 132-152(양 프라이온 기준), 140-160(소 프라이온 기준)이다.

상기 시료에 자성비드-포획항체 복합체 및 검출항체를 다음 표 1의 양으로 동시에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 자기장을 반응 혼합물에 부여하여 자성비드를 분리하고 자성비드를 TBST로 3회 세척한 다음, ECL(enhanced chemiluminescence) 검출을 실시하였다.

실험	항체	사용량
실험 1	비드-3E7	7.5 ㎕
실험 1	3B8/D5-HRP	1 ㎕
실험 2	비드-3E7	5 ㎕
실험 2	3B8/D5-HRP	2 ㎕
실험 3	비드-3E7	2.5 ㎕
실험 3	3B8/D5-HRP	3 ㎕
실험 4	비드-3E7	2.5 ㎕
실험 4	T2-HRP (36 ㎍/ml)	3.3 ㎕
실험 5	비드-MA1-750	2.5 ㎕
실험 5	T2-HRP (36 ㎍/ml)	3.3 ㎍

한편, 비료 실시예로서 자성비드-포획항체 복합체를 시료와 우선적으로 반응시킨 다음, 검출항체를 반응시키는 프로토콜로 실시하였다.

시료를 상술한 바와 같이 동일하게 준비하였다. 이어, 자성비드-포획항체 복합체를 시료에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 자기장을 반응 혼합물에 부여하여 자성비드를 분리하고 자성비드를 TBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 분리된 자성비드에 검출항체를 처리하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서, 자기장을 반응 혼합물에 부여하여 자성비드를 분리하고 자성비드를 TBST로 3회 세척하였다. 최종적으로 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출을 실시하였다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따라 자성비드-포획항체(3E7 항체) 및 검출항체(T2-HRP)를 시료에 동시에 처리한 경우에는 분리 처리한 경우와 비교하여 검출 시그널이 매우 높게 나와, 프라이온 검출 민감도가 크게 증가됨을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 자성비드-포획항체 및 검출항체를 시료에 동시에 처리한 경우에는 분리 처리 (step by step)한 경우와 비교하여, 정상형 프라이온에 대한 시그널 세기 대비 멀티머형 프라이온의 시그널 세기의 비율이 동시 처리의 경우보다 훨씬 증가하여 멀티머형 프라이온에 대한 분별력이 매우 크게 향상됨을 알 수 있다.

실시예 II : MDS -3D- Single Bead 시스템에 대한 적합한 완충액의 분석

MDS-3D-Single Bead 시스템에 적합한 완충액을 선별하기 위하여, 자성 비드에 결합된 포획항체 3E7, 3E7-bead 및 검출항체 T2-HRP를 1:1 비율(0.8 ㎍:0.8 ㎍)로 이용하여 Single Bead 시스템을 실시하였다. 시료는 다음과 같이 준비하였다: 10% Triton X-100 in d-H₂O 120 ㎕, 완충액(TAPS, TBST 또는 Tricine, pH 8.0) 580 ㎕ 및 양의 혈장 300 ㎕을 혼합하여 1.2% Triton X-100 및 30% 혈장을 포함하는 총 부피 1 ㎖의 시료를 준비하였다. 포획항체로서의 3E7-결합 자성 비드 2 ㎕ (0.8㎍) 및 검출항체로서의 T2-HRP(4 ㎍/㎖ in TBST) 200 ㎕(0.8 ㎍)을 혼합하여 혼합 항체를 준비하였다. 시료 1 ㎖에 상기 혼합항체 200 ㎕를 첨가하고 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 자기장을 반응 혼합물에 부여하여 자성비드를 분리하고 자성비드를 TBST로 3회 세척한 다음, ECL 검출을 실시하였다(도 3a 및 3b). 도 3a 및 3b에서, "N"은 정상 혈장, “Sc”는 PrP^Sc를 갖는 혈장을 나타낸다. 도 3a 및 도 3b에서 볼 수 있듯이, Tricine 완충액이 PrP^Sc혈장에 대해 가장 높은 시그널을 나타내면서도, 정상 혈장에 대해서는 시그널이 가장 낮게 나타났는 바, 혈장 시료에서 PrP^Sc를 검출하는 데 있어 가장 우수한 분별력을 나타냄을 알 수 있다.

실시예 III : MDS -3D- Dual Bead 시스템에 의한 혈장 내 멀티머형 PrP 검출

10% Triton X-100 120 ㎕, TBST 완충액(pH 8.0) 730 ㎕ 및 양 혈장 150 ㎕를 혼합하여 1.2% Triton X 및 15% 양 혈장을 포함하는 시료 용액 1 ㎖을 제조하였다.

포획항체로서의 3E7-결합 자성 비드 4 ㎕, 검출항체로서의 MA1 750-결합 형광 라텍스 비드 2 ㎕ 및 TBST 완충액 200 ㎕를 혼합하여 혼합 항체를 준비하였다(3E7-비드/MA1 750-형광 비드, 2:1 비율). 시료 1 ㎖에 상기 혼합항체 200 ㎕를 첨가하고 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 자기장을 반응 혼합물에 부여하여 자성비드를 분리하고 자성비드를 TBST로 3회 세척한 다음, 형광을 측정하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 MDS-3D-Dual Bead 시스템은 혈장 내의 PrP^Sc를 분별적으로 검출하고 있음을 알 수 있다.

실시예 IV : MDS -3D- Dual Bead 시스템에서의 적합한 완충액의 분석

포획항체로서의 3E7-결합 자성 비드 4 ㎕ 및 검출항체로서의 MA1 750-결합 형광 라텍스 비드 1 ㎕를 혼합하여 혼합 항체를 준비하였다(3E7-비드/MA1 750-형광 비드, 4:1 비율). 10% Triton X-100 in d-H₂O 120 ㎕, 완충액(TBST 또는 Tricine, pH 8.0) 730 ㎕ 및 양의 혈장 150 ㎕을 혼합하여 시료용액을 준비하였다. 그 외 과정은 상기 실시예 3과 동일하다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 MDS-3D-Dual Bead 시스템을 이용하여 혈장 시료에서 PrP^Sc를 검출하는 데 있어, TBST가 Tricine 완충액보다 보다 우수한 시그널 세기 및 분별력을 나타낸다.

한편, T2 및 MA1 항체를 각각 포획항체 및 검출항체로 이용하는 또 다른 MDS-3D-Dual Bead 시스템을 구축하여 상기의 과정을 실시하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 이 항체 조합에서도 MDS-3D-Dual Bead 시스템은 혈장 시료에서 PrP^Sc를 검출 하였다.

실시예 V: MDS -3D- Dual Bead 시스템에서의 적합한 혈장 시료 농도의 분석

포획항체로서의 3E7-결합 자성 비드 2 ㎕ 및 검출항체로서의 MA1 750-결합 형광 라텍스 비드 1 ㎕(3E7-비드/MA1 750-형광 비드, 2:1 비율)의 혼합항체를 이용하고, 혈장 시료를 각각 30%, 15% 및 7.5%로 하여 MDS-3D-Dual Bead 시스템의 적합한 혈장 시료 농도를 분석하였다. 완충액으로는 Tricine(pH 8.0)을 이용하였고, 그 외 실험 방법은 상기 실시예 3과 동일하다.

도 6에서 볼 수 있듯이, 혈장 시료 각각 30%, 15% 및 7.5%에 있는 PrP^Sc는 본 발명의 MDS-3D-Dual Bead 시스템에 의해 분별적으로 검출되었다. Sc/N 비율은 혈장 농도가 감소할수록 감소하였으나, 시그널의 세기는 오히려 낮은 혈장 농도에서 가장 높게 나왔다. 따라서, 본 발명의 MDS-3D-Dual Bead 시스템에 적합한 혈장 농도는 약 15%임을 알 수 있다.

실시예 VI : MDS -3D- Single Bead 시스템에서의 적합한 혈장 시료 농도의 분석

MDS-3D-Single Bead 시스템에 적합한 혈장 시료 농도를 분석하기 위하여, 자성 비드에 결합된 포획항체 3E7, 3E7-bead 및 검출항체 T2-HRP를 1:1 비율(0.8 ㎍:0.8 ㎍)로 이용하여 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하였다. 혈장 시료는 각각 30%, 15% 및 7.5%로 하였다. 완충액으로는 Tricine(pH 8.0)을 이용하였고, 그 외 실험 방법은 상기 실시예 2와 동일하다.

도 7에서 볼 수 있듯이, 혈장 시료 각각 30%, 15% 및 7.5%에 있는 PrP^Sc는 본 발명의 MDS-3D-Single Bead 시스템에 의해 분별적으로 검출되었다. Sc/N 비율과 정상 혈장 및 PrP^Sc혈장에 대한 시그널의 세기는 혈장 농도가 감소할수록 감소하였다. 따라서, 본 발명의 MDS-3D-Single Bead 시스템에 적합한 혈장 농도는 약 30% 임을 알 수 있다.

또한, 3E7-Bead 항체 및 T2-HRP 항체를 1:2 비율로 하고 30% 및 100%농도의 혈장은 Tricine(pH 0.8) 완충액에서 준비하였으며, 그 외 실험 방법은 상기 실시예 2와 동일하다. 도 11에서 볼 수 있듯이, 100% 농도의 혈장은 30% 농도의 혈장보다 더 낮은 시그널 세기와 분별력을 나타내었다.

또한, 3E7-Bead 항체 및 T2-HRP 항체를 1:1 비율로 하고 20% 및 25%농도의 혈장은 Tricine(pH 0.8) 완충액에서 준비하였으며, 20% 및 25% 농도의 혈장의 양은 각각 300 ㎕ 및 400 ㎕이다. 그 외 실험 방법은 상기 실시예 2와 동일하다. 도 12에서 볼 수 있듯이, 25% 농도의 혈장은 20% 농도의 혈장보다 더 높은 시그널 세기와 분별력을 나타내었다.

실시예 VII : MDS -3D- Dual Bead 시스템에 의한 혈장 내 멀티머형 PrP 검출

포획항체로서 T2-결합 자성 비드, 검출항체로서 MA1 750-결합 형광 라텍스 비드를 이용하되, 두 항체의 비율을 2:1 또는 4:1로 하여 본 발명의 MDS-3D-Dual Bead 시스템을 실시하였다. 완충액으로는 TBST(pH 8.0)를 이용하였고, 혈장의 농도는 15% 이었다. 그 외 과정은 상기 실시예 3과 동일하다. 도 8에서 볼 수 있듯이, T2-비드/MA1 750-비드의 비율이 4:1인 경우가 2:1인 경우보다 Sc/N 비율이 크고 시그널의 세기도 높게 나왔다.

실시예 VIII : 다양한 디터젼트(detergent)의 농도 및 타입에서 MDS -3D- Single Bead 시스템에 의한 혈장 내 멀티머형 PrP 검출

디터젼트의 농도와 타입을 다양하게 하면서 실시예 2와 동일한 방법(디터젼트 조건을 제외)에 따라, PrP^Sc가 있는 것으로 임상적 소견을 나타내는 양 혈장 시료에 대하여 MDS-3D-Single Bead 시스템으로 멀티머형 PrP를 검출하였다. 도 9에서 볼 수 있듯이, 다양한 트리톤 X-100의 농도(1%, 1,5% 및 2%)는 멀티머 PrP에 대하여 유사한 검출도 및 분별력을 나타내었다. 또한, 결과 편차가 상대적으로 높지만, Np-40(USB사, 미국)도 상당한 검출 및 분별력을 나타내었다. Np-40은 비이온성 디터젼트 중 하나이며 [옥틸페녹실]폴리에톡시에탄올 ([Octylphenoxy]polyethoxyethanol)를 나타낸다.

실시예 IX : 다양한 세척 완충액에서 MDS -3D- Single Bead 시스템 실시에 의한 혈장 내 멀티머형 PrP 검출

양 혈장 시료에 있는 멀티머형 PrP^Sc를 검출하기 위하여, 항체 중량 비(3E7-비드:T2-HRP, 1:2)와 세척 조건을 제외하고 실시예 2와 동일한 방법으로 세척 완충액의 타입을 다양하게 하여 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하였다. 도 10에서 볼 수 있듯이, 멀티머형 PrP는, PBST (phosphate-buffered saline with Tween 20), PBSX (phosphate-buffered saline with Triton X-100)및 TBSx(tris-buffered saline with Triton X-100)과 비교하여 TBST(tris-buffered saline with Tween 20) 세척 완충액에서 가장 뛰어난 검출도 및 분별력을 나타내었다.

실시예 X: MDS -3D- Single Bead 시스템 실시에 의한 혈장 내 멀티머형 프리온 단백질 검출에 있어 PK 절단의 영향

양 혈장 시료에 있는 멀티머형 PrP^Sc를 검출하기 위해서 항체 비율 (3E7-비드:T2-HRP, 1:2)을 제외한 그 외 실시예 2와 동일한 방법으로 프로테아제 K (protease K: PK)의 절단 유무와 함께 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하였다. 도 13에서 볼 수 있듯이, PK 분해는 혈장 시료에서 PrP^Sc에 대한 신호의 세기를 감소시킨다. 이것을 통하여, MDS-3D-Single Bead 시스템을 이용하여 혈액 또는 혈청 시료에서 PrP^Sc를 검출하는데 있어서 프로테아제 K 절단 과정은 필요하지 않음을 알 수 있었다.

실시예 XI : 다양한 비율의 항체에서 MDS -3D- Single Bead 시스템 실시에 의한 혈장 내 멀티머형 PrP 검출

양 혈장 시료에 있는 멀티머형 PrP^Sc를 검출하기 위해서 실시예 2와 동일한 방법으로 항체 비율을 다양하게 하여 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하였다. 3E7-Bead 포획 항체와 T2-HRP 검출 항체의 질량 비율을 4:1, 2:1, 1.33:1 및 1:1로 하여 첨가하였다. 도 14a에서 볼 수 있듯이, 두 항체를 같은 양으로 첨가한 경우에, MDS-3D-Single Bead 시스템 실시에 의한 혈장 내 PrP^Sc 검출에 있어서 가장 우수한 검출도 및 분별력을 나타내었다.

실시예 XII : 다양한 비율의 항체에서 MDS -3D- Dual Bead 시스템에서 혈장 내 PrP 검출

양 혈장 시료에 있는 멀티머형 PrP^Sc를 검출하기 위해서 실시예 3과 동일한 방법으로 항체 비율을 다양하게 하여 MDS-3D-Dual Bead 시스템을 실시하였다. 3E7-Bead 포획 항체와 MAI-750-형광 비드 검출 항체를 4:1과 2:1의 질량 비율로 하여 첨가하였다. 도 14b에서 볼 수 있듯이, 포획 항체 및 검출 항체의 양을 2:1 비율로 첨가한 경우에, MDS-3D-Dual Bead 시스템 실시에 의한 혈장 내 PrP^Sc 검출에 있어 가장 우수한 검출 및 분별력을 나타내었다.

실시예 XIII : 포획 항체 칵테일과 MDS -3D- Single Bead 시스템에서 혈장 내 PrP 검출

양 혈장 시료에 있는 멀티머형 PrP^Sc를 검출하기 위해서 실시예 2와 동일한 방법으로 포획 항체 칵테일과 함께 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하였다. 포획 항체로서, 3E7-Bead와 T2-Bead 항체(도 15a) 또는 3E7-Bead와 MAI-Bead(도 15b)로 구성된 포획 항체 칵테일이 사용되었다. 포획 항체 칵테일과 검출 항체, 즉 T2-HRP의 비율은 1:1로 하였다. 도 15a와 15b에서 볼 수 있듯이, 포획 항체 칵테일은 혈장 내 PrP^Sc에 대하여 우수한 검출도 및 분별력을 나타내었다.

실시예 XIV : 검출 항체 칵테일과 MDS -3D- Single Bead 시스템에서 혈장 내 PrP 검출

양 혈장 시료에 있는 멀티머형 PrP^Sc를 검출하기 위해서 실시예 2와 동일한 방법으로 검출 항체 칵테일을 첨가하여 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하였다. 첨가한 항체 세트는 (i) 포획 항체로서 3E7-Bead와 검출 항체 칵테일로서 T2-바이오틴과 MAI-바이오틴 및 (ii) 포획 항체로서 MAI-Bead 와 검출 항체 칵테일로서 T2-바이오틴과 3E7-바이오틴이다. 도 15c에서 볼 수 있듯이, 검출 항체 칵테일은 혈장 내 PrP^Sc에 대하여 우수한 검출도 및 분별력을 나타내었다.

실시예 XV : 동일한 조건하에서 MDS 및 MDS -3D- Single Bead 시스템의 검출력의 비교

본 발명자들은 멀티머를 형성하는 폴리펩티드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별적으로 검출하는 방법을 이미 개발하였으며, 이를 멀티머 검출 시스템(Multimer Detection System: MDS)로 명명하고, PCT 출원하였다(PCT/KR2005/004001).

믿을 수 있는 실험방법으로 MDS와 MDS-3D-Single Bead 시스템의 PrP^Sc 검출도 및 분별력을 비교하기 위하여, 양 혈장 내 멀티머 형 PrP^Sc는 동일한 실험조건하에서 각각 검출되었다. 3E7 및 T7 항체가 포획 항체 및 검출 항체로 각각 이용되었다.

도 16에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 MDS-3D-Single Bead 시스템이 MDS보다 양 혈장 내 PrP^Sc에 대하여 더 높은 민감도 및 분별력을 나타내었다.

실시예 XVI : 다른 항체 세트를 이용하는 MDS -3D- Single Bead 시스템에 대한 최적 혈장 농도 결정

양 혈장 시료에 있는 멀티머형 PrP^Sc를 검출하기 위해서 항체 세트 타입과 혈청농도를 제외한 그 외 실시예 2와 동일한 방법으로 MDS-3D-Single Bead 시스템을 실시하였다. 포획 항체로는 ICSM35-바이오틴 스트렙타비딘 비드, 검출항체로는 1E4-HRP를 이용하였으며, 양 혈장의 농도는 25%로 하였다. ICSM35 항체 (D-Gen, 영국)는 아미노산 서열 96-105(양 프라이온 기준) 또는 아미노산 서열 104-113(소 프라이온 기준)에 대응하는 에피토프를 인식하며, 1E4 항체 (Sanquin Reagents, 네덜란드)는 아미노산 서열 100-111(양 프라이온 기준) 또는 아미노산 서열 108-119(소 프라이온 기준)에 대응하는 에피토프를 인식한다.

도 17에서 볼 수 있듯이, 부분적으로 중첩하는 에피토프를 인식하는 항체 세트는 혈장 내 PrP^Sc에 대하여 매우 우수한 검출도 및 분별력을 나타내었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다

Claims

다음을 포함하는 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하기 위한 키트:
(a) 고상의 캐리어(solid phase carrier)의 표면에 3차원적으로 결합되어 있고, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드상의 하나의 특정 에피토프에 결합하는 포획항체; 및
(b) 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드상의 하나의 특정 에피토프에 결합된 포획항체에 의해 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 있는 멀티머-형성 폴리펩타이드상의 에피토프에 결합하는 검출항체; 단, 상기 포획항체가 결합하는 에피토프의 아미노산 서열과 검출항체가 결합하는 에피토프의 아미노산 서열은 동일하지 않고 중첩되어 있다.
제 1 항에 있어서, 상기 검출항체는 고상의 캐리어의 표면에 3차원적으로 결합된 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드는 Aβ 펩타이드, β-아밀로이드(β-amyloid), tau 단백질, 프라이온, α-시누클레인, Ig 경사슬, 혈청 아밀로이드 A, 트랜스티레틴, 시스타틴 C, β₂-마이크로글로블린, 헌팅팅(huntingtin), 항산화효소(Superoxide dismutase), 서핀(serpin) 또는 아밀린(amylin)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
제 3 항에 있어서, 상기 검출 대상의 멀티머-형성 폴리펩타이드는 프라이온 단백질인 것을 특징으로 하는 키트.
제 4 항에 있어서, 상기 모노머형은 PrP^c이고, 멀티머형은 PrP^Sc인 것을 특징으로 하는 키트.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 포획항체가 인식하는 폴리펩타이드의 에피토프는 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 검출항체가 인식하는 폴리펩타이드의 에피토프는 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 고상의 캐리어는 자성 비드인 것을 특징으로 하는 키트.
제 2 항에 있어서, 상기 검출항체가 결합된 고상의 캐리어는 라텍스 비드인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 검출항체에는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
제 2 항에 있어서, 상기 검출항체 및 검출항체가 결합된 고상의 캐리어 중 하나 이상에는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 검출항체에 결합된 표지는 화학물질, 효소, 방사능물질, 형광물질, 발광물질, 화학발광물질 또는 FRET 표지인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 생시료는 뇌 균질액 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 키트.
제 14 항에 있어서, 상기 생시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 혈액 시료는 혈장인 것을 특징으로 하는 키트.
제 14 항에 있어서, 상기 생시료가 뇌 균질액인 경우 상기 키트는 프로테아제 K 또는 트립신을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 캐리어-포획항체 및 검출항체는 몰비 2:1-1:2로 칵테일 형태로 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.