DE69926081T2

DE69926081T2 - Entfernung von prionen aus blut, plasma und anderen flüssigkeiten

Info

Publication number: DE69926081T2
Application number: DE69926081T
Authority: DE
Inventors: B. Stanley PRUSINER; G. Jiri SAFAR
Original assignee: University of California; University of California Berkeley
Current assignee: University of California; University of California Berkeley
Priority date: 1999-01-20
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2019-12-18
Also published as: JP2002539081A; IL144097A0; AU2589800A; US20030180706A1; AU768032B2; ATE299268T1; WO2000043782A2; CN1182399C; EP1145013B1; WO2000043782A3; US6916419B2; US20010005578A1; CA2363846A1; ES2242447T3; CN1357109A; EP1145013A2; US6221614B1; KR20010089612A; BR9916932A; DE69926081D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zum Reinigen von Proben und insbesondere Verfahren zum Entfernen von Prionen aus Blut und Blutprodukten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bei Prionen handelt es sich um infektiöse Pathogene, die die spongiforme Enzephalopathien des zentralen Nervensystems in Menschen und Tieren verursachen. Prionen unterscheiden sich von Bakterien, Viren und Viroiden. Die gegenwärtig vorherrschende Hypothese ist, dass kein Nukleinsäurebestandteil für die Infektiösität eines Prionproteins erforderlich ist. Des Weiteren infiziert ein Prion, das eine Tierspezies (z.B. einen Menschen) infiziert, keine andere (z.B. eine Maus).
Bei einem Hauptschritt in der Untersuchung von Prionen und der Erkrankungen, die sie verursachen, handelte es sich um die Entdeckung und Reinigung eines als Prionprotein („PrP") bezeichneten Proteins [Bolton et al., Science 218:1309-11 (1982), Prusiner et al., Biochemistry 21:6942-50 (1982); McKinley et al., Cell 35:57-62 (1983)]. Gene, die Prionprotein vollständig kodieren, wurden geklont, sequenziert und in transgene Tiere exprimiert. PrP^c wird durch ein Wirtsgen mit einer einzelnen Kopie kodiert [Basler et al., Cell 46:417-28 (1986)] und ist gewöhnlich an der Außenfläche von Neuronen zu finden. Eine führende Hypothese ist, dass Prionerkrankungen aus der Umwandlung von PrP^c zu einer als PrP^Sc bezeichneten modifizierten Form resultieren.
Es scheint, dass die Traberkrankheit-Isoform des Prionproteins (PrP^Sc) sowohl für die Übertragung als auch für die Pathogenese der übertragbaren neurodegenerati ven Erkrankungen von Tieren und Menschen erforderlich ist. Siehe Prusiner, S.B., „Molecular biology of prion disease", Science 252:1515-1522 (1991). Bei den üblichsten Prionerkrankungen von Tieren handelt es sich um die Traberkrankheit des Schafes und der Ziege und die spongiforme Rinderenzephalopathie (BSE) des Rinds [Wilesmith, J. and Wells, Microbiol. Immunol. 172:21-38 (1991)]. Vier Prionerkrankungen des Menschen wurden identifiziert. (1) Kuru, (2) Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJD), (3) Gerstmann-Strassler-Scheinker-Krankheit (GSS) und (4) die tödlich verlaufende familiäre Schlaflosigkeit (FFI) [Gajdusek, D.C., Science 197:943-960 (1977); Medori et al., N. Engl. J. Med. 326:444-449 (1992)]. Die Gegenwart von menschlichen Prionerkrankungen als sporadische, genetische und infektiöse Krankheiten gab anfänglich Rätsel auf, die durch den zellulären genetischen Ursprung von PrP erklärt wurden.
Die meisten CJD-Fälle sind sporadisch, jedoch werden etwa 10-15% als autosome dominante Störungen vererbt, die durch Mutationen im menschlichen PrP-Gen verursacht werden [Hsiao et al., Neurology 40:1820-1827 (1990); Goldfarb et al., Science 258:806-808 (1992), Kitamoto et al., Proc. R. Soc. Lond. 343:391-398]. Iatrogenes CJD wurde durch menschliches Wachstumshormon verursacht, das von Kadaverhypophysen sowie Rückenmarktransplantaten des Rückenmarks [Brown et al., Lancet 340:24-27 (1992)]. Trotz zahlreichen Versuchen, CJD mit einer infektiösen Quelle wie dem Konsum von mit Traberkrankheit infiziertem Schafsfleisch zu verbinden, wurde dies außer in Fällen von iatrogen induzierter Erkrankung bis heute nicht ermittelt [Harries-Jones et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 51:1113-1119 (1988)]. Andererseits wird angenommen, dass Kuru, das seit vielen Jahrzehnten das Fore und benachbarte Stämme der Neuguinea-Highlands verwüstete, durch Infektion während rituellem Kannibalismus verbreitet wurde [Alpers, M.P., Slow Transmissible Diseases of the Nervous System, Band 1, S.B. Prusiner and W.J. Hadlow, Hg. (New York: Academic Press) S. 66-90 (1979)].
Die anfängliche Übertragung von CJD auf Versuchsprimaten ist geschichtlich reichhaltig belegt und begann mit der Erkenntnis von William Hadlow, dass eine Ähnlichkeit zwischen Kuru und Traberkrankheit vorliegt. 1959 regte Hadlow an, Extrakte, die von an Kuru verstorbenen Patienten hergestellt wurden, in nicht menschliche Primaten einzuimpfen und die Tiere auf eine Erkrankung zu beobachteten, von welcher man vorhersagte, dass sie nach einer längeren Inkubationsdauer auftritt [Hadlow, W.J., Lancet 2:289-290 (1959)]. Sieben Jahre später zeigten Gajdusek, Gibbs und Alpers die Übertragbarkeit von Kuru auf Schimpansen nach Inkubationsdauern im Bereich von 18 bis 21 Monaten [Gajdusek et al., Nature 209:794-796 (1966)]. Die Ähnlichkeit der Neuropathologie von Kuru mit derjenigen von CJD [Klatzo et al., Lab Invest 8:799-847 (1959)] war der Anlass für ähnliche Versuche mit Schimpansen, und Krankheitsübertragungen wurden 1968 erörtert [Gibbs, Jr. et al., Science 161:388-389 (1968)]. Während der letzten 25 Jahre wurden etwa 300 Fälle von CJD, Kuru und GSS auf eine Vielzahl von Menschenaffen und Affen übertragen.
Der Aufwand, die Knappheit und häufig die spürbare Unmenschlichkeit solcher Versuche beschränkten diese Arbeit und folglich die Ansammlung von Wissen. Während behauptet wurde, dass die zuverlässigsten Übertragungsdaten von Untersuchungen unter Verwendung von nicht menschlichen Primaten stammen, wurden einige Fälle von menschlichen Prionerkrankungen auf Nager übertragen, dies jedoch mit scheinbar geringerer Regelmäßigkeit [Gibbs, Jr. et al., Slow Transmissible Diseases of the Nervous System, Band 2, S.B. Prusiner and W.J. Hadlow, Hg. (New York: Academic Press), S. 87-110 (1979); Tateishi et al., Prion Diseases of Humans and Animals, Prusiner et al., Hg. (London: Ellis Horwood), S. 129-134 (1992)].
Die seltene Übertragung von menschlicher Prionerkrankung auf Nager wurde als Beispiel für die „Speziesschranke" genannt, die zuerst von Pattison in seinen Untersuchungen über die Übertragung des Traberkrankheitsmittels zwischen Schaf und Nager beschrieben wurde [Pattison, I.H., NINDB Monograph 2, D.C. Gajdu sek, C.J. Gibbs Jr. und M.P. Alpers, Hg. (Washington, D.C.: US Government Printing), S. 249-257 (1965)]. In diesen Untersuchungen war die anfängliche Übertragung von Prionen von einer Spezies auf eine andere mit einer längeren Inkubationszeit verbunden, wobei nur wenige Tiere eine Erkrankung entwickelten. Eine anschließende Übertragung innerhalb derselben Spezies wurde dadurch charakterisiert, dass alle Tiere nach stark verkürzten Inkubationszeiten erkrankten.
Es zeigte sich, dass die molekulare Basis für die Speziesschranke zwischen dem Syrischen Hamster (SHa) und der Maus in der Sequenz des PrP-Gens unter Verwendung der transgenen (Tg-) Maus vorlag [Scott et al., Cell 59:847-857 (1989)]. SHaPrP unterscheidet sich von MoPrP an 16 Positionen außerhalb der 254 Aminosäurereste [Basler et al., Cell 46:417-428 (1986); Locht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6372-6376 (1986)]. Tg(SHaPrP)-Mäuse, die SHaPrP exprimieren, wiesen verkürzte Inkubationszeiten auf, als sie mit SHa-Prionen beimpft wurden. Als ähnliche Studien mit die menschlichen oder Schafs-PrP-Transgene exprimierenden Mäusen durchgeführt wurden, war die Speziesschranke nicht aufgehoben, d.h. der Prozentanteil an infizierten Tieren war unakzeptabel gering, und die Inkubationszeiten waren unakzeptabel lang. Folglich war es nicht möglich, z.B. im Fall von menschlichen Prionen transgene Tiere (wie ein PrP-Gen einer anderen Spezies enthaltende Mäuse) zu verwenden, um eine Probe zur Bestimmung dessen, ob die Probe mit Prionen infiziert wurde, zuverlässig zu testen. Die Bedeutung des aus dem Fehlen eines solchen Tests resultierenden Gesundheitsrisikos ist nachstehend veranschaulicht.
Mehr als 45 junge Erwachsene, die vorher mit von menschlichen Hypophysen abgeleitetem HGH behandelt wurden, entwickelten CJD [Koch et al., N. Engl. J. Med. 313:731-733 (1985); Brown et al., Lancet 340:24-27 (1992); Fradkin et al., JAMA 265:880-884 (1991); Buchanan et al., Br. Med. J.302:824-828 (1991)]. Glücklicherweise wird nun rekombinantes HGH verwendet, obwohl die scheinbar fernliegende Möglichkeit auftrat, dass eine erhöhte Expression von durch hohes HGH stimuliertem wtPrP^c eine Prionenerkrankung induzierte [Lasmezas et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1163-1169 (1993)]. Dass das von Hypophysen hergestellte HGH mit Prionen kontaminiert war, wird durch die Übertragung einer Prionerkrankung auf einen Affen 66 Monate nach der Beimpfung mit einer verdächtigen HGH-Charge gestützt [Gibbs, Jr. et al., N. Engl. J. Med. 328:358-359 (1993)]. Die mit Prionerkrankungen verbundenen langen Inkubationszeiten zeigten nicht das volle Ausmaß an iatrogenem CJD seit Jahrzehnten in tausenden von weltweit mit HGH behandelten Menschen. Iatrogenes CJD zeigte sich scheinbar auch in vier unfruchtbaren Frauen, die mit kontaminiertem, vom Menschen abgeleiteten Gonadotrophinhormon behandelt wurden [Healey et al., 8r. J. Med. 307:517-518 (1993); Cochius et al., Aust. N.Z.J. Med. 20:592-593 (1990); Cochius et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 55:1094-1095 (1992)], sowie in mindestens 11 Patienten, die Rückenmarktransplantate erhielten [Nisbet et al., J.Am. Med. Assoc. 261:1118 (1989); Thadani et al., J. Neurosurg. 69:766-769 (1988); Williamson et al., J. Neurosurg. Psychiatry 54:940 (1991); Brown et al., Lancet 340:24-27 (1992)]. Diese Fälle von iatrogenem CJD unterstreichen die Notwendigkeit des Durchmusterns von Arzneimitteln, die möglicherweise mit Prionen infiziert sein könnten.
Die Immunoaffininitätsreinigung und Neutralisation von Traberkrankheitsprioninfektiösität ist in Gabazion et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6617-6621 (1988) beschrieben. WO 93/23432 beschreibt lösliche Prionpolypeptide und Verfahren zum Nachweis und zur Reinigung derartiger Polypeptide. WO 97/40681 beschreibt von viralen und molekularen Pathogenen freies biologisches Material und ein Verfahren zu dessen Herstellung. WO 97/43649 beschreibt Chaperone, die sich an Prionproteine binden können, und die Unterscheidung der Isoformen von PrP^c und PrP^Sc.
Verschiedene Heteropolysäuren einbringende Testvorrichtungen wurden auf dem Fachgebiet beschrieben; siehe US-Patente Nr. 4,300,905, 4,320,086 und 5,521,060. Die katalytischen Eigenschaften und das elektrochemische Verhalten von Heteropolysäuren wurden ebenso beschrieben [Saidkhanov., Journal of Mole cular Catalysis, 21:356-373 (1983) und Alpatova et al., Elektrokhimiya 30(7): 859-866 (1994)].
Jüngst wurden zwei Ärzte in Frankreich wegen fahrlässiger Tötung eines Kindes, das mit von Leichen extrahierten Wachstumshormonen behandelt wurde, angeklagt. Das Kind entwickelte Creutzfeld-Jakob-Krankheit. (Siehe New Scientist, 31. Juli 1993, S. 4). Nach dem Pasteur Institut lagen seit 1989 24 berichtete Fälle von CJD in jungen Menschen vor, die zwischen 1983 und Mitte 1985 mit menschlichem Wachstumshormon behandelt wurden. 15 dieser Kinder starben. Es scheint nun, als ob hunderte von Kindern in Frankreich mit dem Risiko des Entwickelns von CJD mit aus toten Körpern extrahierten Wachstumshormon behandelt wurden (siehe New Scientist, 20. November 1993, S. 10). Im Hinblick darauf besteht eine deutliche Notwendigkeit für ein günstiges, kosteneffizientes Mittel zum Entfernen von CJD verursachenden Prionen aus Blut und Blutprodukten. Die folgende Erfindung stellt ein solches Verfahren bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Entfernen von Prionen aus einer menschlichen Körperflüssigkeit bereit, umfassend die Schritte: Inkontaktbringen einer menschlichen Körperflüssigkeit in fließfähigem flüssigem Zustand mit einem festen Substrat, das aus einem natives PrP^Sc bindenden Prionkomplexbildner zusammengesetzt ist; und Inkontaktlassen der menschlichen Körperflüssigkeit mit dem Substrat über eine Zeitdauer, in welcher sich die Prionen in der menschlichen Körperflüssigkeit an das Substrat binden, wobei der Komplexbildner ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Heteropolysäure oder einem Salz davon, einem Metallsalz von Wolframatophosphorsäure und einem Antikörper.
Prionen werden durch Inkontaktbringen dieser Materialien mit einem Komplexbildner aus einer menschlichen Körperflüssigkeit wie Blut und Plasma entfernt. Das Substrat kann in beliebiger die Entfernung des Prions aus den biologischen Materialien gewährender Konfiguration wie als kugelförmige Polymerperlen, die mit einem Komplexbildner beschichtet und in einer Säule beinhaltet sind, durch man welche das Blut, das Plasma oder ein anderes Material, das im Verdacht steht, Prionen zu enthalten, fließen lässt, verwendet werden.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um eine Vorrichtung zum Entfernen von Prionen aus einer Probe, wobei die Vorrichtung aus einem auf einem ferromagnetischen Material aufgetragenen wasserunlöslichen Polymer und einem auf der Oberfläche des Polymers aufgetragenen Prionkomplexbildner zusammengesetzt ist, wobei der Komplexbildner ein natives PrP^Sc bindendes Metallsalz von Wolframatophosphorsäure ist.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches und wirtschaftliches Mittel zum Entfernen von Prionen aus einem Material bereitzustellen.
Ein Vorteil der Erfindung ist es, dass Blutprodukte, die Prionen enthalten könnten, beim Bearbeiten durch die Erfindung als prionenfrei bescheinigt werden können.
Ein Merkmal der Erfindung ist es, dass sich native Prionen selektiv an chemische Mittel wie Heteropolysäuren oder Metallsalze von Heteropolysäuren binden. Ein bevorzugtes chemisches Mittel zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung ist Natriumphosphorowolframato.
Ein anderes Merkmal der Erfindung ist es, dass sich native Prionen selektiv an biologische Mittel wie selektive PrP^Sc-Bindungsantikörper binden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist eine Durchflussvorrichtung zur Entfernung von Prionen aus einer flüssigen Probe, die ein Gehäuse, durch welches eine flüssige Probe fließt, und Substratoberflächen, die aus Prionkomplexbildnern zusammengesetzt sind, bei welchen es sich um ein Metallsalz von Wolframatophosphorsäure handelt und das natives PrP^Sc bindet, umfasst. Das Substrat kann in Form von kugelförmigen Polymerperlen mit dem auf ihrer Oberfläche aufgetragenen Metallsalz von Wolframatophosphorsäure vorliegen. Die kugelförmigen Perlen können einen ferromagnetischen Metallkern, der die Abtrennung der Perlen unter Verwendung von magnetischen Kräften gewährt, und eine inerte Polymerbeschichtung des Metallkerns mit dem mit dem Metallsalz der Wolframatophosphorsäure beschichteten Polymer aufweisen.
Diese und andere Aufgaben, Aspekte, Vorteile und Merkmale der Erfindung werden dem Fachmann durch Lesen der Details der Bindungsmittel, Vorrichtungen und Verfahren, wie vollständiger nachstehend beschrieben, klar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Bevor die vorliegenden Verfahren und Vorrichtungen offenbart und beschrieben werden, sollte es klar sein, dass diese Erfindung auf die bestimmten Kennzeichen, Tests oder Verfahren nicht beschränkt ist, da sie natürlich variieren können. Es sollte auch klar sein, dass die hier verwendete Terminologie nur zum Zwecke des Beschreibens der bestimmten Ausführungsformen dient, und es ist nicht beabsichtigt, dass sie diese beschränkt, da der Umfang der vorliegenden Erfindung nur durch die anhängigen Ansprüche beschränkt ist.
Wenn nicht anders definiert, weisen alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die selben Bedeutungen auf, wie sie üblich durch den Fachmann verständlich sind, dem diese Erfindung gehört. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, die denjenigen hier beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, bei der Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben.
Die hier erörterten Veröffentlichungen sind einzig zu deren Offenbarung vor dem Einreichungsdatum der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Des Weiteren sind die bereitgestellten Veröffentlichungsdaten Gegenstand der Veränderung, wenn gefunden wird, dass das tatsächliche Veröffentlichungsdatum sich von dem hier bereitgestellten unterscheidet.
DEFINITIONEN
Bei dem „Komplexbildner" kann es sich um einen Antikörper, z.B. einen für natives PrP^Sc selektiven Antikörper oder eine Wolframatophosphorsäure (PTA), die in Form eines Salzes, z.B. Natriumphosphorowolframato zugesetzt werden kann, handeln. Die Komplexbildner können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Zum Beispiel kann ein biologischer Komplexbildner zusammen mit einem chemischen Komplexbildner verwendet werden. In einem anderen Beispiel können zwei Komplexbildner derselben Klasse miteinander verwendet werden. Der gebildete Komplex muss ein gewisses Mittel zum Abtrennen des Komplexes von dem Rest der Zusammensetzung wie eine Immobilisierung des Komplexbildners auf einer Oberfläche bereitstellen. Ein bevorzugter Komplexbildner bindet PrP^Sc schneller als er PrP^C bindet, und ein besonders bevorzugtes Mittel bindet PrP^Sc mit einem hohen Affinitätsgrad und PrP^C mit keinen nennenswerten Graden. Tatsächlich bindet ein bevorzugtes Bindungsmittel PrP^Sc mit einer zweifachen oder größeren Bindungsaffinität, als es PrP^C bindet, und vorzugsweise der fünffachen oder größeren Bindungsaffinität, als es PrP^C bindet.
Der Begriff „Protein" soll wie hier verwendet eine beliebige Aminosäuresequenz umfassen und schließt modifizierte Sequenzen wie Glycoproteine ein. Der Begriff schließt natürlich vorkommende Proteine und Peptide sowie diejenigen, die rekombinant oder synthetisch synthetisiert werden, ein. Wie hier zusammen mit der vorliegenden Erfindung verwendet, soll der Begriff „Protein" spezifisch natürlich vorkommende Proteine abdecken, die in mindestens zwei verschiedenen Konformationen vorkommen, wobei beide Konformationen dieselbe oder im Wesentli chen dieselbe Aminosäuresequenz, jedoch zwei oder mehrere unterschiedliche dreidimensionale Strukturen aufweisen. Die zwei Konformationen des Proteins schließen mindestens eine nicht mit dem Krankheitszustand verbundene Konformation und mindestens eine mit dem Krankheitszustand verbundene – pathogene Konformation ein. Ein spezifisches und bevorzugtes Beispiel für ein wie in Verbindung mit dieser Offenbarung verwendetes Protein ist ein PrP-Protein, das die als die PrP^C-Form bezeichnete Nichtkrankheitsform und die als PrP^Sc bezeichnete krankheitsverbundene Form einschließt. Obwohl ein Prionprotein der PrP^Sc-Form eines PrP-Proteins infektiös und pathogen ist, ist die Krankheitskonformation von anderen Proteinen nicht infektiös, obwohl sie pathogen ist. Wie hier verwendet, kann der Begriff pathogen bedeuten, dass das Protein tatsächlich die Krankheit verursacht, oder es kann einfach bedeuten, dass das Protein mit der Krankheit verbunden ist und deshalb vorliegt, wenn die Krankheit vorliegt. Folglich ist ein wie in Verbindung mit dieser Offenbarung verwendetes pathogenes Protein nicht unbedingt ein Protein, das das spezifische Ursachenmittel für eine Erkrankung ist.
Die Begriffe „PrP-Protein", „PrP" und dergleichen werden hier abwechselnd verwendet und sollen sowohl die infektiöse PrP^Sc-Teilchenform, von welcher bekannt ist, dass sie Krankheiten (spongiforme Enzephalopathien) in Menschen und Tieren verursacht, als auch die nicht infektiöse PrP^C-Form, die unter geeigneten Bedingungen zu der infektiösen PrP^Sc-Form umgewandelt wird, bedeuten.
Die Begriffe „Prion", Prionprotein" und „PrP^Sc-Protein" und dergleichen werden hier abwechselnd verwendet und bedeuten die infektiöse PrP^Sc-Form von PrP, wobei es sich hierbei um eine verkürzte Form der Worte „Protein" und „Infektion" handelt. Die Teilchen sind größtenteils, wenn nicht ausschließlich aus durch ein PrP-Gen kodierten PrP^Sc-Molekülen zusammengesetzt. Prionen sind im Allgemeinen PrP^Sc-Dimere. Prionen unterscheiden sich von Bakterien, Viren und Viroiden. Bekannte Prionen infizieren Tiere unter Verursachung der Traberkrankheit, einer übertragbaren degenerativen Erkrankung des zentralen Nervensystems des Schafs und der Ziege, sowie der spongiformen Rinderenzephalopathie (BSE) oder des „Rinderwahns" und der spongiformen Katzenenzephalopathien von Katzen. Bei vier Prionerkrankungen, von welchen es bekannt ist, dass sie Menschen befallen, handelt es sich um (1) Kuru, (2) Creutzfeld-Jalcob-Krankheit (CJD), (3) Gerstmann-Straussler-Scheinker-Krankheit (GSS) und (4) die tödlich verlaufende familiäre Schlaflosigkeit (FFI). Wie hier verwendet, schließt der Begriff „Prion" alle Formen von Prionen ein, die alle oder beliebige dieser Erkrankungen oder andere in beliebigen verwendeten Tieren und insbesondere in Menschen und Nutzfarmtieren verursachen.
Der Begriff „PrP-Gen" wird hier verwendet, um genetisches Material zu beschreiben, das Proteine, einschließlich bekannte Polymorphismen und pathogene Mutationen exprimiert. Der Begriff „PrP-Gen" bedeutet im Allgemeinen ein beliebiges Gen von beliebiger Spezies, das eine beliebige Form eines PrP-Proteins kodiert. Einige allgemein bekannte PrP-Sequenzen sind in Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101 (1992) und den US-Patenten 5,565,186; 5,763,740; 5,792,901 und WO 97/04814 beschrieben. Das PrP-Gen kann von einem beliebigen Tier, einschließlich den hier beschriebenen „Wirts-" und „Test " Tieren, und beliebigen und allen Polymorphismen und Mutationen davon stammen, wobei erkennbar ist, dass die Begriffe andere PrP-Gene wie diejenigen, die schon entdeckt sind, einschließen. Das durch ein solches Gen exprimierte Protein kann entweder eine PrP^C-(Nichtkrankheits-) oder PrP^Sc-(Krankheits-) Form annehmen.
Der Begriff „Antikörper" steht für ein Immunglobulinprotein, das ein Antigen binden kann. Antikörper bedeutet wie hier verwendet, dass er den gesamten Antikörper sowie ein beliebiges Antikörperfragment (z.B. F(ab)', Fab, Fv) einschließt, das das Epitop, Antigen oder Antigenfragment von Interesse binden kann. Die Antikörper für Tests der Erfindung sind immunreaktiv oder immunspezifisch und binden deshalb spezifisch und selektiv natives PrP^Sc-Protein. Antikörper, die sowohl für die native Nichtkrankheitsform als auch für die Krankheitsform (z.B. sowohl für natives PrP^C als auch natives PrP^Sc) immunreaktiv und immunspezi fisch sind, können verwendet werden. Antikörper für PrP sind vorzugsweise immunspezifisch, z.B. im Wesentlichen nicht kreuzreaktiv mit verwandten Materialien. Einige spezifische Antikörper, die in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden können, sind in der PCT-Anmeldung WO 97/10505 offenbart. Diese veröffentlichte PCT-Anmeldung entspricht dem am 8. Dezember 1998 erteilten US-Patent 5,846,533. Der Begriff „Antikörper" umfasst alle Antikörpertypen, z.B. polyklonale, monoklonale und diejenigen, die durch die Phagendisplaymethodologie hergestellt sind. Bei besonders bevorzugten Antikörpern der Erfindung handelt es sich um Antikörper, die sowohl für natives PrP^C als auch PrP^Sc einen relativ hohen Affinitätsgrad aufweisen, und diejenigen, die eine größere Bindungsaffinität für PrP^Sc aufweisen, sind bevorzugt. Ein Antikörper der Erfindung ist ein wie hier definierter „Komplexbildner".
„Gereinigter Antikörper" bedeutet denjenigen, der ausreichend frei von anderen auf natürliche Weise damit verbundenen Proteinen, Kohlenhydraten und Lipiden ist. Ein derartiger Antikörper „bindet vorzugsweise" an PrP^Sc-Protein (oder ein Antigenfragment davon) und erkennt im Wesentlichen nicht oder bindet im Wesentlichen nicht an andere unverwandte Antigenmoleküle. Ein gereinigter Antikörper der Erfindung ist vorzugsweise mit einer spezifischen Spezies immunreaktiv und immunspezifisch und stärker bevorzugt für natives PrP^Sc immunspezifisch.
„Antigenes Fragment" eines Proteins (z.B. eines PrP-Proteins) bedeutet einen Teil eines solchen Proteins, der einen Antikörper binden kann.
„Bindet spezifisch" bedeutet eine hohe Aviditäts- und/oder hohe Affinitätsbindung eines Antikörpers an ein spezifisches Polypeptid, z.B. ein Epitop eines Proteins z.B, ein PrP^Sc. Die Antikörperbindung an seinem Epitop an diesem spezifischen Polypeptid ist vorzugsweise stärker als die Bindung desselben Antikörpers an einem anderen Epitop, insbesondere derjenigen, die in Molekülen in Verbindung mit oder in derselben Probe als spezifisches Polypeptid von Interesse vorliegen können, z.B. bindet er stärker an Epitopfragmenten eines Proteins wie PrP^Sc, sodass der Antikörper durch Einstellung der Bindungsbedingungen fast ausschließlich an eine Epitopstelle oder an Fragmente eines gewünschten Proteins wie ein Epitopfragment von PrP^Sc bindet.
Die Begriffe „nachweisbar markierter Antikörper", „nachweisbar markiertes anti-PrP" oder „nachweisbar markiertes anti-PrP-Fragment" bedeuten einen Antikörper (oder ein Antikörperfragment, das Bindungsspezifität beibehält) mit einer angelagerten nachweisbaren Markierung. Die nachweisbare Markierung ist normalerweise durch chemische Konjugation angelagert, ist jedoch die Markierung ein Polypeptid, könnte sie alternativ dazu durch genetische Manipulationstechniken angelagert sein. Verfahren zur Herstellung von nachweisbar markierten Proteinen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Auf dem Fachgebiet bekannte nachweisbare Markierungen sind jedoch gewöhnlich radioisotope, fluorophore, paramagnetische Markierungen, Enzyme (z.B. Meerrettichperoxidase) oder andere Einheiten oder Verbindungen, die entweder ein nachweisbares Signal (z.B. Radioaktivität, Fluoreszenz, Farbe) emittieren oder nach Einwirken seines Substrats auf die Markierung ein nachweisbares Signal emittieren. Verschiedene nachweisbare Markierungs/Substrat-Paare (z.B. Meerrettichperoxidase/Diaminobenzidin, Avidin/Streptavidin, Luciferase/Luciferin), Verfahren zum Markieren von Antikörpern und Verfahren zur Verwendung von markierten Antikörpern sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Harlow and Lane, Hg. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). Europium ist eine besonders bevorzugte Markierung.
Die hier verwendeten Abkürzungen schließen ein:

ZNS: für zentrales Nervensystem;
BSE: für spongiforme Rinderenzephalopathie;
CJD: für Creutzfeld-Jakob-Krankheit;
FFI: für tödlich verlaufende familiäre Schlaflosigkeit;
GdnHCl: für Guanidinhydrochlorid;
GSS: für Gerstmann-Strassler-Scheinker-Krankheit;
Hu: für menschlich;
HuPrP: für mnschliches Prionprotein;
Mo: für Maus;
MoPrP: für Mäuseprionprotein;
SHa: für Syrischer Hamster;
SHaPrP: für Prionportein des Syrischen Hamsters;
PrP^Sc: für die Traberkrankheit-Isoform des Prionproteins;
PrP^C: für die in einer Zelle enthaltene allgemeine normale Isoform des Prionproteins;
PrP^CJD: für die CJD-Isoform eines PrP Proteins;
FVB: für einen standardmäßigen Inzuchtmäusestamm, der häufig bei der Herstellung von transgenen Mäusen verwendet wird, da die Eier von FVB-Mäusen relativ groß sind und eine Mikroinjektion von exogener DNA relativ gut tolerieren;
[PrP]_β: – Konzentration von Prionprotein in β-Lagen-Konformation;
[DRC]: – Konzentration einer krankheitsverbundenen Konformation eines Proteins;
PTA: – Wolframatophosphorsäure;
NaPTA: – Natriumphosphorwolframato;
TCA: – Trichloressigsäure;
AC: – Affinitätschromatographie

ALLGEMEINE ASPEKTE DER ERFINDUNG
Tests zum Nachweis von Prionen sind in der Entwicklung, jedoch noch nicht kommerzialisiert. Des Weiteren wurden die Kosten, die Günstigkeit oder Genauigkeit (in großem Maßstab) solcher Tests noch nicht bestimmt. Demzufolge wird es, wenn ein Material wie menschliches Plasma im Verdacht steht, Prionen zu enthalten, zerstört – siehe The Wall Street Journal, 25. November 1998, S. 1, Artikelüberschrift: „Mad Cow' Fears Leads U.K. to Destroy Parts of all Donated Blood", was dadurch angezeigt wird, dass England seinen Vorrat an menschli chem Plasma zerstörte. Diese dramatische Aktion wurde unternommen, da (1) Prionen in ihrem menschlichen Plasma vorliegen könnten, (2) Prionerkrankungen tödlich verlaufen und gegenwärtig nicht behandelbar sind, (3) gegenwärtig keine im Handel erhältlichen Tests für Prionen vorliegen und (4) gegenwärtig kein im Handel erhältliches Verfahren zum Entfernen von Prionen aus einer Probe vorliegt. Die vorliegende Erfindung schließt ein Verfahren zum Entfernen von Prionen ein.
Einige Prionen wie das durch das PrP-Gen exprimierte Protein weisen mehr als eine konformationelle Form auf. Zum Beispiel kann ein PrP-Protein seine zelluläre Form, d.h. seine PrP^C-Form oder seine Traberkrankheits-Form, d.h. seine PrP^Sc-Form annehmen. Eine Form des Proteins ist harmlos (z.B. PrP^C), wohingegen eine andere Form des Proteins pathogen ist (z.B. PrP^Sc). Liegt die eingeschränkte pathogene Form des Proteins wie PrP^Sc in einem Tier in sehr geringen Mengen vor, zeigt das Tier keine Krankheitssymptome. Entwickelt das Tier jedoch einen Krankheitszustand zu der pathogenen Form des Proteins entwickelt es z.B. eine Prionkrankheit. Zur Vermeidung des Fortschreitens und/oder der möglichen Übertragung der Erkrankung ist es wichtig, jegliches PrP^Sc, das in biologischen Flüssigkeiten und insbesondere in einen Patienten eingebrachten biologischen Flüssigkeiten (z.B. Blutprodukten) zu entfernen. Die vorliegende Erfindung ist in Bezug auf (1) das Eliminieren der pathogenen Form des Proteins aus der Probe derart, dass das Material „prionenfrei" gemacht wird und/oder (2) das Reduzieren der Konzentration der pathogenen Form des Proteins in einem Material auf einen derartigen Gehalt, dass das Material „nichtinfektiös" gemacht wird, nützlich.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Prionen aus einer Probe einer menschlichen Körperflüssigkeit durch Behandeln der Probe mit einem Komplexbildner, der sich an natives PrP^Sc (vorzugsweise selektiv) bindet und die Entfernung des nativen PrP^Sc gewährt, zu entfernen. Das vorliegende Verfahren ist insbesondere, obwohl nicht ausschließlich zur Behandlung und/oder Entfernung von nativem PrP^Sc aus Vollblut nützlich. Die Entfernung kann durch Komplexieren mit einem immobilisierten Komplexbildner, d.h. Behandeln der Probe mit einer/einem mit einem Komplexbildner immobilisierten Affinitätssäule, Membran, einem Filter oder Perlen durchgeführt werden. Der Komplexbildner entfernt effizient das native PrP^Sc aus der Probe der menschlichen Körperflüssigkeit, während gewährt wird, dass die Probe zum Gewähren einer korrekten Verwendung der Probe im Wesentlichen dieselbe Form beibehält, d.h. einen korrekten pH-Wert, Strukturintegrität der Zellen und Proteine und dergleichen beibehält.
VERFAHREN IM ALLGEMEINEN
Jeder beliebige Typ an menschlicher Körperflüssigkeit kann unter Verwendung der vorliegenden Erfindung verarbeitet werden, um eine pathogene Form eines Proteins zu entfernen.
Eine zu behandelnde menschliche Körperflüssigkeit sollte bei Raumtemperatur (15°C bis 30°C) in flüssiger fließfähiger Form vorliegen. Die Lösung sollte einen pH-Wert von etwa 6,4 bis 8,4, vorzugsweise 7,4 aufweisen und kein überschüssiges Magnesium oder Calcium enthalten.
Bei dem nächsten Schritt handelt es sich um den wichtigsten im Verfahren der Erfindung. Eine Probe menschlicher Körperflüssigkeit wird mit einem Komplexbildner behandelt, der auf einer festen Oberfläche oder Sonstiges immobilisiert wird, was in einer Weise bereit gestellt ist, die die Abtrennung des priongebundenen Komplexmittels von der Probe gewährt. Der Komplexbildner bildet einen Komplex oder bindet sich vorzugsweise in irgendeiner Form mit oder ausschließlich an ein beliebiges eingeschränktes in der Probe vorliegendes Protein (im Allgemeinen eine pathogene Form), wodurch jegliches in der Probe vorliegendes natives PrP^Sc an der festen Oberfläche durch Behandlung der Probe mit dem immobilisierten Komplexbildner effektiv immobilisiert wird.
In einer Ausführungsform wird ein chemisches Mittel wie eine Heteropolysäure (z.B. PTA) oder vorzugsweise ein Metallsalz davon (NaPTA) an einer festen Oberfläche wie ein Membranfilter, eine Magnetperle und dergleichen immobilisiert. Die Probe der menschlichen Körperflüssigkeit wird mit dem Komplexbildner über eine Zeitdauer behandelt, die zum Gewähren des Komplexierens des gesamten nativen PrP^Sc in der Probe mit PTA ausreichend ist. Zum Beispiel könnte die Probe bei etwa 30°C bis 45°C (vorzugsweise 37°C) über eine Dauer von etwa 1 bis 16 Stunden inkubiert werden. Der Komplexbildner bildet mit dem nativen PrP^Sc einen Komplex. Wichtig ist, dass der gebildete Komplex durch gewisse Mittel, z.B. Filtration, Verwendung eines magnetischen Feldes, Abscheidung und dergleichen von dem Rest der Probe abgetrennt werden kann.
Das Verfahren der Erfindung erzeugt eine Probe aus menschlicher Körperflüssigkeit, in welcher das PrP^Sc oder ein anderes pathogenes Protein aus der Probe, und vorzugsweise auf Gehalte, mit welchen das PrP^Sc durch herkömmliche Mittel nicht nachweisbar ist, im Wesentlichen entfernt wurde. Verfahren der Entfernung des PrP^Sc verhindern die Übertragung von PrP^Sc-vermittelten Störungen durch Bereitstellen von biologischen Proben, die frei von infektiösen Gehalten an Prionen, d.h. „prionenfrei" sind.
KOMPLEXBILDNER
Verbindungen, die als Komplexbildner in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen Antikörper ein. Diese Komplexbildner werden in einer Weise verwendet, die die Bindung und Entfernung von Prionen aus einer biologischen Lösung gewährt, während die wichtigen Elemente des biologischen Materials intakt gelassen werden, z.B, die zellulären Morphologie und der Proteinintegrität bewahrt wird. Derartige Komplexbildner können in Vollblut, in Blutbestandteilen wie Plasma und Plättchen und in anderen biologischen Flüssigkeiten, wie es dem Fachmann klar ist, verwendet werden.
Chemische Mittel
In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Verbindung zur Entfernung von Prionen aus einem biologischen Material um Heteropolysäure oder ein Salz davon. Heteropolysäuren sind vollständig oder teilweise protonierte Formen von Oxyanionen mit mindestens einem zentralen Element und mindestens einem koordinierendem Element. Heteropolysäuren können Keggin- oder Dawson-Strukturen aufweisen.
Eine besondere Klasse von Heteropolysäuren ist die protonierte Form von Heteropolymolybdaten. Diese Anionen enthalten 2 bis 18 sechswertige Molybdänatome um ein oder mehrere zentrale Atome. Etwa 36 verschiedene Elemente wurden als zentrale Atome dieser Heteropolymolybdate identifiziert. Diese Anionen sind alle stark oxygeniert. Beispiele für Heteropolymolybdate schließen [PMo₁₂O₄₀]³, [As²Mo₁₈O₆₂]⁶, und [TeMo₆O₂₄]⁶ ein, wobei es sich bei den zentralen Atomen um P⁵⁺, As⁵⁺ bzw. Te⁶⁺ handelt. Eine detailliertere Erörterung von Heteropolymolybdaten ist in der Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 3. Ausg., 15, 688-689 (1981) bereit gestellt.
Eine andere Klasse von Heteropolysäuren, die zu der protonierten Form von Heteropolymolybdaten analog ist, ist die protonierte Form von Heteropolywolframaten. In Heteropolywolframaten ist das koordinierende Element Wolfram statt Molybdän. Das US-Patent Nr. 4,376,219 erörtert die Herstellung von verschiedenen Heteropolysäuren. Die zentralen Elemente dieser Heteropolysäuren können ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus P, Si, B, Ge, As, Se, Ti, Zr, Mn, F, V, Ce und Th. Die koordinierenden Elemente dieser Heteropolysäuren schließen Mo und/oder W ein. Optionale koordinierende Elemente schließen V, Mn, Co, Ni, Cu, Zn und Fe ein. Das Verhältnis der Anzahl der koordinierenden Elemente zu der Anzahl an zentralen Elementen kann 2,5 bis 12, vorzugsweise 9 bis 12 betragen. Bestimmte in US-Patent Nr. 4,376,219 beispielhaft beschriebene Heteropolysäuren schließen Wolframatophosphorsäure, Wolframatokieselsäure, 10- Wolframato-2-vanadiumphosphorsäure, 6-Wolframato-6-molybdänphosphorsäure, Molybdänatophosphorsäure, Molybdänatokieselsäure, Germanatowolframatosäure, Wolframatoflusssäure und 18-Wolframato-2-phosphorsäure sowie Salze aller oder beliebiger dieser Säuren, z.B. Metallsalze wie Na-, K-, Mg- und Ca-Salze ein. Eine besondere Heteropolysäure zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist Wolframatophosphorsäure, d.h. H₃PW₁₂O₄₀ und ihre Metallsalze, insbesondere Na-Salze. Solche Komplexbildner binden sich wirksam an natives PrP^Sc.
Solche chemischen Mittel können allein, in Kombination oder mit anderen nicht-bioaktiven Chemikalien wie Puffern und inerten Bindungschemikalien verwendet werden. Heteropolysäuren der Erfindung (z.B. PTA) werden vorzugsweise, obwohl nicht ausschließlich in einer Metallsalzform verwendet. Die Metallsalzform schließt Natrium, Kalium, Calcium und dergleichen ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Die mit dem vorliegenden Trägermaterial kombinierte Menge an Heteropolysäure oder Salz davon, die wird, sollte in einer zum maßgeblichen Entfernen von PrP^Sc aus einer biologischen Flüssigkeit ausreichenden Menge und vorzugsweise in einer zum Entfernen von PrP^Sc auf nicht nachweisbare Gehalte oder zumindest nicht-infektiöse Gehalte ausreichenden Menge vorliegen. Das Gewichtsverhältnis von Heteropolysäure zu Trägermaterial kann z.B. etwa 1:20 bis etwa 1:1 betragen. Die Heteropolysäure kann mit dem Trägermaterial in einer Weise kombiniert werden, die eine angemessene Dispersion der Heteropolysäure bereitstellt, durch welche der wirksame Oberflächenbereich der Heteropolysäure erhöht wird. Eine bevorzugte Technik zum Kombinieren dieser Bestandteile erfolgt durch Imprägnieren des Trägermaterials mit der Heteropolysäure. Die Heteropolysäure kann auch durch eine Ionenaustauschtechnik mit dem Trägermaterial kombiniert werden. Die Imprägnierungstechnik kann das Sorbieren einer wässrigen Lösung der Heteropolysäure in den gasförmigen Bereich des Trägermaterials, gefolgt vom Trocknen zum Entfernen von Wasser und zum Zurücklassen einer trägergebunde nen Heteropolysäure beinhalten. Andere wie dem Fachmann durch Lesen dieser Offenbarung verständliche Verfahren zum Immobilisieren von Heteropolysäuren oder Salzen davon können zum Immobilisieren dieser Komplexbildner verwendet werden.
Biologische Mittel
Nützliche PrP^Sc bindende Antikörper und Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind im am 8. Dezember 1998 erteilten US-Patent 5,846,533 offenbart und beschrieben. Teile dieser an PrP^Sc bindenden Antikörper können an eine Trägeroberfläche gebunden und in der vorliegenden Verbindung verwendet werden.
Bei dem Komplexbildner der Erfindung kann es sich auch um einen Antikörper handeln, der für Prionen selektiv ist, Dieser Antikörper kann direkt immobilisiert oder an einen anderen Bestandteil (z.B. ein Metall mit hoher Dichte) gebunden werden. Der Antikörper, z.B. der in US-Patent 5,846,533 offenbarte Antikörper bindet an PrP^Sc.
Im Allgemeinen versagt die Traberkrankheit-Infektion bei der Erzeugung einer Immunantwort, wobei Wirtsorganismen PrP^Sc von derselben Spezies tolerieren. Antikörper, die entweder an PrP^C oder an PrP^Sc binden, sind in US-Patent 5,846,533 offenbart. Der Fachmann kann beliebige Antikörper unter Verwendung von bekannten Verfahren herstellen, siehe z.B. Verfahren zur Herstellung von Phagendisplayantikörpergenbanken in US-Patent 5,223,409. Polyklonale anti-PrP-Antikörper wurden folglich nach der Immunisierung mit großen Mengen an Ameisensäure oder SDS-denaturiertem SHaPrP 27-30 in Kaninchen vermehrt [Bendheim, Barry et al. (1984) Nature 310:418-421; Bode, Pocchiari et al. (1985) J Gen Virol 66:2471-2478; Safar, Ceroni et al. (1990) Neurology 40:513-517]. Gleichermaßen wurde eine handvoll anti-Prp-monoklonale Antikörper gegen PrP 27-30 in Mäusen hergestellt [Barry and Prusiner (1986) J Infect Dis 154:518-521; Kascsak, Rubenstein et al. (1987) J Virol 61:3688-3693]. Diese Antikörper wur den gegen Ameisensäure- oder SDS-denaturiertes PrP 27-30 gebildet und können natives PrP^C und behandeltes oder denaturiertes PrP^Sc sowohl von SHa als auch Menschen gleich gut erkennen, binden sich jedoch nicht an MoPrP. Nicht überraschend wurden die Epitope dieser Antikörper in Regionen der Aminnsäureunterschiede zwischen SHa- und MoPrP enthaltenden Sequenz abgebildet [Rogers, Yehiely et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:3182-3186].
Es ist nicht ganz klar, warum viele Antikörper des in den vorstehend genannten Veröffentlichungen beschriebenen Typs an PrP^C und behandeltes oder denaturiertes PrP^Sc, jedoch nicht an natives PrP^Sc binden. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass dies stattfinden kann, da Epitope, die frei gelegt werden, wenn das Protein in der PrP^C-Konformation vorliegt, nicht frei gelegt werden oder teilweise in der PrP^Sc-Konfiguration versteckt sind, wobei das Protein relativ unlöslich und kompakter zusammen gefaltet ist.
Für die Zwecke der Erfindung bedeutet ein Hinweis darauf, dass keine Bindung stattfindet, dass die Gleichgewichts- oder Affinitätskonstante K_a 10⁶ l/mol oder weniger beträgt. Des Weiteren ist die Gegenwart einer Bindung erkennbar, wenn K_a 10⁷ l/mol oder mehr, vorzugsweise 10⁸ l/mol oder mehr beträgt. Eine Bindungsaffinität von 10⁷ l/mol oder mehr kann auf Grund (1) eines einzelnen monoklonalen Antikörpers (d.h. von großen Anzahlen einer Antikörperart) oder (2) einer Vielzahl von verschiedenen monoklonalen Antikörpern (z.B. von großen Anzahlen von jeweils fünf verschiedenen monoklonalen Antikörpern) oder (3) von großen Anzahlen an polyklonalen Antikörpern vorliegen. Es ist auch möglich, Kombinationen von (1) – (3) zu verwenden. Ausgewählte bevorzugte Antikörper binden verglichen mit ihrer Bindung an die native Konformation von PrP^Sc mindestens 4-mal eifriger an behandelte oder denaturierte PrP^Sc-Formen des Proteins. Der vierfache Unterschied in der Bindungsaffinität kann unter Verwendung von einigen verschiedenen Antikörpern wie in vorstehendem (1) – (3) erzielt werden, und als solche könnten einige der Antikörper in einem Gemisch weniger als den vierfachen Unterschied aufweisen.
Eine Vielzahl an verschiedenen Verfahren kann mit einem oder mehreren verschieden Antikörpern verwendet werden. Der Fachmann erkennt, dass Antikörper mit bekannten Markierungen markiert und mit gegenwärtig verfügbaren Robotern, Sandwich-Tests, Elektronendetektoren, Fließzytometrie und dergleichen verwendet werden können. Des Weiteren können die Antikörper direkt oder über andere Zwischenverbindungen wie anti-Antikörpern an dichtere Bestandteile gebunden werden.
REINIGUNGSVERFAHREN
Der Komplexbildner der Erfindung kann in einer Vielzahl an Reinigungsverfahren verwendet werden, um Prionen von einem biologischen Material wirksam zu entfernen. Eine Anzahl an Verfahren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist wie folgt zusammengefasst.
Affinitätschromatographie
Die Affinitätschromatographie (AC) beruht auf der Wechselwirkung eines Proteins mit einem immobilisierten Liganden. Die AC gründet sich teilweise auf der Wechselwirkung von an chromatographischen Trägern angelagerten Liganden. Ein an eine Matrix gekoppelter hydrophober Ligand wird hier unterschiedlich als AC-Träger, AC-Gel oder AC-Säule bezeichnet. Es ist des Weiteren klar, dass die Stärke der Wechselwirkung zwischen dem Protein und dem AC-Träger nicht nur eine Funktion des Verhältnisses einer nicht-polaren zur polaren Oberfläche auf dem Protein, sondern auch der Verteilung der nicht-polaren Oberflächen ist.
Eine Anzahl an Matrizen kann bei der Herstellung von AC-Säulen eingesetzt werden. Vorzugsweise handelt es sich bei derartigen Matrizen um Perlen, und stärker bevorzugt kugelförmige Perlen, die als Trägeroberfläche für den Komplexbildner der Erfindung dienen. Vorgeschlagene Materialien für die Matrizen schließen Agarose, vernetztes Dextran, Polyhydroxylethylmethacrylat, Polyacrylamid, Cellulose und Derivate oder Kombinationen davon, vorzugsweise in Form von porösen Kugeln, ein. Celluloseacetat wurde früher erfolgreich in Vorrichtungen zur Reinigung von biologischen Flüssigkeiten, z.B. außenkörperlichen Blutreinigungsvorrichtungen verwendet. Polyurethan ist besonders blutverträglich. Auch sind Siliciumdioxid und seine Derivate als Trägermaterial zur Verwendung mit Heteropolysäuren besonders nützlich. Siehe US-Patente 5,475,178 und 5,366,945.
Bei dem bevorzugten Material zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Agarose, ein natürlich vorkommendes hydrophiles Polymer. Ein perlenförmiges Gel mit einer Porosität von 90-96% wird durch Variieren des Prozentanteils der Agarose gebildet. Das Molekulargewicht des Gels liegt im Bereich von 0,5 Millionen für 10%ige Agarose bis 20 Millionen für 4%ige Agarose. Teilchendurchmesser im Bereich von 20 bis 200 Mikron sind im Handel erhältlich. Die mechanische Festigkeit von Agaroseperlen kann entweder durch Erhöhen des Prozentanteils der Agarose oder Vernetzen der Perlen mit Epichlorhydrin oder 2,3-Dibrompropanol unter Verwendung des Verfahrens von J. Porath et al. in J. Chromat 60, 167 (1971) erhöht werden. Dies gewährt eine entsprechende Erhöhung des maximalen Betriebsdrucks (eine fünfzigprozentige Erhöhung der Agarose führt zu einer zwei- bis vier- fachen Erhöhung des maximalen Betriebsdrucks).
Die Kriterien zum Bestimmen des geeigneten Kopplungsverfahrens lauten: Minimierung des Auslaufens des Komplexbildners aus einem Träger, Beibehalten der Wärmestabilität der Verbindung und Bewahrung der optimalen Komplexbildnermenge. Die Technik darf auch keine Verschlechterung des Trägermaterials oder der Herstellung der reaktiven Gruppen an dem Träger, die Blutbestandteile in vivo binden würden, verursachen. Der Komplexbildner muss auch seine Aktivität über einen Zeitraum beibehalten.
Weitere Faktoren, die beim Optimieren des Affinitätschromatographiekopplungsverfahrens berücksichtigt werden müssen, sind: der Verteilungsgrad des Kopplungsmittels mit den Teilchen und/oder Säulen; der pH-Wert; die Temperatur; die Fließgeschwindigkeit der biologischen Probe durch die Säule; die Größe des gebundenen Komplexbildners; und/oder der Durchmesser und die Porengröße des jeweiligen Trägers. Jede dieser Bedingungen kann für ein bestimmtes Verfahren, eine bestimmte biologische Probe und einen bestimmten Komplexbildner so, wie es dem Fachmann klar ist, optimiert werden.
Die AC-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann zur leichten Verwendung der Zusammensetzung in einer Reinigungsvorrichtung für eine biologische Flüssigkeit in einer Filterhülse enthalten sein. Ist die Säulenzusammensetzung in einer einzelnen Hülse enthalten, kann sie leicht und bequem ersetzt werden, wenn die Reinigungskapazität der Zusammensetzung erschöpft ist. In einer anderen Ausführungsform kann es sich bei der Hülse um ein integrales Teil einer Reinigungsvorrichtung handeln, wobei in diesem Fall die gesamte Vorrichtung ersetzt wird, nachdem die Wirksamkeit der Filtrationszusammensetzung erschöpft ist. Die Trägerteilchen im Komplexbildner werden in die Hülse eingesetzt und die mit dem Komplexbildner umzusetzende Lösung dann durch die Hülse zirkuliert. Im Handel erhältliche Einheiten zur Dialyse, zum Blutaustausch oder Oxygenierung können ebenso auf die Verwendung der Reinigungsvorrichtung angepasst werden.
Filtrationsverfahren
Ein anderes Verfahren, das zum Entfernen von Prionen aus einer biologischen Probe verwendet werden kann, beinhaltet die Filtration durch eine Membran. Die Membran kann den Prionenkomplexbildner aufweisen, der entweder auf einer der biologischen Flüssigkeit zugewandten Seite oder stärker bevorzugt von der biologischen Flüssigkeit abgewandten Seite direkt an die Membran konjugiert ist. In einer anderen Ausführungsform kann der Komplexbildner in einem Bereich hinter der Membran abgeteilt sein, der für größere Bestandteile der biologischen Materialien, z.B. Blutzellen unzugänglich ist. Im letzteren Beispiel kann der Komplexbildner an eine unlösliche Matrix hinter der Membran gebunden sein. Die Membran zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann in ebener Form, in Form einer oder mehrerer hohler Fasern und/oder in Form von flachen Folien vorliegen. Siehe US-Patent Nr. 4,361,484.
Geeignete Materialen für die Membran schließen regenerierte Cellulose, Celluloseacetat, Fließacrylcopolymer, Polysulfon, Polyethersulfon, Polyacrylnitril, Polyamid und dergleichen ein. Das biologisch aktive Material wird in den Poren und/oder auf der Oberfläche der von der biologischen Flüssigkeit abgewandten Seite der Membran immobilisiert. Dadurch wird verhindert, dass die Bestandteile wie Blutkörperchen mit dem aktiven Material in Kontakt kommen. Die Poren der Membran liegen üblicherweise in der Größenordnung von 0,01 bis 0,8 Mikron, vorzugsweise 0,15 bis 0,45 Mikron. Der Polymerträger muss unter den Bedingungen seiner vorgesehenen Verwendung stabil sein, d.h. er sollte durch Blut nicht chemisch oder enzymatisch abgebaut werden, der Träger und der immobilisierte Komplexbildner müssen blutverträglich sein, und der Träger sollte gute Fließeigenschaften und geringe Komprimierbarkeit unter klinischen Fließgeschwindigkeiten im Bereich von 150-250 ml/Min. aufweisen.
Durch die vorstehende Konstruktion der mikroporösen Membran, d.h. asymmetrisches Immobilisieren des Prionkomplexbildners, muss die biologische Flüssigkeit zur Entfernung von möglichen übrigen schädlichen Rückständen keiner anschließenden Filtration unterzogen werden. Sowohl die Abtrennung als auch die Entfernung der Substanzen kann in ein und demselben Schritt durchgeführt werden.
Die mikroporöse halbdurchlässige Membran kann in Form von einzelnen Fasern vorliegen, die gebündelt und in ein und demselben Gehäuse mit einem Einlass und Auslass für die biologische Flüssigkeit eingekapselt sind. Die Enden der Faser werden mittels eines geeigneten Bindemittels verklebt, um die einzelnen Fa sern im Wesentlichen parallel im Gehäuse zu halten. Ein Ende der Faser oder des Faserbündels ist in Kommunikation mit dem Einlass bereitgestellt, während das gegenüberliegende Ende in Kommunikation mit dem Auslass bereitgestellt ist.
Das biologische Material wird durch den Einlass und durch die Längsöffnung der Fasern in das Gehäuse und durch den Auslass aus dem Gehäuse gepumpt. Während des Durchgangs durch das Gehäuse wird die Flüssigkeit derart Druckvariationen unterzogen, dass bewirkt wird, dass nur eine durchdringende Fraktion in einem anderen Weg durch die Faserwände in jeder Richtung zum Kontakt mit dem Prionkomplex-bildenden Material fließt. Das Mittel zur Realisierung der Druckvariationen kann wiederum aus einer Expansionskammer in Kommunikation mit dem Raum zwischen den einzelnen Fasern bzw. Faserbündeln aufgebaut werden. Jegliches anschließendes Filtrieren des biologischen Materials zur Entfernung von möglichen schädlichen Rückständen ist nicht nötig, da das Filtrieren automatisch durch den Durchgang der Flüssigkeit durch die Faserwände erzielt wird.
Die Druckvariationen können von -200 bis +200 mmHg, vorzugsweise von -100 bis +100 mmHg variieren. Je länger der Diffusionsweg für das Blut ist, wenn z.B. der Prionkomplexbildner an eine unlösliche Matrix hinter der Membran gebunden ist, desto höhere Kompensationsdruckvariationen sind erforderlich, um den gewünschten Abtrennungseffekt zu erzielen. In einem entsprechenden Weg kann der Rhythmus der Druckvariationen von 0,05 bis etwa 10 Hz, vorzugsweise 0,5 bis 1 Hz variieren. Nach dem Durchgang durch die Behandlungseinheit kann das biologische Material, z.B. das Vollblut, erneut direkt in den Patienten eingeführt oder zur zukünftigen Verwendung aufbewahrt werden. Behandeltes Blut kann vollständig oder in seinen verschiedenen Bestandteilen z.B. Plasma, Blättchen, Erythrozyten usw. aufbewahrt werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Blut vor der Entfernung von Prionen in seine Bestandteile aufgetrennt werden.
Ist der Komplexbildner ein Antikörper, ist es häufig erwünscht, ein molekulares Abstandhaltersegment, das ein Mittel dafür, den Antikörper von der Wand der äußeren porösen Seite der hohlen Fasermembran auf Abstand zu halten, bildet, vorzuweisen. Diese allgemeine Anordnung ist bevorzugt, wenn das Molekulargewicht des Antigens groß ist, z.B. ein Molekulargewicht von 100.000 Daltons oder höher aufweist. Zum Beispiel ist eine Methylengruppe mit sechs oder acht Kohlenstoffatomen als Abstandhalter oder „Griff" zwischen Antikörper und Membranoberfläche günstig. Wird das Antigen durch Albumin leicht absorbiert oder noch leichter mit Albumin chemisch umgesetzt als das Material der Filtermembranoberfläche, kann das Abstandhaltermolekül ein Protein wie Albumin sein. Es kann vorgesehen sein, dass die Außenfläche einer Membran verglichen mit demjenigen der Innenflächen ein relatives poröses Material ist, bei welchem es sich gewöhnlich um eine wirksame Filteroberfläche auf einer Ultrafiltermembran oder des asymmetrischen, mitunter anisotropischen genannt, Typs handelt. Folglich kann z.B. die äußere poröse Seite einer Membran mit 17%iger menschlicher Albuminlösung in Kochsalzlösung behandelt werden. Das Albumin beschichtet die Oberflächen mit einer porösen Zone der Membranstruktur (d.h. die Zone, die unterhalb der Grenzschicht der Membran liegt), wonach eine Lösung aus Proteinen (z.B. ein PrP^Sc-Antikörper) auf dem Albumin abgeschieden werden kann. Häufig ist es erwünscht, das Protein zu einem gewissen Grad zu vernetzen (wie mit einer verdünnten Glutaraldehydlösung oder etwas anderem wie mit einem milden vernetzungsinduzierendem Mittel), wodurch das Verankern des Materials auf der Membranoberfläche an Stelle unterstützt wird.
Eine Vorgehensweise zum Herstellen einer Hülse, die pathogene Faktoren aus Blut entfernen kann, ist ein außenkörperliches Zirkulationssystem, wobei Fasermembrane eine ausreichende Durchlässigkeit für den zu entfernenden pathogenen Blutfaktor durch die Membran und in einen löslichen, immobilisierten Antikörper, der im Außenfaserraum maskiert ist, aufweist. Dies beinhaltet die Bildung eines Polymerkonjungats mit hohem Molekulargewicht aus PrP^Sc-Antikörper und PrP^Sc, das die Filtrationsstelle der Membran im Rest der biologischen Probe, d.h. wo die Zellen gehalten werden, nicht kreuzen kann.
Zum Bilden eines löslichen, immobilisierten Komplexbildners kann das Molekulargewicht des immunreaktiven Komplexbildners auf eine solche Größe erhöht werden, die vom äußeren, porösen Teil der Faser und in das zu reinigende Blut nicht diffundiert. Dies kann durch chemisches Umsetzen des Komplexbildners mit einer wasserlöslichen Substanz mit hohem Molekulargewicht wie Silicagel oder Dextran oder durch Polymerisieren des immunreaktiven Komplexbildners durchgeführt werden. Die Verwendung solcher makromolekülhaltigen Antikörper ist für eine hohe Geschwindigkeit der Antigenabsorption auf Grund der verbesserten Geschwindigkeit der Polymerisationswirkungen auf den Massenübergang und die Bindungskinetiken vorteilhaft.
In einer anderen Ausführungsform kann die Membran aus zwei Membranhälften zusammengesetzt sein, die im Allgemeinen mechanisch zueinander identisch, jedoch chemisch aus unterschiedlichem Material aufgebaut sind. In diesem Fall ist es ausreichend, wenn nur die vom biologischen Material abgewandte Membranhälfte den Prionkomplexbildner binden kann. Zum Beispiel können die Membranhälften in einer aneinander stoßenden Beziehung zueinander bereitgestellt sein, wobei der PrP^Sc-Komplexbildner vorzugsweise in den Poren und auf beiden vom biologischen Material abgewandten Oberflächen der Membranhälfte gebunden wird.
Der Komplexbildner (z.B. NaPTA oder anti-PrP^Sc-Antikörper) kann auch in der Membran immobilisiert werden, sodass die dem biologischen Material zugewandte Oberfläche frei von einem kontaktierenden Reagenz ist. Dies dient zum Vermeiden des Kontakts zwischen Blutkörperchen und dem Reagenz und dadurch von pyrogenen und/oder anaphylaktischen Reaktionen. Folglich handelt es sich dabei um eine Form einer symmetrischen Immobilisierung, wobei der Prionkomplexbildner auf einer Oberfläche der Membran (sowie in den Poren) immobi lisiert ist. Der Vorteil des Immobilisierens innerhalb der Poren der Membran liegt darin, dass die aktive mikroskopische Oberfläche verglichen mit der makroskopischen Oberfläche vervielfacht (>1.000) werden kann. Da der Komplexbildner im vom biologischen Material abgewandten Teil der Membran immobilisiert wird, kommt das biologische Material mit dem Material nicht in Kontakt. Demzufolge ist kein anschließendes getrenntes Filtrieren des biologischen Materials nötig.
In einer anderen Ausführungsform kann der Prionkomplexbildner an eine unlösliche Matrix hinter der Membran gebunden sein. Das Behandlungsverfahren ist ziemlich ähnlich, da jedoch der nötige Diffusionsweg um etwa das zehnfache länger ist, kann es nötig sein, etwas mehr tatsächlichen Fluss durch die Membran anzuordnen.
Ungeachtet dessen, ob der Prionkomplexbildner in den Poren oder an einer unlöslichen Matrix hinter der Membran immobilisiert wird, wird das Immobilisierungsverfahren vorzugsweise derart durchgeführt, dass der Komplex an Prionen und dem Komplexbildner angebunden und immobilisiert bleibt, d.h. nach der Reinigungstechnik nicht im Blut vorliegt. Im Allgemeinen ist eine kovalente Kopplung die sicherste Immobilisierung. Die Natur der verwendeten kovalenten Kopplung hängt von der Wahl des Membranmaterials und der Natur des Komplexbildners ab.
Magnetische Teilchen
Prionen können auch unter Verwendung von magnetischen Teilchen, die aus Prionkomplexbildner zusammengesetzt sind, aus biologischen Materialien entfernt werden. Bei den Grundbestandteilen der magnetischen Teilchen der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen magnetischen Kern. Der Kern besteht aus Teilchen aus Eisenoxid oder anderen magnetischen Materialien. Das PrP^Sc-Bindungsmittel der Erfindung kann direkt auf den magnetischen Kern oder indirekt auf den magnetischen Kern z.B. durch die Verwendung eines faserartigen Materials und eines Bindungsmittels eingebracht werden. Das faserartige Material kann ein organisches Polymer in Form von Fasern wie Kohlehydratpolymere, Harnstoffformaldehyd oder Polynanomethylenharnstoff und insbesondere Cellulosefasern umfassen. Das Bindungsmittel ist ein Material, das zwischen den magnetischen Kern und die Faserstränge als Flüssigkeit oder in Lösung eingebracht wird und während des Herstellungsverfahrens durch Einfrieren, Polymerisation oder Abdampfen eines Lösungsmittels verfestigt wird. Beispiele für geeignete Bindungsmittel sind Agar, Gelatine, Epoxyharz oder Harnstoffformaldehydfurfurylalkohol.
Magnetische Mikroteilchen, die im vorliegenden Verfahren nützlich sind, können in einer Vielzahl an regelmäßigen oder unregelmäßigen Formen vorliegen, wobei vorzugsweise die Form den Oberflächenbereich der Mikroteilchen maximiert. Die magnetischen Mikroteilchen sollten von einer derartigen Größe sein, dass ihre Abtrennung aus der Lösung, z.B. durch Filtration oder magnetische Abtrennung nicht schwierig ist. Zusätzlich sollten die magnetischen Mikroteilchen nicht so groß sein, dass der Oberflächenbereich minimiert wird oder dass sie für Vorgänge im Mikromaßstab nicht geeignet sind. Geeignete Größen liegen im Bereich von 0,1 .mu mittlere Durchmesser bis etwa 100 .mu mittlerer Durchmesser. Eine bevorzugte Größe beträgt etwa 1,0 .mu mittlerer Durchmesser. Geeignete magnetische Mikroteilchen sind im Handel von PerSeptive Diagnostics erhältlich und als BioMag COOH (Katalog Nummer 8-4125) bezeichnet.
Die beschichteten magnetischen Teilchen der vorliegenden Erfindung können durch Rühren oder Mischen der Kernteilchen in einer ein faserartiges Material, einen Prionenkomplexbildner und ein Bindungsmittel umfassenden Suspension hergestellt werden. Die Fasern lagern sich an den Kernteilchen an, und das Bindungsmittel füllt die Zwischenräume. Das Bindungsmittel wird dann durch das vorstehend erörterte Mittel in derartiger Weise verfestigt, dass der Prionkomplexbildner an der äußeren Oberfläche zugänglich ist. Ein Beispiel für ein solches Sys tem, das Eisenoxyd als Kernteilchen, Cellulosefasern als faserartiges Material und Agar als Bindemittel verwendet, ist in US-Patent Nr. 5,705,628 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung schließt in ihrem Umfang auch ein magnetisches Verbundharz ein, das magnetische Teilchen umfasst, die in einer organischen Polymermatrix eingebettet sind, die entweder für Prionen selektive Stellen enthält oder diese daran angelagert sind.
Der Verbund kann folglich magnetische Teilchen umfassen, die in einem Polymerharz eingebettet sind, das aktive Stellen oder zum selektiven Absorbieren der Prionen vorgesehene Chemikalien enthält. Zum Beispiel weist das Polymerharz Teilchen von daran gebundenen selektiven Absorptionsmitteln auf. Bei den selektiven Absorptionsmitteln kann es sich z.B. um ein Metall von Wolframatophosphorsäure sein.
Die magnetischen Verbundteilchen der vorliegenden Erfindung können in einem Verfahren zur Entfernung von Prionen aus einer beliebigen fließbaren biologischen Probe verwendet werden. Die Entfernung von Prionen aus dem menschlichen Produkt erfolgt durch Inkontaktbringen der zu behandelnden Lösung mit Teilchen aus einem magnetischen Verbundharz mit immobilisiertem Komplexbildner und Abtrennen durch magnetische Filtration der magnetischen Verbundharzteilchen von der Lösung. Diese magnetischen Teilchen können einmal verwendet und verworfen oder zur Verwendung bei der Reinigung von anderen Blutprodukten wiedergewonnen werden. Die Teilchen können durch Unterziehen der magnetischen Verbundharzteilchen einer Regenerierung unter Verwendung einer geeigneten Regenerierungslösung, Abtrennen der regenerierten magnetischen Verbundharzteilchen von der Regenerierungslösung wiedergewonnen werden.
Die magnetischen Verbundharzteilchen mit gebundenen Prionen werden dann durch magnetische Filtration durch auf dem Fachgebiet bekannte Techniken aus der Lösung selektiv entfernt. Die magnetischen Verbundharzteilchen werden dann aus dem Filter wiedergewonnen und die Prionen unter Verwendung einer geeigneten Regenerierungslösung, z.B. einer Säurelösung daraus entfernt. Die gereinigten magnetischen Verbundharzteilchen werden dann durch magnetische Filtration wiedergewonnen und die gereinigten Teilchen zur weiteren Verwendung rückgeführt.
Die Reinigung von biologischem Material eines Patienten kann durch eine außerkörperliche Behandlungseinheit erfolgen, und nach der Behandlung kann die gereinigte Flüssigkeit entweder aufbewahrt oder erneut in den Patienten eingebracht werden. Das biologische Material wird z.B. aus einem Patienten in eine Behandlungseinheit gepumpt, die eine mikroporöse halbdurchlässige Membran mit Poren mit 0,01-0,8 Mikron, vorzugsweise 0,15-0,45 Mikron umfasst. Während des Durchgangs durch die Behandlungseinheit wird das biologische Material Druckvariationen (z.B. von -200 bis +200 mmHg, vorzugsweise von -100 bis +100 mmHg) unterzogen, wodurch bewirkt wird, dass eine durchdringende Fraktion des biologischen Materials, z.B. das Plasma in einen anderen Weg durch die Membranwand in jeder Richtung zum Kontakt mit dem Komplexbildner fließt.
BEISPIELE
Die folgenden Beisiele sind dargelegt, um dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung dessen bereitzustellen, wie die vorliegende Erfindung durchgeführt und verwendet wird, und sollen den Rahmen dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, weder beschränken noch sind sie zum Darstellen der nachstehenden Versuche als alle oder die einzigen durchgeführten Versuche beabsichtigt. Es wurden Bemühungen durchgeführt, die Genauigkeit in Bezug auf die verwendeten Zahlen (z.B. Mengen, Temperatur usw.) zu gewährleisten, jedoch sollten einige Versuchsfehler und Abweichungen berücksichtigt werden. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich Teile auf das Gewicht, ist das Molekulargewicht ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts, ist die Temperatur in Grad Celsius angegeben und liegt der Druck bei oder nahe Atmosphärendruck.
BEISPIEL 1
Kugelförmige aus einem Silicatderivat zusammengesetzte Perlen werden in einer zylinderförmnigen Metallchromatographieapparatur verwendet. Die Perlen werden zur Affinitätschromatographie durch Imprägnieren der Perlen mit PTA vor dem Einsetzen in die Chromatographiegehäuseapparatur hergestellt. Die Perlen von etwa 5 mm wurden mit 25 Gew.-%iger Beladung von H₃PW₁₂O₄₀ durch das einleitende Benetzungsverfahren imprägniert. Die beschichteten Perlen werden in einem Vakuumofen getrocknet, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Schließlich werden die beschichteten Perlen bei 350°C für eine Dauer von 1 Stunde unter Stickstoff und 4 Stunden an Luft calciniert.
Die beschichteten kugelförmigen Perlen werden auf etwa 37°C abgekühlt, in die Chromatographiesäulenapparatur gegeben und mit 20 mM Natriumphosphat bei pH 7 äquilibriert. Ein Präparat von menschlichem Plasma wird dem Gemisch zugesetzt, das man zum Binden der Prionen an dem immobilisierten PTA mit ausreichender Geschwindigkeit über die Säule laufen lässt. Ein Aliquot des gereinigtem Plasmas wird dann unter Verwendung von Western-Blot-Analyse auf die Gegenwart von Prionen getestet.
BEISPIEL 2
Eine aminsubstituierte Nylonmembran wird wie folgt wie in US-Patent Nr. 4,361,484 beschrieben hergestellt. Ein für Prionen selektiver Antikörper wird zur Verwendung bei der Filtration an die aminsubstituierte Membran gekoppelt. Der IgG-Teil des α-PrP^Sc-Moleküls wird unter Verwendung von Glutardialdehyd auf der Membran immobilisiert. Die Membran wird mit einer 2,5%igen Lösung von Glutardialdehyd in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH = 6,8 behandelt, mit destilliertem Wasser gespült und getrocknet. Eine α-PrP^Sc enthaltende Lösung wird in 0,1 mM Phosphatpuffer (pH = 6,0, 4°C) gelöst und die Lösung mit der behandelten Memb ran inkubiert. Man lässt die Kopplung des Antikörpers mit der Membran für eine Dauer von 15 Stunden bei 4°C stattfinden. Nach der Inkubation wird die Membran in destilliertem Wasser gespült und das ungebundene α-PrP^Sc mit dem ersten Spülwasser zur späteren Verwendung aufgefangen.
Die Membran mit gebundenem α-PrP^Sc wird dann zur Entfernung von PrP^Sc-Protein aus menschlichem Blut in einer Hämofiltrationsapparatur verwendet. Der α-PrP^Sc-gebundene Filter wird dann in eine Hämofiltrationsvorrichtung, wie diejenige, beschrieben in den US-Patenten Nr. 5,858,238, 5,855,782 und 5,851,394, gegeben.
BEISPIEL 3
Ein Verfahren zur Reinigung von Blut eines lebenden Tieres beinhaltet das Durchleiten des Blutes durch eine außenkörperliche Anschlussvorrichtung. Eine Anschlussvorrichtung ist für diesen Zweck mit hohlen Cellulosefasern mit einem ID von 200 u und einer Innenwanddicke von 30 Mikrometern konstruiert. Die gebildete Hülse weist einen Gesamtrohrinnenoberflächenbereich von 0,6 Quadratmeter auf.
Die hohlen Fasern werden mit einer Lösung eines anti-PrP^Sc-Antikörpers in mit Borat gepufferter Kochsalzlösung unter Beibehalt von pH 8,5 durchschwemmt. Nach dreistündiger Zirkulation wird die Hülse intensiv mit Kochsalzlösung gewaschen. Die Lösung wird durch auf dem Fachgebiet bekannte Immundiffusionstechnik vor und nach dem Zirkulationsschritt auf anti-PrP^Sc-Antikörper getestet, um den Grad der Antikörperaufnahme durch die Faserwand zu bewerten. Anschließend wird die Hülse in Stickstoffstrom getrocknet, in einen Plastikbeutel gegeben und versiegelt.
Eine Hülse, enthaltend 1.000 asymmetrische hohle Fasern mit einer Abschnittporengröße bei 500.000 Dalton MW und einem Innendurchmesser von 150-200 Mikron, wird durch Durchpumpen von Kochsalzlösung durch die Faserwände von außen im „Umkehr"-Ultrafiltrationsmodus gewaschen. Anschließend wird eine 1%ige Lösung menschliches Serumalbumin in derselben Weise durch die Faserwand gepumpt, um eine monomolekulare Schicht aus Albumin an der Porenoberfläche der externen Seite der röhrenförmigen Membran abzuscheiden. Anschließend wird die Lösung aus anti-PrP^Sc-Antikörper durch die Wände der hohlen Fasern in „Umkehr"-Richtung filtriert, um zu gewähren, dass sich die Antikörper direkt an die externe Seite der Membran oder in enger Nähe zur Membran im äußeren Bereich binden. Die Aktivität der Lösung vor der Filtration und diejenige des das Lumen verlassenden Filtrats werden auf anti-PrP^Sc-Antikörper getestet. Das Gleichgewicht liefert die Menge an immunologischer Aktivität, die in der Hülse abgeschieden wurde. Nach dem Durchspülen des Lumenraums der hohlen Faser mit Streptomycin und Kochsalzlösung wird die Hülse in einen Kunststoffbeutel gegeben und versiegelt. So hergestellte Hülsen werden in außerkörperlichen Anschlussvorrichtungen verwendet.
BEISPIEL 4
Superparamagnetische Polystyrolperlen, enthaltend Magnetit (mittlerer Durchmesser 0,8 mu.m, 67% Magnetgehalt – Sigma Chemical Co.), werden über Nacht bei Raumtemperatur mit einem mit PrP^Sc angereichertem monoklonalen Antikörper beschichtet. Die erhaltenen antikörperbeschichteten Perlen werden dann in eine Apparatur gegeben, die aus einem Behälter wie einem Spritzenkörper zusammengesetzt ist, der eine Trägermatrix enthält, die von einer helikal gewundenen Kupferdrahtspule umgeben ist, die an eine geeignete Versorgung mit elektrischem Wechselstrom über geeignete Schaltelemente angeschlossen ist.
Eine Probe mit 10 ml Prionprotein enthaltendem Rinderblut wurde den Perlen zugesetzt und für eine Dauer von 10 Minuten inkubiert (in Gegenwart eines angelegten magnetischen Feldes). Ein Wechselstromfeld (50 Hz, 50 Volt) wurde auf die Spule angelegt, um ein magnetisches Feld zu erzeugen, und die magnetischen Perlen wurden von dem Blut isoliert. Komplexierte Perlen wurden durch Immunfluoreszenz-Färbungstechniken unter Verwendung eines anti-PrP^Sc-Fluoreszenz-FITC-Konjungats (Bradsure Biochemicals Ltd.) auf die Gegenwart von Prionen getestet. Die unter Verwendung des Verfahrens nachweisbaren Prionenkomplexe weisen deutlich darauf hin, dass ein spezifisches Einfangen der Prionen erzielt wurde.

Claims

Verfahren zum Entfernen von Prionen aus einer menschlichen Körperflüssigkeit, umfassend die Schritte: Inkontaktbringen einer menschlichen Körperflüssigkeit in fließfähigem flüssigem Zustand mit einem festen Substrat, das aus einem natives PrP^Sc bindenden Prionenkomplexbildner zusammengesetzt ist, und Inkontaktlassen des menschlichen Körperflüssigkeit mit dem Substrat über eine Zeitdauer, in welcher sich die Prionen in der menschlichen Körperflüssigkeit an das Substrat binden, wobei der Komplexbildner ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Heteropolysäure oder einem Salz davon, einem Metallsalz von Wolframatophosphorsäure und einem Antikörper.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Komplexbildner um einen Antikörper handelt und der Antikörper selektiv an natives PrP^Sc bindet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die menschliche Körperflüssigkeit menschliches Blut umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat in Form von kugelförmigen Perlen vorliegt, die aus einem ferromagnetischen Metall mit einem darauf aufgetragenen Polymer zusammengesetzt sind, und wobei es sich bei dem Komplexbildner um ein Metallsalz von Wolframatophosphorsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 4, ferner umfassend: Entfernen des Substrats aus dem Kontakt mit der menschlichen Körperflüssigkeit durch Anwenden von magnetischer Energie.
Vorrichtung zum Entfernen von Prionen aus einer Probe, umfassend: ein wasserunlösliches Polymer, das auf einem ferromagnetischen Metall aufgetragen ist, und einen Prionenkomplexbildner, der auf eine Oberfläche des Polymers aufgetragen ist, wobei es sich bei dem Komplexbildner um ein natives PrP^Sc bindendes Metallsalz von Wolframatophosphorsäure handelt.
Durchflussvorrichtung zum Entfernen von Prionen aus einer flüssigen Probe, umfassend: ein Gehäuse, durch welches eine flüssige Probe fließt, und Substratoberflächen, die aus einem Prionenkomplexbildner zusammengesetzt sind, bei welchem es sich um ein Metallsalz von Wolframatophosphorsäure handelt und der natives PrP^Sc bindet.
Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei das Gehäuse zylinderförmig ist und es sich bei dem Substrat um Polymerperlen mit einem auf deren Oberflächen aufgetragenen Metallsalz von Wolframatophosphorsäure handelt.