KR20010103037A

KR20010103037A - 프리온 및 ＰｒＰＳｃ의 분리 용도로 제조되는 혈청 샘플

Info

Publication number: KR20010103037A
Application number: KR1020017011208A
Authority: KR
Inventors: 프루시너스탠리비.; 사파지리지.
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 2000-02-28
Publication date: 2001-11-17
Also published as: US20030208052A1; JP2002538468A; WO2000052197A1; CA2362986A1; NZ513670A; BR0008619A; EP1159446A1; MXPA01008969A; IL145058A0; CN1189572C; AU3387600A; AU768654B2; US7151000B2; CN1346410A; CN1657942A; EP1159446A4; US6166187A

Abstract

샘플 내 단백질을 더 분석하는 것, 예를 들어 샘플 내 프리온을 검출하는 것을 가능하게 하는 방식으로 샘플이 혈액으로부터 제조된다. 혈액은 추출되고, 응고되도록 허용되고, 분리공정 (예를 들어 원심분리)을 받아 혈청을 얻는다. 혈청은 샘플 내 프리온에 결합하여 착화제/단백질 착물을 형성하는 착화물로 처리되며 이는 착물의 농축을 가능케 한다. 착물의 농축은 성공적으로 분석될 수 있는, 예를 들어 광범위한 상이한 타입의 프리온을 검출하는 분석 방법학을 사용하여 분석될 수 있는 샘플을 결과한다 (도면 참조).

Description

프리온 및 ＰｒＰＳｃ의 분리 용도로 제조되는 혈청 샘플{BLOOD SERUM SAMPLE PREPARED FOR ISOLATION OF PRIONS AND PrPSc}

프리온은 인간과 동물에서 중추신경계 해면양 뇌병증을 일으키는 감염성 병원체이다. 프리온은 박테리아, 바이러스 및 비로이드와는 구별된다. 현재 지배적 가설은 프리온 단백질의 전염성에 핵산 성분이 필수적이지 않다는 것이다. 게다가, 한 동물 종(예를 들어, 인간)을 감염시키는 프리온은 다른 동물 종 (예를 들어, 마우스)을 감염시키지 않을 것이다.

프리온과 그것이 유발하는 질병에 대한 이 연구에서 주요한 단계는 프리온 단백질이라고 하는 단백질의 발견 및 정제였다 [Bolton et al.Science218:1309-11 (1982); Prusiner et al.,Biochemistry21:6942-50 (1982); McKinley et al.,Cell35:57-62 (1983)]. 완전한 프리온 단백질 코딩 유전자가 그 이래로 클로닝되고, 서열화되고, 트랜스제닉 동물 내에서 발현되었다. PrP^C는 단일-복제수 숙주 유전자에 의하여 코딩되고 [Basler et al.Cell46:417-28 (1986)] 일반적으로 뉴런 외표면 상에서 발견된다. 유력한 가설은 PrP^C가 PrP^Sc라 불리는 변형된 형태로 전환한 결과로 프리온 질병이 일어난다는 것이다.

프리온 단백질의 스크래피 (scrapie) 이소형 (PrP^Sc)이 동물과 인간의 전염성 신경 변성 질병의 전염과 병원론 모두에 필수적인 것으로 보인다. Prusiner, S.B., "Molecular biology of prion disease,"Science252: 1515-1522 (1991) 참조. 동물에서 가장 일반적인 프리온 질병은 양과 염소의 스크래피 및 소과의 해면양 뇌병증 (BSE)이다 [Wilesmith, J.와 Wells,Microbiol. Immunol.172:21-38 (1991)]. 인간의 4가지 프리온 질병은 (1)쿠루병, (2)크로이츠펠트-야콥 병(CJD), (3) Gerstmann-Streussler-Sheinker 병(GSS), (4)치명적 가족성 불면증 (FFI)으로 동정되어 왔다 [Gajdusek, D.C.,Science197:943-960 (1997); Medori et al.,N. Eng. J. Med.326:444-449 (1992)]. 산발성, 유전적 및 감염성 질병으로서의 인간 프리온 질병의 발표는 초기에 PrP의 세포 유전적 기원에 의하여 설명되어 왔던 난제를 불러일으켰다.

대부분의 인간 CJD 사례는 산발성이지만, 약 10 내지 15%는 인간 PrP 유전자의 돌연변이에 의하여 상염색체 우성 장애로서 유전된다 [Hsiao et al.,Neurology40: 1820-1827 (1990); Goldfarb et al.,Science258: 806-808 (1992); Kitamoto et al.,Proc. R. Soc. Lond.343:391-398]. 의원성 CJD는 뇌척수 경막 조직편 뿐 아니라 시체 뇌하수체에서 유래한 인간 성장 호르몬에 의하여 야기되었다 [Brown et al.,Lancet340: 24-27 (1992)]. CJD를 스크래피로 감염된 양고기의 소비와 같은 감염성 기원에 연결시키려는 다수의 시도에도 불구하고, 의원성으로 유도되는질병의 경우를 제외하고는 동정되어 기원을 정하지 못하였다 [Harries-Jones et al.,J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry51: 1113-1119 (1988)]. 다른 한편, 수십년간 뉴기니아 고지대의 포레(Fore)와 이웃 부족을 황폐화시킨 쿠루병은 전례적 식인풍습 동안의 감염에 의하여 확산된 것으로 믿어진다 [Alpers, M.P.,Slow Transmissible Disease of Nervous System, Vol. 1, S.B. Prusiner와 W.J. Hadlow, eds. (New York: Academic Press), pp. 66-90 (1979)].

CJD의 실험 영장류로의 최초의 전염은 William Hadlow의 쿠루병과 스크래피 간의 유사성의 인식에서 시작되는 흥미있는 역사를 가진다. 1959년, Hadlow는 쿠루병으로 사망한 환자에서 제조된 추출물을 비인간 영장류에 접종하고 그 동물을 긴 잠복기 후 발생할 것이 예상되는 질병에 대하여 관찰하는 것을 제안하였다 [Hadlow, W.J.,Lancet2: 289-290 (1959)]. 7 년 후, Gajdusek, Gibbs 및 Alpers는 18 내지 21 개월 범위의 잠복기 후 쿠루병의 침팬지로의 전염성을 증명하였다 [Gajdusek et al.,Nature209: 794-796 (1996)]. 쿠루병과 CJD의 신경병리학의 유사성 [Klatzo et al.,Lab Invest.8: 799-847 (1959)]은 침팬지에 대한 유사한 실험을 촉발하였고 질병의 전염성은 1968년에 보고되었다 [Gibbs, Jr. et al., Science 161: 388-389 (1968)]. 지난 25 년 간, 약 300 가지의 CJD, 쿠루병 및 GSS가 각종 유인원과 원숭이에 전염되었다.

이 같은 실험의 비용, 희귀성 및 종종 비인간적 행위로 인식됨은 이 연구를 제한하고 따라서 지식의 축적을 제한하였다. 가장 신뢰할 만한 전염성 데이터는 비인간 영장류를 사용한 연구로부터 도출된 것으로 알려진 반면, 인간 프리온 질병의몇몇 사례는 설치류에게 전염되었지만 더 비정규적이다 [Gibbs, Jr. et al.,Slow Transmissible Diseases of the Nervous System, Vol.2, S.B. Prusiner and W.J. Hadlow, eds. (New York: Academic Press), pp. 87-110 (1979); Tateishi et al.,Prion Diseases of Humans and Animals, Prusiner et al., eds. (London: Ellis Horwood), pp. 129-134 (1992)].

인간 프리온 질병의 설치류로의 드문 전염은 Pattison에 의하여 그의 양과 설치류 간의 스크래피 작용제의 전달에 관한 연구에서 최초로 기술된 "종 장벽"의 예로서 인용되었다 [Pattison, I.H.,NINDB Monograph 2, D.C. Gajdusek, C.J. Gibbs Jr. 및 M.P. Alpers, eds. (Washington, D.C.:U.S. Government Printing), pp. 249-257 (1965)]. 그 관찰에서, 한 종에서 다른 종으로의 프리온의 전달은 오직 소수의 질병 진행 동물과의 장기간 잠복기와 연관이 있었다. 동일한 종 내의 뒤 이은 전달은 매우 단기간 잠복기 후 모든 동물이 발병되는 것를 특징으로 하였다.

시리아생 햄스터 (SHa)와 마우스 사이의 종 장벽에 대한 분자적 기초는 트렌스제닉 (Tg) 마우스를 사용한 PrP 유전자의 서열에 존재한다는 것이 나타났다 [Scott et al.,Cell59: 847-857 (1989)]. SHaPrP 는 MoPrP와 254개의 아미노산 잔기 중 16개의 위치에서 상이하다 [Basler et al.,Cell46: 417-428 (1986); Locht et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA83: 6372-6376 (1986)]. SHaPrP를 발현하는 Tg(SHaPrP) 마우스는 SHa 프리온과 배양될 때 짧은 잠복기를 가졌다. 인간 또는 양의 PrP 트렌스젠을 발현하는 마우스로 유사한 실험이 수행되었을 때, 종 장벽은 폐기되지 않았다, 즉 감염된 동물의 백분율은 받아들일 수 없도록 낮았고 잠복기는 받아들일 수 없도록 길었다. 그러므로, 예를 들어 인간 프리온의 경우 (다른 종의 PrP 유전자를 함유하는 마우스 같은) 트랜스제닉 동물을 사용하여 샘플이 프리온으로 감염되었는지 여부를 결정하기 위하여 샘플을 신뢰할 수 있게 시험하는 것이 불가능하였다. 이 같은 시험법의 부재의 결과인 건강상의 위험의 심각성은 하기에 예시된다.

인간 뇌하수체에서 유래한 HGH로 이전에 처치된 45명이 넘는 젊은 성인이 CJD를 진행시켰다 [Koch et al.,N. Engl. J. Med.313: 731-733 (1985); Brown et al.,Lancet340: 24-27 (1992); Fradkin et al.,JAMA265: 880-884 (1991); Buchanan et al.,Br. Med. J.302: 824-828 (1991)]. 다행스럽게, 고 HGH에 의하여 촉진되는 야생형 PrP의 높은 발현이 프리온 질병을 유도할 수 있다는 외형적으로는 간접적인 가능성이 재기되지만, 재조합 HGH가 현재 사용된다 [Lasmezas et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun.196: 1163-1169 (1993)]. 뇌하수체로부터 준비된 HGH가 프리온으로 오염되었다는 것은, 의심스러운 다량의 HGH로 접종된지 66개월 지난 원숭이에게 프리온 질병이 전염된 것에 의하여 뒷받침된다 [Gibbs, Jr. et al.,N. Engl. J. Med.328: 358-359 (1993)]. 프리온 질병과 관련된 긴 잠복기는 전 세계적으로 HGH로 처치된 수천명의 사람의 의원성 CJD의 전 범위를 나타내지는 않을 것이다. 의원성 CJD는 또한 뇌척수 경막 조직편 이식을 받은 적어도 11명의 환자 뿐 아니라 [Nisbet et al.,J. Am. Med. Assoc.261: 1118 (1989); Thadani et al.,J. Neurosurg.69: 766-769 (1988); Willison et al.,J. Neurosurg. Psychiatric54: 940 (1991); Brown et al.,Lancet340: 24-27(1992)], 오염된 인간 뇌하수체-유도 성선자극호르몬으로 처치된 네명의 불임 여성에서 진행된 것으로 나타난다 [Healy et al.,Br. J. Med.307: 517-518 (1993); Cochius et al.,Aust. N. Z. J. Med.20:592-593 (1990); Cochius et al.,J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry55: 1094-1095(1989)]. 의원성 CJD의 이들 사례는 프리온으로 오염될 가능성이 있는 조제약을 스크리닝할 필요성을 역설한다.

최근, 프랑스의 두 의사는 시체로부터 추출된 성장 호르몬으로 처치되었던 어린이의 본의 아닌 고살 혐의를 받았다. 그 어린이는 크로이츠펠트-야곱병을 진행하였다 (New Scientist, 1993년 7월 31일 페이지 4 참조). 파스퇴르 연구소에 따르면, 1983년 내지 1985년 중반에 인간 성장 호르몬으로 처치되었던 어린 환자에서의 24개의 보고된 CJD 사례가 1989년 이래로 있어 왔다. 이들 어린이 중 15명이 사망하였다. 프랑스에서 사체에서 추출된 성장 호르몬으로 처치된 수백명의 어린이들이 CJD를 진행시킬 위험에 처한 것으로 현재 나타난다 (New Scientist, November 20, 1993, 페이지 10). 이 같은 이유에서, 혈액과 혈액 산물에서 CJD를 일으키는 프리온을 제거하는 편리하고 비용-효율적 방법의 필요가 명백히 있다. 본 발명은 이 같은 방법을 제공한다.

발명의 개요

본 발명의 요지는 샘플 내에 존재하는 단백질의 질병 입체구조 (예를 들어 PrP^Sc)를 분리 및 성질 결정하고, 만일 요구된다면 단지 검출하는 것을 가능케하는 방식으로 (혈액으로부터 얻어지는) 샘플을 제조하는 것이다. 환자로부터 전혈이 분리된다. 혈액은 실온에서 응고되도록 허용된 다음 원심분리를 수행하여 혈청을 분리한다. 분리된 혈청을, 혈액 내 PrP^Sc에 결합하고 그것에 의하여, 존재하는 어떤 PrP^Sc도 농축시키는 것을 가능하게 하는 소듐 포스포텅스테이트 (PTA) 같은 착화제에 접촉시킨다. PrP^Sc를 함유하는 것으로 추정되는 농축 분획은 더 농축되고, PrP^Sc는 성질 결정, 또는 만일 요구된다면 단지 PrP^Sc가 존재하는지에 대하여 분석된다. PrP^Sc의 검출은 PrP^Sc으로 오염된 혈액의 사용을 회피하는 것을 가능케한다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 동일한 혈액으로부터 준비된 샘플을 시험한 때 양성 결과가 얻어지지만, 샘플이 혈장, 혈소판 또는 백혈구로부터 준비되어 프리온의 존재에 대하여 시험된 때, 음성의 결과가 얻어진다. 그러므로, 여기에 개시된 방법은 혈액 내 존재하는 프리온 또는 다른 단백질의 병원성 입체구조를 분리하고 성질 결정하고, 만약 요구된다면 이를 검출하는 하나 이상의 상이한 분석방법을 사용하는 것을 가능케 하는 진보적 사전처리 방법이다.

본 발명은 다량의 혈액을 얻는 단계, 그 혈액을 응고하도록 허용하는 단계, 혈청을 응고된 혈액에서 분리해내는 단계, 단백질의 병원성 입체구조와 함께 단백질/착화제 착물을 형성하는 착화제에 혈청을 접촉시키는 단계, 및 샘플 내에 착물을 농축하는 단계를 포함하는 샘플을 제조하는 방법 포함한다. 그 농축된 샘플이 본 발명의 제조된 샘플이다. 이 같은 방식으로 샘플을 제조함에 의하여, 그렇지 않으면 결정될 수 없는 혈액의 성질을 결정하는 것을 가능하게 하는, 제조된 샘플의분석의 수행이 가능하다. 예를 들어, 그렇지 않으면 프리온이 검출될 수 없는 제조된 샘플에 존재하는 프리온 단백질 같은 단백질의 병원성 형태의 존재를 결정하는 것이 가능하다. 혈액은 어떤 포유동물로부터도 얻어질 수 있고 바람직하게는 단백질의 입체구조 변화에 관련된 질병을 가지는 것으로 의심되는 포유동물로부터 얻는다. 예를 들어, 혈액은, 아직 질병의 증상을 나타내지는 않으지만 입체구조적으로 변화된 단백질의 존재와 관련된 질병, 예를 들어 PrP 단백질, 즉 프리온의 입체구조적으로 변화된 형태와 연관된 프리온 관련 질병을 가진다고 의심되는 인간, 암소, 또는 양으로부터 얻을 수 있다.

비록 다수의 상이한 착화제와 샘플을 농축하는 수단이 사용될 수 있지만, 본 발명은 인간 또는 농장 가축 유래 혈액 같은 혈액 내 프리온의 존재의 결정을 위하여 가장 바람직하게 수행된다. 본 발명을 수행하고 프리온의 존재가 결정될 때 샘플의 제조를 올바르게 하기 위하여, 착화제는 바람직하게는 포스포텅스트산의 염이고 가장 바람직하게는 소듐 포스포텅스테이트이다. 게다가, 샘플의 착물을 농축하는 것은 다수의 상이한 방법에 의하여 수행되지만, 원심분리를 사용하여 바람직하게 수행된다. 본 발명의 중요한 측면은 혈액은 항응고제를 사용하여 응고를 막는것 같은 어떤 방법의 사용도 없이 혈액을 응고하도록 허용하는 것이다. 혈액은 항응고제 없이 혈액을 멸균 용기에서 실온에 방치하는 것을 허용하는 것 같은 직접적이고 단순한 방법에 의하여 응고되도록 허용할 수 있다. 혈액이 응고되도록 허용된 후 혈청은 원심분리 같은 방법을 사용하여 바람직하게 분리되고 혈액은 단백질의 병원성 입체구조와 함께 단백질/착화제 착물을 형성시키는 착화제에 접촉된다. 이 단백질/착화제 착물이 형성된 다음 착물은, 그 다음 입체구조적으로 변화된 단백질의 존재에 대하여 분석될 수도 있는 본 발명의 샘플을 얻기 위하여 원심분리 같은 임의의 공지 방법에 의하여 농축된다.

본 발명의 주요한 목적은 질병 입체구조로 존재하고 혈액에 존재하는 단백질 (예를 들어 프리온)의 정체를 밝히는 결과를 가져오는 샘플 제조 방법론을 제공하는 것이고 그 방법은 다른 기관 내에서 단백질이 특성 결정될 방식과 달리 그들이 혈액에 존재할 때 이들 단백질을 분리하고 성질 결정하는 것을 가능케 한다.

본 발명의 다른 목적은 특정 단백질의 질병 입체구조와 관련된 질병 (예를 들어 프리온 질병)의 치료제로서, 그 천연 발생 형태 또는 변형된 형태로 사용될 수 있는, 프리온 형성을 억제하는 천연 발생 인자를 밝히는데 필요한 초기 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 혈액내 단백질의 질병 입체구조 (예를 들어 PrP^Sc)를 검출하는 다양한 기술을 통하여 분석될 수 있는 (본 발명의 방법에 따라 제조된) 샘플을 제공하는 것이다.

본 발명의 한 목적은 감염성 프리온 (PrP^Sc)이 혈액에 존재하는지 결정하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 목적은 혈액 샘플을 사용하여 프리온 관련 질병의 진단을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 장점은 그것이 혈액 내 프리온의 검출에 대하여 분석할 수 있는,시험할 수 있는 샘플을 제공한다는 것이다.

본 발명의 한 측면은 오직 혈청만이 PrP^Sc를 검출하는 분석을 수행하는데 사용될수 있다는 것이다. 즉, 혈액, 혈장, 혈소판 및 백혈구는 그릇된 음성 결과를 제공한다.

다른 장점은 (예를 들어 인간 이식 수술에 사용되는) 혈액, 혈액 산물, 골수 및 다른 모든 기관과 조직이 시험되고 무프리온으로 증명될 수 있다는 것이다.

본 발명의 다른 측면은 다양한 상이한 착화제가 혈청 내 임의의 PrP^Sc를 시험하기 이전에 농축하여 본 발명의 처리된 샘플을 제공하는데 사용될 수 있다는 것이다.

본 발명의 다른 측면은 착화제는 헤테로폴리산 또는 그것의 금속염 또는 폴리펩티드, 작은 분자, 선택적 PrP^Sc결합 항체 및 PrP^Sc결합 항체 같은 생물학적 작용제라는 것이다.

다른 측면은 바람직한 착화제는 포스포텅스트산의 금속염이고 소듐 포스포텅스테이트가 특히 바람직하다는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 그 방법이 혈액 내에 존재하는 프리온의 정체가 드러나도록 허용하고 그것에 의하여 혈액 및 다른 기관 및/또는 조직으로부터의 프리온 감염성의 제거와 관련된 정제과정을 용이하게 한다는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 그 방법학에 따라 제조된 샘플을 사용하는 것과 그 다음 용해도, 3차원적 구조 및 감염성을 포함하는 단백질의 특정 성질을 결정하기위하여 형성된 착물에 존재하는 단백질을 더 분석하는 것이다.

본 발명의 중요한 장점은 단백질의 병원성 입체구조가 혈액으로부터 추출된 후 그것을 뇌조직 같은 다른 조직에서 추출된 동일한 단백질에 비교함에 의하여 분석될 수 있다는 것이다.

본 발명의 이런 및 다른 목적, 측면, 장점 및 성질은 더 충분히 하기된 바와 같은 방법학의 상세한 사항을 읽으면 당업계 숙련자에게 명백할 것이다.

본 발명은 혈액의 프리온을 검출하는 방법에 일반적으로 관련된다.

도 1은 프리온을 포함하지 않은 대조군 유래 백혈구 및 "스크래피"로 표지된 프리온으로 감염된 동물로부터 수집한 백혈구에 입체구조-의존 면역분석을 수행한 결과를 도시한 그래프이다. 방법과 결과는 비교예 1에 기술된다.

도 2는 프리온을 포함하지 않은 대조군 유래 혈소판 및 "스크래피"로 표지된 프리온으로 감염된 동물로부터 수집한 혈소판 샘플에 입체구조-의존 면역분석을 수행한 결과를 도시한 그래프이다. 방법과 결과는 비교예 2에 기술된다.

도 3은 혈장에 입체구조-의존 면역분석을 수행한 결과를, 프리온을 포함하지 않은 대조군 유래 혈장과 "스크래피"로 표지된 프리온으로 감염된 동물로부터 수집한 혈장을 비교한 결과와 함께 도시한 그래프이다. 방법과 결과는 비교예 3에 기술된다.

도 4는 본 발명의 방법에 따라 제조된 혈청 샘플에 입체구조-의존 면역분석을 수행한 결과를 도시한 그래프이다. 분석법은 프리온을 포함하지 않은 대조군 유래 혈청 샘플에 수행되었다. 동일한 분석법이 "스크래피"로 표지된 프리온으로 감염된 동물로부터 수집한 혈청에 수행되었다. 방법과 결과는 비교예 4에 기술된다.

도 5는 실시예 4에서 산출된 데이터와 도 4에 도시한 데이터를 조합한 그래프이다. 이 그래프는 50 퍼센트 (점선)와 95 퍼센트 (외측 상자선)의 중앙값 (중간의 선)을 도시한다. 이 데이타는 시험된 대조군 혈청과 시험된 프리온 감염 샘플은 겹치지 않음을 분명하게 나타낸다.

바람직한 구체예의 상세한 설명

여기에 사용되는 본 제조된 시험 샘플, 방법학 및 조성이 개시되고 기술되기 전에, 본 발명이 특정한 항체, 단백질, 표지들, 분석 또는 방법에 한정되는 것이 아니며 당연히 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본 발명의 범위는 오직 부가된 청구항에 의하여 제한될 것이므로, 여기에서 사용된 용어는 특정한 구체예를 설명하기 위한 목적일 뿐 한정으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.

별도로 한정되지 않는다면, 여기에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 이 발명이 속한 기술분야의 통상의 기술을 가진자에게 보통 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 여기에서 설명된 것들과 유사하거나 동일한 방법 및 물질 중 어느 하나도 본 발명의 실시나 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 여기에 기술된다. 여기에서 언급된 모든 발행물들은 발행물들이 인용되는 관계에 있어서 방법 및/또는 물질을 설명하고 개시하기 위한 참고문헌에 의해 여기에 수록된다.

여기에서 논의되는 발행물들은 본 출원의 제출일에 앞서서 단지 개시를 위해제공된다. 여기에서 본 발명이, 선행발명의 관점에서 그러한 발행에 선행하는 권리가 부여되지 않는다는 승인처럼 해석되지 않는다. 더 나아가, 발행의 실제 날짜가 여기서 제공된 것과 다르다고 발견되면 제공된 발행의 날짜는 바뀌게 된다.

정의

용어 "혈청"은 몸에서 혈액을 채취하여 어떤 보존제도 없이 혈액을 용기에 넣어 혈액이 혈병(血餠)을 형성하도록 허용하여 얻어지는 혈액의 분획을 의미하려는 의도이다. 혈장은 그 후 혈병으로부터 분리될 수 있는 혈액의 액체 부분이다. 혈병은 용해성 단백질 (피브리노겐)이 불용성 단백질 (피브린)로 전환되어 형성된다. 피브린은 혈구를 고체상에 포집하는 섬유상 물질의 해면 망상구조를 형성한다. 응고는 일반적으로 실온에서 10 내지 15 분이 소요되지만 채혈한 혈액의 타입 및 혈액이 놓여진 용기의 타입에 따라 다양하다. 넓은 의미로 용어 "혈청"은 여기에서 혈병 형성 단백질 또한 제거된, 혈액 내 비-고체-유사 물질을 말하기 위하여 사용된다. 혈청과 혈장 간의 상이점은 혈청은 피브린을 함유하는 응고된 혈액에 의하여 형성되고 피브리노겐을 함유하는 혈장은 항응고제 때문에 응고하도록 허용되지 않은 혈액으로부터 형성된다는 점이다. 표본이 혈청인지 혈장인지 결정하기 위하여 피브리노겐 시험이 사용될 수 있다. 혈청이 있다면, 피브리노겐은 반응없이 첨가될 수 있다. 혈장 항응고 표본은 수집되자마자 원심분리될 수 있다. 항응고제 없는 혈액인 혈청 표본은 - 일반적으로 실온에서 적어도 30 분 동안 - 응고되도록 허용된다. 응고 시간은 유리나 실리콘 입자 같은 물리적 요소에 의하여 영향받을 수 있고 트롬빈의 첨가로 감소될 수 있다. 혈장을 얻기 위하여 EDTA, (완충된 또는 비-완충된) 시트르산 나트륨 또는 헤파린 같은 항응고제가 첨가된다. 비교예 1 내지 3에서는 완충된 시트르산 나트륨이 항응고제로 사용된다. 혈청이 요구되는 본 발명의 방법학에서는 항응고제가 사용되지 않았다.

용어 "착화제"는 여기에서 단백질의 긴축 입체구조 (예를 들어 PrP^Sc) 및/또는 단백질의 느슨한 입체구조 (예를 들어 PrP^C)에 결합하거나 선택적으로 착화하는 어떤 물질을 말하는 것으로 사용된다. 이 착화제는 펩티드나 항체, 예를 들어 PrP^Sc에 선택적인 항체 같은 생물학적 분자 또는 화학제, 예를 들어 염의 형태, 예를 들어 소듐 포스포텅스테이트로 첨가될 수 있는 포스포텅스트산 (PTA)일 수 있다. 착화제는 단일 또는 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드와 화학제의 사용 같이 생물학적 착화제는 화학 착화제와 연결되어 사용할 수 있다. 다른 실시예에서 동일 부류의 두 종류의 착화제가 함께 사용될 수 있는데, 예를 들어 포스포텅스트산 (및 그것의 염) 및 트리클로로아세트산의 조합이다. 형성된 착화제는, 착화제를 표면에 고정하는 것 같은 착물을 조성물의 나머지와 분리하는 몇몇의 수단을 제공하여야 한다. 바람직한 착화제는 PrP^C에 결합하는 것보다 PrP^Sc에 더 잘 결합하고, 특히 바람직한 작용제는 PrP^Sc에 고친화도로 결합하고 PrP^C에 유의 수준으로 결합하지 않는다. 객관적으로, 바람직한 착화제는 PrP^C에 결합하는 것보다 PrP^Sc에 두 배 이상의 결합친화도로 결합하고, 바람직하게는 PrP^C에 결합하는 것보다 5 배 이상의결합친화도로 결합한다.

여기에서 사용될 때 용어 "단백질"은 어떤 아미노산 서열도 포괄하고 당단백질과 같은 변형된 서열을 포함할 것이다. 본 용어는 재조합적으로나 합성적으로 합성된 것들 뿐만아니라 천연적으로 생기는 단백질과 펩티드를 포함한다. 본 발명과 관계하여 사용된 대로 용어 "단백질"은 두 입체구조가 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지지만 상이한 3차원적 구조를 가지는 점에 있어서 적어도 두 가지의 상이한 입체구조에서 생기는 천연 발생 단백질을 포괄하기 위하여 특히 의도된다. 단백질의 두 입체구조는 질병 상태에 관련되지 않는 적어도 하나의 입체구조 및 질병상태에 관련되는 -병원성의-적어도 하나의 입체구조를 포함한다. 이 개시와 관계하여 사용된 대로 단백질의 구체적이고 바람직한 예는 PrP^C로 지시된 비질병 형태 및 PrP^Sc로 지시된 질병 관련 형태를 포함하는 PrP 단백질이다. PrP단백질의 PrP^Sc형태의 프리온 단백질이 전염성 및 병원성이지만, 다른 단백질의 질병 입체구조는 그것이 병원성이지만 전염성은 아니다. 여기에서 사용될 때 용어 병원성은 단백질이 실제로 질병을 유발하는 것을 의미하거나 단백질이 질병과 관련되고 그 결과 질병이 존재할 때에 존재하는 것을 단순히 의미한다. 그러므로, 이 개시에 관련하여 사용된 병원성 단백질은 반드시 질병의 특별한 매개자의 원인이 되는 단백질인 것은 아니다.

용어"PrP 단백질", "PrP" 등은 여기에서 호환성있게 사용되고 인간 및 동물내에서 질병(해면양 뇌병증)을 유발하는 것으로 알려진 전염성의 입자 형태 PrP^Sc및 적당한 조건하에서 전염성의 PrP^Sc형태로 전환되는 비 전염성 형태 PrP^C를 의미한다.

여기에서 PrP의 전염성의 PrP^Sc형태를 말하기 위해 호환적으로 사용한 용어 "프리온", "프리온 단백질" 및 " PrP^Sc단백질" 등은 단어 "단백질" 및 "감염"의 단축형이다. 입자는, 따로 배제하지 않는다면, PrP 유전자에 의해 코딩된 PrP^Sc분자를 널리 포함한다. 프리온은 일반적으로 PrP^Sc이량체이다. 프리온은 박테리아, 비루스 및 비로이드와는 구별된다. 공지의 프리온은 동물을 소과의 해면양 뇌병증(BSE), 또는 "광우병", 및 고양이의 고양이과 해면양 뇌병증 뿐만아니라, 양과 염소의 중추신경계로 전달할 수 있고 퇴행성의 질병인 스크래피를 유발하도록 감염시킨다. 인간을 감염시키는 공지의 네개의 프리온 질병은 (1)쿠루병, (2)크로이츠펠트-야콥병(CJD), (3)Gdrstmann-Straussler-Scheinker 병(GSS), (4)치명적인 가족성 불면증(FFI)이다. 여기에서 사용된 "프리온"은 사용된 어떤 동물, 특히 인간과 농장 가축에서 이들 질병이나 그외 것들의 전부 또는 일부를 유발하는 프리온의 모든 형태를 포함한다.

용어 "PrP 유전자"는 여기에서 공지의 다형성 및 병원성 돌연변이를 포함하는 단백질을 발현하는 유전적 물질을 설명하기 위해 사용된다. 용어 "PrP 유전자"는 PrP 단백질의 어떤 헝태를 코딩하는 어떤 종의 어떤 유전자를 일반적으로 가리킨다. 일부 일반적으로 알려진 PrP 서열은 그러한 서열을 개시하고 기술하기 위한 참고문헌에 의해 여기에서 수록된 Gabriel et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9097-9101(1992), 그리고 미국특허 5,565,186; 5,763,740; 5,792,901; 그리고 WO 97/04814에 기술된다. PrP 유전자는 여기에서 설명된 "숙주" 및 "시험" 동물 및 그들의 다형성과 돌연변이 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는 어떤 동물로 부터 유래할 수 있고, 이 용어는 앞으로 발견될 다른 이 같은 PrP 유전자를 포함하는 것으로 인식된다. 이 같은 유전자에 의하여 발현되는 프리온은 PrP^C(비질병) 또는 PrP^Sc(질병) 형태 중 어느 하나를 취할 수 있다.

용어 "항체"는 항원에 결합하는 능력이 있는 면역글로불린 단백질을 나타낸다. 여기에서 사용될 때 항체는 에피토프, 관심의 항원 또는 항원적 단편에 결합하는 능력이 있는 항체 단편 (예컨데 F(ab)', Fab, Fv) 뿐만 아니라 온전한 항체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 분석을 위한 항체는 면역반응성이거나 면역특이성일 것이고, 그 결과 관심의 단백질 예를 들어 PrP 단백질과 구체적으로 PrP^Sc단백질 또는 PrP^Sc이량체에 특이적이고 선택적으로 결합한다. 두 천연적 비-질병 형태 및 질병 형태 모두에 대하여 (예컨데, 천연 PrP^C및 천연 PrP^Sc모두에 대하여) 면역반응성이고 면역특이성인 항체가 사용될 수 있다. PrP 에 대한 항체는 바람직하게는 면역특이성이다 - 예컨데 관련된 물질과 실질적으로 교차-반응성이 아니다. 본 발명에 관계하여 사용될 수 있는 일부 특이적 항체는 항체를 개시하고 기술하기 위한 참고문헌에 의해 여기에 수록되는 공개된 PCT 출원 WO 97/10505에서 개시된다. 이 공개된 PCT 출원은 여기에 또한 참고문헌으로 수록된 1998년 12월 8일 특허된 미국 특허 제 5,846,533호에 대응한다. 샘플 내에 존재하는 PrP^C의 전부 또는 실질적으로 전부를 가수분해하도록 디스파제로 충분하게 샘플이 처리된 경우, 개시된 PCT출원에서 PrP^Sc에 결합하는 항체는 본 발명의 기초적인 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "항체"는 예컨데 폴리클론, 모노클론, 및 박테리오파지 디스플레이 방법론에 의해 생산된 그것과 같은 모든 항체 타입을 포괄한다. 본 발명의 특히 바람직한 항체는 천연 PrP^C와 처리된 PrP^Sc에 대한 상대적으로 고도의 친화력을 가지는 항체이고 PrP^Sc에 대하여 더 큰 결합친화도를 가지는 항체가 바람직하다. 본 발명의 항체는 여기에 정의된 바와 같이 "착화제"이다.

PrP^C에 결합을 위한 다른 항체는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션,12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852에 1986년 10월 8일에 기탁되고- PrP^C에 선택적으로 결합하는 항체를 개시하는 참고문헌에 의하여 수록된- 1989년 2월 21일에 특허된 미국특허 4,806,627에서 개시되고 기술된 하이브리도마 세포주 ATCC HB9222에 의해 생성된 모노클론 항체 263K 3F4이다.

"정제된 항체"는 다른 단백질, 탄수화물 및 천연적으로 연결되어 있는 지방이 충분히 없는 것을 말한다. 그러한 항체는 PrP^Sc단백질 (또는 그것들의 항원적 단편)에 "우선적으로 결합"하고, 항원적으로 관련되지 않은 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는다. 본 발명의 정제된 항체는 바람직하게는 특이적 종에 대해 면역반응성이고 면역특이성이며, 더 바람직하게는 천연 PrP^Sc에 대해 면역특이성이다.

(예컨데 PrP 단백질 같은) 단백질의 "항원적 단편"은 항체 결합을 가능하게 하는 그러한 단백질의 부분을 의미한다.

"특이적으로 결합한다"는 것은 특정 폴리펩티드 예를들어, 단백질 예를 들어 PrP^Sc의 에피토프에 대한 항체의 높은 결합활성 및/또는 높은 결합 친화력 결합을 의미한다. 특정 폴리펩티드 상의 이들의 에피토프에 결합하는 항체는 관심의 특정 폴리펩티드로서 어떤 다른 에피토프, 특히 연결되는 분자 내 또는 같은 샘플 내에서 존재할 에피토프에 같은 항체의 결합보다 더 강력하고, PrP^Sc와 같은 단백질의 에피토프 단편에 더 강하게 결합하여 그결과 결합조건에 맞춤에 의해, 항체는 에피토프 부위 또는 PrP^Sc의 변성에 의해 노출되고 천연 PrP^Sc에서 노출되지 않은 에피토프 단편과 같은 원하는 단백질의 단편에 거의 독점적으로 결합한다.

"검출할 수 있게 표지된 항체", "검출할 수 있게 표지된 항-PrP" 또는 "검출할 수 있게 표지된 항-PrP 단편"은 부착된 검출할 수 있는 표지를 가지는 항체(또는 결합 특이성을 보유하는 항체 단편)를 의미한다. 검출할 수 있는 표지는 통상화학적 접합에 의해 정상적으로 부착되었고, 표지가 폴리펩티드인 경우에 그것은 유전적 조작 기술에 의해 선택적으로 부착될 수 있다. 검출할 수 있게 표지된 단백질의 제조 방법은 당업계에서 주지이다. 그러나 당업계에서 알려진 검출할 수 있는 표지는 통상 방사성 동위원소, 형광단, 상자성 표지, 효소 (예컨데, 고추냉이 페르옥시다제), 또는 다른 부분 또는 검출할 수 있는 신호 (예컨데, 방사성, 형광, 색상)를 발하거나 그의 기질에 표지를 노출시킨 후에 검출할 수 있는 신호를 발하는 화합물이다. 다양한 검출할 수 있는 표지/기질 쌍(예컨데 고추냉이 페르옥시다제/디아미노벤지딘, 아비딘/스트렙트아비딘, 루시페라제/루시페린), 항체의 표지 방법, 표지된 항체의 사용 방법은 당업계에서 공지이다.(예컨데, Harlow and Lane, eds.(Antibodies: A Laboratory Manual(1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)참조). 유로퓸은 특히 바람직한 표지이다.

여기에서 사용된 약어는:

중추신경계에 대하여 CNS;

소과의 해면양 뇌병증에 대하여 BSE;

크로이츠펠트-야콥병에 대하여 CJD;

치명적인 가족성 불면증에 대하여 FFI;

염산 구아니딘에 대하여 GdnHCl;

Gerstamnn-Strassler-Scheinker 병에 대하여 GSS;

인간에 대하여 Hu;

인간 프리온 단백질에 대하여 HuPrP;

마우스에 대하여 Mo;

마우스 프리온 단백질에 대하여 MoPrP;

시리아생 햄스터에 대하여 SHa;

시리아생 햄스터 프리온 단백질에 대하여 SHaPrP;

프리온 단백질의 스크래피 이소형에 대하여 PrP^Sc;

프리온 단백질의 세포에 함유된 보통의 정상적 이소형에 대하여 PrP^c;

PrP 단백질의 CJD 이소형에 대하여 PrP^CJD;

FVB 마우스의 난자가 상대적으로 크고 외인성 DNA 의 마이크로주사에 상대적으로 큰 내성이 있어서 트랜스제닉 마우스의 생산에 종종 사용되는 마우스의 표준 근친교배 종에 대하여 FVB;

[PrP_β] - β-시트 입체구조의 프리온 단백질의 농도

[DRC] - 단백질의 질병 관련 입체구조의 농도

PTA - 포스포텅스트산

NaPTA - 소듐 포스포텅스트산

TCA - 트리클로로아세트산

AC - 친화성 크로마토그래피

를 포함한다.

본 발명의 일반적 측면

프리온의 검출용 분석법은 개발 중이지만 아직 상업화되지 않았다. 게다가, 이 같은 분석법의 비용, 편리성 또는 정확도 (대규모에서)는 아직 결정되지 않았다. 따라서, 인간 혈장 같은 물질이 프리온을 함유한다고 의심되면 폐기된다 - 영국이 인간 혈장의 공급을 폐기한 것을 알리는 The Wall Street Journal, 1998년 11월 25일 페이지 1 기사제목: "Mad Cow's Fears leads U.K. to Destroy Parts of all Donated Blood" 참조하시오. (1) 프리온이 그들의 인간 혈장에 존재할 수 있고, (2) 프리온 질병이 치명적이며 현재 치료될 수 없으며, (3) 현재 프리온에 대한 시중 구입 가능한 시험법이 없고, (4) 현재 샘플로부터 프리온을 제거할 시중구입 가능한 방법이 없기 때문에, 이러한 극적인 조치가 취하여졌다. 본 발명은 그 샘플 더 분석될 수 있도록, 예를 들어 단백질의 질병관련 입체구조, 예를 들어 PrP^Sc의 존재에 대하여 시험될 수 있도록 샘플을 제조하는 방법을 포함한다.

PrP 유전자에 의하여 발현되는 단백질의 몇몇은 한 가지를 넘는 입체구조형을 가진다. 예를 들어 PrP 단백질은 그것의 세포형, 즉 PrP^C형 또는 그것의 스크래피형, 즉 PrP^Sc형을 취한다. 단백질의 한 형태 (예를 들어 PrP^C)는 무해하지만 단백질의 다른 형태 (예를 들어 PrP^Sc)는 병원성이다. PrP^Sc같은 단백질의 압축형인 병원성 형태가 동물 (예를 들어 인간, 암소, 양, 돼지 또는 닭) 내에 극소량 존재할 때에는 동물은 질병의 증상을 나타내지 않는다. 그러나, 동물은단백질의 병원성 형태에 관련된 질병 - 예를 들어 프리온 질병을 진행시킬 것이다. 진행 및/또는 질병의 가능한 전염을 막기 위하여, 생체액, 특히 환자에게 도입될 생체액 (예를 들어 혈액 산물)에 어떤 PrP^Sc라도 존재하는지 결정하는 것이 중요하다. 본 발명은 샘플 내에 단백질의 질병 입체구조가 존재하는지 결정하기 위하여 샘플이 분석되도록하는 특정 방식으로 샘플을 제조하는 관점에서 유용하다. 단백질의 질병 입체구조가 검출되면 나머지 혈액은 폐기된다. 만약 질병 입체구조가 발견되지 않으면 혈액은 직접 사용되거나, 저장되거나 관련 혈액 산물의 생산에 사용된다.

불용성 단백질과 관련된 질병

여기에 제공된 대부분의 개시 및 구체예는 샘플내에 PrP^Sc의 존재를 결정하는 것과 관련된 분석법의 사용과 관계된다. 그러나, 상기에 지시된 대로, 본 발명의 분석법은 질병과 관련된 하나의 고차 구조를 포함하는 두개의 서로 다른 고차 구조의 형태를 취하는 어떠한 단백질의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다. 하기는 두 개 또는 그 이상의 서로 다른 고차 구조를 취하는 불용성의 단백질과 관련된 질병의 목록이지만 이에 한정되지 않는다.

질병 불용성 단백질

알츠하이머병 APP,Aβ펩티드,α1-항키모트립 신, 탠,비- Aβ 성분

프리온병,크로이츠펠트 야곱병,

스크래피 및 소 해면양 뇌병증 PrP^Sc

ALS SOD 및 신경미세섬유

픽병 픽체

파킨스병 루이체

당뇨병 타입 I 아밀린

복합 밀로마-플라스마 세포 이혼화증 IgGL-사슬

가족성 아밀로이드 다발성 신경증 트랜스티레틴

갑상선의 수질성 암종 프로칼시토닌

만성 신장병 β₂-마이크로글로뷰린

울혈성 심부전 심방 나트륨배설촉진인자

노인성 심부전 및 계통 아밀로이드증 트랜스티레틴

만성 염증 혈청 아밀로이드 A

죽상경화증 ApoA1

가족성 아밀로이드증 겔소린

상기에 열거된 불용성 단백질은 각각 많은 변이체 또는 돌연변이를 포함하여 본 발명에 모두 포함되는 서로 다른 종을 생산한다. 공지된 병원성 돌연변이 및 프리온 질병과 관련된 PrP 내의 다형성은 하기에 나타나고 인간, 양 및 소의 서열은1996년 10월 15일 특허된 US 5,565,186,에 나타난다.

같은 아미노산 서열을 가진 두 개의 서로 다른 3 -차원 입체구조를 가진 단백질이 또한 언급되어야만 한다. 하나의 입체구조는 질병 특징과 관련되어 있고 일반적으로 불용성인 반면에 다른 입체구조는 질병 특징과 관련되어 있지 않고 용해성이다. 본 발명의 방법학은 열거된 질병, 단백질 및 종에 한정되지 않는다.

방법 일반

본 발명의 요지는 제조된 샘플이 그 후 더 분석되도록, 예를 들어 단백질의 질병 입체구조의 존재에 대하여 분석되도록, 예를 들어 PrP^Sc의 존재에 대하여 분석되도록 샘플이 제조되는 것을 허용하는 처리 단계를 결정하는데 있다. 샘플이 본 발명에 따라 올바르게 제조되면 다양한 분석 방법이 관심의 단백질 검출에 사용될수 있다. 그러나, 만일 샘플이 본 발명에 따라 제조되지 않는다면 알려진 분석 방법학은 그릇된 음성 결과를 부여할 것이다.

단순히 말하여 분 발명은 일차적으로 혈액 샘플을 얻고 혈액을 응고되도록 허용하는 것을 포함한다. 혈청은 분리되고 혈청은 관심의 단백질과 함께 착화제/단백질 착물을 형성하는 착화제로 처리된다. 착물의 형성은 예를 들어 착물이 원심분리를 사용하여 분리되고 농축될 수 있도록 비중을 증가시켜 관심의 단백질의 농축을 용이하게 한다. 이 단계에서 샘플은 적당하게 제조되고 더 분석될 수 있다. 예를 들어 어떤 공지의 방법이나 개발될 방법에 의하여 관심의 단백질의 존재에 대하여 시험될 수 있다.

본 발명의 샘플을 제조하는데 사용되는 혈액은 어떤 혈액일 수도 있지만 바람직하게는 인간 또는 농장 가축, 예를 들어 암소, 양, 말 또는 닭의 혈액이다. 비록 혈액의 응고가 중요하지만 응고를 수행하기 위하여 어떤 특정 방법도 필요하지 않다. 혈액은 단순히 실온에서 (바람직하게는 멸균 유리 용기에) 방치되도록 허용될 수 있고 응고에 대하여 관찰된다. 어떤 항응고제 항-응고 작용제 등도 첨가하지 않는 것은 당연히 중요하다. 응고에 관련된 혈액 내 단백질은 그것에 의하여 제거되고, 이들 혈병 형성 단백질이 어떤 방법으로든 관심의 단백질의 검출을 방해할 수 있으므로 이들 단백질의 제거는 샘플 제조에서 매우 중요하다. 일단 혈병이 형성되면 어떤 공지 방법, 예를 들어 혈청이 혈병으로부터 깨끗하게 분리될 때까지 원심분리를 사용하여 혈청이 분리되고 혈청은 샘플의 최상층으로부터 부어질 수 있다.

혈청이 얻어진 다음 혈청은 관심의 단백질이 농축되는 것을 허용하는 방식으로 처리된다. 이것은 착화제 또는 관심의 단백질보다 더 높은 비중을 가지는 착화제/단백질 착물을 형성시키는 착화제를 첨가하여 바람직하게 수행된다. 그러므로, 착물은 샘플 내에서 가라앉고 그 속도는 원심분리에 의하여 크게 촉진된다.

최종 사용

일단 본 발명에 따라 샘플이 제조되면 샘플은 다양한 가능한 최종 용도를 가진다. 예를 들어, 샘플은 단지 관심의 단백질 (예를 들어 프리온)이 샘플 내에 있는지 더 분석하기 위하여 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 많은 범위의 다른 가능한 최종 용도를 제시한다. 예를 들어 샘플은 착화제와 착물을 형성한 단백질의 특정 성질 결정을 수행하는데 사용될 수 있다. 단백질의 성질 결정은 유용한 정보를 제공할 수 있다. 성질 결정은 단백질의 용해도, 3차원적 구조 및 감염성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이들 성질 뿐아니라 다른 것도 그 후 단백질이 뇌조직으로부터 추출되고 분리될 때 같이 상이한 기관이나 조직으로부터 추출된 단백질의 동일한 결정된 성질과 비교될 수 있다.

본 발명이 유효하게 작용하는 이유에 대하여는 여기에서 결론적으로 주장될 수 없다. 그러므로, 본 발명의 범위는 내재하는 기작을 설명하는 어떤 특정 이론에 의하여 한정되지 않는다. 그렇지만 혈병 형성에 관련된 단백질은 병원성 입체구조의 형성에 저해 효과를 가지는 것처럼 나타난다. 대안으로, 혈병 형성 단백질이 단백질의 질병 형태의 형성을 허용하는 몇몇 다른 저해제나 인자를 제거한다. 이 경우에 해당한다고 할 때, 이 저해제의 분리는 질병에 대한 가치 있는 치료법을 제공할 것이다. 단백질의 병원성 형태와 관련된 질병의 신호를 일차적으로 감지한 후, 저해제는 인간을 포함하는 어떤 포유동물에도 투여될 수 있을 것이다. 이 같은 저해제의 투여는 단백질의 병원성 형태의 더 나아간 형성을 막고 그것에 의하여 질병의 진행을 저지할 것이다.

착화제

한 구체예에서, 헤테로폴리산 (예를 들어 PTA) 같은 화학적 작용제 또는 바람직하게는 그것의 염 (NaPTA)이 착화제이다. 샘플은 실질적으로 샘플 내 모든 PrP^Sc가 PTA와 착물을 형성하도록 허용할 충분한 기간동안에 걸쳐 착화제 처리를 받는다. 예를 들어, 샘플은 약 30 ℃ 내지 45 ℃ (바람직하게는 37 ℃)에서 약 1 내지 16 시간동안에 걸쳐 항온처리될 수 있다. 착화제는 PrP^Sc와 착물을 형성한다. 중요한 것은 형성된 착물이 어떤 수단, 예를 들어 여과, 자기장의 사용, 침전 등에 의하여 샘플의 나머지와 분리될 수 있다는 것이다.

본 발명의 방법은 PrP^Sc또는 다른 병원성 단백질이 결과적 샘플 내에 실질적으로 농축되어 있는 생체 샘플을 제조한다.

본 발명의 착화제로 유용한 화합물은 항체, 효소, 펩티드, 화학물질 종, 결합분자 등을 포함한다. 이들 착화제는 혈청의 필수적 구성요소는 온전하게 유지한 채, 예를 들어 세포 형태학과 단백질의 원래상태를 유지한 채, 혈청으로부터의 프리온의 결합과 제거를 허용하는 방식으로 사용된다.

화학제

본 발명의 한 구체예에서, 생체물질로부터 프리온의 제거를 위한 화합물은 PrP^Sc을 침전시키는 화학제이다. 본 발명의 착화제로 사용되는 화학제의 바람직한 한 부류는 헤테로폴리산과 그것의 염이다. 헤테로폴리산은 적어도 하나의 중심원소와 적어도 하나의 배위원소를 가지는 산소음이온의 전체 또는 부분적으로 프로톤화된 형태이다. 헤테로폴리산은 Keggin 또는 Dawson 구조를 가진다.

헤테로폴리산의 특정 부류는 헤테로폴리 몰리브데이트의 프로톤화 형태이다. 이들 음이온은 2 내지 18 개의 6가 몰리브데늄 원자를 하나 이상의 중심원자 주위에 함유한다. 약 36 개의 상이한 원소가 이들 헤테로폴리 몰리브데이트의 중심원자로서 확인되었다. 이들 음이온은 모두 고도로 산소화된다. 헤테로폴리 몰리브데이트의 예는 [PMo₁₂O₄₀]³, [As²Mo₁₈O₆₂]⁶, 및 [TeMo₆O₂₄]⁶를 포함하며, 중심 원자는 각각 P⁵⁺, As⁵⁺, Te⁶⁺이다. 헤테로폴리 몰리브데이트의 더 자세한 논의는 Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 제 3 판, 15, 688-689 (1981)에 제공된다.

헤테로폴리 몰리브데이트의 프로톤화 형태에 유사한 헤테로폴리산의 다른 부류는 헤테로폴리 텅스테이트의 프로톤화 형태이다. 헤테로폴리 텅스테이트에서, 배위 원소는 몰리브데늄 대신 텅스텐이다. 그 전문 개시가 여기에 명백히 참고문헌으로 수록된 미국 특허 No. 4,376,219는 각종의 헤테로폴리산의 제조를 논한다. 이들 헤테로폴리산의 중심 원소는 P, Si, B, Ge, As, Se, Ti, Zr, Mn, F, V, Ce 및 Th로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 헤테로폴리산의 배위 원소는 Mo 및/또는 W를 포함한다. 선택적 배위 원소는 V, Mn, Co, Ni, Cu, Zn 및 Fe를 포함한다. 중심 원소의 수에 대한 배위 원소의 수의 비율은 2.5 내지 12, 바람직하게는 9 내지 12이다. 미국 특허 No. 4,376,219에 예시된 특정 헤테로폴리산은 포스포텅스트산, 실리코텅스트산, 10-텅스토-2-바나도포스포르산, 6-텅스토-6-몰리브도포스포르산, 포스포몰리브딕산, 실리코몰리브딕산, 게르마노텅스트산, 텅스토플루오르산, 및 18-텅스토-2-포스포르산 뿐만 아니라 이들 산 중 어느 하나 또는 전부의 염, 예를 들어 Na, K, Mg 및 Ca 염을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 특정 헤테로폴리산은 포스포텅스트산, 즉 H₃PW₁₂O₄₀과 그것의 금속염 특히 Na 염이다. 이 같은 착화제는 PrP^Sc에 효과적으로 결합한다.

이 같은 화학제는 단독으로나, 조합하여, 또는 완충액과 불활성 결합화학물질 같은 다른 비-생물활성 화학물질과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 헤테로폴리산 (예를 들어 PTA)는 유일하게는 아니지만 바람직하게 금속염의 형태로 사용된다. 금속염은 나트륨, 칼륨, 칼슘 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

존재하는 혈청에 첨가되는 헤테로폴리산 또는 그것의 염의 양은 혈청에 존재하는 PrP^Sc를 유의하게 농축시키기 충분한 양, 바람직하게는 PrP^Sc를 검출 불가능한 수준으로 또는 적어도 비-감염 수준으로 제거시키기 충분한 양으로 존재하여야 한다. 혈청에 대한 헤테로폴리산의 중량비는, 예를 들어 약 1:20 내지 약 1:1이다. 헤테로폴리산은 헤테로폴리산의 적당한 분산을 제공하는 어떤 방식으로든 혈청과 조합되어 헤테로폴리산의 유효 표면을 증가시키고 착물 형성을 보증한다.

생물학적 작용제

다른 구체예에서, 착화제는 단백질 펩티드, 또는 PrP^Sc에 선택적으로 결합하는 다른 생물학적 부분이다.

한 구체예에서, 착화제는 펩티드 또는 프리온에 선택적으로 결합하도록 고안된 다른 작은 분자이다. 바람직하게는, 펩티드나 작은 분자는 PrP^Sc에 우선적으로 결합하도록 고안된다. "우선적으로 결합하다"에 의하여는 펩티드가 적어도 20배 이상, 더 바람직하게는 50 배 이상, 더 바람직하게는 100 배 이상, 더욱 더 바람직하게는 1000 배 이상 생체 용액에서 다른 단백질보다 PrP^Sc에 결합할 가능성이 더 있는 것을 의미한다. 일반적으로 생체액은 PrP^Sc를 천연형으로 함유하므로, 본 발명의 펩티드는, 변성형과 대조되는, PrP^Sc의 천연형에 결합하도록 바람직하게 고안된다. 펩티드는, 당업계 숙련자가 예견할 수 있는 바와 같이, 결합이 더 용이한 PrP^Sc의 영역에 대하여 펩티드를 고안하여 PrP^Sc에의 결합을 최대화하도록 고안된다. PrP^Sc에 결합하는 유용한 항체는, 여기에 수록되어 항체와 항체를 생산하는 방법을 개시하고 기술하는 1998년 12월 8일 특허된 미국 특허 5,846,533에 개시되고 기술된다. 대안으로, 펩티드는 PrP^C에 선택적으로 결합하거나 또는 PrP^Sc와 PrP^C모두에 결합하도록 고안된다.

본 발명의 착화제는 또한 프리온에 선택적인 항체이다. 이 항체는 항체가 관심의 단백질에 결합하는 것을 허용하는 방식으로 혈청에 첨가된다. 이 항체, 예를 들어 미국 특허 5,846,533에 개시된 항체는 PrP^Sc에 결합할 수 있다. 샘플에 존재하는 PrP^C를 제거하기 위하여, PrP^C에 선택적 또는 우선적으로 결합하는 항체가 사용된다. 이 같은 항체는 1986년 10월 8일 기탁된 세포주 ATCC HB9222에 의하여 생산되는 모노클론 항체 263K 3F4를 개시하는 1989년 2월 21일 특허된 미국특허 4,806,627에 개시되고, 이는 참고문헌으로 여기에 수록된다. 항체를 생산하는 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852로부터 얻을 수 있다.

일반적으로 스크래피 감염은 면역반응을 일으키는데 실패하고 숙주 생체는 동일한 종으로부터의 PrP^Sc에 내성이 있다. PrP^C또는 PrP^Sc에 결합하는 항체는 미국 특허 5,846,533에 개시된다. PrP^C에는 결합하지만 PrP^Sc에 결합하지 않는 임의의 항체가 사용될 수 있고 이 같은 것은 당업계 숙련자가 공지 과정, 예를 들어 US 5,223,409의 파지 디스플레이 항체 라이브러리를 생산하는 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 폴리클론 항-PrP 항체는 다량의 포름산- 또는 SDS-변성된 SHaPrP 27-30으로의 면역화에 이어 토끼로부터 생산되었다 [Bendheim, Barry et al. (1984)Nature 310: 418-421; Bode, Pocchiari et al. (1985)J Gen Virol 66:2471-2478; Safar, Ceroni et al. (1990) Neurology 40: 513-517]. 유사하게, 소량의 PrP 27-30에 대한 항-PrP 모노클론 항체가 마우스에서 생산되었다 [Barry와 Prusiner(1986)J Infect Dis 154: 518-521; Kascsak, Rubenstein et al. (1987)J Virol 61: 3688-3693]. 이들 항체는 포름산- 또는 SDS-변성 PrP 27-30에 대하여 생산되었고 SHa과 인간에서 유래한 천연 PrP^C와 처리되거나 변성된 PrP^Sc모두 잘 인지할 수 있으나 MoPrP에는 결합하지 않는다. 당연히, 이들 항체의 에피토프는 SHa- 및 MoPrP 간의 아미노산 차이를 함유하는 서열의 영역에 매핑된다 [Rogers, Yehiely et al. (1993)Proc Natl Acad Sci USA 90:3182-3186].

본 발명의 목적에서, 결합이 일어나지 않는다는 표시는 평형 또는 친화도 상수 K_a가 10⁶l/mole 이하임을 뜻한다. 게다가, 결합은 K_a가 10⁷l/mole 이상일 때에, 더 바람직하게는 10⁸l/mole 이상일 때 인식될 것이다. 결합친화도 10⁷l/mole 이상은 (1) 단일 모노클론 항체 (즉, 한 종류의 항체 다수) 또는 (2) 다수의 상이한 모노클론 항체에 (즉, 다수의 각 5 가지 상이한 모노클론 항체) 또는 (3) 다수의 폴리클론 항체에 기인한다. (1) 내지 (3)의 조합의 사용도 가능하다. 선택되는 바람직한 항체는 PrP^Sc의 천연 입체구조에 결합하는 것에 비할 때 단백질의 처리되거나 변성된 PrP^Sc형태에 적어도 4 배 더 강하게 결합할 것이다. 결합 친화도의 4 배 차이는 상기 (1) 내지 (3) 각각에 대하여 몇몇의 상이한 항체를 사용하여 성취되고 혼합물의 항체의 일부는 4 배보다 작은 차이를 가질 수 있다.

단백질 검출 분석

일단 본 발명에 따라 샘플이 제조되면 샘플은 다양한 공지 기술에 의하여 분석된다. 여기에 제출된 실시예 및 비교예는 1998년 2월 20일 공개된 PCT 공개 WO 98/37411에 개시되고 기술된 타입의 입체구조-의존 면역분석 (CDI)을 사용한다. 그러나, 다른 타입의 단백질 검출 분석도 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체분석 또는 프리온의 검출용으로 조작된 더 특이적 트렌스제닉 마우스를 사용하는 것도 가능하다. 이 같은 마우스는 1996년 10월 15일 특허된 U.S. 특허 5,565,186; 1998년 6월 9일 특허된 U.S. 특허 5,763,740; 및 1998년 8월 11일 특허된 U.S. 특허 5,792,901에 개시된다. 대안으로, 제조된 샘플은 1998년 12월 8일 특허된 U.S.특허 5,846,533에 개시되고 기술된 항체를 사용하여 분석될 수 있다. 이들 공보 각각은 본 발명에 따라 제조된 샘플에 사용될 수 있는 특정 타입의 분석을 개시하고 기술하기 위하여 여기에 참고문헌으로 그 전체가 수록된다. 그러나, 본 발명은 이같은 단백질 분석 방법학의 사용에 한정되는 것이 아님이 지적된다. 다른 분석도 사용될수 있고, 정확한 결과를 얻기 위하여 본 발명에 따라 제조된 샘플을 사용할 수 있는 다른 분석이 의심할 바 없이 개발될 것이다.

입체구조-의존 면역분석의 고감도 때문에 여기에 기술된 실시예는 이 분석을 사용하고 각 시헙된 실시예에 동일한 방법으로 사용하여 결과를 비교하는 것을 가능케 한다. 분석의 자세한 내용이 고개된 PCT 출원 WO 98/37411에 기술되나 기초적 방법학은 지금 기술될 것이다.

이 방법은 두 개의 부분으로 나누어진 샘플로 시작하는 것이 필요하다. 샘플의 제 1의 부분은 결합상대와 접촉한다. 결합상대는 단백질의 제 2의 입체구조에 대한 것보다 단백질의 제 1의 입체구조에 고친화도를 가진다. 결합상대는 전형적으로, 표지된 3F4 같은 항체이다. 결합상대가 제 1의 입체구조인 단백질에 결합하도록 허용한 후 형성된 결합상대/단백질 착물의 농도가 측정된다.

샘플의 제 2의 부분은 그 후 제 2의 입체구조인 단백질의 결합 친화도가 결합 상대에 대하여 증가하도록 하는 방식으로 처리된다. 이 처리는 다양한 상이한 방법학을 포함할 수 있고 종종 샘플을 제 2의 병원성 입체구조의 단백질이 더 느슨하고 따라서 더 결합상대에 결합하기 쉬운 상태가 되도록 하는 충분한 기간동안과 조건 하에서 프로테아제에 노출하는 것과 관련된다.

처리된 제 2의 부분은 그 후 결합상대에 접촉된다. 단백질과 결합상대 간의 결합이 일어나도록 허용한 후 제 2의 처리된 부분 내에 형성된 결합상대/단백질 착물의 농도가 측정된다.

샘플이 단백질의 제 2의, 질병 입체구조인 단백질을 함유하지 않았다면 처리는 거의 효과가 없을 것이다. 그러나, 처리는 단백질의 제 1의 입체구조에 어떤 영향을 줄 것이고 그것의 결합상대에 대한 결합 친화도를 약간의 정도로 증가시킬 수 있다. 따라서, 처리로 결과된 제 1의 입체구조의 단백질의 결합상대에 대한 증가된 친화도를 보상하는 조정된 농도를 제공하기 위하여 제 2의 농도에 조정이 이루어져야 할 것이다.

제 1의 농도와 조정된 농도를 얻은 후 둘은 서로 비교된다. 만약 조정된 농도가 제 1의 농도보다 크면 이는 원래의 샘플에 제 2의 병원성 입체구조의 단백질이 존재함을 나타내는 것이다.

입체구조-의존 면역분석의 변형을 수행하는 것이 가능하다. 공개된 PCT 출원WO 98/37411에 상세하게 기술된 한 변형은 원래의 샘플이 제 1 및 제 2의 부분으로 나누는 것을 필요로하지 않는다. 처리 공정은 샘플에 수행되고 농도가 측정된다. 그 농도는 그 후 시험된 샘플이 프리온을 함유하는지 결정하기 위하여 (샘플의 통계적으로 유의한 군에서 사전에 얻어진) 기지의 표준과 비교된다.

하기 실시예는 본 대상 발명을 만들고 사용하는 방법의 완전한 개시와 기술을 당업계 통상의 기술을 가진자에게 제공하기 위하여 제출되며, 발명자가 그의 발명에 의도한 범위를 제한할 의도이거나, 하기 실험이, 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내거나 함축하려는 의도가 아니다. 사용된 수 (예를 들어 분량, 온도 등)에 대하여는 정확성을 보장하기 위하여 노력을 기울였으나 몇몇 실험적 오차 및 편차는 고려되어야 한다. 별도로 지시되지 않은 경우, 비율은 무게 대비 비율, 분자량은 평균 분자량, 온도는 섭씨이며 압력은 대기압 또는 거의 대기압이다.

비교예 1, 2 및 3은 프리온을 함유하는 샘플이 각각 (1) 백혈구, (2) 혈소판 및 (3) 혈장으로부터 제조될 때 각각이 그릇된 음성 결과를 나타냄을 나타낸다. 그러나, 샘플이 본 발명에 따라 혈청으로부터 제조되면 (실시예 4), 진정 양성 결과가 얻어진다. 각 비교예 1, 2, 3 및 실시예 4에서 사용된 착화제는 소듐 포스포텅스테이트였다. 게다가, 각 제조된 샘플은 입체구조-의존 면역분석 (CDI)를 사용하여 시험되었다.

비교예

시트르산 나트륨으로 처리된 시리아생 햄스터의 분획 내 PrP ^Sc 에 대한 입체구조-의존 면역분석 (CDI)

응고를 방지하기 위하여 시리아생 햄스터 전혈을 3.8 % (w/v) 완충 시트르산 나트륨과 배합하였고 (1:9), 1100RPM에서 회전시켜 혈장을 얻은 후 Percoll 구배 (Pharmacia)에 의하여 상이한 분획으로 분리하였다. 정상 (대조군) 및 스크래피-감염 (스크래피) 시리아생 햄스트로부터 얻어진 백혈구 (WBC), 혈소판 및 혈장을 프로테아제 저해제 존재 하에서 PTA로 침전시켰다. 펠릿이 프리온 단백질 (PrP^Sc)의 감염성 이소형의 존재에 대하여 CDI에 의하여 시험되었다. 응고형성을 방지하고 비교예를 제공하기 위하여 시트르산 나트륨을 첨가하였다.

비교예 1

백혈구

PrP^Sc는 스크래피-감염 시리아생 햄스터의 백혈구 (WBC)에서 검출 가능하지 않다. 시트르화된 혈액으로부터 얻어진 WBC를 2 % 살코실에서 용해하고 소듐 포스포텅스테이트로 침전시켰다. 각 샘플로부터의 천연 및 변성된 알리쿼트를 글루타르알데히드-활성화 ELISA 평판에 가교결합시키고 두 알리쿼트 모두 유로퓸 표지 3F4와 함께 항온처리하였다. 7 차례 세척 단계 후, 신호는 Discovery (Packard Inc.) 시간-분해 형광 분광계에 의하여 평가되었다. 결과는 각 샘플의 변성된 (TRF_D) 및 천연 (TRF_N) 알리쿼트로부터의 신호의 비로 표현된다.

비교예 2

혈소판

PrP^Sc는 스크래피-감염된 시리아생 햄스터의 시트르화된 혈액에서 분리된 혈소판에서 검출 가능하지 않다. 시트르화된 혈액에서 분리된 혈소판을 2 % 살코실에서 용해하고 소듐 포스포텅스테이트로 침전시켰다. 각 샘플로부터의 천연 및 변성된 알리쿼트를 글루타르알데히드-활성화 ELISA 평판에 가교결합시키고 두 알리쿼트 모두 유로퓸 표지 3F4와 함께 항온처리하였다. 7 차례 세척 단계 후, 신호는 Discovery (Packard Inc.) 시간-분해 형광 분광계에 의하여 평가되었다. 결과는 각 샘플의 변성된 (TRF_D) 및 천연 (TRF_N) 알리쿼트로부터의 신호의 비로 표현된다.

비교예 3

혈장

PrP^Sc는 스크래피-감염된 시리아생 햄스터의 시트르화된 혈액에서 분리된 혈장에서 검출 가능하지 않다. 시트르화된 혈액에서 분리된 혈장을 2 % 살코실에서 용해하고 소듐 포스포텅스테이트로 침전시켰다. 각 샘플로부터의 천연 및 변성된 알리쿼트를 글루타르알데히드-활성화 ELISA 평판에 가교결합시키고 두 알리쿼트 모두 유로퓸 표지 3F4와 함께 항온처리하였다. 7 차례 세척 단계 후, 신호는 Discovery (Packard Inc.) 시간-분해 형광 분광계에 의하여 평가되었다. 결과는 각 샘플의 변성된 (TRF_D) 및 천연 (TRF_N) 알리쿼트로부터의 신호의 비로 표현된다.

실시예 4

응고된 전혈로부터의 혈청 내 PrP ^Sc 에 대한 입체구조-의존 면역분석

스크래피-감염 시리아생 햄스터의 혈청내 PrP^Sc의 양성 검출. 2.5를 넘는 값은 혈청 내 PrP^Sc가 존재함을 가리킨다. 정상 (대조군) 또는 스크래피-감염 시리아생 햄스터 (스크래피)로부터 얻은 시리아생 햄스터 혈이 유리 시험관 (Becton-Dickinson, Inc.)에서 응고되었다. 3,000rpm에서 원심분리하여 혈청을 혈병으로부터 분리하였고 프로테아제 저해제로 처리하였다. 2 % 살코실, 0.8 내지 1.2 % (w/v) 소듐 포스포텅스테이트, 및 35 내지 50 mM의 MgCl₂첨가 후, 샘플을 밤새 37 ℃에서 항온처리하였고 14,000g에서 회전시켰다. 펠릿을 재현탁하고 천연 및 변성 알리쿼트로 나누었다. 각 알리쿼트는 글루타르알데히드-활성화 ELISA 평판에 가교결합시키고 유로퓸 표지 3F4와 함께 항온처리하였다. 7 차례 세척 단계 후, 신호는 Discovery (Packard Inc.) 시간-분해 형광 분광계에 의하여 평가되었다. 결과는 각 샘플의 변성된 (TRF_D) 및 천연 (TRF_N) 알리쿼트로부터의 신호의 비로 표현된다. 각 데이터 점수는 단일 실험을 나타낸다.

실시예 5

대조군 및 스크래피 감염된 시리아생 햄스터로부터의 데이터의 중복이 없다는 것에 의하여 혈청 PrP^Sc시험의 고 진단감도와 특이성이 증명된다. 플롯 4로부터의 데이터가 중앙값 (중간선), 50th (점선) 및 95th (외측 상자선) 백분율로서 표현된다.

본 발명은 가장 유용하고 바람직한 구체예라고 생각되는 것으로 여기에 나타나고 기술된다. 그러나, 거기서부터 발명의 범위내에 있는 개량이 행하여 질 수 있고, 명백한 변형은 이 개시를 읽고 당업계 숙련자가 생각해낼 것임이 인식되어야 한다.

Claims

다량의 혈액을 얻는 단계;

그 혈액이 응고되도록 허용하는 단계;

응고된 혈액으로부터 혈청을 분리하는 단계;

단백질의 병원성 입체구조와 함께 단백질/착화제 착물을 형성하는 착화제에 혈청을 접촉시키는 단계; 및

샘플 내 착물을 농축하는 단계를 포함하는, 샘플을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 단백질의 병원성 형태는 βA4 단백질, PrP 단백질 및 트랜스티레틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질의 것이고 혈청은 원심분리를 사용하여 분리되고 착화제는 헤테로폴리산 또는 그것의 염인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 혈액은 질병의 증상을 나타내지 않는 인간, 암소 및 양으로 구성된 군으로부터 선택되는 포유동물로부터 얻어지고 착화제는 포스포텅스트산의 염인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 혈액은 인간의 것이고, 단백질의 병원성 입체구조는PrP^Sc이며, 착화제는 소듐 포스포텅스테이트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 착물의 단백질을 분석하여 성질을 결정하는 단계를 더 포함하며, 성질은 용해도, 3차원적 구조 및 감염성으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 단백질의 성질을, 혈액이 추출된 동물과 동일한 동물의 뇌조직으로부터 추출된 단백질의 질병 입체구조의 동일한 성질과 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 샘플의 제 1의 부분을, 제 2의 병원성 입체구조보다 제 1의 입체구조에 더 고친화도를 가지는 결합상대에 접촉시키고, 제 1의 부분 내 결합상대/단백질 착물의 제 1의 농도를 측정하는 단계;

샘플의 제 2의 부분을 처리하여 제 2의 입체구조의 결합상대에 대한 결합 친화도를 증가시키는 단계;

처리된, 샘플의 제 2의 부분을 결합상대에 접촉시켜 제 2의 처리된 부분 내의 결합상대/단백질 착물의 제 2의 농도를 측정하는 단계;

제 2의 농도를 조정하여 처리로 결과된 제 1의 입체구조의 결합상대에 대한 증가된 친화도를 보상하는 조정된 농도를 제공하는 단계; 및

제 1의 농도를 조정된 농도와 비교하여 제 2의 병원성 입체구조의 단백질의 존재를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 제 1의 농도와 제 2의 농도가 시간-분석분해촉진 형광을 사용하여 측정되고;

단백질의 제 2의 병원성 입체구조가 샘플 내에 1 x 10³입자/ml 이하로 존재하고;

상기 단백질은 βA4 단백질, PrP 단백질 및 트랜스티레틴으로 구성된 군으로부터 선택되고; 그리고

샘플의 제 2의 부분은 열, 압력 및 화학적 변성으로 구성된 군으로부터 선택되고 제 2의 병원성 입체구조의 어떤 단백질의 적어도 2 %를 결합상대에 대한 친화도가 증가된 입체구조로 전환시키기 충분한 처리를 사용하여 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 결합상대는 상기 단백질의 제 2의 병원성 입체구조에 대한 친화도보다 상기 단백질의 제 1의 입체구조에 대하여 적어도 10 배 높은 친화도를 가지는 표지된 항체를 포함하고;

혈액은 인간, 소, 양 및 돼지로 구성된 군으로부터 선택되는 포유동물로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 샘플을 처리하여 단백질의 제 2의 입체구조를 결합상대에 대하여 제 2의 입체구조보다 높은 친화도를 가지는 결합 입체구조로 전환시키는 단계;

처리된 샘플을 결합상대에 접촉시켜 샘플 내 결합상대/단백질 착물의 농도를 측정하는 단계;

농도를 조정하여 처리로 결과된 제 1의 입체구조의 결합상대에 대한 증가된 친화도를 보상하는 조정된 농도를 제공하는 단계; 및

상기 조정된 농도를 대조군 농도 및 사전 결정된 표준 농도로 구성된 군으로부터 선택되는 기지의 농도와 비교하여 샘플 내에 단백질의 제 2의 입체구조가 존재하는지를 결정는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 결합상대는 표지된 항체를 포함하고, 착화제는 포스포텅스트산의 금속염을 포함하며 농도는 유동 세포계측을 사용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 단백질은 PrP 단백질이고 조정된 농도는 처리된 비-감염성 대조군 샘플로부터 결정된 기지의 농도와 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 조정된 농도는 인간, 암소 및 양으로 구성된 군으로부터선택되는 비-감염 포유동물 군으로부터의 처리된 샘플로부터 사전 결정된 기지 농도와 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 항체는 3F4이고 착화제는 소듐 포스포텅스테이트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 제 2의 입체구조의 단백질은 샘플 내에서 ml 당 1 x 10³단백질 분자 이하로 존재하고, 제 1의 입체구조의 단백질은 샘플 내에서 ml 당 1 x 10⁶단백질 분자 이하로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
인간, 암소 및 양으로 구성된 군으로부터 선택되는 포유동물로부터 추출되는 혈액으로부터 얻어지는 혈청을, 혈액에서 PrP^Sc와 결합하여 PrP^Sc의 비중에 비교할 때 더 높은 비중을 가지는 착물을 형성하는 착화제에 접촉시키는 단계;

중력을 이용하여 농축된 샘플에서 착물을 농축하는 단계; 및

농축된 샘플의 PrP^Sc를 분석하는 단계를 포함하는, 혈액 내의 PrP^Sc존재를 결정하는 방법.
제 16 항에 있어서, 착화제는 헤테로폴리산 또는 그것의 염이고 착물의 농축에서 중력의 사용은 원심분리에 의하여 강화되는 것을 특징으로 하는 방법.
다량의 혈액을 얻는 단계;

그 혈액이 응고되도록 허용하는 단계;

응고된 혈액으로부터 혈청을 분리하는 단계;

PrP^Sc단백질과 함께 착물을 형성하는 포스포텅스트산 및 그것의 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 착화제에 혈청을 접촉시키는 단계; 및

샘플 내에서 PrP^Sc단백질과 함께 형성된 착물을 농축하는 단계를 포함하는, 샘플을 제조하는 방법.
제 18 항에 있어서, 혈청은 소듐 포스포텅스테이트와 접촉되고;

혈액은 인간, 암소 및 양으로 구성된 군으로부터 선택되는 포유동물로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 착물의 PrP^Sc단백질을 분석하여 성질을 결정하는 단계로서, 성질은 용해도, 3차원적 구조 및 감염성으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로하는 단계;

PrP^Sc단백질의 성질을, 혈액이 추출된 동물과 동일한 타입의 동물의 뇌조직으로부터 추출된 단백질의 질병 입체구조의 동일한 성질과 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 농축은 혈청을 착화제에 접촉시킨 후 원심분리를 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 농축은 혈청을 착화제에 접촉시킨 후 여과를 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 혈액은 혈액을 실온에서 항응고제 없이 멸균 용기내에 두도록 허용하는 것 외의 과정을 사용하지 않고 응고되도록 허용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 착화제는 혈청과 1 내지 16 시간 범위의 시간동안 30 ℃ 내지 45 ℃ 온도 범위에서 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.