KR100849422B1 - 변형 프리온 단백질에 의한 퇴행성 뇌질환의 치료제 - Google Patents

변형 프리온 단백질에 의한 퇴행성 뇌질환의 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프리온 질병 예방 및 치료제에 관한 것으로, 양이온성 아미노산 단량체, 양이온성 아미노산 중합체 및 입체이성질체 중 선택된 1종이상 및/또는 다중 음이온성 화합물 및 그 동족체로부터 선택된 1종이상을 혼합하여 이루어지며,
상기 양전하를 띠고 있는 아미노산 단량체는 리신, 아르기닌, 히스티딘 및 오르니틴으로부터 선택되는 화합물을, 그리고 상기 다중 음이온성 화합물은 포스포텅스텐산(phosphotugnstic acid), 텅스텐산 나트륨(sodium tungstate), 몰리브덴산 나트륨(sodium molybdate), 파라몰리브덴산 암모늄(ammonium paramolybdate), 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)중 선택되는 화합물을 신경계 세포배양에 적용하는 것을 특징으로 하는 프리온 질병 예방 및 치료제가 제공된다.
프리온, 양이온성 아미노산 화합물, 다중 음이온성 화합물, 동종 아미노산 중합체, 입체이성질체

Description

변형 프리온 단백질에 의한 퇴행성 뇌질환의 치료제{Treatment for degenerative brain disease caused by prion protein}
도 1은 L-리신의 농도에 따라 kringle domain과 재조합 PrP간 상호작용의 간섭 정도를 도시한 그래프이고,
도 2는 kringle domain이 PrPC로부터 PrPSc로의 변환을 매개하는 것을 입증하는 도면(A) 및 그래프(B)이고,
도 3은 리신 단량체의 항 프리온 활성을 측정한 도면이며,
도 4는 리신 중합체의 항 프리온 활성을 측정한 도면이며,
도 5는 항프리온 활성과 다양한 크기의 L형 리신 중합체(PLK) 간 상관관계를 도시한 도면이며,
도 6은 리신 중합체의 입체 이성질체의 항 프리온 활성을 측정한 도면이며,
도 7은 리신 중합체와 퀴나크린을 함께 처리시 항 프리온 활성의 상승 효과를 도시한 도면이며,
도 8은 아르기닌 중합체의 항 프리온 활성을 측정한 도면이며,
도 9는 포스포텅스텐산/MgCl2의 항 프리온 활성을 측정한 도면이다.
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본 발명은 프리온(prion) 질병 예방 및 치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 프리온 치료에 효과적이면서 경제적일 뿐 아니라 예방 또한 간편한 프리온 질병 예방 및 치료제에 관한 것이다.
프리온 질병(전염성 해면상뇌증)은 prion이라고 알려진 단백질성 병원체에 의해 발병, 전염되며 PrPSc라고 알려진 단백질만으로 구성되어 있다.
전염성을 가진 PrPSc는 정상 프리온 단백질 PrPC로부터 유래한다. PrPC는세포막에 존재하는데 생리활성은 아직 밝혀지지 않고 있다. PrPSc의 생성기작은 잘 알려지지 않았지만 아마도 PrPC, PrPSc 그리고 이들의 구조변화에 도움을 줄 것으로 생각되는 protein X 간 단백질 상호작용이 주 요인으로 추측되고 있다.
이들 프리온 단백질은 다양한 종의 포유류에서 진행성 신경질환을 일으키며, 그 치사율은 100%에 다다른다. 인간의 CJD, 소의 BSE, 양의 스크래피(scrapie), 사슴의 CWD등이 대표적 프리온 질병으로 알려져 있다.
일반적으로 이 질병은 동종내에서 전파되지만 이종으로 전이되었을 때 더 큰 문제를 야기한다. 가장 대표적인 예로서 소의 BSE로부터 전이되어 발병한 인간의 변형 (v) CJD를 들 수 있다.
현재 이러한 프리온 질병에 대한 예방 및 치료제는 존재하지 않는다. 일부 물질이 항프리온 효과를 나타내는 것으로 알려져 있지만, 세포배양과 동물실험에서 그 효과는 미미하거나 만족스럽지 못한 결과를 보이고 있다.
따라서, 전염성 해면상뇌증(TSE; prion 질병) 예방/ 치료제 개발은 경제적으로도 학문적으로도 모두 잠재성과 가능성을 갖고 있다.
이에 본 발명의 목적은 프리온 질병에 대하여 효과적인 예방 및 치료제를 제공하려는데 있다.
본 발명의 일견지에 의하면,
양이온성 아미노산 단량체, 양이온성 아미노산 중합체 및 입체이성질체 중 1종 이상 선택되고, 상기 아미노산으로는 리신, 아르기닌, 히스티딘 및 오르니틴으로부터 선택되는 화합물을 신경계 세포에 적용하며,
이때 선택된 양이온성 아미노산 단량체의 농도는 5-40mM이고, 양이온성 아미노산 중합체 및 입체이성질체의 농도는 1-10㎍/ml인 것을 특징으로 하는 프리온 질병 예방 및 치료제가 제공된다.
본 발명의 제2견지에 의하면,
다중 음이온성 화합물 및 그 동족체 중 1종 이상 선택되고, 상기 다중 음이온성 화합물은 포스포텅스텐산, 텅스텐산 나트륨, 몰리브덴산 나트륨, 파라몰리브덴산 암모늄 및 우라닐 아세테이트 중 선택되며, 선택된 1종 이상의 화합물 및 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화망간, 염화구리, 염화아연 등으로 대표되는 2가 양이온 화합물의 혼합물을 신경계 세포에 적용하며,
이때 선택된 다중 음이온성 화합물의 농도는 염화마그네슘 8.5㎛ 기준으로 0.001-0.008%인 것을 특징으로 하는 프리온 질병 예방 및 치료제가 제공된다.
본 발명의 제3견지에 의하면,
양이온성 아미노산 단량체, 양이온성 아미노산 중합체 및 입체이성질체 중 선택된 1종이상, 다중 음이온성 화합물 및 그 동족체로부터 선택된 1종이상, 및 염화마그네슘을 혼합하여 이루어지며,
상기 아미노산으로는 리신, 아르기닌, 히스티딘 및 오르니틴으로부터 선택되는 화합물을, 그리고 상기 다중 음이온성 화합물로는 포스포텅스텐산, 텅스텐산 나트륨, 몰리브덴산 나트륨, 파라몰리브덴산 암모늄 및 우라닐 아세테이트 중 선택되는 화합물을 신경계 세포에 적용하며,
이때 선택된 양이온성 아미노산 단량체의 5-40mM이고, 양이온성 아미노산 중합체 및 입체이성질체의 농도는 1-10㎍/ml이고, 다중 음이온성 화합물의 농도는 염화마그네슘 8.5㎛ 기준으로 0.001-0.008%인 것을 특징으로 하는 프리온 질병 예방 및 치료제가 제공된다.
이하에서는 우선 본 발명의 프리온 질병의 예방 및 치료 메카니즘에 대하여 설명한다. 그 가설은 다음과 같은 2가지로 나누어볼 수 있다.
첫째, 프리온의 구성물질인 PrPSc가 PrPC의 구조변화에 의해 생성될 때 수반되는 PrPC와 protein X 사이의 상호작용을 이들 물질들이 방해하여 PrPSc의 형성을 저해하는 것으로 예측된다.
둘째, PrPSc 또는 PrPC 자체에 직접 작용하여 PrPSc와 PrPC의 구조적 안정성이나 활성에 변화를 초래하고 이로 인해 프리온 변환과정에 일어나는 각 단백질간의 상호작용이 억제되어 PrPSc의 형성이 봉쇄되는 것으로 추측된다.
따라서 프리온으로 인해 퇴행된 신경세포 유실의 복구에는 그 효과가 직접적으로 연관되지 않을 것으로 생각된다. 이들 물질은 단독으로 또는 프리온의 증식을 억제하는 다른 종류의 물질과 함께 이용되어, 동물의 기관과 조직에서 프리온을 제거한 후, 생체 자체적 조직복구능력에 의존하는 소극적 치료방법에 이용될 수 있다. 뿐만 아니라, 이 물질은 신경세포 유도/활성 물질과 함께 투여되어 감염조직으로부터 프리온을 제거함과 동시에 신경조직의 복구를 유도하는 적극적인 치료방법에 이용될 수 있어서 그 치료효과를 극대화시킬 것으로 기대된다.
나아가 상기 가설 메카니즘과 연관지어 선택된 본 발명의 화합물은 양전하를 띠고 있는 아미노산 단량체와 이로부터 얻어진 단일 중합체, 이들의 입체이성질체 및 다중음이온 화합물와 그 동족체로부터 선택된다.
본 발명에서 유효성분으로서 사용가능한 양전하를 띠고 있는 아미노산 단량체는 리신, 아르기닌, 히스티딘 및 오르니틴으로부터 선택된다. 그 함량은 5 - 40 mM 인 것이 바람직하다. 본 발명의 시험조건하에서 리신의 경우, 5 mM 의 농도로 프리온 감염세포를 처리했을 경우 세포내 프리온의 잔류량은 변화하지 않았고 10-20mM의 농도로 처리시에는 프리온 잔류량이 크게 감소하였으나 40mM의 농도에서는 세포 독성을 나타내면서 상당수의 세포가 치료효과를 보이기도 이전에 사멸하였다.
참고로, 프리온이 감염된 세포 배양액내에서의 역할과 관련하여 상기 아미노산, 특히 리신의 기능을 정리해보면, 생리/생화학적 측면에서 리신은 세포의 대사에 절대적으로 필수적인 아미노산으로 단백질의 주요성분 중 하나이다. 다른 아미노산과 마찬가지고 에너지의 공급원이고, 면역기능, 세포의 생성, 유지, 재생등의 기능이 있으며, 호르몬 생성등에도 관여한다. 항프리온 활성측면에서 리신은 프리온 변환에 관여하는 protein X에 결합하여 변환을 저지한다고 생각된다.
상술한 아미노산은 개별적으로 사용하여도 좋으며, 아르기닌, 히스티딘, 오르니틴등의 아미노산 또는 이의 중간체 중 2종 이상을 혼합하여 사용하여도 좋다. 그 함량은 2종 이상을 혼합할 경우 전체 혼합물내에서 아미노산 자체의 체적%의 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 아미노산 구성비 및 농도에 따라 적절하게 결정할 수 있는 것으로 여겨진다.
또한, 후술하는 실시예에서 확인되는 바와 같이, 입체이성질체, 특히 L 타입을 사용할 경우 그 효과가 탁월한 것을 확인할 수 있다.
본 발명에서 또 다른 유효성분으로서 사용가능한 양전하를 띠고 있는 아미노산 중합체는 리신, 아르기닌, 히스티딘 및 오르니틴 중합체로부터 선택된다. 그 함량은 리신 중합체의 경우 1㎍/ml - 5 ㎍/ml, 기타 중합체의 경우 1㎍/ml - 10 ㎍/ml인 것이 바람직하다. 본 발명의 시험조건하에서 리신 중합체의 경우, 1㎍/ml 미만의 농도로 프리온 감염세포를 처리했을 경우 세포내 프리온의 잔류량은 미미한 변화를 보였고 1 - 5 ㎍/ml의 농도로 처리시에는 프리온 잔류량이 급격히 감소하여 잔류 프리온이 거의 검출되지않을 뿐 아니라 세포독성도 없거나 매우 작았다. 5 ㎍/ml 초과의 농도에서는 세포독성이 급격히 증가하였다. 아르기닌 중합체의 경우, 2.5㎍/ml의 농도로 프리온 감염세포를 처리했을 경우 세포내 프리온의 잔류량은 5% 미만이었고 5 - 10 ㎍/ml의 농도로 처리시에는 프리온 잔류량이 급격히 감소하여 잔류 프리온이 검출되지않을 뿐 아니라 세포독성도 없거나 매우 작았다. 10 ㎍/ml 초과의 농도에서는 세포독성이 급격히 증가하였다.
참고로, 프리온이 감염된 세포 배양액내에서의 역할과 관련하여 상기 아미노산 중합체의 기능을 고려해보면 다음과 같다.
1) 리신 중합체: 이는 생리적 조건에서는 존재하지 않는 합성물질이므로 생리적인 기능에 대하여 잘 알려져 있지 않다. 단지 이 물질은 외부적 영향 (완충액의 종류, pH, 열)에 따라 다양한 생화학적 구조를 갖을 수 있다고 알려져 있다. 리신 중합체가 양성 전하를 띠고 있다는 성질과 세포외막은 음전하를 많이 띠고 있는 사실에 기초하여 세포배양시 배양용기 표면에 이 물질을 처리하여 세포가 보다 쉽 게 용기에 접착해서 자랄 수 있게 하는 데 이용되고 있다. 리신 중합체는 일부 거대분자의 생체내 전달용 운반체로 이용되기도 한다. 항프리온 활성측면에서 리신 중합체는 프리온 변환에 관여하는 protein X에 결합하여 변환을 저지한다고 생각된다.
2) 아르기닌 중합체: 이 역시 생리적 조건에서는 존재하지 않는 합성물질이므로 생리적인 기능에 대하여 잘 알려져 있지 않다. 이 물질은 유전자나 약물을 생체내의 조직이나 기관으로 전달시키는 운반체로 많이 사용되고 있다. 항프리온 활성측면에서 리신 중합체는 프리온 변환에 관여하는 protein X에 결합하여 변환을 저지한다고 생각된다.
상술한 아미노산은 개별적으로 사용하여도 좋으며, 히스티딘, 오르니틴등의 아미노산 또는 이의 중간체 중 2종 이상을 혼합하여 사용하여도 좋다. 2종 이상을 혼합할 경우 전체 혼합물내에서 아미노산 자체의 체적%의 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 아미노산 구성비 및 농도에 따라 적절하게 결정할 수 있는 것으로 여겨진다.
또한, 후술하는 실시예에서 확인되는 바와 같이, 입체이성질체를 사용할 경우 그 효과가 탁월한 것을 확인할 수 있다. 특히, 분자량 30KDa 이상인 L형 리신 중합체 (PLK)를 약 2㎍/ml의 농도로서 사용하던가, 분자량 15KDa이상인 L형 아르기닌 중합체 (PLR)를 2.5-5㎍/ml의 농도로서 사용하던가, 혹은 분자량 15-70KDa 범 위내인 D형 리신 중합체(PDK)를 1-1.5㎍/ml의 농도로서 사용하는 경우 탁월한 효과를 확인할 수 있었다.
나아가 프리온 질병에 대한 예방 및 치료 효과가 기 밝혀진 퀴나크린, 퀴놀린, RNA 엡타머, PrP 펩티드, 항PrP 항체, 포스포로티오에이트 올리고 뉴클레오티드, CpG (올리고 뉴클레오티드), 피리딘 유도체 (2-Amino-6-[(2-aminophenyl)thio]-4-(2-furyl)pyridine-3,5-dicarbonitrile), 콩고 레드, 가지형 폴리아민 (Polyethylenimine, PAMAM dendrimer), PrP(prion protein)-Fc, Leu-Pro-Phe-Phe-Asp의 서열을 갖는 β-병풍구조 파괴 펩티드, 포르피린 (porphyrin), 프탈로시아닌 (phthalocyanine), 수라민 (suramin), 암포테리신 B (amphotericin B), tetracycline, 요오도소루비신 (iododoxorubicin), 프루피리틴 (flupiritine), dapsone, 인도메타신 (indomethacin), 디메틸 술폭사이드, 에피갈로카테신 갈레이트 (epigallocathechin gallate), 폴리술페이트 글리코사미노글리칸 (polysulfated glycosoaminoglycans), 헤파란 술페이트 (heparan sulfate), 덱스트란 술페이트 (dextran sulfate) 및 펜토산 술페이트 (pentosan sulfate)로부터 선택된 1종 이상을 유효 농도 50 (EC50 ) 기준 약 1:1의 함량비로 더 혼합함으로써 프리온 질병에 대한 항프리온 효과를 상승시킬 수 있다.
한편, 본 발명에서 유효성분으로서 사용가능한 다중 음이온 화합물은 포스포텅스텐산, 텅스텐산 나트륨, 몰리브덴산 나트륨, 파라몰리브덴산 암모늄 및 우라닐 아세테이트로부터 선택된 1종 이상을 염화마그네슘과 혼합하여 사용한다. 그 함량은 염화마그네슘의 농도 8.5 μM를 기준으로 0.001 - 0.008 % 범위내인 것이 바람직하다. 본 발명을 위한 시험에서는 상기 함량범위가 이용되었던 최소와 최대량이었으며, 최소량 이하와 최대량 이상의 농도에서 항프리온 효과뿐 아니라 세포독성도 알려져 있지 않다.
참고로, 현재까지 밝혀진 다중 음이온 화합물의 생리ㆍ생화학적 기전은 그리 많지 않으나, 포스포텅스텐산의 세포생물학적, 생화학적 용도는 다음과 같다:
세포 시료를 염색하여 헤마톡실린과 더불어 조직학적 연구에 이용된다. 피브린, 콜라겐, 섬유소등과 결합한다고 알려져 있으며, 전자를 많이 가지고 있으므로 바이러스, 신경, 다당체등을 음성염색하고 전자 현미경 이미지를 위한 염색제로 쓰인다. 이 물질은 PrPSc 또는 PrPSc가 포함되어 있는 생화학적 분획의 구성물질 중 하나와 선택적으로 결합하여 프리온의 농축과정에 이용되기 때문에 PrPSc를 통한 항프리온 활성을 나타내는 것으로 추측된다.
상술한 다중 음이온성 화합물은 개별적으로 사용하여도 좋으며, 포스포텅스텐산에 텅스텐산 나트륨, 몰리브덴산 나트륨, 파라몰리브덴산 암모늄 및 우라닐 아세테이트등의 다른 다중음이온성 화합물 중 2종 이상을 혼합하여 사용하여도 좋다. 2종 이상을 혼합할 경우 전체 혼합물내에서 다중 음이온성 화합물 자체의 체적%의 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 화합물 구성비 및 농도에 따라 적절하게 결정할 수 있는 것으로 여겨진다.
나아가 프리온 질병에 대한 예방 및 치료 효과가 기 밝혀진 퀴나크린, 퀴놀린, RNA 엡타머, PrP (prion protein) 펩티드, 항PrP 항체, 포스포로티오에이트 올리고 뉴클레오티드, CpG (올리고 뉴클레오티드), 피리딘 유도체 (2-Amino-6-[(2-aminophenyl)thio]-4-(2-furyl)pyridine-3,5-dicarbonitrile), 콩고 레드, 가지형 폴리아민 (Polyethylenimine, PAMAM dendrimer), PrP(prion protein)-Fc, Leu-Pro-Phe-Phe-Asp의 서열을 갖는 β-병풍구조 파괴 펩티드, 포르피린 (porphyrin), 프탈로시아닌 (phthalocyanine), 수라민 (suramin), 암포테리신 B (amphotericin B), tetracycline, 요오도소루비신 (iododoxorubicin), 프루피리틴 (flupiritine), dapsone, 인도메타신 (indomethacin), 디메틸 술폭사이드, 에피갈로카테신 갈레이트 (epigallocathechin gallate), 폴리술페이트 글리코사미노글리칸 (polysulfated glycosoaminoglycans), 헤파란 술페이트 (heparan sulfate), 덱스트란 술페이트 (dextran sulfate) 및 펜토산 술페이트 (pentosan sulfate)로부터 선택된 1종 이상을 유효 농도 50 (EC50 ) 기준 약 1:1의 함량비로 더 혼합함으로써 프리온 질병에 대한 항프리온 효과를 상승시킬 수 있다.
본 발명에 의해 제조된 프리온 질병의 예방 및 치료제는 의약 또는 음료 등의 식품으로서 유용하다. 의약으로서 이용하는 경우의 투여형태는 특별히 한정되지 않지만, 경구투여, 주사, 수액투여 등의 일반적인 투여 경로를 거칠 수 있다.
경구 투여의 경우에는 상기 조성을 갖는 화합물 또는 혼합물로서, 의약상 허용되는 담체, 부형제와 함께 정제, 알약, 캡슐, 겔, 시럽등의 제제로서 이용해도 된다. 다만, 정제나 산제 등의 고형제로는 흡수에 시간이 걸리는 경우가 많으므로 액제 등에 의한 경구투여가 바람직하다. 그 경우에는 적당한 첨가물, 예를 들면 염화나트륨 등의 염류, 완충제, 킬레이트제 등과 함께 수용액으로 투여하는 것이 바람직하다.
또, 주사제로서는, 적당한 완충제, 등장제 등을 첨가하고 멸균증류수에 용해 한 것을 이용하여, 예를 들면 정맥내로 점적 주입하면 된다.
적절한 피복에 의해 당제 코어를 만들 수 있다. 이와 같은 목적을 위해, 농축된 당 용액이 이용될 수 있는데, 여기에는 선택적으로 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이산화티타늄, 락커 용액과 적절한 유기용매 또는 용매 혼합물 등을 포함할 수 있다. 안료 또는 염료가 활성 화합물을 확인하고 상이한 조합을 특징화시키기 위해 첨가될 수 있다.
경구로 이용될 수 있는 제약학적 조성물은 젤라틴으로 만들어진 푸쉬-피트(push-fit) 캡슐과 젤라틴과 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제로 만들어진 연성 캡슐을 포함한다. 푸쉬-피트 캡슐에는 활성 성분과 락토오즈와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 또는 선택적으로 안정화제를 포함할 수 있다.
연성 캡슐에는 활성 화합물을 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 액체에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다.
또한, 주된 프리온 감염 세포인 신경세포를 표적으로 하는 특이 항체 (항프리온 단백질 항체)로 피복된 약물의 형태로 투여할 수 있다. 이러한 표적 약물 수송 시스템은 병이 있는 조직에 선택적으로 취해질 수 있다. 리포좀의 구성성분인 양전하성 지질과 본 발명에서 언급하는 양이온성 아미노산 화합물은 생체내 약물/ 유전자 전달 운반체로 연구 이용되고 있다.
식품으로서 이용하는 경우에는, 적당한 풍미를 가하여 드링크제, 예를 들면 청량음료나 분말음료, 예를 들면 스프레이 드라이법, 동결건조법, 마이크로파인 파우더법 등에 의해 작성한 분말을 캡슐화한 것, 또는 정제의 형태로 할 수 있다.
투여될 양은 치료받는 개인의 체중, 상태의 심각성, 투여방법 및 의사의 판단에 따라 다양해질 수 있다. 필요에 따라 본 발명의 화합물 또는 혼합물은 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 약형을 포함하는 포장 또는 투여장치에 제공될 수 있다. 제약학적 수용가능한 담체내에 조성된 본 발명의 화합물 또는 혼합물은 적절히 제조되어 적정 용기내에 위치시키고, 지시된 조건의 치료용임을 알린다. 레벨에 표시된 적절한 지시로는 프리온 치료 및 예방용 치료를 포함한다.
<실시예>
이하, 실시예를 통해 본 발명을 구체화한다. 다만, 본 발명을 예시하고자 하는 것일 뿐 본 발명을 이에 한정하려는 것은 아니다.
1. 도입: 연구 배경
프리온 및 프리온 질병
프리온은 숙주에 치명적인 퇴행성 신경질환을 일으키는 전염성 병원체이 다[1,6]. 이 병원체는 기존의 다른 병원체 (곰팡이, 박테리아, 바이러스)와는 구별되는데 이는 프리온이 유전물질로 알려진 핵산이 배제된 PrPSc 라는 단백질만으로 구성되어 있기 때문이다[6]. PrPSc는 포유동물의 PRNP유전자에서 생성되는 세포성 정상 프리온 단백질 PrPC가 구조적 변화를 거쳐서 형성된 병원성 비정상 프리온 단백질이다[1]. 이 단백질성 병원체는 잘 알려지지 않은 기작을 통해 진행성 신경장애를 촉발하는데, 이 신경장애는 주로 뇌기능의 손상에서 비롯된 특유의 임상적 증상과 뇌조직에 공포 (vacuolation) 형성, gliosis, 프리온 침착등의 병리학적 변화를 수반한다[1,2]. 프리온 질병은 인간에서 발병하는 크로이츠펠트-야콥병(CJD), 소에서 발병하는 소해면상뇌증 (BSE; 광우병), 양에서 발병하는 스크래피, 사슴에서 발병하는 만성소모성질환 (CWD)등을 포함한다[3]. 또 이 질병은 내부적 요인인 유전적 돌연변이와 자발적 구조변환 뿐 아니라 외부적 요인에 의한 감염에 따라 발병한다[1-3]. 병원체의 최초의 기원이 내부 또는 외부적 요인인 것에 상관없이 일단 전염/발병되면 동종내의 다른 숙주로 전파가 가능한 것은 물론 종간 장벽을 뛰어 넘어 이종의 숙주로도 전파될 수 있다.
프리온 변환
프리온을 구성하고 있는 병원성 PrPSc는 신경세포에 많이 발현되는 PrPC로부터 단백질 구조가 변화되어 형성된다[1]. PrPC의 생리적 기능은 아직 밝혀지지 않고 있지만 이 정상 세포성 단백질의 발현이 프리온 질병의 발병에 매우 밀접하게 관련되어 있다[7,8]. 프리온 질병의 병인은 프리온 변환 과정으로 설명될 수 있다. 프리온 질병의 발병 과정 중, PrPSc는 새로운 PrPSc 분자를 만들기 위해 PrPC를 변환시키는데, 이 때 PrPC에서는 α-나선구조에서 β-병풍구조로 단백질 구조가 바뀌는 대규모의 생화학적 변화가 일어나게 된다[1-3,7,8]. 그 결과 변환된 PrPSc는 부분적으로 단백질 가수분해 효소 (Proteinase K; PK)에 대한 저항성을 나타내지만 변환 이전의 PrPC는 PK에 의해 분해되는 감수성을 지니고 있다[1,9]. PrPC에서 PrPSc로 변환되는 과정에는 protein X라고 명명된 보조 단백질의 기능이 필수적이다[10]. 이 제3의 단백질은 PrPC와 상호작용하는 것으로 밝혀져 있지만, 아직 그 실체가 알려져 있지 않다.
단백질 X 후보 단백질
형질전환 동물에서의 프리온 전염실험, PrPC 구조에 대한 연구, 배양 세포에서의 PrPSc 생성에 대한 분자 생물학적 연구 등을 통하여, protein X가 PrPC로부터 PrPSc로의 변환에 중요한 역할을 수행한다는 사실과 PrPC와 protein X 사이의 상호작용과 관련한 결합 성질 등이 알려졌으나, 실제로 어떤 단백질이 protein X인지에 대해서는 알려진 바 없다[10-14]. 일부 연구에 의하면 몇몇의 단백질들이 PrPC 또는 PrPSc와 상호작용한다고 보고되었지만, 그들이 실제로 동물 모델에서 프리온 발병 과정에 어떠한 기능적 역할을 하는지 정립되어 있지 않다[15-31]. 최근의 보고에 의하면, laminin receptor precursor, stress inducible protein 1 과 같은 단백질이 배양 세포 내의 PrPSc 형성에 관여한다고 알려져 있다[25,26,28-31]. 그 외에도 세포질, 핵 또는 세포막에 위치하는 protein X 후보 단백질들이 여럿 보고되 었다. 그러나 프리온 변환은 세포막 중 지질 성분을 다량 함유하고 있는 caveolae-like domain 에서 이루어지는 것으로 알려져 있으므로, protein X는 이 부분에 위치하거나 쉽게 근접할 수 있는 단백질일 것으로 추측된다[32-37].
프리온 단백질과 kringle - domain 을 지닌 단백질 사이의 상호작용
본 연구자는 α-나선 구조로 이루어진 재조합 생쥐 PrP를 이용하여 파아지 디스플레이 cDNA 발현 라이브러리를 검사하여 PrP에 결합하는 플라스미노겐의 kringle domain을 포함하는 파아지 클론을 선별하였다[14]. 선별 시 이용된 α-나선 구조를 지니고 있는 재조합 생쥐 PrP는 세포에서 발견되는 PrPC와 유사한 구조를 가지고 있으며, 실제로 시험관내 결합 실험에서 정제된 kringle domain과 결합하였다. 이는 PrP가 플라스미노겐, 플라스민, 조직형 플라스미노겐 활성인자 등과 같은 kringle domain 을 지니고 있는 단백질과 상호작용 한다는 여러 독립적인 연구에 의해 재확인되었다[14,23,42-51]. Kringle domain은 성장 인자와 혈관 신생, 혈액 응고, 섬유소 분해에 관련하는 단백질 등에서 발견되는데, 각각의 단백질이 지니고 있는 kringle domain의 숫자는 다양하다[38-41]. 그러나 kringle domain의 구조는 그들을 포함하는 모든 단백질에서 공통적으로 잘 보존되어 있다. 이들 kringle domain 함유 단백질 중 일부는 세포막 중 지질 성분을 다량 함유하고 있는 부위에 위치한 그들의 수용체 또는 다른 단백질과 상호작용 한다고 알려져 있고, 실제로 그들간의 상호작용에 필요한 결합은 kringle domain을 통하여 이루어진다. 대부분의 kringle 매개 상호작용에는 kringle domain의 리신 결합 부위가 중요한 역할을 담당하고 있다고 밝혀져 있다[39,40].
시험관 내 단백질 결합 연구를 통하여, 본 연구자는 kringle domain과 재조합 생쥐 PrP의 상호작용이 PrPC와 protein X 사이의 상호작용을 유사함을 발견하였다. Q218K dominant negative 돌연변이를 갖는 PrP는 그렇지 않은 정상 PrP 보다, PrP(23-231)는 분절된 PrP (89-231) 보다, α-나선 구조의 PrP는 β-병풍구조의 PrP 보다 kringle domain에 강하게 결합하였다[14]. 뿐만 아니라, 시험관내 경합시험 (competition assay)에서 kringle domain과 재조합 PrP의 상호작용은 리신 농도가 증가함에 따라 억제되었다(도 1) [14].
프리온이 감염된 생쥐 양성신경종양 세포 (ScN2a세포)에 항원인식 부위가 부착된 PrP 를 발현시킨 후 실시한 프리온 변환 시험에서 kringle domain이 PrPC로부터 PrPSc로의 변환을 매개하는 것이 증명되었다. 항원인식부위가 부착 된 MHM2 PrP 는 혼성 생쥐 PrP로서 시리안 햄스터 PrP의 고유한 항원 인식 부위를 지니고 있다. 그러므로 이 혼성 PrP는 ScN2a 세포내에서 scrapie 형태로 변화될 수 있을 뿐 아니라, ScN2a 세포에서 발현될 경우 내인성 생쥐 PrP와 구별되며, 햄스터 PrP 항원인식부위에 결합하는 3F4 항체로 검출 가능하다(도 2, 패널 A, 줄 2). 이들 세포 배양액에 kringle domain을 첨가하면 PK 저항성을 보이는 MHM2 PrPSc의 형성이 세포내에서 약 4배 가량 증가하였다(Ryou, 비공개 자료, 도 2, 패널 A와 B, 줄 2와 3).
항프리온 제제와 프리온 변환 과정에 관련된 치료법 개발 대상
프리온 질병을 예방하거나 병의 진행을 지연시키기 위하여 많은 감염억제제, 면역 조절제, 다중 음이온성 물질 등을 포함하는 약용 물질과 약리 활성을 지닌 화학 물질들이 프리온 치료를 위하여 시험되었다[54,55,54와 55의 참고문헌]. 그러나 현재까지 이러한 접근 방법은 프리온 질병을 치료하기에는 불충분하였다. 많은 화합물들이 배양 세포에서 프리온의 형성을 부분적으로 저해하거나, 프리온의 제거를 일부 촉진시키고, 프리온에 감염된 실험동물에서 잠복기를 조금 연장시키는 등의 미미한 효과는 보였으나, 일단 임상적 증상을 보이는 단계까지 질병이 진행되었을 경우, 치료 효과를 보이는 화합물은 아직 발견되지 않았다.[54,55,54와 55의 참고문헌]. 이들 화합물 각각의 작용 양상은 더더욱 알려져 있지 않다. 그러므로 프리온 변환 기작의 이해에 기초한 체계적인 접근 방법이 더욱 중요하게 부각되고 있다.
프리온 변환 과정은 프리온 질병의 핵심적인 생화학적 특성이기 때문에 이에 기초한 합리적인 치료법의 개발이 요구된다. 가장 가능성 있는 접근 방법은 화합물과PrPC, PrPSc, protein X 사이의 결합을 통해 이들의 구조적 안정성 및 활성을 변화시키는 것을 들 수 있다. 현재까지 알려진 항프리온성 물질에는 퀴놀린, 퀴나크린, RNA 엡타머, PrP 펩티드, 항PrP 항체, 포스포로티오에이트 올리고 뉴클레오티드, 피리딘 유도체 (2-Amino-6-[(2-aminophenyl)thio]-4-(2-furyl)pyridine-3,5-dicarbonitrile) 등이 있으며, 이들은 PrPC를 통해 작용하는 것으로 여겨진다[56-65]. 한편, 콩고 레드, 가지형 폴리아민, PrP-Fc, 그리고 β-병풍구조 파괴 펩티드 등은 PrPSc를 통해 작용하는 것으로 추정된다[66-71]. 그렇지만, protein X의 불분명한 실체로 인해, protein X에 매개하여 항프리온 활성을 나타내는 물질은 현재까지 개발되어 있지 않다.
2. 연구의 근거 및 관련성
프리온 질병 치료법을 개발하기 위한 목적으로, 본 연구자는 프리온 변환과정에 초점을 맞추었다. 이는 프리온 변환이 프리온 질병 발생의 중추적인 분자적 현상이기 때문이다[1].
본 연구의 접근 방법은 종래의 접근 방법과는 달리 지금까지 고려되지 않았던 protein X를 대상으로 한다. 현재까지의 실험결과를 종합하면 리신이나 이와 유사한 양이온성 아미노산이 protein X에 결합하여 PrPC와 protein X 사이의 상호작용을 방해한다고 추론된다. 시험관내 경합시험을 통해 알려진 것과 같이 첨가되는 L-리신의 양에 비례하여 PrPC 와 kringle domain사이의 상호작용이 저해되는 사실은 이러한 추론을 가능하게 한다. 후속 배양세포를 이용한 실험에서 리신과 아르기닌등의 양이온성 아미노산의 단량체, 동종중합체, 그리고 입체이성질체가 PrPSc의 형성을 저해하는 사실은 앞선 추론과 결과에 상응한다.
이들 양이온성 아미노산 중합체 또는 유사 중합체는 생체내 유전자 치료나 약물 전달등을 위한 운반체로 많이 연구, 이용되어 왔기 때문에 이들이 생체내에서 어떤 약리학적, 독성학적 성질과 효과을 나타내는지에 대한 많은 연구결과가 알려져있다. 이는 앞으로 본 연구를 통해 알려진 화합물들이 생체실험을 통해 검정될 때 매우 긴요하게 이용될 수 있을 것이다[72-76].
본 연구는 인간과 동물에 공통적으로 감염이 가능한 프리온 질병을 치료하는 잠재적 치료법을 개발할 목적으로 단백질-단백질간, 특히 PrPC와 protein X의 상호결합을 간섭하는데 초점이 맞춰진다. 그러므로 본 발명은 프리온 전환이 필수적인 모든 종류의 프리온 질병에 공통적으로 적용될 수 있다. 실제로 프리온 질병은 종내 및 종간 전염이 가능할 뿐 아니라 감염된 숙주의 100%가 치사하는 치명적인 병이다. 이들은 kuru, sporadic CJD, familial CJD, iatrogenic CJD, 변형 (v) CJD, Gerstmann-Straussler-Scheinker 질병 및 치명적 가족 불면증 (FFI)과 같은 인간 질병을 다수 포함한다[1-3].
프리온 질병의 분자적 병인기작은 PrPC와 PrPSc, PrPC와 protein X 사이의 단백질 상호작용이 중심이되어 발생하는 분자구조의 전환으로 설명된다. 그러므로 본 연구에서는 이들 단백질 상호작용 중 하나인 PrPC와 proten X 사이의 상호작용을 항프리온 약제 개발의 대상으로 삼았다. 실제로 protein X의 후보인 kringle domain에 결합하는 화합물을 이용하여 PrPC-kringle domain 상호작용을 간섭, 프리온의 변환을 억제하여 질병의 발생을 차단하거나 발전을 불가능하도록 하는데 목적이 있다. 이는 프리온 질병의 치료 및 예방 뿐 아니라 이 질병에 대한 분자 수준의 이해와 연구에 밀접한 관련성을 가지고 있다.
3. 결과
상기 실험관 내 결합실험에서 관찰된 L-리신에 의한 PrPC 와 kringle domain 간 상호 작용 억제가 프리온 변환을 예방하고, 실질적으로 세포내의 PrPSc 를 제거하는지를 확인하기 위해서, 본 연구자는 ScN2a 세포에 다양한 농도의 L-리신 용액을 6일 동안 처리하였다. L-리신을 10 mM 과 20 mM 농도로 각각 세포에 처리 시, 세포 내 PrPSc의 40% 와 80%가 제거되었으며, 이를 통하여 L-리신의 농도가 증가함에 따라 세포 내 PrPSc 양을 감소되는 것을 확인하였다(도3). ScN2a 세포에 20 mM 보다 높은 농도로 L-리신을 처리 시, 배양 세포의 수가 확연히 감소 하는 독성을 나타내었다(데이터 미도시). 본 결과는 리신이 PrPC와 kringle domain의 상호 작용을 차단함으로써 항프리온 효과를 나타냄을 시사한다.
리신 단량체 처리시 배양세포의 PrPSc가 불완전하게 제거되었으며 고농도에서 아미노산 독성이 관찰되었으므로, 본 연구자는 리신 중합체를 시험하였다. 리신 중합체는 ScN2a 세포에 다량의 리신을 공급할 수 있을 뿐 아니라, 일반적으로 세포를 배양 용기에 부착시키는 물질로 상용되어 왔기에, 낮은 세포 독성을 나타낼 것으로 기대하였다. 리신 단량체를 이용한 실험과 같이, ScN2a 세포에 0에서 5 ㎍/ml 농도의 리신 중합체-분자량 30-70 KDa (PLK30-70)을 처리하였다. PLK30-70 을 2 ㎍/ml 이상으로 ScN2a 세포에 6일간 처리 시, 배양 세포에서 PrPSc가 모두 제거 되었 다 (도 4). 1 ㎍/ml의 PLK30-70처리 시 약 20-30% 가량의 PrPSc 가 배양 세포에 잔존하는 것으로 보아 배양 세포의 모든 PrPSc를 제거하기에는 충분하지 않았다 (도4). 나아가서, 본 연구에서 시험된 최고농도인 5 ㎍/ml PLK30-70 처리 시에도 20 mM 초과 고농도의 리신 단량체를 처리했을 때 관찰 되었던 세포 사멸, 형태학적 변화, 단백질 총량의 변화와 같은 세포 독성은 없었다 (데이터 미도시).
리신 중합체에 존재하는 하전된 아민기의 숫자가 리신 중합체의 항프리온 활성에 어떠한 영향을 주는가를 확인하기 위해서 다양한 크기의 L형 리신 중합체의 효능을 검사하였다. 중합체를 구성하는 리신 단량체의 수에 따라 다양한 크기의 리신 중합체가 형성된다. 리신이 양이온성 아미노산이므로, 중합체의 크기에 따라 보유하는 양전하 하전도가 다르다. kringle domain을 반복적으로 지닌 단백질의 경우, kringle domain과 리신 중합체 사이의 상호 결합이 중합체의 크기에 따라 영향을 받을 수 있다고 추측된다. 참고로, 프라스미노겐의 경우 다섯 개의 kringle domain이 이 단백질의 아미노 말단에 연속적으로 존재한다[41]. 하지만 리신 중합체의 구성 단량체의 수와 kringle domian의 수가 화학량적으로 1:1 이라는 사실은 아직 밝혀지지 않았다. 실험에 이용된 L형 리신 중합체의 크기는 1에서 300 KDa 정도이었다. 그들은 PLK, 분자량 1 KDa (PLK1), 분자량 1-4 KDa (PLK 1-4), 분자량 4-15 KDa (PLK4-15), 분자량 15-30 KDa (PLK15-30), 분자량 30-70 KDa (PLK30-70), 분자량 70-150 KDa (PLK70-150), 분자량 150-300 KDa (PLK 150-300) 및 분자량 >300 KDa (PLK 300)이었다. 5 ㎍/ml 농도에서 다양한 크기의 PLK 는 ScN2a 세포 배양 시 PrPSc 제거에 서로 다른 효과를 나타내었다 (도5, 하부 패널). PLK1 과 PLK1-4는 시험 조건하에서 PrPSc의 제거에 비효과적이었다. PLK4-15와 PLK15-30은 서로 비슷한 정도의 항프리온 효과를 보였으나, PLK1과 PLK1-4 보다는 매우 효과적이었다. 이들의 항프리온 활성은 본 연구에서 시험된 PLK중 중간 정도의 활성을 띄고 있으며, 비처치군 대비90% 정도의 PrPSc 가 제거되었다. 그러나ScN2a 세포가 PLK30-70, PLK70-150, PLK15-300, PLK300등의 고 분자량 PLK에 노출되면 세포 내 PrPSc는 모두 제거 되었다. 한편, 상기 어떠한 PLK를 이용한 실험에서도 PrPC의 양의 변화가 관찰되지 않았다(도5, 상부 패널). 이 결과는 PLK의 항프리온 활성이 중합체 내에 존재하는 양전하 그룹의 숫자에 비례한다는 것을 제시한다.
프리온 전파를 억제하는 더 강력한 물질을 찾기 위해서, 리신 중합체의 입체 이성질체를 ScN2a 세포에 처리하여 항프리온 활성을 측정하였다. 이성질체 간의 동일한 물리화학적 성질에도 불구하고 그들의 약리적 효능과 선택성이 많은 질병에 있어 크게 다를 수 있다[78-80]. 실제로 퀴나크린의 입체 이성질체는 다른 항프리온 활성을 보인다[81]. 그러나 퀴나크린의 작용 기전은 거의 알려져 있지 않다. 또 퀴나크린과 리신 중합체의 이성질체가 동일한 기전으로 프리온을 제거하는지도 알려져 있지 않다. 리신 중합체의 입체 이성질체 (PLK와 PDK)의 처리를 통하여, D형 리신으로 이루어진 중합체 (PDK30-70, PDK15-30)가 L형 리신으로 구성된 중합체 (PLK30-70) 보다 PrPSc의 제거에 더욱 효과적임을 알 수 있었다(도 6). PrPSc를 50% 감소시키는 유효 농도 (EC50)는 PLK30-70에서 1 ㎍/ml, PDK30-70에서 0.5 ㎍ /ml, PDK15-30에서 0.7㎍/ml 로 나타났다. 완전한 PrPSc 제거를 위해서는 PLK30-70 은 2㎍/ml 농도가 필요한데 반해서, PDK30-70과 PDK15-30은 1-1.5 ㎍/ml이면 충분하였다. 이는 PrPSc가 입체 이성질체의 종류에 따라 다른 효율로 제거됨을 시사한다.
더 효과적인 프리온 치료를 위해서, ScN2a 세포에 항프리온 물질을 혼합해서 처리하는 방법이 고안되었다. 이를 위하여 PLK와 PDK 각각을 퀴나크린과 함께 세포에 처리하였다. 퀴나크린은 아크리딘 고리와 짧은 곁사슬로 이루어진 작은 화학물질로 항프리온 활성을 갖고 있다[82]. PLK30-70과 퀴나크린을 함께 처리 시, 각각을 단독으로 처리했을 때 보다 PrPSc의 제거에 더욱 효과적이었다(도7, 패널 A). 이와 유사하게, 단독으로는 PrPSc를 완전히 제거하지 못하는 농도의 PDK15-30과 PDK30-70를 각각 퀴나크린과 함께 처리 시 PrPSc를 완전히 제거하는 효과를 보였다(도7, 패널 B). 그러므로, 리신 중합체와 퀴나크린을 조합하여 ScN2a 세포에 처리하면, 세포내 PrPSc가 두 물질의 협력작용에 의해 상승적으로 제거될 수 있음을 확인할 수 있었다.
리신과 아르기닌이 모두 양전하를 띄고 있으므로, 아르기닌 중합체도 리신 중합체에서 발견된 항프리온 활성을 지니고 있을 것으로 예상하였다. ScN2a 세포에 다양한 농도로 분자량 15-70 KDa 의 L형 아르기닌 중합체 (PLR15-70)를 6일 간 처리하였다. 리신 중합체와 같이, 아르기닌 중합체도 항프리온 활성을 나타내었다. PLR15-70 은 5 ㎍/ml 이상의 농도에서 PrPSc를 완전히 제거하였고 2.5 ㎍/ml 농도에서는 거의 대부분 (>95%)의 PrPSc를 제거하였다(도8). 본 연구에서 시도된 가장 높은 농도인 10 ㎍/ml 에서 PLR15-70은 세포의 유지 및 성장에 아무런 부작용도 유발하지 않았다.
상술한 양이온성 화합물과 독립적으로, 본 연구자는 무기화합물인 다중 음이온성 화합물 포스포 텅스텐산(PTA)과 염화 마그네슘의 혼합물 (PTA/염화 마그네슘)이 ScN2a 세포에서 PrPSc를 제거하는데 효과가 있음을 발견하였다.
본 연구자는 PTA와 염화 마그네슘의 혼합물이 특정 농도에서 독점적으로 PrPSc에 결합한다는 사실에 근거하여[83], 이 혼합물이 PrPC와 PrPSc 사이의 상호작용을 방해하는 기전으로 PrPSc의 형성을 억제할 것이라는 가설을 수립하였다.
리신 중합체와 아르기닌 중합체에 적용한 동일한 방법으로 수행된 실험에서, 첨가된 PTA/염화 마그네슘의 농도 증가에 비례하여 ScN2a 세포의 PrPSc가 제거됨을 알 수 있었다. PK 저항성이 있는 PrPSc 는 PTA/염화 마그네슘의 농도의 증가에 따라 감소하였다. PTA/염화 마그네슘이 0.001%/8.5 μM의 농도에서 PrPSc의 수준을 현저히 감소시켰으며, 상기 농도를 2배 이상으로 증가시키면, PrPSc는 처리된 세포로부터 완전히 제거 되었다(도9, 하부 패널).
흥미롭게도, PrPC의 양은 처리한 PTA/염화 마그네슘의 농도에 반비례하였다. 이 혼합물은 PrPSc에 선택적으로 결합하는 것으로 알려져 있지만, 본 연구의 시험조건하에서는 혼합물의 농도가 배양액내에서 증가함에 따라 PrPSc는 물론 PrPC도 감소하였다(도9, 상부 패널). 그렇지만 이 사실이 PTA/염화 마그네슘이 PrPC와 결합한다는 증거는 아니다. PTA/염화 마그네슘이 직접적으로 PrPC를 감소시키는지 또는 다른 기전을 통해 간접적으로 PrPC에 영향을 미치는지 명확하지 않다.
그럼에도 불구하고, PTA/염화 마그네슘 혼합물과 양이온성 아미노산 중합체 모두 강력한 항프리온 활성을 보일 뿐만 아니라 이들은 프리온 변환 기전에 있어서 서로 다른 단계 (PTA/염화 마그네슘- PrPSc 또는 PrPC, 양이온성 아미노산 중합체- protein X)에 작용하는 것으로 추정되므로 이 두 물질을 함께 적용시킨다면 항프리온 활성을 극대화 할 수 있을 것으로 여겨진다.
4. 실험 절차 및 방법:
화합물의 항 프리온 활성 측정:
화합물(리신 단량체, 리신과 아르기닌의 단일 중합체, 이들 중합체의 입체 이성질체, 그들의 유도체, PTA/MgCl2, 퀴나크린)의 항 프리온 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자는 상기 화합물을 영구적으로 프리온이 감염된 신경계 세포모델인 ScN2a 세포 배양물 내에 단독 혹은 조합으로 처리한 후 잔존하는 PrPSc의 정도를 측정, 프리온 제거 효능을 검정하였다[77].
상기 화합물은 Sigma Chemical (St.Louis, MO)로부터 구입하였다. 세포 배양에 필요한 완충액, 세포 배양액, 소의 태아 혈청 (FBS) 등은 Invitrogen(Carlsbad, CA)로부터 구입하였다.
상기 화합물을 인산 완충 식염수(PBS)에 용해시켜 4℃에 보관, 사용하였다. ScN2a 세포를 10% FBS, 1% GlutaMax 및 1x 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배양액 (DMEM)에서 배양하였다. 화합물 처리를 위하여, ScN2a 세포를 약 2-3%의 최초 밀도로 배양용기에 분주하고 다양한 농도의 화합물(리신 단량체의 경우 mM 수준; 리신과 아르기닌 중합체 및 퀴나크린의 경우 nM - μM 수준; PTA/MgCl2 혼합물의 경우 0.001-0.008% 정도)를 세포 배양액 내에 유지시켰다.
6일간의 화합물 처리후 세포를 PBS로 2회 세척하고, 세포 배양접시 내에서 파쇄완충액 (Tris 20mM, pH 8.0; NaCl 150mM, 0.5% NP40, 0.5% deoxycholate, 나트륨염)을 이용하여 곧바로 세포를 파괴시켰다.
실온에서 1-2분간 방치한 다음, 세포 파쇄액을 1.5ml 튜브에 수집하고, 30초간 14,000xg에서 원심분리하였다. 원심분리된 파쇄액의 맑은 상층액을 따로 모아 다음 실험에 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
PrPSc는 PK에 대하여 부분적으로 저항성을 유지하므로, 동일한(~500㎍) 단백질양의 세포 파쇄액을 20㎍/ml의 PK 농도로 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. PK 처리는 단백질 분해효소 저해제인 PMSF를 최종 농도 2mM로 첨가하여 정지시켰다. PK 처리된 세포 파쇄액은 4℃에서 1시간동안 15,000xg에서 원심분리하였다. 그 결과 얻어진 침착물을 직접 50㎕ 의 1X SDS PAGE 샘플 적하용 완충액 (50mM Tris, pH 6.8, 2% SDS, 0.1% 브로모페놀 블루, 10% 글리세롤, 2.5% 2-메르캅토에탄올)에 용해시키고 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
12% SDS-PAGE 겔의 웰 상에 적재하기에 앞서, 샘플을 3분간 100℃로 끓였다. 샘플을 Tris-Glycin SDS-PAGE 전기영동 완충액(25mM Tris, pH 8.3, 192mM 글리신, 0.1% SDS)하에 1.5시간동안 100V의 전압에서 분획하였다.
이어서 Bio-Rad Western 전이 기구 (Bio-Rad)을 사용하여 겔상에서 분획된 샘플을 니트로셀룰로스 막(Protran BA-83, Schleicher & Schuell)으로 전이시켰다. 이 과정은 1시간동안 20mA에서 SDS-PAGE 전이 완충액(12mM Tris, pH 8.3, 96mM 글리신, 20% 메탄올)을 사용하여 수행하였다. 이후 막을 5% 탈지유를 포함하는 TBST(25mM Tris, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20)에서 1 시간이상 반응시켰다.
PrPC가 화합물의 처리에 의해 영향을 받았는지를 밝히기 위해, 세포 파쇄액 중 20㎍을 PK 처리 없이 곧바로 겔에 분획한 후 상기 기술된 동일한 방법에 의해 분석하였다.
PrPC 및 PrPSc의 검출은 일차항체인 항-PrP 항체 D13(InPro Biotechnology) 와 이 항체의 말단을 인식하는 이차항체를 이용하였다. 검출을 위한 발색 및 발광은 이차항체에 부착된 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) (Pierce)를 통하여 이루어졌다.
일차항체와 2시간, 이차항체와 1시간 동안 상온에서 차례로 반응시킨 후 HRP용 강화 화학발광(ECL; Amersham Pharmacia) 기질을 신호 증폭에 사용하였다. 필요에 따라 신호는 Doc-It Image Analysis 소프트웨어(UVP, Upland, CA)로 증폭하였다.
상기한 바에 따르면, 프리온 질병 및 그 손상과 관련된 모든 질환을 효과적으로 그리고 경제적으로 치료할 수 있으며, 그 예방 또한 간편하다는 잇점을 갖는다.

Claims (7)

  1. 양이온성 아미노산 단량체, 양이온성 아미노산 중합체 및 입체이성질체 중 1종 이상 선택되고, 상기 양이온성 아미노산은 리신 또는 아르기닌인, 화합물을 신경계 세포에 적용하며,
    상기 양이온성 아미노산 단량체의 농도는 5-40 mM이고, 양이온성 아미노산 중합체 및 입체이성질체의 농도는 1-10 ㎍/ml인 것을 특징으로 하는 인간의 쿠루(kuru)병, 크로이츠펠트-야곱 질병 (CJD), 변형크로이츠펠트-야곱 질병 (vCJD), 의인성 크로이츠펠트-야곱 질병 (iCJD), 가족성 크로이츠펠트-야곱 질병 (fCJD), 산발성 크로이츠펠트-야곱 질병 (sCJD), 거츠만-스트로이슬러-쉐인커 병 (GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 치명적 산발성 불면증 (FSI), 면양, 염소의 스크래이피 병, 소의 소 전염성 해면상뇌증 (BSE), 밍크의 전염성 밍크뇌증 (TME), 사슴, 엘크류의 만성소모성질환 (CWD), 및 고양이, 호랑이, 사자, 치타의 고양이 전염성 해면상뇌증 (FSE)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 치료제.
  2. 삭제
  3. 양이온성 아미노산 단량체, 양이온성 아미노산 중합체 및 입체이성질체 중 선택된 1종 이상; 포스포텅스텐산, 텅스텐산 나트륨, 몰리브덴산 나트륨, 파라몰리브덴산 암모늄 및 우라닐 아세테이트 중 선택된 1종 이상의 다중 음이온성 화합물; 및 염화마그네슘;을 혼합하여 이루어지며, 상기 양이온성 아미노산은 리신 또는 아르기닌임을 특징으로 하고,
    상기 혼합물을 신경계 세포에 적용하며, 상기 양이온성 아미노산 단량체의 농도는 5-40 mM이고, 양이온성 아미노산 중합체 및 입체이성질체의 농도는 1-10 ㎍/ml이고, 다중 음이온성 화합물의 농도는 염화마그네슘 8.5 μM기준으로 0.001-0.008%인 것을 특징으로 하는, 인간의 쿠루(kuru)병, 크로이츠펠트-야곱 질병 (CJD), 변형크로이츠펠트-야곱 질병 (vCJD), 의인성 크로이츠펠트-야곱 질병 (iCJD), 가족성 크로이츠펠트-야곱 질병 (fCJD), 산발성 크로이츠펠트-야곱 질병 (sCJD), 거츠만-스트로이슬러-쉐인커 병 (GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 치명적 산발성 불면증 (FSI), 면양, 염소의 스크래이피 병, 소의 소 전염성 해면상뇌증 (BSE), 밍크의 전염성 밍크뇌증 (TME), 사슴, 엘크류의 만성소모성질환 (CWD) 및 고양이, 호랑이, 사자, 치타의 고양이 전염성 해면상뇌증 (FSE)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 퇴행성 뇌질환의 치료제.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 아미노산 중합체는 분자량이 30 - 1000　 KDa 범위 내인 L형 리신 중합체를 2 ~ 5 ㎍/ml 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 치료제.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 아미노산 중합체는 분자량이 15-70 KDa 범위 내인 D형 리신 중합체를 1-1.5㎍/ml 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 치료제.
  6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 아미노산 중합체는 분자량이 15- 70 KDa 범위 내인 L형 아르기닌 중합체를 2.5 - 10 ㎍/ml 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 치료제.
  7. 제1항 또는 제3항에 따른 화합물에,
    퀴나크린, 퀴놀린, RNA 엡타머, PrP (prion protein) 펩티드, 항PrP 항체, 포스포로티오에이트 올리고 뉴클레오티드, CpG (올리고 뉴클레오티드), 피리딘 유도체 (2-Amino-6-[(2-aminophenyl)thio]-4-(2-furyl)pyridine-3,5-dicarbonitrile), 콩고 레드, 가지형 폴리아민 (Polyethylenimine, PAMAM dendrimer), PrP(prion protein)-Fc, Leu-Pro-Phe-Phe-Asp의 서열을 갖는 β-병풍구조 파괴 펩티드, 포르피린 (porphyrin), 프탈로시아닌 (phthalocyanine), 수라민 (suramin), 암포테리신 B (amphotericin B), tetracycline, 요오도소루비신 (iododoxorubicin), 프루피리틴 (flupiritine), dapsone, 인도메타신 (indomethacin), 디메틸 술폭사이드, 에피갈로카테신 갈레이트 (epigallocathechin gallate), 폴리술페이트 글리코사미노글리칸 (polysulfated glycosoaminoglycans), 헤파란 술페이트 (heparan sulfate), 덱스트란 술페이트 (dextran sulfate) 및 펜토산 술페이트 (pentosan sulfate)로부터 선택된 1종 이상을 유효농도 50 (Effective Concentration50, PrPSc를 50% 감소시키는 유효농도) 기준 1:1의 함량비로 더 혼합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 치료제.
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